Sarah Nurainina1512 100 017

Faridah Tsuraya 1512 100 051

Resume Journal berjudul Isolation of Heterotrophc Thiosulfate-Oxidizing Bacteria and Their Role in a Conservation Tidal Flat in the Ariake Sea, Japan

Pendahuluan

Laut Ariake adalah laut semi tertutup yang mempunyai sedikit kontak dengan lautan terbuka untuk pergantian dan demikian rentan untuk pergantian lingkungan. Penurunan substansi populasi keberadaan bentik yang disebabkan emisi sulfida telah dilaporkan. Sulfide secara normal terpancar dari bagian anoxic dari tidal flat dekat bagian permukaan dari sedimen lumpur. campuran yang dikeluarkan oleh SRB (sulfate reducing bacteria) seperti buangan produk metabolic dari respirasi anaerobik dengan campuran organik dengan sulfate yang disuplai oleh air laut selama pasang tinggi. Jumlah sedikit dari sulfide bereaksi dengan keberadaan metal dan ditempatkan di sedimen, ketika jumlah besarnya diremove oleh oksidasi biologi. Sulfide dioksidasi untuk elemen sulfur atau sulfate oleh bermacam sulfur oksidasi bacteria (SOB) yang hidup di pasang surut flat. Bacteria adalah organisme kunci yang merespon untuk oksidasi campuran sulfur inorganik. Informasi awal tentang bakteria yang mendiami tidal flat telah dilaporkan. Mereka mensurvei keberagaman dan kelimpahan populasi bakteria dari GENE 16S Rrna. Tujuan dari penelitiaan, mereka mengisolasi SOB heterotrof dari Tidal flat Midorikawa dan meneliti hubungan di oksidasi thiosulfate dan sulfide. Thiosulfate digunakan untuk mengisolasi mengenai stabilitas dan kelimpahan di tidal flat. Aturan SOB heterotrof di siklus sulfur akan didiskusikan.

Material dan Methods

Deskripsi tempat Sampling

Tidal flat midorikawa adalah bagian dari estuari midorikawa yang berlokasi di bagian barat prefecture kumamoto, pulau kyushu jepang. Di estuary, air tawar dari sungai midorikawa bertemu air laut dari laut semi tertutup Ariake. Selama pasang rendah, lumpur menjadi terekspos dan beberapa burung migrasi pencari makan dan beberapa hewan seperti mudskippers dan kepiting dapat diamati.

Sampling dan prosedur isolasi

Sedimen atas 2 cm yang disampel, dimasukkan 50 mL polypropylene falcon conical tube (BD Bioscience Durham, NC USA) selama pasang rendah di Juni 2013. Tabung sampling dijaga dalam keadaan dingin selama perjalanan ke laboratorium dan disimpan di 4OC sebelum inokulasi. Thiosulfate mineral (TM) liquid medium digunakan untuk kesuburan medium untuk menumbuhkan sulfur oksidasi bakteria. TM medium disiapkan dengan (per liter) : 1 g NH4Cl, 0,1 g CaCl2, 2H2O, 10 g NaCl, 0,5 g KH2PO4, 2 g K2HPO4, 0,8 g MgSO4 7H2O, 3 g Na2S2O3 5H2O didistilasi dan 2ml dari 05 % phenol red sebagai indikator Ph. 3 Campuran pertama dikombinasi dengan 1 ml trace metal solustion dan diautoclav di 121OC untuk 20 menit dan disubsekuen campuran dan ditambah setelah disetriliasi filter melalui cellulose acetate membrane filter. Terakhir PH medium disesuaikan menjadi 7.3. sampel sedimen 3 g ditansfer ke 100 ml TM medium di 300 mL botol kerucut. Botol inokulasi diisi dengan kapas steril dan diinkubasi aerob di 30OC pada rotary shaker pada 120 rpm. Inkubasi berakhir ketika Ph kultur liquid memulai untuk di bawah 7. Kultur liquid lalu diperlakukan ke serial dilution sebelumnya untuk disebarkan ke TM medium plate yang berisi 1,5% agar dan 0.02% ekstrak yeast. Piring Inokulasi diinkubasi di 30OC untuk 7 hari di bawah kondisi aerob. Morfologi koloni jelas dipilih dan distreak ke TM piring medium dan diinkubasi di bawah kondisi yang sama.

Karakterisasi oksidasi thiosulfate

Tabung gelas diisi dengan 2 layer agar medium dan masing-masing 10 ml. Layer bawah diisi 1% agar dan 400 ul 10% Na2S ketika atasnya berisi TM medium dengan 0,05% agar, 0,1 % NaHCO3 dan 0,02% ekstrak yeast. Thiosulfate dihilangkan dari medium meninggalkan sulfide yang menyediakan satu-satunya sumber energi. Na2S solution ditambahkan di tabung sebelum agar di bawahnya tercampur. Ketika agar bawah diubah ke solid, 0.5 ml cell suspensi di 1% garam solution ditransfer ke situ. Lalu terkover oleh medium agar layer atas. Tabung inokulasi diinkubasi aerob di 30Oc. Eksperimen direplikasi 2 kali dan sebagai kontrol, inkulasi medium tanpa Na2S dan steril medium dengan Na2S disipakan.

Amplifikasi PCR partial gen 16 S Rrna

Single koloni isolasi terpurifikasi diambil dari medium agar menggunakan steril toothpick dan ditransfer langsung ke PCR reaction mixture sebagai template. Bakteri umum primernya 27F (5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) dan 518R (5-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3) dan amplitaq gold digunakan untuk amplifikasi bagian 16S gen rRna. PCR ditunjukkan dengan T Gradien Biometra Thermocycler di bawah mengikuti kondisi. Initial denaturasi pada 95OC untuk 5 menit diikuti oleh siklus 25 denaturasi pada 95oc untuk 1 menit didinginkan pada 50oc untuk 1 menit dan ekstensi pada 72Oc untuk 2 menit. Untuk menkonfirm bahwa ukurannya benar, PCR reaksi mensubyek ke elektroforesis pada 1,5% agarosa gels di 1x TAE buffer, gels menodai dengan ethibium bromide dan reaksi produksidivisualissi oleh illuminasi dengan sinar ultraviolet pada 302 nm. PCR produk menkonfirm menjadi ukuran yang benar dengan purifikasi enguunakan UltraClean PCR Clean Up Kit.

Analisis Sequence

Purifikasi produk PCR bagian GEN 16S Rrna dikirim ke TaKaRa company menjadi tersequence menggunakan Big Dye terminasi v3.1 Cycle Sequencing Kit pada ABI 3730xl DNA analizer. Didapatkan sequenced yang diupload dan dikomper menjadi getbank database menggunakan web based BLAST analysis tools di Nasional Center for Biotechnology informasi untuk dianalisis fiologenetik afiliasi dan identitas kekerabatannya.

Estimasi kelimpahan heterotrof thiosulfate-oxidizers di lingkungan

Satu gram sampel sedimen telah diperlakukan untuk serial dilution di tabung glass yang berisi 9 ml 1% solution garam. Rangkaian termasuk delapan 10-lipatan langkah dilusion. Dari masing-masing ini, 1 ml suspensi diransfer menjadi 40 ml TM liquid medium di 100 ml botol conical yang berisi 0,1 % Na pyruvate sebagai sumber karbon dan 0,02 % ekstrak yeast. Medium disiapkan duplikate dan diinkubasi aerob pada 30Oc. Aktivitas thiosulafe oxidizers dideteksi pada tidak terwarnainya indikator PH.

Hasil

Dari hasil uji isolasi pengoksidasi thiosulfate, setelah 7 hari masa inkubasi koloni bakteri tumbuh pada semua agar plate hingga pengenceran 10-5. Masa inkubasi yang lebih lama dapat membuat koloni menjadi lebih tebal dan lebih luas namun tidak merubah jumlah mereka. Koloni yang mampu terpisah dengan baik hanya ditemukan pada plat agar pada pengenceran 10-3 dan 10-5. Dari semua plat, koloni diinokulasikan lagi pada fresh agar plate dengan komposisi yang sama dan didapatkan 25 koloni yang dapat hidup. Mayoritas koloni mengubah warna medium menjadi kuning dan beberapa yang lain berubah menjadi warna merah muda. Selanjutnya 5 strain yang representative yaitu MKH02, MKH04 dan MKH20 sebagai bakteri produksi asam dan MKH16 & MKH41 sebagai bakteri produksi basa dikarakterisasi.

Kelima isolat yang ditemukan selanjutnya dikarakterisasi dengan diuji responnya terhadap tiga kondisi medium yang berbeda. Hasilnya, kelima isolate tersebut merespon tiga kondisi medium secara berbeda-beda. Isolat MKH02 dan MKH20 dapat tumbuh di medium mixotrofik dan heterotrofik namun tidak tumbuh pada medium autotrofik. Sedangkan isolat MKH04 yang mampu memfiksasi karbon anorganik dan mampu tumbuh pada seluruh kondisi karena sifatnya yang merupakan fakultatif litoautotrof. Sebaliknya, isolat MKH16 & MKH41 menaikkan pH medium selama pertumbuhan mixotrof dan idak dapat tumbuh pada medium yang kekurangan karbon organik. Kedua isolat mengubah pH dari medium mixotrof dalam waktu yang relative cepat (