Next Generation Sequencing, una nueva tecnologa para el diagnstico molecular de la Fibrosis QusticaAutor: Fernando Sotillo

Directora: Teresa Casals

Centro: IDIBELL

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IntroduccinCaractersticas generalesCaractersticas clnicasCaractersticas molecularesDiagnsticoObjetivosMaterial y mtodosResutadosDiscusin*

Fibrosis Qustica (FQ; OMIM#219700): enfermedad autosmica recesiva severa ms frecuente en la poblacin caucsica.

Incidencia: 1/2000-4000

Causada por mutaciones en el gen cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR; ABCC7; OMIM #602421)

CFTR: canal de cloruro expresado en clulas epiteliales

*Caractersticas generalesDeficiencias transporte inico CFTRMutaciones en CFTR

Manifestaciones respiratorias: Enfermedad pulmonar crnicaMayor causa moribilidad y mortalidad*Deficiencias en CFTRAumento de viscosidad secrecionesDificultad aclaramiento mucociliarInfeccin respiratoriaInflamacin y lesin irreversibleCaractersticas clnicas

*Caractersticas clnicasManifestaciones tracto gastrointestinal:Insuficiencia pancreticaPncreas exocrinoPncreas endocrinoCFRDManifestaciones genitourinarias:Manifestaciones de las glndulas sudorparas:Infertilidad, ACBCDFrtiles, no riesgos embarazoMalabsorcin grasas, Vits liposolublesConcentracin sales 3-5X

*Caractersticas molecularesCFTR: protena integral de membrana170kDa5 dominiosCFTR: regin 7q32.127 exones>1900 mutaciones descritasF508del ms frecuenteelevada heterogeneidad (SNVs, InDels, SVs)

*DiagnsticoEvaluacin clnica+ Test sudor+ Anlisis molecular CFTRTest del sudor: test cuantitativo de iontoforesis con pilocarpina

[Cl-]> 60mml/l

60mmol/l>[Cl-]

*ObjetivosValidar la tecnologa NGS en el anlisis molecular de CFTR (captura y secuenciacin)Evaluar la eficiencia y sensibilidad de NGS, frente a las otras tcnicas de rastreo, en la deteccin de mutaciones CFTR en una poblacin con alta heterogeneidad molecularObjetivos generalesObjetivos concretosIdentificar de manera precisa los puntos de rotura (breakpoints) de una nueva delecin en CFTR (no descrita en las bases de datos pblicas) que implica la prdida del exn 22Caracterizar e identificar de manera precisa los breakpoints de un gran reordenamiento, previamente descrito como la delecin simultanea de dos regiones del gen abarcando 50kb (Morral 1993)

*Material y MtodosPacientes: 92 muestras de pacientes FQ previamente analizadas y de genotipo identificado mediante tcnicas habituales. Anonimizadas. Mtodos:Anlisis NGS del gen CFTRCaracterizacin de mutacionesPreparacin alcuotasDiseo de primersAmplificacin de las regiones dianaAnlisis de los productos de PCRPurificacin y secuenciacin SangerReferencias 3.Anlisis especfico de los reordenamientos

*ResultadosCaracterizacin delecin exn 22Estimacin NGS

BP 5 NGS:117,267,172BP 3 NGS:117,269,047

*ResultadosCaracterizacin de la mutacin CFTR50kbDel Estimacin NGSBP 5 del4-8 NGS:117,170,000BP 3 del4-8 NGS:117,182,000BP 5 del12-21 NGS:117,217,000BP 3 del12-21 NGS:117,255,000 Confirmacin Sanger

BP 5 Sanger:117,169,908Insercin TATATBP 3 Sanger:117,180,511

*ResultadosCaracterizacin de la mutacin CFTR50kbDelLos breakpoints de la delecin 4-8 se correspondenPor primera vez se observa la inversin

*ResultadosCaracterizacin de la mutacin CFTR50kbDelBP Inv I.3BP Del I.11Repeticiones 20pb intrones 11 y 21

*Conclusiones Capacidad ptima de la NGS para la deteccin y caracterizacin de estas dos nuevas SvsDel 22:permite deteccin, igual que MLPAmejora sensibilidad, aporta BPCFTR50kbdel:permite su caracterizacin por primera vez

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