8/8/2019 Fib Rob Last Protein Ofn Human in e

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 ) 5 2 3 1b u f f e r a t c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , g / m l a n d 6 mM, r e s p e c -t i v e l y .F - I F A s s a y . F - I F a c t i v i t y w a s d e t e r m in e d b y t h e c y t o p a t h i ce f f e c t ( C P E ) - i n h i b i t i o n m e t h o d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d ( 2 ) w i t hi n t e r n a t i o n a l s t a n d a r d F - I F ( N a t i o n a l I n s t i t u t e o f A l l e r g y a n dI n f e c t i o u s D i s e a s e s ) a s r e f e r e n c e .

RESULTSM e t h o d o f G e n e E x p r e s s i o n . We d e s i r e d t o a b u t t a D NAf r a g m e n t b e a r i n g o u r p o r t a b l e p r o m o t e r t o t h e ATG e n c o d i n gt h e a m i n o - t e r m i n a l m e t h i o n i n e o f p r e - F - I F i n o n e c a s e a n d t ot h e AT G e n c o d i n g t h e a m i n o - t e r m i n a l m e t h i o n i n e o f m a t u r eF - I F i n a n o t h e r c a s e . T h i s p r o m o t e r f r a g m e n t e n c o d e s t h ep r o m o t e r a n d l e a d e r s e q u e n c e o f t h e l a c o p e r o n b u t t e r m i n a t e st w o b a s e p a i r s b e f o r e t h e A T G t h a t e n c o d e s t h e a m i n o - t e r m i n a lm e t h i o n i n e o f f 3 - g a l a c t o s i d a s e ( 8 - 1 0 ) . T h e m R N A e n c o d e d b yt h e f r a g m e n t d o e s c o n t a i n t h o s e b a s e s c a l l e d t h e S h i n e - D a l -g a r n o ( S D ) s e q u e n c e t h a t , i n c o n j u n c t i o n w i t h a p r o p e r l y p o -s i t i o n e d A U G , p r o m o t e r i b o s o m e b i n d i n g a n d i n i t i a t i o n o fp r o t e i n s y n t h e s i s ( 9 - 1 1 ) . We h a v e c a l l e d t h e c o m b i n a t i o n o f t h eSD s e q u e n c e o f l a c Z w i t h t h e A U G o f a n o t h e r g e n e a " h y b r i dr i b o s o m e - b i n d i n g s i t e , " a n d w e h a v e c o n s t r u c t e d v a r i o u s h y b r i dr i b o s o m e - b i n d i n g s i t e s t o e x p r e s s a v a r i e t y - o f p r o k a r y o t i c a n d

e u k a r y o t i c p r o t e i n s ( 8 - 1 0 ) . A l t h o u g h i t i s c l e a r t h a t t h e S D -A U G s e p a r a t i o n m u s t b e s m a l l ( 3 - 1 1 b a s e s ) , w e c a n n o t y e tp r e d i c t t h e o p t i m a l p l a c e m e n t n o r d o w e k n o w t h e e f f e c t o fb a s e s e q u e n c e ( 1 5 ) .O u r s t r a t e g y , i n o u t l i n e , w a s a s f o l l o w s . F o l l o w i n g t h e s t r a t e g yo f G u a r e n t e e t a l . ( 1 1 ) , w e f u s e d a 5 ' p o r t i o n o f t h e F - I F g e n ew i t h a l a r g e 3 ' f r a g m e n t o f t h e l a c Z g e n e o f E . c o l i ( F i g . 2 ) . T h i sl a c Z s e q u e n c e e n c o d e s e n z y m a t i c a l l y a c t i v e f 3 - g a l a c t o s i d a s e ,a n d a s i n d i c a t e d i n t h e f i g u r e , i t i s f u s e d t o a p o r t i o n o f l a d . T h i sf u s e d g e n e , c a r r i e d o n a p l a s m i d , w a s n o t e x p r e s s e d , h o w e v e r ,b e c a u s e i t l a c k s t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s e -q u e n c e s . We t h e n o p e n e d t h e p l a s m i d a t a u n i q u e r e s t r i c t i o ne n z y m e s i t e 5 ' t o t h e F - I F g e n e a n d r e s e c t e d D NA t o v a r i o u se x t e n t s b y u s i n g e x o n u c l e a s e ( F i g . 2 A a n d B ) . T h i s e n a b l e d u st o p o s i t i o n t h e p o r t a b l e p r o m o t e r a t m a n y p o i n t s n e a r a n d i nt h e 5 ' r e g i o n o f t h e F - I F g e n e ( F i g . 2 C ) . L a c t o s e - n e g a t i v e

P u r i f y p s t - F f f r a g m e n t b e a r i n g5 ' e n d s o f am p an d p r e - I F2 P u r i f y P s t - H E n i ( f i l l e d in ) i n t e r n a l

I F f r a g m e n t

P u r i f y Pst-Bom ( f i l l e d in )f r o g m e n t b e a r i n g 'I-Z

M I b d f t p T R 56

FIG. 1. C o n s t r u c t i o n of pTR56. Thearrowsindicate the direc-tions oftr anscri pti o n of theampgene and the pre-F-IF gene.

b a c t e r i a w e r e t r a n s f o r m e d w i t h a m i x t u r e o f t h e s e p l a s m i d s ,a n d t h o s e ( r a r e ) t r a n s f o r m a n t s e x p r e s s i n g h i g h l e v e l s o f f 3 - g a l -a c t o s i d a s e w e r e i d e n t i f i e d o n t h e a p p r o p r i a t e i n d i c a t o r p l a t e s .S e q u e n c e a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t w o s u c h i s o l a t e s b o r e t h ep o r t a b l e p r o m o t e r a d j a c e n t t o t h e AT G o f p r e - F - I F i n o n e c a s e( p L G 1 0 4 ) a n d t h e ATG o f m a t u r e F - I F i n t h e o t h e r ( p L G 1 1 7 )

I C u t w i t h H i n d ZA

B

8 1 7 ' 7 h ' f d AT G A T G

2 D i g e s t w i t h B o / 3 / e x o n u c l e a s eB O M n A T G A T G| p r e - I F ' ' I - Z 7 /

a n d AT GLIl Z a /3 a C u t w i t h B O M rb I n s e r t B o m - P w v I l a c p r o m o t e r f r a g m e n tc T r o n s f o r m a n d s c r e e n f o r L a c * c o l o n i e sC \

ATG ATG AT Gd F l a c p 1 are-IacP I F'ZZ/p L G I 0 4 p L G I 1 74 a C u t w i t h Ets

b J o i n w i t h P s I f r a g m e n t b e a r i n g 3 e n d o f I FD

- p L G I 0 4 R p L G I 1 7 R

F I G . 2 . C o n s t r u c t i o n o f p l a s m i d s t h a t d i r e c t t h e s y n t h e s i s o fp r e - F - I F ( p L G 1 0 4 R ) a n d m a t u r e F - I F ( p L G 1 1 7 R ) . P l a s m i d pTR56c o n t a i n s t h e 5 ' e n d o f t h e F - I F g e n e f u s e d t o t h e 3 ' e n d o f t h e l a c I - Zg e n e a n d u n i q u e H i n d I I I a n d BamHI s i t e s 6 a n d 1 1 6 b a s e s u p s t r e a mf r o m t h e A T G o f p r e - F - I F . T h e ATGs e n c o d i n g t h e a m i n o t e r m i n u so f p r e - a n d m a t u r e F - I F a r e s e p a r a t e d b y 6 0 b a s e p a i r s . S t e p 1 , t h ep l a s m i d w a s o p e n e d b y c l e a v a g e w i t h H i n d I I I . S t e p 2 , t h e l i n e a r i z e dp l a s m i d w a s d i g e s t e d f o r v a r i o u s t i me s w i t h t h e e x o n u c l e a s e B a l 3 1 .S t e p 3 , t h e r e s e c t e d p l a s m i d s w e r e c u t w i t h Bam a n d r e l i g a t e d w i t ha n e x c e s s o f a f r a g m e n t b e a r i n g t h e l a c p r o m o t e r t h a t t e r m i na t e s 5b a s e p a i r s b e y o n d t h e l a c SD s e q u e n c e . T h i s 1 0 5 - b a s e - p a i r p o r t a b l ep r o m o t e r i s b o u n d e d b y Bam a n d P v u I I e n d s . I t i s a d e r i v a t i v e o f t h el a c 9 5 p o r t a b l e p r o m o t e r ( s e e r e f . 1 6 ) . S t r a i n LG90 [ F - , A ( l a c -p r o ) X 1 1 1 ] w a s t r a n s f o r m e d w i t h t h e l i g a t i o n m i x a n d w a s p l a t e d o nl a c t o s e M a c C o n k e y i n d i c a t o r a g a r . R e d ( l a c t o s e - u t i l i z i n g ) c o l o n i e sw e r e p i c k e d , a n d t h e s t r u c t u r e s o f t w o p l a s m i d s , p L G 1 0 4 a n d p L G 1 1 7 ,w e r e d e t e r m i n e d . T h e r e l e v a n t p o r t i o n s o f t h e s e t w o D N A m o l e c u l e sa r e s h o w n i n t h e f i g u r e . S t e p 4 , t h e g e n e s f o r p r e - F - I F a n d m a t u r e F - I Fw e r e r e c o n s t r u c t e d . P l a s m i d s p L G 1 0 4 a n d p L G 1 1 7 w e r e c u t w i t h P s tI , a n d t h e r e l e v a n t p o r t i o n w a s j o i n e d w i t h a P s t I - P s t I f r a g m e n tb e a r i n g t h e 3 ' e n d o f t h e F - I F g e n e a n d t h e 3 ' e n d o f a m p . T h e d e s -i g n a t i o n R i n d i c a t e s t h e r e c o n s t r u c t e d F - I F - p r o d u c i n g f o r m o f t h ep l a s m i d s .

B i o c h e m i s t r y : T a n i g u c h i e t a l .

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5 2 3 2 B i o c h e m i s t r y : T a n i g u c h i e t a l .S D - 2 1 + 1A - [ A G G A I AACAG I A C A C C A AGC-

p L G 1 0 4 ( p r e - F - I F )SD + 1AGGA A A C A G I C C AGC-

pLG 1 1 7 ( F - I F )

BSD + 1

- AGGA AACAG C T A T G I A C C-l a c ZF I G . 3 . ( A ) N u c l e o t i d e sequences o f t h e DN As a r o u n d t h e r e g i o n se n c o d i ng r i b o so m e - b i nd i n g s i t e s o f genes e n c o d i n g p r e - F - I F ( i np L G 1 0 4 R ) a n d m a t u r e F - I F ( i n p L G 1 1 7 R ) . T h e v e r t i c a l l i n e s s e p a r a t e

sequences c a r r i e d o n t h e l a c p o r t a b l e f r a g m e n t f r o m F - I F sequences.T h e b o x e s i n d i c a t e t h e l a c Z SD sequence a n d t h e A T Gs e n c o d i n g t h ea m i n o - t e r m i n a l m e t h i o n i n e s o f p r e - F - I F a n d o f m a t u r e F - I F . ( B )C o r r e s p o n d i n g r e g i o n o f w i l d - t y p e l a c Z ( 1 7 ) .( F i g . 2 C ; see a l s o F i g . 3 ) . T h e D NA c o n t a i n i n g t h e l a c Z 3 ' genef r a g m e n t was r e m o v e d a n d r e p l a c e d w i t h t h e 3' e n d o f t h e F - I Fgene, r e g e n e r a t i n g i n t a c t F - I F ( p L G 1 1 7 R ) a n d p r e - F - I F( p L G 1 0 4 R ) , i n w h i c h R i n d i c a t e s t h e r e c o n s t i t u t e d F - I F gene( F i g . 2 D ) .

P l a s m i d s t h a t D i r e c t t h e S y n t h e s i s o f F - I F ( p L G 1 1 7 R ) a n dp r e - F - I F ( p L G 1 0 4 R ) . F i g . 3A s h o w s t h e D N A sequence a r o u n dt h e j u n c t i o n s o f t h e p o r t a b l e p r o m o t e r a n d t h e A T G s e n c o d i n gt h e a m i n o t e r m i n u s o f p r e - F - I F ( p L G 1 0 4 a n d p L G 1 0 4 R ) a n dt h a t o f m a t u r e F - I F ( p L G 1 1 7 a n d p L G 1 1 7 R ) . I n e a c h c a s e , t h eSD sequence ( A G G A ) o f l a c Z c a r r i e d on t h e p o r t a b l e p r o m o t e rh a s b e e n p o s i t i o n e d seven b a s e p a i r s f r o m t h e A T G o f F - I F . T h i si s p r e c i s e l y t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e SD sequence a n d t h e A T Gf o u n d i n w i l d - t y p e l a c Z ( F i g . 3 B ) ( 1 7 ) . T h e s e p a r t i c u l a rp l a c e m e n t s were r a r e . I n t h e s c r e e n i n g t h a t y i e l d e d p L G 1 0 4 ,l a c t o s e - u t i l i z i n g c o l o n i e s a p p e a r e d a t a f r e q u e n c y o f a p p r o x i -m a t e l y 5 % . P l a s m i d p L G 1 1 7 was i d e n t i f i e d i n a s e p a r a t e ex-p e r i m e n t i n v o l v i n g more e x t e n s i v e e x o n u c l e o l y t i c d i g e s t i o n .I n t h i s c a s e , l a c t o s e - u t i l i z i n g c o l o n i e s were f o u n d a t a f r e q u e n c yo f o n l y a p p r o x i m a t e l y 0 . 0 1 % . P r o t e i n s P r o d u c e d b y p L G 1 0 4 R a n d p L G 1 1 7 R . T h e ex-p e r i m e n t o f F i g . 4 uses t h e " m a x i c e l l " t e c h n i q u e t o d i s p l a y t h o s ep r o t e i n s e n c o d e d b y p L G 1 0 4 R a n d p L G 1 1 7 R . S u i t a b l y t r e a t e dm a x i c e l l s d i f f e r e n t i a l l y i n c o r p o r a t e r a d i o a c t i v e a m i n o a c i d s i n t op l a s m i d - e n c o d e d p r o t e i n s t h a t are e a s i l y v i s u a l i z e d b y a u t o -r a d i o g r a p h y a f t e r p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 1 , 1 8 ) .p L G 1 0 4 R a n d p L G 1 1 7 R e a c h d i r e c t t h e s y n t h e s i s o f o ne p r o t e i ni n a d d i t i o n t o , 3 - l a c t a m a s e . I n t h e case o f p L G 1 1 7 R , a p r o t e i nwas p r o d u c e d w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e l y2 0 , 0 0 0 , c o n s i s t e n t w i t h t h e p r e d i c t e d ( f r o m t h e DNA s e q u e n c e )s i z e o f u n g l y c o s y l a t e d m a t u r e F - I F ( 6 ) . I n t h e case o f p L G 1 0 4 R ,t h e p r o t e i n p r o d u c e d h a d a m o l e c u l a r w e i g h t o f a b o u t 2 3 , 0 0 0 ,w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e p r e d i c t e d m o l e c u l a r w e i g h t o f un-g l y c o s y l a t e d p r e - F - I F .F i g . 4 a l s o s h o w s t h e f a t e o f p u l s e - l a b e l e d p L G 1 0 4 R a n dp L G 1 1 7 R p r o t e i n s i n a m a x i c e l l e x p e r i m e n t . D e n s i t o m e t r yt r a c i n g o f t h e g e l ( n o t s h o w n ) r e v e a l s t h a t p r e - F - I F wascom- T h i s s c r e e n i n g a l s o y i e l d e d a t h i r d f u s i o n , pLG1 1 5 . I n t h i s c a s e , t h ep o r t a b l e p r o m o t e r i s a b u t t e d t o n u c l e o t i d e 1 8 o f t h e sequence en-c o d i n g t h e F - I F l e a d e r some 2 0 b a s e s f r o m t h e n e a r e s t p o s s i b l e i n i -t i a t o r t r i p l e t ( 6 ) . E x p e r i m e n t s s i m i l a r t o t h e e x p e r i m e n t o f F i g . 4

s u g g e s t t h a t , i n t h i s c a s e , p r o t e i n s y n t h e s i s i n i t i a t e s a t t h e i n t e r n a l A T Gl o c a t e d a t p o s i t i o n 1 7 5 i n t h e DNAsequence p u b l i s h e d b y T a n i g u c h ie t a l . ( 6 , 7 ) . T h i s A T G i s f o r t u i t o u s l y p r e c e d e d b y an S D - l i k e sequencei n t h e F - I F g e n e . We d o n o t u n d e r s t a n d ho w t h e p o r t a b l e p r o m o t e rp l a c e m e n t i n p L G 1 1 5 e n h a n c e s t h e e f f i c i e n c y o f u t i l i z a t i o n o f t h i sA T G .

Jow'-'-- Sm.#F I G . 4 . P r o t e i n s e n c o d e d b y p l a s m i d s pLG104R ( p r e - F - I F ) a n dPLG117R ( F - I F ) . P l a s m i d p r o t e i n s w e r e l a b e l e d b y t h e m a x i c e l lt e c h n i q u e ( 1 8 ) . P r o t e i n s e n c o d e d b y p L G 1 0 4 R w e r e l a b e l e d f o r 5 m i nw i t h [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e ( l a n e 1 ) a n d t h e n c h a se d w i t h n o n r a d i o a c t i v em e t h i o n i n e f o r 1 2 m i n ( l a n e 2 ) o r 5 0 m i n ( l a n e 3 ) . L a b e l i n g a n d c h a s i n gw e r e t e r m i n a t e d b y f r e e z i n g t h e c e l l s . A f t e r s p i n n i n g f o r 2 m i n i n a nE p p e n d o r f c e n t r i f u g e , t h e c e l l p e l l e t s w e r e s u s p e n d e d i n L a e m m l i ' ss a m p l e b u f f e r ( 1 3 ) , i n c u b a t e d f o r 3 m i n a t 1 0 0 1 C , t h e n s u b j e c t e d t oa n a l y s i s b y p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a s d e s c r i b e d ( 1 3 ) .S i m i l a r l y , p r o t e i n s e n c o d e d b y p L G 1 1 7 R w e r e l a b e l e d f o r 5 m i n ( l a n e4 ) a n d c h a s e d f o r 1 2 m i n ( l a n e 5 ) o r 5 0 m i n ( l a n e 6 ) . L a n e s 7 , 8 , a n d9 d i s p l a y t h e s a m e l a b e l i n g p r o t o c o l p e r f o r m e d o n p l a s m i d p G L 1 0 1 ,w h i c h e n c o d e s o n l y f 3 - l a c t a m a s e . P l a s m i d p L G 3 0 2 - 2 R , w h i c h d i r e c t ss y n t h e s i s o f r a b b i t f , - g l o b i n ( 5 0 0 0 - 7 5 0 0 m o l e c u l e s p e r c e l l ) ( 1 1 ) w a sl i k e w i s e a n a l y z e d a s s h o w n i n l a n e s 1 0 , 1 1 , a n d 1 2 .

p l e t e l y d e g r a d e d i n a 5 0 - m i n c h a s e ( l a n e s 1 a n d 3 ) , a n d F - I Fw a s a b o u t 5 0 % d e g r a d e d i n t h a t t i m e ( l a n e s 4 a n d 6 ) . A l t h o u g hp r o c e s s i n g o f f 3 - l a c t a m a s e f r o m p r e - 4 - l a c t a m a s e i s e v i d e n t ,p r e - F - I F i s a p p a r e n t l y n o t p r o c e s s e d .We e s t i m a t e d t h e l e v e l o f o u r F - I F a n d p r e - F - I F s y n t h e s i si n t w o w a y s . F i r s t , we m e a s u r e d t h e a m o u n t o f r a d i o a c t i v i t yi n c o r p o r a t e d d u r i n g a 5 - m i n p u l s e i n t o F - I F a n d p r e - F - I F i na m a x i c e l l e x p e r i m e n t . We c o m p a r e d t h e s e v a l u e s w i t h a k n o w ns t a n d a r d , n a m e l y , r a b b i t 1 3 - g l o b i n s y n t h e s i z e d b y t h e p l a s m i dp L G 3 0 2 - 2 R ( 1 1 ) ( s e e F i g . 4 ) . T h i s c o m p a r i s o n s u g g e s t s t h a t ,w e r e t h e F - I F m o l e c u l e s s t a b l e , t h e s t e a d y - s t a t e l e v e l s w o u l db e 5 0 0 0 - 1 0 , 0 0 0 m o l e c u l e s p e r c e l l . S e c o n d , we f o u n d t h a tg r o w i n g c e l l s b e a r i n g p l a s m i d s p L G 1 1 7 a n d p L G 1 0 4 s y n t h e s i z ea b o u t 1 2 0 0 - 1 4 0 0 u n i t s o f 0 3 - g a l a c t o s i d a s e ( 1 9 ) . A s s u m i n g t h a tt h e h y b r i d F - I F ( o r p r e - F - I F ) - f 3 - g a l a c t o s i d a s e m o l e c u l e s h a v et h e s a m e s p e c i f i c a c t i v i t y a s 3 - g a l a c t o s i d a s e , t h i s v a l u e r e p r e -s e n t s 5 0 0 0 - 1 0 , 0 0 0 m o l e c u l e s p e r c e l l ( 1 1 ) . P r e v i o u s e x p e r i e n c ew i t h 3 - g a l a c t o s i d a s e h y b r i d p r o t e i n s m o d i f i e d a t t h e i r a m i n ot e r m i n i s u g g e s t s t h a t t h e y a r e s t a b l e d u r i n g g r o w t h ( 2 0 ) .A n t i v i r a l A c t i v i t y o f t h e Human F i b r o b l a s t I n t e r f e r o nP o l y p e p t i d e S y n t h e s i z e d i n E . c o l i . E x t r a c t s o f b a c t e r i ab e a r i n g p l a s m i d p L G 1 1 7 R i n h i b i t e d g r o w t h o f v e s i c u l a r s t o -m a t i t u s v i r u s o n h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s i n a t y p i c a l i n t e r f e r o na s s a y ( i n h i b i t i o n o f c y t o p a t h i c e f f e c t ) ( 2 , 2 1 ) . T h i s a c t i v i t y w a sa b o l i s h e d b y a n t i b o d y t o F - I F b u t n o t b y a n t i b o d y t o l e u k o c y t ei n t e r f e r o n ( F i g . 5 ) . M o r e o v e r , e x t r a c t s o f b a c t e r i a c a r r y i n gp L G1 0 4 R , p L G 1 l 5 R , a n d p B R 3 2 2 f a i l e d t o m a n i f e s t a n t i v i r a la c t i v i t y . T h e a n t i v i r a l a c t i v i t y d i r e c t e d b y p L G 1 1 7 R s u r v i v e sa s o j o u r n a t l o w pH ( p H 2 . 0 ) o r t r e a t m e n t w i t h D N a s e a n dR N a s e , b u t i t i s a b o l i s h e d b y t r y p s i n t r e a t m e n t ( d a t a n o t s h o w n ) .A s s u m i n g t h a t u n g l y c o s y l a t e d F - I F i s a s a c t i v e a s g l y c o s y l a t e dF - I F [ 2 X 1 0 8 u n i t s / m g ( 2 2 ) ] , t h e a c t i v i t y we t y p i c a l l y r e c o v -e r e d w o u l d c o r r e s p o n d t o a p p r o x i m a t e l y 5 0 i n t e r f e r o n m o l e -c u l e s p e r b a c t e r i a l c e l l .

DISCUSSIONO u r r e s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t o u r a p p l i c a t i o n o f t h e m e t h o do f G u a r e n t e e t a l . ( 1 1 ) t o t h e F - I F g e n e i s o l a t e d b y T a n i g u c h ie t a l . ( 6 , 7 ) h a s p r o d u c e d t w o p l a s m i d s ( p L G 1 0 4 R a n dp L G 1 1 7 R ) t h a t d i r e c t t h e s y n t h e s i s o f p r o t e i n s w h o s e p r i m a r ys e q u e n c e s c o r r e s p o n d , r e s p e c t i v e l y , t o t h o s e o f p r e - F - I F a n dF - I F .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 )

8/8/2019 Fib Rob Last Protein Ofn Human in e

4/4

B i o c h e m i s t r y : T a n i g u c h i e t a l .

[ ) ; l i : :' . I \ t I d ' ..0.C l 000.\lti-F-IV D o C Q : C)

v . l x t j i 1 ( t NX e t r a c ( t 1 1N v r u0* 1 . 0

*- 0 0nI3{~2 .9C .0

F I G . 5 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n t i v i r a l a c t i o n o f b a c t e r i a l l y p r o -d u c e d F - I F as a s s a y e d i n v i t r o . E x t r a c t s o f b a c t e r i a b e a r i n g p L G 1 1 7 Rwere a d d e d i n 1 : 2 d i l u t i o n s t o human f i b r o b l a s t c e l l s ( F S - 7 ) g r o w i n gi n m i c r o t i t e r d i s h e s . I n t w o c a s e s , t h e s e e x t r a c t s were p r e t r e a t e ds e p a r a t e l y w i t h a n t i b o d y t o F - I F a n d w i t h a n t i b o d y t o l e u k o c y t e i n -t e r f e r o n ( L e - I F ) . T h e t r e a t e d c e l l s were c h a l l e n g e d w i t h v e s i c u l a rs t o m a t i t u s v i r u s a n d s t a i n e d w i t h c r y s t a l v i o l e t ( 2 ) . W e l l s c o n t a i n i n gc e l l s u n i n f e c t e d w i t h v i r u s or p r o t e c t e d a g a i n s t v i r a l i n f e c t i o n s t a i nd a r k l y w i t h t h i s d y e . A l s o s h o w n are t h e e f f e c t s o f no e x t r a c t a n d ane x t r a c t o f a s t r a i n b e a r i n g p l a s m i d p B R 3 2 2 .

T h e s e p l a s m i d s b e a r a l a c p o r t a b l e p r o m o t e r a b u t t e d t o t h eA T G e n c o d i n g t h e a m i n o - t e r m i n a l m e t h i o n i n e o f p r e - F - I F( p L G 1 0 4 R ) a n d t o t h e A T G e n c o d i n g t h e a m i n o - t e r m i n a lm e t h i o n i n e o f F - I F ( p L G 1 1 7 R ) . I n e a c h c a s e , t h e s e p r o m o t e rp l a c e m e n t s were o r i g i n a l l y r e c o g n i z e d b y t h e i r a b i l i t i e s t o e f -f i c i e n t l y d i r e c t s y n t h e s i s o f a F - I F - f 3 - g a l a c t o s i d a s e h y b r i dp r o t e i n . I n e a c h c a s e , t h e d i s t a n c e s e p a r a t i n g t h e SD sequenceo f t h e l a c p r o m o t e r f r o m t h e A T G i s p r e c i s e l y t h a t f o u n d i n t h e 'case o f w i l d - t y p e l a c Z . When c o m p a r e d w i t h p B R 3 2 2 ,p L G 1 1 7 R a n d p L G 1 0 4 R e a c h d i r e c t s y n t h e s i s o f o n e newp r o t e i n o f m o l e c u l a r w e i g h t s a p p r o x i m a t e l y 2 0 , 0 0 0 a n d 2 3 , 0 0 0 ,r e s p e c t i v e l y . T h e s e are t h e s i z e s e x p e c t e d f o r u n g l y c o s y l a t e dp r o t e i n s w i t h t h e p r i m a r y sequences o f F - I F a n d p r e - F - I F asp r e d i c t e d f r o m t h e DNA sequence o f T a n i g u c h i e t a l . ( 6 ) . I np r e v i o u s c a s e s , we h a v e f o u n d t h a t f o r m a t i o n o f s u c h h y b r i dr i b o s o m e - b i n d i n g s i t e s , n o t d i s s i m i l a r t o t h e ones s h o w n h e r e ,h a v e d i r e c t e d c o r r e c t i n i t i a t i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s ( r a b b i t$ - g l o b i n , s i m i a n v i r u s 4 0 t u m o f ( t ) a n t i g e n , X r e p r e s s o r ) as d e -t e r m i n e d b y d i r e c t a m i n o a c i d s e q u e n c i n g ( 8 - 1 1 ) . I n a l l o f t h e s ec a s e s , t h e a m i n o - t e r m i n a l m e t h i o n i n e w a s m a i n t a i n e d . We h a v en o t d e t e r m i n e d t h e a m i n o a c i d sequence o f o ur b a c t e r i a l l yp r o d u c e d F - I F .P l a s m i d p L G 1 1 7 R , b u t no o t h e r p l a s m i d d e s c r i b e d h e r e ,d i r e c t s a n t i v i r a l a c t i v i t y c h a r a c t e r i s t i c o f F - I F u n d e r o ur assayc o n d i t i o n . T h e amount o f t h i s a c t i v i t y i s m u c h l o w e r ( o n l y a b o u t1 % ) t h a n t h a t p r e d i c t e d o n t h e b a s i s o f t h e r a t e a t w h i c h t h ep r o t e i n i s s y n t h e s i z e d i n o ur b a c t e r i a We imagine t h e f o l l o w i n gp o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h i s d i f f e r e n c e .( i ) T h e p r o t e i n i s r a p i d l y d e g r a d e d . T h e p u l s e - c h a s e ex-p e r i m e n t o f F i g . 5 i n d i c a t e s t h a t t h e b a c t e r i a l l y p r o d u c e d F - I Fp r o t e i n i s s o m e w h a t u n s t a b l e u n d e r t h e p a r t i c u l a r c o n d i t i o n so f t h a t e x p e r i m e n t . B u t t h i s d e g r e e o f i n s t a b i l i t y w o u l d n o ta c c o u n t f o r t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e e x p e c t e d a n d t h e o b-s e r v e d r e s u l t . T h e c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h we v i s u a l i z e d t h ep r o t e i n s ( i . e . , i n m a x i c e l l s ) may n o t a c c u r a t e l y r e f l e c t t h e e x t e n to f d e g r a d a t i o n i n g r o w i n g c e l l s .( H ) B a c t e r i a l l y s y n t h e s i z e d F - I F , w h i c h i s u n g l y c o s y l a t e d ,may h a v e l o w s p e c i f i c a c t i v i t y i n o u r i n t i t r o a s s a y .( M i ) O u r m e t h o d o f e x t r a c t i o n may n o t e f f i c i e n t l y recovera c t i v e F - I F . We h a v e n o t s y s t e m a t i c a l l y v a r i e d g r o w t h c o n d i -t i o n s or m e t h o d s o f e x t r a c t i o n .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 7 ( 1 9 8 0 ) 5 2 3 3We h a v e o n l y h i n t s a s t o w h y p r e - F - I F , s y n t h e s i s o f w h i c hi s d i r e c t e d b y p L G 1 0 4 R , i s t o t a l l y i n a c t i v e i n o u r a s s a y . I t i sp o s s i b l e t h a t t h e u n p r o c e s s e d f o r m i s i n h e r e n t l y i n a c t i v e . T h em a x i c e l l e x p e r i m e n t s s h o w n o i n d i c a t i o n t h a t p r e - F - I F i s c o r -r e c t l y p r o c e s s e d a n d s u g g e s t t h a t i t i s h y p e r l a b i l e c o m p a r e d t oF - I F . O x e n d e r e t a l . ( 2 3 ) h a v e d e s c r i b e d a c a s e ( t h e l e u c i n e -s p e c i f i c b i n d i n g p r o t e i n ) i n w h i c h t h e m a t u r e f o r m i s l e s s s e n -s i t i v e t o p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n t h a n i s t h e p r e c u r s o r b e a r i n ga h y d r o p h o b i c l e a d e r . I t i s p o s s i b l e t h a t p r e - F . I F i s e x p o r t e d

t o t h e p e r i p l a s m w i t h o r w i t h o u t c o n c o m i t a n t c l e a v a g e o f i t sl e a d e r a n d i s r a p i d l y d e s t r o y e d t h e r e .We a r e i n d e b t e d t o D r . J . V i l c e k f o r h i s h e l p a n d s u p p l y o f a n t i -b o d i e s . T h e w o r k o f T . T . h a s b e e n s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h eC a n c e r I n s t i t u t e , a n d T . T . t h a n k s D r s . H . S u g a n o a n d M . M u r a m a t s uf o r t h e i r e n c o u r a g e m e n t . L . G . i s a P o s t d o c t o r a l F e l l o w o f t h e J a n eC o f f i n C h i l d s M e m o r i a l F u n d f o r M e d i c a l R e s e a r c h .

1 . F i e l d , A . K . , T y t e l l , A . A . , L a m p s o n , G . P . & H i l l e m a n , M . R .( 1 9 6 7 ) P r o c . N a t i . A c a d . S c d . USA 5 8 , 1 0 0 4 - 1 0 0 9 .2 . S t e w a r t , W . E . , I I ( 1 9 7 9 ) T h e I n t e r f e r o n S y s t e m ( S p r i n g e r ,V i e n n a ) .3 . I s a a c s , A . & L i n d e n m a n n , J . ( 1 9 5 7 ) P r o c . R . S o c . L o n d o n S e r . B1 4 7 , 2 5 8 - 2 6 7 .4 . K n i g h t , E . , J r . , H u n k a p i l l e r , M . W . , K o r a n t , B . D . , H a r d y , R . W .F . & H o o d , L . E . ( 1 9 8 0 ) S c i e n c e 2 0 7 , 5 2 5 - 5 2 6 .5 . T a n i g u c h i , T . , S a k a i , M . , F u j i i - K u r i y a m a , Y . , M u r a m a t s u , M . ,K o b a y a s h i , S . & S u d o , T . ( 1 9 7 9 ) P r o c . J p n . A c a d . S e r . B 5 5 ,4 6 4 4 6 9 .6 . T a n i g u c h i , T . , O h n o , S . , F u j i i - K u r i y a m a , Y . & M u r a m a t s u , M .( 1 9 8 0 ) G e n e 1 0 , 1 1 - 1 5 .7 . T a n i g u c h i , T . , F u j i i - K u r i y a r n a , Y . & M u r a m a t s u , M . ( 1 9 8 0 ) P r o c .N a t i . A c a d . S c f . USA 7 7 , 4 0 0 3 - 4 0 0 6 .8 . B a c k m a n , K . & P t a s h n e , M . ( 1 9 7 8 ) C e l l 1 3 , 6 5 - 7 1 .9 . R o b e r t s , T . M . , B i k e l , I . , Y o c u m , R . R . , L i v i n g s t o n , D . M . &P t a s h n e , M . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 , 5 5 9 6 - 5 6 0 0 .1 0 . R o b e r t s , T . M . , K a c i c h , R . & P t a s h n e , M . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t i . A c a d .S c i . USA 7 6 , 7 6 0 - 7 6 4 .1 1 . G u a r e n t e , L . , L a u e r , G . , R o b e r t s , T . M . & P t a s h n e , M . ( 1 9 8 0 ) C e l l2 0 , 5 4 3 - 5 5 3 .1 2 . B a c k m a n , K . , P t a s h n e , M . & G i l b e r t , W . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t i . A c a d .S c i . USA 7 3 , 4 1 7 4 - 4 1 7 8 .1 3 . L a e m m l i , U . K . ( 1 9 7 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 , 6 8 0 - 6 8 5 .1 4 . N a g a t a , S . , T a i r a , H . , H a l l , A . , J o h n s r u d , L . , S t r e u l i , M . , E s o d i ,J . , B o l l , W . , C a n t e l l , K . & W e i s s m a n n , C . ( 1 9 8 0 ) N a t u r e ( L o n d o n )2 4 , 3 1 6 - 3 2 0 .1 5 . S t e i t z , J . A . ( 1 9 7 8 ) i n B i o l o g i c a l R e g u l a t i o n a n d D e v e l o p m e n t ,e d . G o l d b e r g e r , R . ( P l e n u m , New Y o r k ) , V o l . 1 , p p . 3 4 9 - 3 9 9 .1 6 . R o b e r t s , T . M . & L a u e r , G . D . ( 1 9 7 9 ) M e t h o d s E n z y m o l . 6 8 ,4 7 3 - 4 8 1 .1 7 . M a i z e l s , N . ( 1 9 7 4 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 4 9 , 6 4 7 - 6 4 9 .1 8 . S a n c a r , A . , H a c k , A . M . & R u p p , W. D . ( 1 9 7 9 ) J . B a c t e r i o l . 1 3 7 ,6 9 2 - 6 9 3 .1 9 . M i l l e r , J . H . ( 1 9 7 2 ) E x p e r i m e n t s i n M o l e c u l a r G e n e t i c s ( C o l dS p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) .

2 0 . B a s s f o r d , P . , B e c k w i t h , J . , B e r m a n , M . , B r i c k n a n , E . , C a s a d a b a n ,M . , G u a r e n t e , L . , S a i n t - G i r o n s , I . , S a r t h y , A . , S c h w a r t z , M . ,S h u m a n , H . & S i l h a v y , T . ( 1 9 7 8 ) i n T h e O p e r o n , e d s . M i l l e r , J .H . & R e z n i k o f f , W . S . ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l dS p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p . 2 4 5 - 2 6 1 .2 1 . H o , M . & E n d e r s , J . F . ( 1 9 5 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 4 5 ,3 8 5 - 3 8 9 .2 2 . K n i g h t , E . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 , 5 2 0 - 5 2 3 .2 3 . O x e n d e r , D . , A n d e r s o n , J . J . , D a n i e l s , C . J . , L a n d i c k , R . , G u n s a l u s ,R . P . , Z u r a w s k i , G . & Y a n o f s k y , C . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 7 7 , 2 0 0 5 - 2 0 0 9 .