Рудакова Оксана Николаевна : G : E B A < J ? F ? G G U O F...

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное Государственное Образовательное Учреждение Высшего

Профессионального Образования «Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им К. И. Скрябина»

На правах рукописи

Рудакова Оксана Николаевна

АНАЛИЗ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА МЯСА ПРИ

ЛЕЙКОЗЕ КРУПНОГО РОГАГО СКОТА

06.02.05 – ветеринарная санитария, экология, зоогигиена

и ветеринарно-санитарная экспертиза

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук

профессор Меньшикова З. Н.

Москва 2010 г.

2

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ 3

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1 Определение и классификация лейкоза крупного рогатого скота 9

1.2 Этиология лейкоза крупного рогатого скота 12

1.2.1.Классификация, морфология и антигенная структура

вируса лейкоза крупного рогатого скота 12

1.2.2.Устойчивость вируса лейкоза крупного рогатого скота 14

1.2.3.Патогенные свойства ВЛКРС 15

1.3 Распространение болезни и экономический ущерб 18

1.4 Эпизоотологические особенности 21

1.5 Диагностика лейкоза крупного рогатого скота 23

1.5.1.Прижизненная диагностика 23

1.5.2.Предубойная диагностика 35

1.5.3.Послеубойная диагностика 36

1.6.Ветеринарно-санитарная оценка качества и безопасности туш,

внутренних органов и других продуктов убоя 40

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 46

2.1. Материалы и методы исследования 46

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 54

2.2.1. Ретроспективный анализ распространения лейкоза в некоторых

областях российской Федерации 54

2.2.2. Сравнительная оценка прижизненных методов диагностики

Лейкоза крупного рогатого скота 60

2.2.3. Послеубойная диагностика 74

2.2.4. Ветеринарно-санитарная характеристика продуктов убоя при

различных стадиях лейкозного процесса у крупного рогатого скота 86

- органолептическая оценка мяса крупного рогатого скота

больного лейкозом 86

- физико-химические показатели мяса крупного рогатого скота 89

- определение химического состава мяса крупного рогатого скота 91

- аминокислотный состав мяса крупного рогатого скота 92

- бактериологические исследования 94

- определение биологической ценности мяса 96

- полимеразная цепная реакция 98

2.2.5. Обсуждение результатов исследования 99

3. ВЫВОДЫ 113

4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ

НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 115

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 116

6. ИСПОЛЬЗОВАННАЯ НОРМАТИВНАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ 116

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 117

8. ПРИЛОЖЕНИЯ 137

3

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Важным условием продовольственной безопасности

нашей страны является производство достаточных по объему,

доброкачественных, экологически безвредных и полноценных продуктов

питания животного происхождения. Сдерживающими факторами в

обеспечении населения такими продуктами являются антропогенные

составляющие: нарушение правил гигиены и ветеринарно-санитарной

экспертизы при откорме, убое и доставке продуктов переработки животного

сырья потребителю, недостаточная разработка современных критериев оценки

качества продуктов убоя животных (Москалик Р.С., 2003; Туник А.Н., 2005;

Смирнов А.М., 2005; Меграбян Д.С. и соавторы, 2006). Особого внимания

заслуживает оценка мяса и других продуктов убоя, получаемых от животных,

пораженных различными болезнями, в частности, таким заболеванием как

лейкоз, встречающийся во всех субъектах Российской Федерации и многих

странах мира. В последнее десятилетие лейкоз в РФ занимает одно из ведущих

мест в инфекционной патологии. В 2002 г. на долю лейкоза пришлось 53%, в

2004 г. – 57,4% установленных случаев. Болезнь наносит значительный

экономический ущерб из-за нарушения воспроизводства стад, вынужденного

убоя и выбраковки высокопродуктивных больных животных, ограничений

хозяйственной деятельности (продажа молока, племенного молодняка),

затратами на оздоровительные мероприятия. Большую тревогу вызывает

качество используемой в пищу продукции от больных животных (Л.К. Эрнст,

В.П. Шишков, 1984; М.И. Гулюкин, Н.И. Петров, 2005).

Основными методами прижизненной диагностики лейкоза являются

реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД), иммуноферментный анализ

(ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР), которые позволяют выявить

животных, зараженных ВЛКРС на ранних сроках инфицирования при

отсутствии других признаков болезни (Muller J., Yan der Maaten M., 1979; Бурба

Л.Г., Шишков В.П., 1986; Иванова Л.А., 1999; Джапаралиев Н.Т. и соавторы,

2004; Двоеглазов Н.Г. и соавторы, 2005).

4

Плановые мероприятия по серологическому тестированию на лейкоз

поголовья крупного рогатого скота показывают, что число неблагополучных

пунктов по лейкозу в нашей стране увеличивается (Кунаков А.А., Альбикова

Г.М., 2002; Гулюкин М.И. и соавторы, 2004; Соколов Д.С., 2004).

Вопросы оздоровления стад от лейкоза, при недостаточности мер

специфической профилактики, сводятся к единственно действенному методу -

убою больных и инфицированных ВЛКРС животных и замене их здоровыми

особями. Данные о качестве продукции, получаемой от убойных животных,

крайне ограничены и неоднозначны (Адуцкевич В.А., 1969; Пипирас Ю.Ю.,

1971; Лемеш В.М., Пахомов П.И., 1989; Кунаков А.А. и соавторы, 2000;

Альбикова Г.М., 2002).

Согласно нормативным документам (1988г.), в практике отечественных

перерабатывающих предприятий мясо инфицированных ВЛКРС,

гематологически положительных на лейкоз животных, без морфологических

патоанатомических изменений в туше и органах, реализуется без ограничений.

Хотя ранее проведенные исследования показали, что туши и внутренние органы

больных лейкозом животных, убитых в опухолевой стадии болезни, имеют

существенные отклонения от нормы по биохимическим и органолептическим

показателям (Пахомов Л.Н., 1998; Альбикова Г.М., 2002). Сведения о

контаминации продуктов убоя ВЛКРС и качестве продукции, получаемой от

животных на различных стадиях лейкоза, в литературе отсутствуют.

В этой связи использование современных новых методов для

прижизненной и послеубойной диагностики лейкоза, изучения качества

продуктов убоя животных, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом,

является актуальным и требует внимания специалистов ветеринарно-

санитарного профиля в решении одной из главных задач – обеспечение

экологически чистыми и безопасными продуктами животного происхождения

населения нашей страны.

В странах Евросоюза ветеринарный контроль за качеством и

безопасностью продуктов животноводства, соответствующий нормативным

5

документам, осуществляется в процессе производства (на ферме, в хозяйстве), с

прижизненным исследованием крови, молока, а также тканей животных от

выборочного убоя (Смирнов А.М., 2006).

Цель и задачи исследования

Цель нашей работы - сравнительное изучение комплекса современных

методов прижизненной и послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого

скота и определение критериев оценки качества и безопасности продуктов убоя

на разных стадиях лейкозогенеза (болезни).

Задачи исследования:

1. Изучить ретроспективные данные по распространению лейкоза

крупного рогатого скота в некоторых областях РФ и их корреляцию с

послеубойным выявлением болезни;

2. Провести сравнительный анализ информативности клинического,

серологического (РИД), гематологического, молекулярно-биологического

(ПЦР) и морфологического (электронная микроскопия) методов исследования

для прижизненной диагностики лейкоза;

3. Изучить органолептические, физико-химические, гистологические

показатели мышечной ткани и внутренних органов при различных стадиях

лейкоза;

4. Установить возможность контаминации продуктов убоя крупного

рогатого скота вирусом лейкоза и сопутствующими микроорганизмами;

5. Определить пищевую и биологическую ценность мяса больного

лейкозом скота;

6. Предложить и научно обосновать критерии ветеринарно-санитарной

оценки продуктов убоя крупного рогатого скота при лейкозе.

Научная новизна работы

Впервые для прижизненной и послеубойной диагностики лейкоза

использован комплекс современных диагностических методов исследования,

включающий в себя серологические, гематологические, вирусологические,

6

морфологические (электронная микроскопия) и молекулярно-биологические

(ПЦР) методы исследования.

Определена возможность использования морфофункциональных

особенностей лимфоцитов крови в качестве констант предубойной оценки

продуктов убоя больных лейкозом животных.

Изучены эпизоотические особенности распространения лейкоза крупного

рогатого скота в некоторых областях Российской Федерации за период 1994-

2009 гг. Установлено отсутствие прямой корреляции стадий лейкозного

процесса и послеубойного выявления болезни на мясоперерабатывающих

предприятиях.

Представлены новые данные ветеринарно-санитарной оценки качества и

безопасности продуктов убоя крупного рогатого скота на разных стадиях

лейкозогенеза.

Впервые доказана возможность контаминации продуктов убоя животных

провирусной ДНК ВЛКРС и его длительная сохранность в мясном сырье.

Уточнена пищевая и биологическая ценность мяса при лейкозе.

Практическая значимость

На основании проведенных исследований усовершенствованы и научно-

обоснованы данные по ветеринарно-санитраной экспертизе мяса и других

продуктов убоя животных, больных лейкозом. Рекомендованы критерии

определения санитарной, пищевой и биологической ценности мяса крупного

рогатого скота при различных формах и стадиях лейкоза. Полученные данные

имеют теоретическое и практическое значение, способствуют

совершенствованию диагностики лейкоза, получению экологически чистой

продукции и предотвращению распространения этиологического агента данной

болезни. Основные результаты проведенных исследований вошли в учебное

пособие: «Лейкоз крупного рогатого скота (диагностика, ветеринарно-

санитарная экспертиза, профилактика и оздоровительные мероприятия)», М.

2005г., утвержденное УМО ВУЗов; действующие рекомендации

7

«Противоэпизоотические мероприятия при лейкозе крупного рогатого скота в

фермерских и личных подсобных хозяйствах граждан», М. 2007 г., утверждены

на заседании секции «Инфекционная патология животных» отделения

ветеринарии РАСХН 15.03.06 г. Москва; учебное пособие «Ветеринарно-

санитарная экспертиза продуктов убоя сельскохозяйственных животных при

лейкозе» утв. УМО вузов РФ по образованию в области ветеринарии и

зоотехнии 11.10.2010 №63-138.

Материалы и иллюстрации, представленные в диссертации, используются

в учебном процессе по курсу ветеринарно-санитарной экспертизы в ФГОУ

ВПО МГАВМ и Б им. К. И. Скрябина для студентов факультета ветеринарной

медицины и слушателей факультета повышения квалификации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Результаты ретроспективного анализа эпизоотологической ситуации и

послеубойного выявления лейкоза крупного рогатого скота в некоторых

регионах РФ;

2. Использование современных методов исследования и значимость

полученных результатов в оценке доброкачественности, биологической

ценности и безопасности продуктов убоя животных на разных стадиях

лейкозного процесса;

3. Предложения по ветеринарно-санитарной экспертизе и реализации

мяса, продуктов убоя, полученных от крупного рогатого скота на разных

стадиях лейкозогенеза.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на

международных конференциях:

- 4-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные

проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля

сельскохозяйственной продукции», М. 2002 г.;

8

- 1-ой Международной межвузовской, научно-практической конференции

аспирантов и соискателей «Предпосылки и эксперимент» в «Науке»,

посвященной 300-летию Санкт-Петербурга, С-Петербург, 2003 г.;

- 4-ой Международной учебно-методической и научно-практической

конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им. К.И Скрябина, М. 2006

г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в т.ч. 2 в

рецензируемых ВАК журналах, 2 учебных пособия, 1 рекомендация.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 135 страницах компьютерного текста, состоит

из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования,

результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования,

выводов, практических предложений. Работа содержит 24 рисунка, 19 таблиц.

Библиографический список включает 171 источник, из которых 56

иностранных.

9

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Определение и классификация лейкоза крупного рогатого скота

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое неопластическое

заболевание вирусной этиологии, характеризующееся нарушением механизмов

пролиферации лимфоидных клеток с появлением новообразований в различных

кроветворных органах и тканях. Болезнь поражает, в основном, взрослый

крупный рогатый скот и начинается в большинстве случаев с лимфоцитоза.

Лимфоцитоз может длиться в течение многих лет и достигать довольно высоких

показателей. В 60-е годы шел активный поиск этиологического агента лейкоза

крупного рогатого скота, и некоторым ученым удалось выявить вирусные

частицы в молоке и тканях больных лейкозом коров (Theilen G., 1961, Dutcher

R., 1964). Наиболее убедительные результаты с помощью электронной

микроскопии получили Miller J. et al. (1969); Olson C. et al., (1973); Calafat J.,

Hilkeus J., (1978); Brocke A. et al., (1990), которые обнаружили в культурах

лимфоцитов крови от больного лимфосаркомой крупного рогатого скота

большое количество вирусных частиц типа С и описали их морфологию и

морфогенез. В дальнейшем исследования по обнаружению вируса лейкоза и

определению его этиологической роли проводились многими отечественными и

зарубежными учеными (Бурба Л.Г., 1976; Кукайн Р.А. и соавторы, 1973, 1982;

Валихов А.Ф. и соавторы, 1980; Шишков В.П., Меньшикова З.Н., 1989; Van den

Maaten M. et al., 1974; Drisсooll D. et al.,1977; Mussgay M. et al., 1987; Balognesi

D., 1987)

Была доказана взаимосвязь между лейкозом и наличием в краткосрочных

культурах лимфоцитов крови больных коров вируса типа С. Таким образом,

был идентифицирован этиологический агент лейкоза.

Однако следует отметить, что даже при высокой инфицированности

стада, только у трети животных выявляют гематологические изменения, и у 5%

возникает опухолевая форма болезни. Позднее были получены подтверждения

тому, что вирус лейкоза является необходимым, но недостаточным условием в

процессе индукции опухоли (Ferrer J., et al., 1980). Для развития болезни

10

требуется ряд дополнительных эндогенных и экзогенных факторов:

наследственная предрасположенность животного, снижение иммунной защиты

организма, активное действие техногенных и антропогенных факторов (Lilly

F., 1980; Von Melchner H. et al., 1983; Burny A. et al., 1984, 1986, 1988; Гулюкин

М.И. и соавторы, 2004; Петров Н.И. и соавторы, 2004, 2005; Донник И.М. и

соавторы, 2004; Донченко А.С., 2004.).

Большой вклад в изучение лейкозов крупного рогатого скота внесли

отечественные ученые, которые проводили и проводят фундаментальные

исследования: по клинико-гематологической и патоморфологической

диагностике (Симонян Г.А., 1964-2006 гг.; Костромитинов Н.М., 1979;

Кудрявцева Т.П., 1969; Смиронова В.В., 2002 г.), биохимическим,

патогенетическим и эпизоотологическим аспектам гемобластозов (Коромыслов

Г.Ф., 1978; Бусол В.А., 1982; Карликов Д.В., 1983; Аарт Х.К. и соавторы, 1988;

Нахмансон В.М., 1994, 2006; Кузнецов А.П. и соавторы, 2000; Мандыгра Н.С.,

2000; Гаврилов Г.А. и соавторы, 2004).

Лейкоз крупного рогатого скота (leucosis bovis) - общепринятое

название для прогрессирующей пролиферации (размножение делением)

гемопоэтических клеток.

В литературе лейкоз крупного рогатого скота разделяется в зависимости

от происхождения, дифференцирования и функциональной роли клеток,

которые участвуют в злокачественном процессе, а также от клинических и

патоморфологических изменений у больных животных и эпизоотологической

ситуации.

Учитывая этиологические, морфологические и эпизоотологические

факторы большинство авторов (Dungworth A. et al., 1964; Bendixen N., 1965;

Anderson C. и Jarrett F., 1968; Ferrer J. et al., 1980; Смирнова В.В., 2002;

Гулюкин М.И. и соавторы, 2002, 2005; и др.) считают целесообразным

разделить лейкоз КРС на две основные группы:

1. Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота (leucosis enzootica

bovis);

11

2. Спорадический лейкоз крупного рогатого скота (leucosis sporadica

bovis).

Энзоотический лейкоз выявляется в большом проценте у взрослого

крупного рогатого скота.

Спорадические лейкозы - неизвестной этиологии; выявляются редко и в

основном у молодняка (Ohshima K. et al., 1980; Straub O., 1984). Ogawa Y. et

al. (1986); Сюрин В.Н. и соавторы (1998) различают три вида спорадического

лейкоза, а именно: телячий (juvenilis); тимусный (thymus) (Mammerickx M. et

al., 1981); кожный (cutaneus) (Mussgay M., 1980).

Определение лейкозов как злокачественных болезней, поражающих

кроветворные органы и проявляющихся опухолевым ростом, отвечает

современным понятиям классификации опухолей, по которой лейкозы и

другие опухолевые болезни кроветворной и лимфоидной ткани объединены в

одно понятие – гемобластозы, которые включают две группы болезней:

первая – лейкозы (лимфоидный лейкоз, миелолейкоз,

недифференцированный лейкоз) – характеризуется системным поражением

органов кроветворения с вовлечением в процесс костного мозга, селезенки,

лимфоузлов;

вторая – гематосаркомы (лимфосаркома, плазмоцитома,

лимфогранулематоз) – характеризуется образованием очаговых опухолевых

разрастаний, исходящих из клеток кроветворной ткани, нередко без изменений

в периферической крови (Шишков В.П., Бурба Л.Г., 1986; Кунаков А.А., 1988;

Сноз Г.А., 1997; Симонян Г.А., 1995).

В Правилах по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого

скота под термином «лейкозы» объединены обе группы опухолевых болезней

как имеющих генетическое родство.

Накопленный огромный материал по изучению опухолей и лейкозов дает

основание говорить о том, что почти все известные у человека неоплазии

встречаются и у животных.

12

Предположение о вирусе как причине лейкозных заболеваний было

впервые высказано французским вирусологом A. Borrel в 1903 году. В

настоящее время в лабораториях разных стран получено более 160 –ДНК и

РНК – содержащих онкогенных вирусов, общим свойством которых является

способность трансформировать нормальные клетки в опухолевые. (Bolognesi

D., 1976; Deschamps J. et al., 1983; Ristau E., Wittmann W., 1985)

1.2. Этиология лейкоза крупного рогатого скота

1.2.1. Классификация, морфология и антигенная структура вируса

лейкоза крупного рогатого скота

Вирус лейкоза КРС вызывает энзоотическую форму лимфоидного

лейкоза или лимфосаркомы и персистирующий лимфоцитоз. Последний

представляет собой доброкачественную лимфоидную пролиферацию, которая

может смениться моноклональной лимфосаркомой (Gallo R., Woug- -Staal

Flossie, 1982; Marbaix G. et al., 1982; Куделева Г.В., 1991)

Согласно современной классификации вирус лейкоза КРС - ВЛКРС

(синонимы: бычий лейкозный вирус - BLV; онкорнавирус, РНК - содержащий

вирус), принадлежит к семейству Retroviridae (от лат. retro-обратный). По

данным Международного комитета по таксономии вирусов (2000), семейство

разделено на 7 родов. Наиболее распространенными среди домашних

животных являются представители 2 родов: род Deltaretrovirus, объединяющий

вирус лейкоза КРС и Т-лимфотропные вирусы человека типа 1 и 2 и вирус

лейкоза обезьян, а также род лентивирусов (от лат. Lenti – медленный),

состоящий из 5 подродов: вирус иммунодефицитов приматов, лентивирусы

овец и коз, лентивирусы лошадей, лентивирусы кошек, лентивирусы крупного

рогатого скота. Перечисленным выше ретровирусным инфекциям свойственен

ряд общих существенных признаков: длительность инкубационного периода,

хроническое или латентное течение, пожизненная персистенция вируса и

строго ограниченный круг восприимчивых животных (Kaaden O. et al., 1977;

Burny A. et al., 1984, 1987; Mamoun R. et al., 1983)

13

Основным биохимическим признаком всех представителей семейства

Retroviridae является наличие обратной транскриптазы (Mussgay M. et al., 1977).

Вирус лейкоза КРС поражает В-лимфоциты (Орлянкин Б.Г. и соавторы,

2000; Beyer J. et al., 2002; Rhodes J., et al., 2003). ДНК-копия ВЛКРС (провирус)

способна встраиваться в геном клетки–хозяина и длительное время

персистировать в организме, а также передаваться другому индивидууму.

Считается, что жизненный цикл у ретровирусов одинаков: вирус проникает в

клетку путем эндоцитоза, РНК освобождается и транскрибирует в

двухцепочную копию ДНК, которая встраивается как провирус в ДНК клетки

хозяина (Baliga V., Ferrer J., 1977; Kettmann R. et al, 1980). Интеграция

необходима для репликации и размножения вируса. Она происходит путем

сборки новых вирионов, которые отпочковываются от клеточной мембраны

лимфоцита для инфицирования новых клеток (Calafat J., Ressang A., 1978; Gupta

P., Ferrer J., 1980; Валихов А.Ф. и соавторы, 1979; Меньшикова З.Н., Махмуд

А.С., 1979; Шишков В.П. и соавторы; 1989). На ранних стадиях инфицирования

ВЛКРС не вызывает каких-либо изменений в организме, в том числе и

выработки антител в количествах, достаточных для определения

серологическими методами. Провирусную ДНК в лимфоцитах можно выявить

лишь с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Прохватилова Л.Б.,

Джапаралиев Н.Г. и соавторы, 2001; Kelly E. et al 1999).

Зрелый вирус ВЛКРС имеет сферическую форму и относится к

оболочечным вирусам, он состоит из центрального нуклеоида, диаметр

которого варьирует от 40 до 90 нм. Центральная часть нуклеоида отделена от

внешней вирусной оболочки промежуточным слоем. Внешняя вирусная

оболочка представлена двухконтурной мембраной, отличающейся

лабильностью. (Miller J., Olson C., 1969; Calafat J. et al., 1974; Ressang A., 1976;

Валихов А.Я., 1980; Меньшикова З.Н., 1999, 2007).

Антигенная структура. Электрофорез очищенных вирионов ВЛКРС в

SDS – ПААГ и гельфильтрация в присутствии гидрохлорида гуанидина

показывают в составе вирионов 4 главных негликолизированных белка (p24,

14

p15, p12, p10) и 2 гликолизированных белка (gp51и gp30) (Ferrer J., 1972; Miller

J., Olson С, 1977).

Из двух гликопротеидных белков важное значение имеет gp51,

расположенный на поверхности вириона и ответственный за инфекционность и

активность гемагглютининов. Обнаружение специфических противовирусных

антител было положено в основу предложенных серологических методов

диагностики (Van der Maaten M., 1972; Burny A. et al., 1984). Кроме того

установлена общая антигенная детерминанта в главном внутреннем белке

ВЛКРС и вирусе лейкоза саркомы птиц, вирусах типа С млекопитающих

(мышей, хомяков, обезьян) и вирусе типа D (вирус обезьян Мейзон-Пфайзера)

(Bruck C. Rensonnet N. et al., 1984; Burny A., Bruck C. et al., 1980). Между р24

вируса лейкоза крупного рогатого скота и р24 вируса Т – клеточного лейкоза

человека имеется статистически достоверная гомология (Sagata N. et al., 1985).

ВЛКРС обладает тропизмом к лимфоидным клеткам и размножается в

них, т.е. является лимфотропным клеточно-ассоциированным вирусом. Местом

локализации ВЛКРС является В – лимфоциты крови и кроветворных органов,

но в свежевыделенных клетках крови он не обнаруживается (Stock N., Ferrer J.

1972; Donald H. et al., 1976; Ogawa H., 1983). Многолетние исследования не

подтвердили возможность инфицирования человека вирусом лейкоза крупного

рогатого скота (Ressang A., 1977; Федорченко А.Н. и соавторы, 1988). Большое

общебиологическое значение имели доказательства того, что ВЛКРС может

преодолевать межвидовые барьеры и поражать клетки различных животных in

vitro, а также вызывать развитие лейкоза у животных в результате

скармливания им молока от коров индицированных ВЛКРС.

1.2.2. Устойчивость вируса лейкоза крупного рогатого скота

Устойчивость ВЛКРС во внешней среде невысока.

Он чувствителен к температурным воздействиям, обработка при 56°С в

течение 15 минут приводит к его разрушению. Актуальным является вопрос

выживаемости вируса лейкоза в молоке, которое используется для питания

15

людей и кормления молодняка животных. Вирус лейкоза крупного рогатого

скота обнаруживается в молоке в течение 72 часов при 11°С, а при 9°С и 14°С –

соответственно, через 48 и 24 часа (Гулюкин М.И., 1993). Полная инактивация

вируса в молоке или вируссодержащей жидкости происходит при температуре

70-74°С за 17 секунд. Прямой солнечный свет инактивирует ВЛКРС в течение 4

часов, ультрафиолетовые лучи за 30 мин. Повторное замораживание и

оттаивание разрушает вирус и устраняет инфекционность. Воздействие

лазерного луча в течение 30 минут не оказывает вирусостатического и

вироцидного действия на ВЛКРС в крови больных животных (Андриян Е.А. и

др., 1993). В жидком азоте инфекционность вируса сохраняется несколько лет.

Вирус полностью теряет активность в растворах натриевого щелока (0,5%),

этанола – 2%, формальдегида и фенола – 0,5% и др. дезинфицирующих средств

в общепринятых концентрациях. Наиболее простым и экономичным методом

обезвреживания является кипячение, надежно разрушающее ВЛКРС. Имеются

данные о том, что термическая обработка молока от больных лимфолейкозом

коров в течение 5 минут при 70ºС приводит к инактивации ВЛКРС (Москалик

Р.С., 2003; Апалькин В.А., Гулюкин М.Н., Петров Н.И., 2005).

1.2.3. Патогенные свойства ВЛКРС

Вирус лейкоза является экзогенным ретровирусом, который у КРС после

длительного латентного периода может вызвать опухоли из В-лимфоцитов.

Инкубационный период при лейкозе длится относительно долго.

Инкубационным периодом раньше считали период времени от первого

контакта животного с онкорнавирусом до выявления персистентного

лимфоцитоза, а после применения серологических методов, период времени до

появления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.

Кроме результатов успешной передачи вируса энзоотического лейкоза

телятам, исследована возможность передачи лейкоза КРС и другим животным:

овцам, козам, буйволам, свиньям, кроликам, шимпанзе, кошкам и другим

животным и птицам. Результаты испытаний показывают, что

16

экспериментальная инфекция вирусом лейкоза крупного рогатого скота, с

неопластическими (опухолевыми) изменениями, происходит не только у телят,

но и у овец, редко у буйволов и коз (Wittmann W. et al., 1969; Mammerickx M. et

al., 1980; Olson C. et al., 1972; Straub O. et al., 1984). Onuma M. et al. (1977)

вызвали инфекцию плода у овцы экспериментально инфицированной вирусом

энзоотическим лейкозом КРС. Бузераиб Абдель Крим и соавторы (1986)

заразили новорожденных ягнят лимфоцитами крови, инфицированных вирусом

лейкоза крупного рогатого скота, которые обрабатывали

фитогемагглутинином (РНА) в культуре, или вирусом лейкоза изолированным

из длительноживущей культуры клеток. Более 50% овец погибли от лейкоза,

что подтверждено гистологически. Цитогенетические (хромосомные)

исследования показали, что образовавшиеся опухоли не являются результатом

прогрессирующего размножения трансплатированных неопластичных

лимфоцитов, а происходят из лимфоидных клеток животного реципиента,

подвергшихся опухолевой трансформации (Мутузкин Л.И., Марченко Г.И.,

1986; Bishop J., Michael I., 1982; Robertson M., 1983).

Экспериментальная инфекция шимпанзе, свиней, кроликов и кошек

характеризуется появлением антител к вирусу лейкоза крупного рогатого

скота, но развитием патологических изменений специфичных для лейкоза

(Ressang A. et al., 1976; Van der Maaten, Miller J., Ferrer J., 1980). У

экспериментальных животных инкубационный период может длиться по

разному, от 2,6,12,24,44,60 или более месяцев (Straub O., 1978, 1980;

Rosenberger С., 1978; Шишков В.П. и соавторы, 1985; Крикун В.А., 1999).

Животных, у которых в сыворотке крови обнаружили антитела против

ВЛКРС, считаются зараженными.

Различают три этапа болезни:

Первый этап, образуются антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого

скота, которые можно легко обнаружить серологическими методами, а

показатели крови при этом остаются нормальными.

17

На втором этапе, у животных появляется персистентный лимфоцитоз

(у 30%), а очень редко, в племенных хозяйствах устанавливают 90%

животных инфицированных вирусом лейкоза. На этом этапе около 30%

циркулирующих в кровяном русле лимфоцитов содержит провирус.

На третьем этапе, когда болезнь уже прогрессирует, развиваются

опухоли. Появление опухоли можно ожидать и у животных инфицированных

вирусом лейкоза крупного рогатого скота до рождения. Онкорнавирусы в

качестве лейкозогенного фактора, одновременно поражают большое

количество восприимчивых клеток (лимфоцитов), которые трансформируются в

злокачественные.

При изучении органов и тканей, как места для размножения вируса

энзоотического лейкоза, Van der Maaten и Miller J. (1978), доказали, что

селезенка играет большую роль на ранней стадии размножения вируса у телят,

после внутрикожной инокуляции инфицированных лимфоцитов.

У лимфоцитов крови при световой микроскопии не выявлено

морфологических особенностей, а установлены биохимические и

функциональные изменения.

Большое количество исследователей установило присутствие ингибиторов

ВЛКРС в выделениях (секретах и экскретах) животных. Roberts D. et al (1982)

обнаружили, что в свежей сперме быка находится ингибирующий фактор,

который препятствует заражению коров вирусом энзоотического лейкоза скота.

Gupta P. и Ferrer J. (1982), Tsukiyama K., (1985) доказали, что в плазме

крови КРС, инфицированного вирусом лейкоза находится растворимый фактор,

который препятствует размножению вируса в организме животных. Этим

блокирующим фактором является протеин молекулярной массы 150 000. Поэтому

размножение ВЛКРС обнаруживают только in vitro при культивировании

инфицированных лимфоцитов (Baliga V., Ferrer J., 1977; Alencar Filho R. et al.,

1982; Меньшикова З.Н., 1999).

Гибель животных, заболевших энзоотическим или спорадическим

лейкозом, наступает чаще всего, когда опухоль достигает определенной стадии

18

развития, также из-за поражения селезенки, анемии и других патологических

изменений. Средняя продолжительность болезни 6-7 лет, а это соответствует 4

или 5 отелам. Лейкозные животные, как правило, исключаются из воспроизводства

стада раньше, в связи с уменьшением производства молока, способности

приносить приплод и других выраженных клинических нарушений.

1.3. Распространение болезни и экономический ущерб

Лейкоз крупного рогатого скота и других животных распространен

почти, что во всех странах мира. Об этом говорят многие литературные

данные, основанные на диагностических исследованиях и анализах сведений

об убитых и павших животных. В последние 25 лет лейкоз крупного рогатого

скота имеет тенденцию прогрессирующего распространения. Данное явление

можно объяснить усовершенствованием методов диагностики болезни, а

также изменением способа разведения крупного рогатого скота. То есть,

обнаружено, что лейкоз чаще всего проявляется у высокопродуктивного

крупного рогатого скота, в больших и малых племенных и промышленных

хозяйствах (Гулюкин М.И. и соавторы, 2005; Донченко А.С., Логинов С.И.,

2007).

Анализ результатов исследования распространения лейкоза у скота в

мире и России показывает, что болезнь выявляется в большом проценте, на

различных континентах и в различных климато-географических зонах. (Gupta

P., Ferrar J., 1980; Москалик Р.С., 2004).

При этом многие исследователи как в РФ, так и в других странах мира

(Кумков В.Т., 1989; Кузнецов А.П., 1993; Хисамутдинов Ф.Ф., Никитин И.Н.,

1996; Горальский Л.П., 2000; Бобров Н.А., 2001; Oztiz R. et al. 1984; Rhodes J

et al. 2003) указывают на большой экономический ущерб от этой болезни.

В Германии первые сообщения о лейкозе появились еще в конце 19

века. Болезнь распространялась, и в отдельных племенных хозяйствах, к 70-м

годам насчитывалось до 30% крупного рогатого скота, пораженного

лейкозом.

19

В Швеции, первые случаи лейкоза обнаружены в 1915 году (Olson С.,

1961). С 1980 г. число больных лейкозом уменьшается и на 100 000 голов

коров в год, было 35-40 случаев лейкоза (Burny А. et al., 1980).

В Дании, в 1959 году лейкозом на 100.000 крупного рогатого скота

заболевало 15 голов. В период организованной борьбы против лейкоза (1970 –

1980 гг.) число больных животных уменьшилось на 100.000 голов до 2,9 и

проявлялась тенденция дальнейшего снижения (Bendixen N. et al., 1972). В

настоящее время основное поголовье крупного рогатого скота Дании

оздоровлено от лейкоза.

Во Франции энзоотический лейкоз появился на северо-западе и северо-

востоке и имеет тенденцию к распространению.

В Голландии первые данные (1937, 1962 гг.) указывают на то, что лейкоз

присутствовал в небольшом проценте. Позже со скотобоен были получены

сведения увеличения количества лейкоза. Болезнь подтверждена была в 48

областях страны.

В Бельгии единичные случаи лейкоза установлены в 1955 г. Позднее

Mammerickx М. (1974) установил, что 25% животных больны лейкозом или

подозрительны в заболевании.

В Чехословакии в 1962 г. найдены отдельные случаи лейкоза. В 1985 г .

на территории всей Чехословакии AG1D пробой установлено, что вирусом

энзоотического лейкоза заражено не более 2% (от 0,0 - 9,2%).

В Болгарии, первый случай лейкоза у импортных быков описан в 1930

г. В 1965 году Львов В. обнаружил большое количество больного лейкозом

КРС красно-датской породы, ввезенного из Дании и других стран, а также и из

Югославии.

В США первые случаи лейкоза описали в конце 19 века (1897, 1899 гг.)

С применением серологических методов исследования инфекция вирусом

энзоотического лейкоза у КРС обнаружена у около 60% племенного приплода,

и у более 25% коров (Ferrer J., 1980).

20

В СССР официальная статистика по лейкозу ведется с 1965 года. По

отчетным данным Департамента ветеринарии МСХ РФ в 1990 году пунктов,

неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота было 1471, в 1998 –

2622, в 2001 – 2803, в 2002 – 2899, что составляло 53% учтенных случаев

инфекционной патологии крупного рогатого скота. В 2004 году доля лейкоза в

структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота возросла до

57,4%. Такая динамика показателей на фоне значительного сниженья

поголовья крупного рогатого скота свидетельствует о широкой

распространенности болезни на территориях субъектов РФ (Шишкин А.В.,

2006). Обобщая литературные данные, можно сказать, что лейкоз

распространен во всем мире, но есть страны, в которых инцидентность

болезни особенно велика. Так, в Венесуэле – 49%, в Японии – 44%, на

Филиппинах и Мексике – 32% хозяйств, пораженных лейкозом (Onuma M. et

al., 1979; Yoshikawa et al., Romero С. et al., 1981; Меграбян Д.С. и соавторы,

2006).

При изучении причин распространения лейкоза крупного рогатого скота

установлено, что возникновение и распространение болезни в благополучных

по лейкозу хозяйствах связано, в основном, с завозом в них инфицированных

ВЛКРС животных. Животные, у которых в сыворотке крови обнаруживаются

антитела против ВЛКРС, считаются зараженными и по Правилам организации

мер борьбы с лейкозом с/х животных подлежат «выводу» из стад и убою на

мясо. Массовое невыполнение ветеринарными и другими специалистами

мероприятий по борьбе с лейкозом ведет к увеличению хозяйств

неблагополучных по лейкозу (Смирнов Ю.Н., 2005; Гулюкин М.И. и соавторы,

2005).

Экономический ущерб от лейкоза в РФ большой и социально значимый.

Он является результатом относительно высокой заболеваемости и смертности

племенного КРС, устранения из племенных хозяйств клинически больных

животных, снижения производства молока, мяса и получения телят, а также

21

высоких расходов на проведение ветеринарно-санитарных и других

мероприятий.

1.4 Эпизоотологические особенности

ВЛКРС, в отличие от других ретровирусов, имеющих строгую видовую

специфичность, может передаваться различным видам животных.

Естественным хозяином ВЛКРС является крупный рогатый скот.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота способен выделяться во

внешнюю среду с кровью и другими биологическими жидкостями (молоко,

молозиво, сперма, носовые истечения, слюна и т.п.), контаминированными

инфицированными лимфоцитами, которые в свою очередь играют роль

основного фактора инфекции лейкоза (Валихов А.Ф., 1980; Гулюкин М.И.,

2002; Шишкин А.В., 2006; Coulston J. et al., 1991).

Источником инфекции являются зараженные животные на всех стадиях

развития инфекционного процесса (Нахмансон В.М., 1984; Петров Н.И., 1999).

Инфекционный процесс при лейкозе крупного рогатого скота характеризуется

стадийностью. Различают 3 стадии или периода болезни: бессимптомную

(вирусоносительство), гематологическую и опухолевую. Болезнь протекает

вначале бессимптомно, без клинических признаков, а затем проявляется

лимфоцитозом и образованием опухолевых разрастаний в кроветворных,

лимфоидных органах и тканях. Нахмансон В.М. и соавторы (2005) определяют

4 стадии инфекционного процесса, предлагая первым этапом считать

инкубационный период.

Существует 2 пути передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота; от

матери к плоду (неонатальный, внутриутробный, вертикальный) и от одного

животного к другому (постнатальный, горизонтальный). Первый вариант в

эпизоотическом процессе менее распространен и выявляется только у 6 – 11 %

телят, родившихся от инфицированных коров. (Van der Maaten et al., 1981;

Miller J., 1985; Коромыслов Г.Ф., Бурба Л.Г., Нахмансон В.М., 1993).

22

Второй путь считается основным. Инфекция распространяется при

совместном содержании животных, давших положительные и отрицательные

показатели в реакции иммунодиффузии (РИД), при проведении отелов

здоровых и инфицированных коров в одном помещении, нарушении правил

асептики при выполнении ветеринарных и зоотехнических мероприятий

(прививки, туберкулинизация, взятие крови, мечение животных выщипами на

ушах, обрезка рогов и копытец, кастрация, фиксация животных за носовую

перегородку, хирургические операции и др). Заражение происходит, как

правило, при попадании живых лимфоцитов крови в кровяное русло или на

слизистые оболочки здорового животного (Ferrer J. et al., 1987). Для заражения

достаточно ввести парентерально 2500 лимфоцитов (0,0005 мл) крови коровы с

ВЛКРС-инфекцией (Van der Maaten et al., 1981; Mammericks M. et al., 1981,

Evermann J. et al., 1986; Крикун В.А., 1999).

Вирус лейкоза не обладает контагиозностью, в передаче от одного

животного другому превалирует антропогенный (человеческий) фактор. Не

исключается роль в передаче ВЛКРС кровососущих насекомых, а также

молозива и молока (Ohsima K. et al., 1981; Ferrer J. et al., 1981; Kono Y. et al.,

1983; Смирнов Ю.П., 1999; Гулюкин М.И., 2001).

Неповрежденная кожа сосков вымени непроницаема для вируса лейкоза,

но самые незначительные ее повреждения дают возможность ВЛКРС

проникнуть в кровь. Фактором передачи при этом может стать доильный

аппарат. (Андриян Е.А., 1993). Установлено, что риск передачи вируса

значительно возрастает при поражении вымени маститом (Гулюкин М.И.,

1993). Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что основным путем

передачи ВЛКРС является горизонтальный, которым заражено 20-30%

животных от общего поголовья (Romero C. et al., 1982; Москалик Р.С., 2003;

Смирнов П.Н., 2007)

Абсолютной устойчивости крупного рогатого скота к ВЛКРС не

существует. Это относится как к породам, семействам, так и к отдельным

животным (Симонян Г.А., 1993). Однако считается, что в наибольшей степени

23

поражается скот черно-пестрой и красно-степной пород (20-85% взрослого

поголовья) и в меньшей – скот швидской, сычевской и айширской пород – 1,2-

30,9% (Нахмансон В.М., 1995).

1.5. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота

Важным условием успеха в системе мер профилактики и борьбы с

лейкозом крупного рогатого скота является своевременная, достоверная

диагностика и изоляция больных и инфицированных животных, т.е. сдача их на

убой и определение возможности использования мясопродуктов на пищевые и

биотехнологические цели.

У крупного рогатого скота проводится прижизненная, предубойная и

послеубойная диагностика на лейкоз. Диагноз устанавливают на основании

эпизоотологических данных, клинических проявлений, результатов

лабораторных исследований, которые включают серологические,

гематологические, молекулярно-биологические и гистологические методы с

учетом патологоанатомических изменений, характерных для данной болезни.

1.5.1.Прижизненная диагностика

Серологические методы исследования

Основу прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота в

настоящее время составляют серологические методы исследования.

У животных, зараженных ВЛКРС, вырабатываются антитела к вирусным

антигенам, которые выявляются с помощью серологических реакций и в

первую очередь в реакции иммунодиффузии в агаровом геле-РИД (Ferrer J. Et

al., 1972; Miller J. Et al., 1972). Характерной особенностью инфекции вируса

лейкоза у крупного рогатого скота является образование специфических

антител, которые выявляются в крови через 2-8 недель после заражения

животных, и пожизненно сохраняются в организме инфицированных особей

(Levy D. Et al., 1976; House C., Isida T., 1994; Koyama H. Et al., 1981; Салимов

Х.С., 1986; Бехметьева С.В., 2006).

24

Диагностическое значение имеют антитела против внутреннего (р 24) и

оболочечного (gp 51) антигенов ВЛКРС. (Portetelle D. Et al., 1986). Многие

авторы указывают на взаимосвязь между персистенцией антител р 24,

выявляемых в реакции иммунодиффузии и клиническими проявлениями

болезни (Mamerickx M. Et al., 1980; Kono Y. Et al., 1981). Использование

антигена gp 51 ВЛКРС значительно повысило чувствительность метода и

облегчило непрямое выявление онкорнавирусной инфекции у коров (Miller J. Et

al., 1977; Burny A. Et al., 1980). РИД с антигеном gp 51 ВЛКРС, наиболее

чувствительный, сравнительно нетрудоёмкий метод, который не требует

специального оборудования и может быть использован в любой лаборатории

(Beier D., et al., 1985; Wittman W. Et al., 1979; Бурба Л.Г. 1985 и др.; Иванова

Л.А., 1997).

Пробы крови для исследований в реакции иммунодиффузии в агаровом

геле отбирают из яремной вены не ранее, чем через 30 суток после введения

животным вакцин и аллергенов, у стельных коров за 30 суток до и 4 суток после

отела.

В нашей стране при постановке РИД используют набор для

серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ-10-19-442-

87). К набору прилагается наставление по его применению (ГОСТ 25-382-82,

«Крупный рогатый скот. Методы диагностики лейкоза»).

С 1972 года по настоящее время разработано большое количество

иммунологических методов выявления антител к ВЛКРС: реакции

иммунофлуоресценции, радиоиммунопреципитации (РИП), связывания

комплемента (РСК, РДСК), энзиммеченных антител на иммуносоребенте

(ELISA), метод иммуноферментного анализа (ИФА) и т.д.

Серологическими методами антитела к ВЛКРС можно выявить у

животных только старше 6 месяцев, так как телята, выпаиваемые молоком и

молозивом инфицированных ВЛКРС матерей имеют пассивно приобретенные

материнские антитела, которые персистируют до шестимесячного возраста.

25

Серологические методы эффективны для оценки распространения ВЛКРС

среди поголовья при массовых исследованиях, хотя не всегда способны

определить заражение в случае тестирования отдельных животных. При

проведении повторных диагностических исследований выявляются новые

инфицированные животные, которые не были установлены ранее. В редких

случаях положительные результаты могут быть у вакцинированных и стельных

коров. (Смирнов Ю.П., 1999; Мурватуллоев С.А., 1998; Burridge M. Et al., 1982)

Однако все исследователи отмечают высокую специфичность и

чувствительность реакции иммунодиффузии в агаровой геле (РИД), не

уступающие ИФА и другим более трудоемким и дорогим методам исследования

(Koyama H., 1981; Wittman W. Et al., 1983; Прохватилова Л.Б. и соавторы, 1998;

Иванова Л.А., Гулюкин М.И., 1999, 2000)

В настоящее время РИД является основным методом исследования

крупного рогатого скота на лейкоз в РФ. Положительные результаты

оздоровления стад крупного рогатого скота от лейкоза на основе РИД получены

во многих областях и регионах нашей страны.

Гематологический метод

Самым известным и самым лучшим методом для раннего выявления

лейкоза у крупного рогатого скота в 80-е годы была гематологическая

диагностика. В первое время она основывалась на обнаружении повышенного

количества лейкоцитов в периферической крови. Позднее, кроме общего

количества лейкоцитов, стали определять и абсолютное количество лимфоцитов.

То есть, многолетними гематологическими исследованиями установлено, что

лимфоидный лейкоз, который чаще всего встречается у крупного рогатого скота,

сопровождается персистентным лимфоцитозом. В периферической крови

лейкозных животных находятся и не зрелые лимфоидные клетки, которые в

зависимости от морфологических признаков, определяют форму и вид лейкоза.

Румянцев Н.В. (1967) Меньшикова З.Н. (1999) указывали, что на основании

цитоморфологических (количественных) и ультраструктурных исследований

периферической крови, при выявлении несозревших и атипичных клеток крови,

26

возможно, рано обнаружить болезнь и определить форму и вид лейкоза. По

мнению тех же авторов, не созревшие и атипичные, т.е. опухолевые клетки в

периферической крови появляются до увеличения общего количества лейкоцитов,

на стадии онкорнавирусной инфекции (Шишков В.П., Меньшикова З.Н., 1989,

1999).

Результаты анализа крови больных животных меняются в зависимости от

формы и стадии развития лейкоза и от интенсивности лейкозных изменений.

Гематологические изменения у лейкозного скота, как правило, не

развиваются параллельно с развитием лейкозного процесса, То есть, у 30%

лейкозного крупного рогатого скота наступает выраженный лейкоцитоз, а у

остальных животных лейкопения или количество лейкоцитов остается в

пределах нормы. В дальнейшем течение болезни, особенно последняя стадия

лейкозного процесса, сопровождаются выраженным лейкоцитозом - в мазке

периферической крови можно встретить до 90% и более лимфоцитов, из

которых 5-8% могут быть молодые клетки – пролимфоциты и лимфобласты.

Кроме лимфоидных клеток, можно встретить и другие атипичные, опухолевые

клетки. Ультраструктурные изменения в морфологии гемопоэтических клеток

и лимфоцитов наиболее полно установлены с помощью электронной

микроскопии (Кухаренко Н. С. 1975, Пиголкина В.В. 1983; Меньшикова З. Н.

1976-1999, 2007, Weber A. Et al., 1972, 1982, 1984).

На основании результатов многочисленных гематологических

исследований были введены критерии оценки анализа крови животных. Так

называемые «лейкозные ключи».

Первый «лейкозный ключ» был предположен Gotze R. (1954). Он установил,

что при лейкозе происходит увеличение количества лейкоцитов в большинстве за

счет лимфоцитоподобных клеток. В их число автор относил различные клеточные

элементы, имеющие морфологическое сходство с лимфоцитами. Им была создана

схема диагностики, названная «Лейкозным ключом Гётце». Сущность его

заключалась в определении количества лейкоцитов в 1 мкл крови и процента

лимфоидных клеток в лейкоцитарной формуле. Животные, в зависимости от

27

возраста и этих показателей, подразделялись на гематологически отрицательных,

подозрительных в заболевании и положительных в заболевании лейкозом. Было

отмечено, что в опухолевой стадии лейкоза возможно снижение количественных

показателей крови и не рекомендовано применение «ключа» в таких случаях.

После разработки «ключа Гётце» многие исследователи занимались

усовершенствованием гематологического метода применительно к местным

условиям и породам скота. Так Bendixen H. В 1960г. И Winguist G. D в 1961г.

Предложили диагностировать лейкоз по абсолютному количеству лимфоцитов в 1

мкл крови. Датский «ключ Бендиксена» для пяти возрастных групп крупного

рогатого скота предусматривал определение количества лимфоцитов,

характерного для здоровых, подозрительных в заболевании и больных лейкозом

животных. Всего в мире насчитывается около двух десятков лейкозных ключей

(Розенбергер, 1970).

Результаты многочисленных исследований советских ученых позволили

ВИЭВ разработать в 1973г новый «лейкозный ключ», который отличается от

предыдущих тем, что в каждой возрастной группе животных количество

лейкоцитов и абсолютное количество лимфоцитов для здоровых, подозрительных

и больных животных уменьшено на 1 тыс.

Данный ключ был включен в стандарт СЭВ, используемой при импорте и

экспорте животных, а также в Государственный стандарт СССР «Крупный

рогатый скот, методы лабораторной диагностики лейкозов. ГОСТ 25382-82».

Ценность была доказана при диагностике лимфоидного лейкоза, а общий

недостаток – ни один из них не выявляет лейкоз при алейкемическом течении и на

ранних стадиях развития процесса (Симонян Г.А. и др., 1983, 1988; Гулюкин М.И.

и соавторы, 2000). В то же время гематологические исследования – своеобразный

тест благополучия стада. Средний процент животных с персистентным

лимфоцитозом в стаде в разные периоды оздоровления позволяет контролировать

динамику оздоровления поголовья от лейкоза.(Шишков В.П., 1998; Шишкин А.В.,

2006)

28

Согласно новым Правилам по профилактике и борьбе с лейкозом (2000

год) животные, у которых с помощью «лейкозного ключа» установлено

подозрение на лимфоидный лейкоз, подвергаются повторно гематологическим

исследованиям через 2 месяца. Если во время второго гематологического

исследования результаты будут отрицательными на лимфоидный лейкоз,

животные считаются клинически здоровыми, а при выявлении цитологических

изменений лимфоцитов патогномоничных для лейкозных и подозрительных на

лейкоз животных, считаются лейкозными и сдаются на убой. (Донник И.М.,

Смирнов П.Н., 2007)

Животным, у которых при повторном гематологическом исследовании

обнаружены положительные для лейкоза параметры периферической крови,

определяется окончательный диагноз – лимфоидный лейкоз и они удаляются из

стада.

Практикующим ветеринарным специалистам рекомендуется использовать

ниже приведенные показатели лейкоцитов и лимфоцитов (в 1 мкл крови) у

здоровых, подозрительных и больных лейкозом животных (Методические указания

по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, 2001).

Таблица 1

ВОЗРАСТ

ЖИВОТНОГО,

ЛЕТ

ЖИВОТНЫЕ здоровые Подозреваемые

в заболевании

больные

Кол-во

лейкоцитов,

тыс/мкл

абсолютное кол-

во лимфоцитов

тыс/мкл)

(абсолютное кол-

во лимфоцитов

тыс/мкл)

Лимфоциты, %

От 1 до 2 До 12000 От 6 до 11000 Свыше 11000 до 75%



От 6 и старше До 9000 От 5500до 8000 Свыше 8000 до 60%

Таким образом, несмотря на то, что гематологические исследования скота

на наличие лимфоидного лейкоза с помощью «лейкозных ключей», не всегда

бывают специфичны и имеют существенные ограничения, до ввода

чувствительных и специфических серологических и вирусологических методов,

29

они использовались и используются до настоящего времени, для прижизненной

диагностики лейкоза крупного рогатого скота (Шкута А.Б., 2005; Разумовская

В.В., 2005).

Полимеразная цепная реакция

Особую ценность в определении инфицированности ВЛКРС отдельных

животных или выявлении вируса в различных биологических жидкостях и

тканях имеют ДНК-методы.

Как мы уже говорили, вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС)

присутствует в организме животных в виде ДНК-копий (провируса), встроенных

в геном клетки-хозяина. Это делает возможным выявление ВЛКРС с помощью

современных молекулярно-биологических методов, в частности методом

полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразная цепная реакция

разработана Мюллисом К. (фирма «Cetus», США) в 1983 году, за что в 1995 году

автор был удостоен Нобелевской премии. Метод ПЦР основан на уникальной

способности ДНК к самовоспроизведению-репликации. В частности для

обнаружения провируса лейкоза с помощью ПЦР используется геномная ДНК,

выделенная из крови животных. В результате ПЦР определяемый

вирусоспецифический фрагмент выделенной ДНК амплифицируется

(умножается) до количества, достаточного для его визуального определения, т.е.

с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в течение нескольких часов

можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в

количестве, превышающим исходное в 10 раз. Такая высокая степень

направленного обогащения значительно упрощает выявление выделенного

образца ДНК. При амплификации с помощью ПЦР используют два

олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующие интересующий нас

участок ДНК; процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах

температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплиментарными

последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с

этих праймеров ДНК-полимеразой. Праймеры ориентированы таким образом,

30

что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая

количество копий этого участка ДНК.

Как диагностический метод, ПЦР характеризуется высокой

специфичностью, которая обусловлена выбором праймеров и

чувствительностью. С помощью ПЦР удается обнаружить даже

денатурированную нуклеиновую кислоту, присутствующую в следовых

количествах. Для проведения ПЦР-анализа достаточно 50 мкл крови. Метод

ПЦР может использоваться для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в

особо важных случаях и в качестве подтверждающего теста (Гусева Е.В., Сатина

Т.А., 1995; Джапаралиев Н.Т. и соавторы, 2003; Прохватилова Л.Б, 2001; Попов

А.Н., 1993).

ПЦР обнаруживает провирусную ДНК вируса лейкоза в лимфоцитах

периферической крови экспериментально и естественно инфицированных

животных, в суспензиях различных органов и тканей, позволяет выявить

единичные копии вируса в клеточном образце в раннем инкубационном

периоде, когда другими существующими серологическими методами

диагностики лейкоза их обнаружить невозможно (Кузнецова Н.В., Кузнецов

Н.В., Симонян Г.А., 1997; Обухов И.Л., Грузднева К.Н., Панин А.Н., 1997;

Прохватилова Л.Б., Ломакин А.И., Колосов С.Н., 1998; Гулюкин М.И. и др.,

2002; Макаров В.В., Гринишин Д.Н., 2005; Калашников А.Е. и соавторы, 2006).

Полимеразная цепная реакция дает возможность выявить фрагмент генома

ВЛКРС в образцах крови через 1-2 недели после заражения. С помощью ПЦР

удается обнаружить провирусную ДНК лейкоза КРС в крови большинства

экспериментально инфицированных животных, которые считались

отрицательными по данным серологических реакций (Fechner H., 1996;

Klintevall K., 1995).

Ценность ПЦР обуславливается быстротой получения результатов анализа

и возможностью прямой детекции клеток возбудителей или тканей животных в

исследуемом материале (Гинзбург А.Л., 1999; Прохватилова Л.В. и соавторы,

2001; Комарова И.Н., 2005).

31

Тем не менее, следует отметить, что использование метода полимеразнеой

цепной реакции не лишено определенных ограничений. (Бусол В.А., и соавторы,

1999; Quintero J. et al., 1998). В первую очередь, к ним относится возможность

возникновения недостоверных результатов ПЦР-анализа, причинами

ложноположительных результатов, в большинстве случаев, является

контаминация проб матричной ДНК или продуктами амплификации, а также

возможность перекрестного реагирования с гетерологичной ДНК (Панин А.Н. и

соавторы, 1997).

Эффективность, простота исполнения, высокие показатели

чувствительности и специфичности предопределили широкие возможности

практического применения метода ПЦР в различных областях медицины и

ветеринарии. (Munson K. et al., 2000) В настоящее время метод ПЦР широко

используется при диагностике инфекционных заболеваний, в том числе

вызванных возбудителями, трудно поддающихся культивированию; при

генотипировании, оценке вирулентности и определении устойчивости к

антибиотикам различных микроорганизмов и вирусов; в генодиагностике и

генетической дактилоскопии; в пренатальной диагностике и биологическом

контроле препаратов крови: мяса и мясопродуктов (Маккерди Б.Д., Чимера Д.А.,

1999; Обухов И.Л. и соавторы, 1997; Обухов И.Л., Джапаралиев Н.Т. и соавторы,

2000; Джапаралиев Н.Т., 2002).

Электронно-микроскопический метод

В настоящее время для прижизненной, дифференциальной и экспресс-

диагностики гемобластозов на начальных стадиях лейкозного процесса

возможно применение трансмиссионной и сканирующей электронной

микроскопии. (Пиголкина В.В., 1983; Меньшикова З. Н. И соавторы, 1976-2007).

Сканирующая электронная микроскопия позволяет оценить

поверхностную архитектонику, а трансмиссионная – ультраструктуру

инфицированных и лейкозных лимфоцитов (Joshikawa et al., 1983; Horvatn M.,

1996). Благодаря использование этого метода исследования окончательно

доказана вирусная природа лейкоза КРС, определена его морфология и

32

таксономия (Olson C. et al., 1972; Calafat J., Ressan, 1977; Rao G., 1992; Надточей

В.А. и соавторы, 1976; Шишков В.П., Меньшикова З.Н., 1989)

Установлено, что вирус лейкоза крупного рогатого скота обнаруживается

только in vitro при культивировании лейкоцитов крови и лимфы в течение 24, 48

часов. Зрелые вирионы имеют ультраструктуру типичную для онкорнавируса

типа С. Вирусные частицы образуются на поверхности клетки или в

цитоплазматических вакуолях (Weiland F., Ueberschar S., 1976; Van der Maaten et

al., 1978, 1989; Меньшикова З.Н., Махмуд А.С., 1980; Бузераиб А.К., 1986).

Цитоморфологические исследования с помощью световой микроскопии не

позволили выявить различия между здоровыми и опухолевыми лимфоидными

клетками (Симонян Г.А., 2006). При электронной микроскопии установлено, что

лейкозные лимфоциты имеют четкие отличия от нормальных клеток. У них

находят: полиморфизм ядра; гипертрофию мембранного аппарата; дубликацию

ядерных и поверхностных мембран митохондрий; увеличение количества

митохондрий; появление ядерных карманов (самый важный патогномоничный

признак). В одном лимфоците обнаруживают от 1 до 6 и более ядерных карманов

(Weber A. et al., 1974, 1980, 1981; Prem P. et al., 1977; Меньшикова З.Н., 1977,

1999).

Таким образом, ультраструктурные особенности лимфоцитов, постоянно

выявляемые у инфицированных ВЛКРС, могут служить маркерными критериями

при дифференциальной диагностике гемабластозов, смешанных инфекций у

племенных животных и отборе животных для биотехнологических целей.

Клиническая диагностика

Энзоотический лейкоз – самая распространенная форма лейкоза крупного

рогатого скота. Чаще всего появляется у взрослого скота, в возрасте с 3 до 6 лет

и, как правило, бывает лимфоидного типа. В связи с этим болезнь принято

называть энзоотический лимфоидный лейкоз, или хронический лимфолейкоз

крупного рогатого скота (Sagata N., 1980).

33

С точки зрения клинической диагностики, лимфоидный лейкоз может

иметь острую, подострую и хроническую формы, а также латентную,

субклиническую и клиническую стадии.

Лейкоз крупного рогатого скота чаще протекает хронически. Острое и

подострое течение болезни наблюдается лишь в 5-7 % случаев (Смирнов Ю.П.,

2000).

Характер клинических признаков зависит от поражения тех или иных

органов, а полнота – от стадии процесса. Клинические признаки при лейкозе

подразделяются на специфические, характерные для данного заболевания, и

неспецифические, отражающие расстройства общего характера.

Латентная (онкорнавирусная инфекция) и субклиническая

(гематологическая) стадии: энзоотического лейкоза обычно длятся долго,

часто месяцами и годами, протекают без видных изменений общего состояния

животного, субклиническая стадия сопровождается появлением слабых или

выраженных неспецифических клинических симптомов: ухудшается общее

состояние животного, появляется слабость, кахексия, анемия; коровы дают

меньше молока и становятся бесплодными. В случае нарушений в желудочно-

кишечном тракте наблюдают расстройство пищеварения: атонию

преджелудков, тимпанию и диарею часто профузного характера. Также могут

появиться ухудшение работы сердца, отеки в области подгрудка,

межчелюстного пространства, одышка, нарушение дыхательной деятельности,

парезы и паралич задних ног, и другие неспецифические клинические признаки

(Theilen G., Burnham L., 1964 и др.). Эти и другие симптомы обычно

встречаются не только в начальной стадии лейкоза крупного рогатого скота, но

и при многих других болезнях. (Симонян Г.А., 1988, 2006; Нахмансон В.М и

соавторы, 2005)

Клиническая (опухолевая) стадия лейкоза характеризуется

специфическими клиническими признаками: прогрессирующее увеличение

лимфатических узлов в различных частях туловища, печени и селезенке,

появление опухолей на различных частях туловища, экзофтальм и другие

34

видимые патологические изменения и функциональные нарушения

внутренних органов и систем, в связи с развитием опухоли (Mussgay M.1980;

Ristau E., 1985; Lewin H., Bernaco D., 1986; Бурба Л.Г., Кунаков А.А., 1993;

Салимов Х.С., 1986).

У живых животных клиническое диагностирование лимфоидного лейкоза

основывается на увеличение поверхностных и ректально доступных

лимфатических узлов. Характер и степень поражения лимфоузлов бывают

различными в зависимости от формы заболевания. H.Bendixen (1960)

различает три формы поражения опухолевых узлов: системное

(генерализованное) увеличение лимфатических узлов; преимущественное

поражение лимфоузлов внутренних органов; преимущественное поражение

кожи и подкожных лимфоузлов.

Генерализованное поражение встречается редко. Чаще поражаются

регионарные лимфоузлы, при этом внутренние чаще, чем наружные.

Лимфатические узлы при лейкозе умеренно плотной консистенции, иногда

узловатые, безболезненные, большинство легко подвижные, не связаны с

окружающей тканью.

В терминальной, опухолевой стадии энзоотического лейкоза, увеличенные

лимфатические узлы могут привести к функциональным нарушениям

окружающих органов: к затруднению дыхания, глотания; увеличение

мезентериальных лимфатических узлов - к замедлению моторики кишечника

(Кудрявцева Т.П., 1964, 1969; Парчинский О.Г., 1967; Федоров В.В., 1969 и

другие).

Патологии в сердце выявляют больше, чем у половины животных,

больных лимфолейкозом. Чаще всего появляется тахикардия, кардиальные

шумы или аритмии. Эти симптомы можно обнаружить только на последней

(конечной) стадии болезни. В таких случаях нужно исключить травматический

перикардит и болезни сердца другого генеза. При травматическом

перикардите, у большинства животных выявляют нейтрофилию, со «сдвигом

35

направо» в лейкоформуле, но не выраженный лимфоцитоз или анемию,

характерные для лейкоза (Кудрявцева Т.П., 1974; Смирнов ЮП., 1999).

Репродуктивные органы: влагалище, матка и окружающие соединительные

ткани, яичники у большинства животных в развернутой и терминальной

стадии лейкоза также бывают захвачены лейкозными изменениями. (Бурба

Л.Г., Кунаков А.А., 1983; Салимов Х., 1986).

У быков с выраженным клиническим лейкозом, как правило, снижено

либидо, плодовитость или выявляется бесплодие.

У животных с энзоотическим лейкозом появляется и односторонний или

двусторонний экзофтальм из-за лейкозных изменений в ретробульбарных

лимфатических фолликулах (Адуцкевич В.А., 1967; Сюрин В.Н. и соавторы,

1998).

У небольшого количества больных животных клинически или

посмертным путем обнаруживается увеличение селезенки. Лейкозные

изменения в селезенке обнаруживаются почти всегда, когда в

периферической крови находят лейкоцитоз, преимущественно с

лимфобластными клетками (Кухаренко Н.С., 1976; Федоров В.В., 1969;

Шишков В.Т. и соавторы, 1986; Мандыгра Н.С., 2006).

Таким образом, удельный вес специфических клинических признаков, по

которым можно поставить диагноз на лейкоз, невелик. Неспецифические же

симптомы, часто указывающие на опухолевое поражение внутренних органов

приобретают диагностическое значение лишь в сочетании с

гематологическими, серологическим и другими методами исследования.

1.5.2. Предубойная диагностика лейкоза крупного рогатого скота

Так как лейкоз КРС - это хроническое инфекционное длительно

протекающее заболевание, то предубойная диагностика имеет особенное

значение.

36

В латентный период ВЛКРС можно определить только при помощи

серологических методов, ПЦР и электронной микроскопии. По всем клинико-

анатомическим показателям животные выглядят здоровыми.

В субклинической стадии диагноз можно поставить после серологической

и гематологической диагностики. У животных наблюдается лейкоцитоз,

лимфоцитоз и появляются незрелые клетки. Клинические признаки так же не

проявляются. Лейкоз в клинико-анатомической (опухолевой) стадии в

настоящее время встречается редко. Эта стадия является терминальной в

развитии лейкозного процесса, наблюдается у 10-20% больных животных

(Смирнов В.В., 1995, 2003).

Животные, заболевшие лейкозом (если у них при клиническом осмотре не

исследовали кровь, не проводили серологическое исследование в РИД),

направляются на убой чаще всего вне подозрения на лейкоз, а вследствие

побочных общих и клинико-анатомических нарушений: понижение

продуктивности, удоев, плодовитости, приобретению других клинических

болезней, неподдающихся лечению, так как при лейкозе поражается иммунная,

защитная система всего организма животного.

При предубойном осмотре таких животных из неспецифических

клинических признаков обнаруживают: вялость, бледность видимых слизистых

оболочек, расстройство сердечной деятельности, вызывающее подозрение на

травматический перикардит, ретикулит, подозрение на гастроэнтериты, травмы,

вывихи.

Обнаружение при предубойном осмотре хотя бы одного из указанных

симптомов болезни обязывает врача сделать предположение о заболевании

лейкозом и провести дополнительно прижизненные и послеубойные

исследования органов и туш.

37

1.5.3. Послеубойная диагностика лейкоза

Патологоанатомический метод диагностики лейкоза

Основные патологоанатомические исследования при лейкозах

заключаются в выявлении разрастаний злокачественно трансформированных

клеток кроветворной ткани не только в органах гемопоэтической системы, но и в

других жизненно важных органах, не связанных с кроветворением в зрелом

организме животного. Эти изменения выявляются при посмертной и

послеубойной диагностике. Они достаточно характерны и однотипны,

выражаются в образовании опухолей или увеличении органа в объеме (Федоров

В.В., 1969; Кудрявцева Т.П., 1974, 1980; Таджибаев А.А., 1984)

Лимфатические узлы. Многие авторы отмечают лейкозные изменения в

лимфатических узлах в 85 % случаев. Они увеличены, в сравнении с

нормальной величиной в несколько раз, при этом лимфатические узлы не

меняют свою форму. На разрезе трудно отличается или вообще не различается

корковое и мозговое вещество.

В таких лимфатических узлах часто находятся и некротические

изменения, которые приводят к частичному размягчению лимфатического

узла, или характерные очаговые включения желто-творожистого вида,

единичные или множественные кровоизлияния. Редко находят отдельные, четко

ограниченные узлы или большие конгломераты (Кудрявцева Т.П., 1974;

Смирнов Ю.П., 1999; Меньшикова З.Н. и соавторы, 2000).

При всех формах лейкозов, особенно при лимфолейкозе, лимфоузлы в

тазовой полости поражены чаще и более интенсивно, чем в грудной и брюшной

полостях.

Селезенка. В зависимости от стадии лейкоза, селезенка в различной

степени увеличена. В некоторых случаях достигает длину до 1 м, а ширину от

25-30 см. Вес селезенки может достигнуть 17-25 кг. В редких случаях через

поврежденную капсулу сильно кровоточит в брюшную полость и приводит к

смерти животного. В большинстве случаев у сероположительных животных, у

38

которых не выявлены клинические симптомы энзоотического лейкоза,

селезенка не изменена. (Дрогун А.Г. и соавторы, 1980; Ковтун В.Я., 1980).

В некоторых случаях лейкозные изменения в селезенке имеют

диффузный характер. При этом селезенка увеличена, края округлены, на

разрезе пульпа темно-красного цвета, кашеобразной консистенции. В

терминальной стадии границы красной и белой пульпы полностью стираются

– ткань становится красно-коричневая с бурым или малиновым оттенком

(Меньшикова З.Н. и соавторы, 2004; Сноз Г.В., 1987, 1994).

Печень. При лимфоидном лейкозе печень часто увеличена, края

округлены, паренхима серо-коричневого цвета, консистенция, в большинстве

случаев, хрупкая (мягкая).

Почки. Могут быть значительно увеличены, а на разрезе трудно

разграничить корковое и мозговое вещество. Паренхима мягкой консистенции,

саловидная, иногда сопровождается кровоизлияниями. Содержит очаги серо-

белого цвета, саловидные, ограниченные, локализованы в поверхностных и

более глубоких слоях коркового вещества.

Сердце поражается почти во всех случаях заболевания лейкозом (33-

80%). Диффузные изменения находят в правом предсердии и ушке.

Инфильтрация лимфоидными клетками чаще всего встречается в стенке

предсердий, которая из-за этого утолщена. Реже встречаются опухоли

различной величины и формы.

Скелетная мускулатура при лимфолейкозе довольно часто поражается.

Преимущественно изменения находят в жевательных, брюшных, грудных

мышцах, а также мышцах диафрагмы. Пораженные ткани гидремичны,

дряблой конституции, светло-красного цвета с желтоватым или белесым

оттенком. На глубоких продольных разрезах мышц можно увидеть саловидные

изменения.

Легкие и молочные железы поражаются редко, зато бронхиальные,

средостенные и особенно надвымянные лимфоузлы часто имеют лейкозные

включения.

39

Костный мозг. Исследования костного мозга редко проводится, хотя при

некоторых формах лейкоза изменения в нем характерны. Встречаются

желтовато-зеленные очаги мягкой консистенции, образованные из

пролиферативных клеток. (Смирнов Ю.П., 1999; Симонян Г.А. и соавторы,

1983; Сноз Г.В., 1993).

Пищеварительный тракт. В преджелудках опухолевые изменения очень

редко встречаются, их чаще всего можно встретить в сычуге. Выявляют

утолщения стенки сычуга. Единичные или диффузные опухолевые изменения

можно встретить и в тонких, а реже, и в толстых кишках (Кудрявцева Т.П.,

1986; Лазарев И.М., 1990)..

Матка. Матка и яичники часто захвачены лейкозным процессом.

Пролифераты лимфоидных клеток в виде больших и/или маленьких узлов

серо-белого цвета, находятся в стенке рогов, теле и шейки матки, а также

слизистой и строме влагалища.

Семенники (testis). У быков с энзоотическим лейкозом, кроме лейкозных

изменений увеличенных лимфатических узлов, у большего количества животных

находят и патологические изменения половых желез в виде диффузных

образований.

Таким образом, патологоанатомическая картина больного лейкозом

крупного рогатого скота разнообразна, сопровождается опухолевыми

поражениями не только кроветворных, но и других жизненно важных органов.

Системный характер поражений позволяет правильно ориентироваться при

постановке послеубойного диагноза. Однако приведенные выше изменения в

органах и тканях в основном обнаруживаются только в развернутой и

терминальной стадиях болезни. Для дополнения и уточнения

патологоанатомической экспертизы требуются гистологические и

цитоморфологические исследования.

Гистологическая диагностика применяется для уточнения формы и стадии

лейкозного процесса. При этом учитывают морфология клеток различных органов

(лимфоузлов, селезенки, костного мозга), их величину, форму, соотношение ядра

40

и цитоплазмы, число незрелых, пролиферирующих и нормальных клеток, характер

распространения опухолевых клеток в паренхиму органа.

Результаты гистологического анализа позволили заключить, что у крупного

рогатого скота наиболее распространены лимфоидный лейкоз и лимфосаркома,

реже встречаются лимфогрануломатоз и очень редко остальные формы болезни

(Watanabe K. et al., 1999; Смирнова В.В., 1993; Винокурова З.В., 2000; Шипицын

А.Б., Схабун А.К., 2005).

1.6. Ветеринарно-санитарная оценка качества и безопасности туш,

внутренних органов и других продуктов убоя

В настоящее время отсутствуют специфические средства профилактики и

лечения лейкоза. Поэтому основным методом оздоровления хозяйств от данной

болезни является широкомасштабное серологическое тестирование в сочетании

с политикой немедленного изъятия из стад больных, ВLV- инфицированных

животных и их уничтожение. Такие средства именуются за рубежом «стемпинг-

аут» или «модифицированным методом Стемпинг-аут». Они обеспечили полное

оздоровление более 15 стран Западной Европы. В Российской Федерации

количество неблагополучных пунктов по лейкозу увеличивается, оздоровление

хозяйств ведется путем постепенного удаления РИД-положительных животных

из стад и сдача их на убой.

В этой связи ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов убоя

крупного рогатого скота остается актуальным вопросом, требующим

дополнительных уточнений.

Рассматривая ветеринарно-санитарную оценку качества и безопасности

продуктов убоя животных при лейкозе, в историческом аспекте следует

отметить, что до середины 19-го столетия мясо и продукты убоя больных

лейкозом животных отправляли на утилизацию лишь при наличии опухолевых

поражений в лимфатических узлах и мышечной ткани, в других случаях оно

использовалось без ограничений. Более обстоятельные патологоанатомические,

гистологические, физико-химические, микробиологические исследования Л.В.

41

Адуцкевича (1967), В.М. Лемеша позволили современно, на тот момент,

обосновать ветеринарно-санитарную оценку мяса, полученного от больных

лейкозом животных. Авторы установили, что скелетные мышцы больных

животных в 88% случаев были поражены очаговыми или диффузными

лейкемическими пролифератами, изменялся химический состав мяса – оно

имело повышенное (на 4-5%) количество влаги, коэффициент кислотности-

окисляемости в ряде случаев был низким. Обнаружено поражение (в 65%

случаев) малодоступных для клинического исследования лимфоузлов и других

органов. Болезнь клинически не проявлялась. Только незадолго до летального

исхода, вследствие глубокого и прогрессирующего нарушения обмена веществ

в результате давления увеличенных лимфоузлов на рядом лежащие органы,

наблюдали общую слабость, снижение упитанности и удоев, расстройство

сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта и координации

движений. Некоторые исследователи установили снижение упитанности и

микроскопические изменения в тканях лишь у 5-20% животных, убитых в

гематологической стадии, другие не имели отличий от тканей здоровых

животных. В опухолевой стадии более 80% животных имели ниже среднюю

упитанность или были истощены. Мясо от них после 3-х дневного хранения

теряло признаки свежести (Пипирас Ю.Ю., 1972; Лемеш В.М., Пахомов П.И.,

1996).

Бактериологические исследования. Использование микробиологических

методов исследования позволило установить возможность эндогенной

контаминации продуктов убоя животных, больных лейкозом, биологическими

патогенами. Уже в 1930 г. Шоберг Ф. при обследовании 27 туш больных

лейкозом коров в 4-х случаях выделил культуру Salmonella enteriditis, в 1956г.

Кульман А. в 2,7% случаев подтвердил возможность обнаружения сальмонелл

(Соколов Д.С., 2004). По данным Пышко И.И. (1972), в 15 из 31 обследованной

туши от больных лейкозом животных выявлена контаминация мяса

микроорганизмами условно-патогенной группы, их выделили из

поверхностных и глубоких слоев мышц, лимфоузлов, сердца, почек, печени.

42

Автор для сравнения сообщает, что у 17 контрольных туш, полученных от

здорового скота, установлена частичная бактериальная обсемененность только

внутренних органов (23,5%). Подобные сведения приводил Пипирас Ю.Ю.

(1977), который выявлял многочисленные кокковые формы микроорганизмов в

поверхностных и, одиночные бактерии, в глубоких слоях мышечной ткани туш

при гематологической и опухолевой стадиях лейкоза.

Возможность возникновения секундарных инфекций при лейкозе

животных подтвердили Пахомов П.И., Лемеш В.М. (1998), Альбикова Г.М.

(2001), которые при бактериологическом исследовании туш и органов крупного

рогатого скота в развернутой и терминальной стадии лейкоза, при наличии

клинических признаков и патологических изменений, обнаружили

сальмонеллы, кишечную палочку, Proteus и кокковую микрофлору.

В целом из крови и органов больных гемабластозами коров микрофлору

выделили в 6-10 раз чаще, чем у здоровых. У 88% больных гемабластозами

животных из мяса, органов и крови изолировали полиморфные

микроорганизмы, стафилококки, диплококки, микоплазмы, эшерихии,

энтерококки, стабильные и нестабильные L-формы бактерий, стафилококки

(Пахомов П.И., Лемеш В.М., 1997; Кунаков А.А., Альбикова Г.М., 2002). При

этом патогенными для больных мышей оказались диплококки, эшерихии,

некоторые штаммы стафилококков, стрептококков и энтерококков (Азизов

Н.М., 1980). Однако имеются и другие мнения. Так по данным Н.С.

Наконечного и З.М.Сишненко (1965) не установлено контаминации

сальмонеллами и другими микроорганизмами мышечной ткани и внутренних

органов, полученных при убое крупного рогатого скота с гематологической

стадией лейкоза.

Физико-химические показатели мяса. Мясо больных лейкозом

животных и по физико-химическим параметрам отличается от мяса здоровых

животных (Адуцкевич В.А., 1967; Пипирас Ю.Ю., 1972). Мясо животных,

убитых в бессимптомной стадии, имеет физико-химические параметры,

сходные с таковыми у мяса здоровых животных, после созревания: реакция

43

среды (рН) 5,8±0,02; реакция на пероксидазу положительная, реакция с

сернокислой медью отрицательная, реакция с формалином отрицательная.

Исследование мяса животных в гематологической стадии лейкоза с

использованием медного купороса (Пипирас Ю.Ю., 1972) позволило считать

мясо в 5 случаях из 10 несвежим, в 3 из 10 – подозрительной свежести и только

в 2-х случаях – свежим. Показатели рН мяса в среднем составляли 6,3±0,142;

реакция на пероксидазу у 70% туш была сомнительной.

Мясо коров с изменениями лейкозного характера в отдельных

лимфоузлах или паренхиматозных органах по органолептике относили к

свежему. Отдельные кокки в глубоких слоях мышц обнаружили у 40% туш, рН

мяса составил 5,9 ± 0,07, реакция с медным купоросом только у 30% туш

показала, что мясо подозрительной свежести, реакции на пероксидазу у 70%

туш отрицательные.

В тушах, полученных от коров выше средней упитанности, больных

лейкозом, все физико-химические показатели мяса были в норме, такого же

мнения придерживались и Наконечный Н.С. и Сишненко З.И. (1965), которые

считали, что животные с гематологическим диагнозом на лейкоз, в основном,

выше средней упитанности. При ветеринарно-санитарном послеубойном

осмотре туш таких животных обнаруживают незначительные изменения во

внутренних органах, лимфоузлах и селезенке. Мясо таких животных после

остывания имело рН 5,7-6,8, положительную бензидиновую пробу.

Другие исследователи (Пахомов П.И., 1996, 1998; Альбикова Г.М., 2001,

2002) отмечали ухудшение пищевой и биологической ценности мяса крупного

рогатого скота в зависимости от стадии развития лейкозного процесса.

Кроме того, установлено, что даже сыворотка крови КРС, больного

лейкозом, обладает токсическими свойствами. После внутривенного введения

ее крысам отмечается явление острой интоксикации животных и их гибель

(Кумков В.Т. и соавторы, 1974), что подтверждено и кристаллографическими

исследованиями Орлова А.А. и Пахмутова И.А. (2004).

44

Тревожным фактором является установленная способность ВЛКРС

преодолевать межвидовые барьеры, поражать клетки различных видов

животных in vivo, вызывать лейкоз у шимпанзе после скармливания молока от

инфицированных ВЛКРС коров (Mс ´Clure et al., 1974; Андриян Е.А., Аванесов

Р.А., 1972). Доказана не только трансмиссия ВЛКРС через молоко, но

лейкозогенные свойства его фракций (Кукайн Р.А и соавторы, 1976;

Парфанович М.И. и соавторы, 1978; Салимов Х.С., 1982; Romero C. Et al.,

1983).

Однако указанные факты не повлияли на лояльную ветеринарно-

санитарную оценку продуктов убоя животных, больных лейкозом,

существующую в нашей стране. Согласно «Правилам ветеринарного осмотра

убойных животных и ветсанэкспертизы мяса и мясопродуктов» (1988) при

любой форме лейкоза при поражении мышц, лимфатических узлов, нескольких

паренхиматозных органов или выявлении лейкозных разрастаний (бляшек) на

серозных покровах, тушу (независимо от упитанности) и другие продукты убоя

утилизируют.

Если поражены отдельные лимфатические узлы или органы, но нет

изменений в скелетной мускулатуре, такие лимфатические узлы или органы

утилизируют, а тушу и непораженные органы используют в зависимости от

бактериологического исследования. При обнаружении сальмонелл тушу и

непораженные органы направляют на проварку или изготовление консервов.

При отсутствии сальмонелл тушу и непораженные органы направляют на

изготовление колбасных изделий в соответствии с П.П 11.5.1 и 11.5.2.

При положительном результате гематологического исследования

животного на лейкоз, но при отсутствии патологических изменений,

свойственных лейкозу, тушу и органы выпускают без ограничений.

Таким образом, анализ доступной нам отечественной и зарубежной

литературы позволяет сделать заключение, что к настоящему моменту

применение современных молекулярно-биологических методов исследования

позволило получить новые данные о лейкозогенезе, установить вирусную

45

природу лейкоза крупного рогатого скота, разработать чувствительные методы

диагностики. На этом фоне вопросы ветеринарно-санитарной экспертизы и

оценки мяса и других продуктов убоя при лейкозе разработаны недостаточно.

Они основываются на неоднозначных результатах исследования отдельных

авторов. Среди ученых нет единого мнения о безопасности употребления мяса

лейкозных животных. Частично это объясняется тем, что вопрос сохранности

ВЛКРС в мясе, контаминации его биологическими патогенами (бактериями,

вирусами, опухолевыми клетками и т.д.) заражение человека через продукты

убоя, безопасности мяса на различных этапах лейкозогенеза не решен. Нет

однозначного мнения о биологической ценности и безвредности мяса крупного

рогатого скота при лейкозе. В действующих «Правилах ветеринарно-

санитарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизе

мяса и мясных продуктов» не определен вопрос оценки мяса РИД-

положительных животных и недостаточно конкретно представлены и

обоснованы особенности ветеринарно-санитарной оценки продуктов убоя при

различных стадиях и формах течения лейкоза крупного рогатого скота. Нужно

признать, что ветеринарно-санитарная экспертиза и санитарная оценка мяса и

мясопродуктов при лейкозе требуют более углубленных исследований с

использованием современных классических и молекулярно-биологических

методов исследования, которые позволят давать комплексную оценку

продуктов убоя при лейкозе.

46

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материалы и методы исследования

Работа проводилась на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, в

лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии (группа по изучению

лейкозов с/х животных ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, хозяйствах

Выгонического района Брянской области, Можайского района Московской

области, на Калужском мясокомбинате, сотрудникам которых мы выражаем

искреннюю благодарность за организационно-техническое содействие.

Объектом наших исследований служили 327 голов крупного рогатого скота

черно-пестрой породы: из них 233 животных из хозяйства и 88 коров

поступивших на мясокомбинат.

Животные были разделены на следующие группы:

-Клинически здоровые коровы, серологически отрицательные в реакции

иммунодиффузии (РИД) – 78 головы.

-Клинически здоровые коровы, серологически положительные (РИД+),

бессимптомная стадия лейкоза – 214 голов.

Больные коровы:

-серологически положительные (гематологическая стадия болезни) – 35

голов.

-опухолевая стадия - 9 голов.

Все животные подбирались по принципу аналогов со сходной

зоотехнической характеристикой: порода, пол, возраст.

Материалом для собственных исследований служили:

-статистические данные ветеринарной отчетности и результаты

собственных исследований по лейкозу. Эпизоотологический анализ проводили,

учитывая серологические, гематологические, гистологические исследования и

данные ветеринарно-санитарной экспертизы убойных животных на

мясоперерабатывающих предприятиях, убойных пунктах и рынках Брянской,

Калужской и Московской областей и других и регионов Российской

Федерации;

47

-кровь крупного рогатого скота – цельная, взятая из яремной вены,

стабилизированная цитратом натрия; кровь использовалась для электронной

микроскопии лимфоцитов, для выделения ДНК и постановки ПЦР с

праймерами, направленными на выявление ВЛКРС. Сыворотка использовалась

для постановки реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД); лейкоциты

культивировали in vitro для определения репродукции вируса лейкоза;

-мясо и другие продукты убоя (внутренние органы, эндокринные железы)

здоровых и больных лейкозом животных. Отобраны и исследованы 93 пробы

мяса и внутренних органов.

Прижизненная диагностика лейкоза осуществлялась на основании

клинико-гематологических, вирусологических, молекулярно-биологических

(ПЦР) и электронно-микроскопических исследований.

Послеубойный диагноз на основании патоморфологических,

гистологических, молекулярно-биологических методов исследования туш и

органов убойных животных.

Исследования проводились по стандартным методикам согласно

«Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота»,

М.1999

Гематологические исследования проводили путем подсчета лейкоцитов в

камере Горяева, приготовления мазков крови и их окраса по Романовскому-

Гимзе, выведением лейкограммы и на автоматическом анализаторе COBAS

MIRA (Щвейцария).

Обследованные животные имели следующие гематологические показатели:

здоровые коровы 4,5-9,0 тыс/мкл лейкоцитов (50-60% - лимфоцитов), больные

животные 14,5-37,5 тыс/мкл лейкоцитов (80-90% - лимфоцитов).

Вирусологические исследование проводили с помощью реакции

иммунодиффузии в агаровом геле с гликопротеидным gp антигеном ВЛКРС.

Использование РИД gp51 в ветеринарной практике позволяет выявить

животных – вирусоносителей ВЛКРС.

48

В реакции использовали стандартный коммерческий антиген,

изготовленный Курской биофабрикой, содержащий гликопротеид gp 51,

позволяющий выявить в сыворотке крови животного антитела к ВЛКРС. РИД

ставили в чашках Петри на агаре Дифко. Реакцию учитывали по четырех

бальной системе:

(+)- контрольная линия преципитации имеет незначительный изгиб в

сторону лунки с испытуемой сывороткой, упираясь в край последней;

(++)- контрольная линия имеет значительный изгиб, не соприкасаясь с

краем лунки с испытуемой сывороткой;

(+++)- линия преципитации между испытуемой сывороткой и антигеном

выражена, но резко сдвинута в сторону лунки с испытуемой сывороткой,

вследствие чего имеет дугообразную форму;

(++++)- линия преципитации между испытуемой сывороткой и антигеном

четкая, более или менее прямая, проходит близко к середине расстояния между

лунками (ГОСТ 25-382-82.Крупный рогатый скот. Методы лабораторной

диагностики лейкоза).

Полимеразная цепная реакция. Для определения вирусоносительства

ВЛКРС у крупного рогатого скота, кроме реакции иммунодиффузии

использовалась полимеразная цепная реакция – один из молекулярно-

биологических методов диагностики. Материалом для анализа служили

образцы мяса крупного рогатого скота и цельная кровь, взятая из яремной вены

в одноразовые вакуумные пластиковые пробирки, содержащие в качестве

концентрата ЭДТА.

ДНК получали из 0,5 мл цитратной крови, добавлением 1 мл NH4Cl

лизирующего буфера (8,3 г. NH4Cl, 1,0 г КНСО3, 3,72 мг Na2EDTA на 100 мл

раствора) с последующим перемешиванием и центрифугированием 1 мин. при

2500 g. Это действие повторяли 2-5 раз для отмывания лейкоцитов от

эритроцитов. Затем осадок ресуспензировали в 300 мкл. ДНК-

экстрагирующего буфера (400 mМ NaCl, 10 mM Tris HCl (pH=8,0), 2 mM

Na2EDTA), добавляли 20 мкл 10 % SDS и хорошо перемешивали. Добавляли 5

49

мкл 20 мг\мл протеиназы К, хорошо перемешивали и инкубировали при

температуре 500 С в течение 45 мин. - 1 час. После этого добавляли 100 мкл. 6

M NaCl, перемешивали, инкубировали при комнатной температуре 5 мин.,

центрифугируют при 14000 g 5 мин. Супернатант переносили в другую

пробирку Эппендорфа, добавляя 1 мл этанола (предварительно находившегося

не менее 2 часов при температуре -200 С). Через некоторое время

перемешивали, не используя вортекс, центрифугировали 1-2 мин., удаляли

этанол и высушивали с помощью салфетки и марли. Для растворения ДНК

добавляли 250 мкл ТЕ буфера на 5-10 мин при комнатной температуре,

тщательно перемешивали, использовали для дальнейшей амплификации.

Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме реакционной смеси 50

мкл. В пробирку последовательно добавляется: 33 мкл деионизированной

стерильной воды; 5 мкл реакционного буфера (х 10); на около 18 мкл смеси

dNTP; по 1 мкл праймеров; 0,5 мкл Taq-полимеразы или другого заменяющего

фермента (1 ед.); 2 мкл раствора ДНК (102 – 10 6 пг); 25 мкл минерального

масла (масло должно полностью покрыть водный раствор во избежание

испарения реакционной смеси в ходе реакции).

Для постановки ПЦР на выявление провирусной ДНК вируса лейкоза КРС

использовались наборы серии GenePak DNA PCR test BLV (gag).

GP51

5’

LTR gag pol env pXBL 5’ LTR

LTR – длинные концевые повторы (long terminal repeat)

gag – ген, кодирующий белки сердцевины (определяет группоспецифический

антиген –group specific antigen)

pol – ген, кодирующий обратную транскриптазу (polymerase)

env – ген, кодирующий белки оболочки (envelope)

pXBL - неидентифицированная область

50

Таблица 2

Характеристика праймеров

№

пп

Последовательность Положение в

геноме

Размер ампл.

участка п.н.

1a 5’-GTGCCAAGTCTCCCAGATAC-3’ 5035-5054 613

1b 5’-TTGCCTTGAGAAACATTGAA-3’ 5628-5647

2a 5’-GGCCATGGTCACATATGATT-3’ 5129-5148 448

2b 5’-CGAGTTGACCCAGAAGATTT-3’ 5557-5576

Нумерация положения в геноме дана по Sagata et al.

Для выявления фрагмента из области гена GP51 использовали

«гнездовую» ПЦР. После 32 циклов амплификации с праймерами 1a и 1b в

режиме: 30 с при 940 С, 30 с при 550 С, и 40 с при 720 С, отбирали 5 мкл смеси и

проводили 30 циклов амплификации с праймерами 2a и 2b в том же режиме.

По окончании реакции к реакционной смеси добавляли 25 мкл хлороформа,

встряхивали на вортексе и разделяли фазы кратким центрифугированием.

Продукты ПЦР (15 мкл водной фазы и 2 мкл краски для нанесения)

анализировали электрофорезом в 2 % агарозном геле, приготовленном с

бромистым этидием, при напряжении 100В, до прохождения бромфеноловым

синим 2-3 см от линии старта, после чего гель фотографировали в проходящем

ультрафиолете с помощью цифровой видеокамеры, переводом изображения на

компьютер. Использование реамплификации с внутренними праймерами

повышает чувствительность реакции и позволяет выявлять наличие провируса в

геноме даже при небольшом числе копий, а также повышает специфичность,

так как в некоторых случаях после амплификации с внешней парой праймеров

помимо основного продукта амплификации наблюдается синтез

низкомолекулярных побочных продуктов.

Электронная микроскопия. Электронно-микроскопические

исследования нативных и культивированных in vitro лимфоцитов крови

крупного рогатого скота проводили на электронном микроскопе JEM 100 C на

кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМ и Б им К.И. Скрябина. Кровь

51

брали из яремной вены (20 мл). В качестве антикоагулянта использовали

гепарин (30 ед/мл). Эритроциты удаляли лизисом с помощью 0,85% раствора

хлористого аммония 3 – 5 минут, затем выделяли лейкоциты путем

центрифугирования при 1000 об/мин в течение 15 минут. После двукратной

промывки клетки подсчитывали в камере Горяева в растворе трипанового

синего для оценки их жизнедеятельности. Затем лейкоциты засевали из расчета

2 – 4 x 10 клеток на 1 мл среды, состоящий из 45% среды Игла с глутамином, 40

% среды 199, 15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и

антибиотиков.

Клетки культивировались 48 – 72 часа при t 37С. Процесс приготовления

препаратов для получения ультратонких срезов включает ряд этапов:

фиксацию, обезвоживание и заливку исследуемого материала в эпоксидные

смолы. Культивированные клетки фиксировали по Sabatini (1963) с

предварительной фиксацией исследуемого материала глутаровым альдегидом.

Последующую фиксацию проводили 1% раствором четырехокиси осьмия

на веронал-ацетатном буфере с добавлением сахарозы.

Фотографирование производили на сверхконтрастные диапозитивные

пластины при инструментальном увеличении микроскопа 5000 – 30000 раз.

Послеубойная диагностика. Оценка качества мяса и продуктов убоя

проводилась патологоанатомическим, гистологическим методами.

Патологоанатомические исследования проводили при послеубойном осмотре

туш и органов животных, обращали внимание на величину органов,

распространенность опухолевых разрастаний, их связь с лимфатическими

узлами и другими органами и тканями.

Гистологически исследовались органы: печень, сердце, лимфатические

узлы, селезенка, почки. При этом учитывали морфологию клеток различных

органов, их величину, форму, число незрелых пролиферирующих клеток и

нормальных клеток, характер распространения опухолевых клеток в паренхиму

органов.

52

Гистологические исследования органов и тканей проводили по

общепринятой методике (Пирс Э., 1962; Меркулов П.А., 1969). Исследуемый

материал фиксировали в 10%-водном растворе формалина, обезвоживали в

спирте, заключали в парафин с последующим приготовлением срезов и

окраской их гематоксилин-эозином.

Исследование мяса и органов убойного скота проводили согласно

«Правилам ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-

санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов». При органолептическом

исследовании туш руководствовались ГОСТом 7269-79 «Мясо. Методы отбора

образцов и органолептические методы определения свежести». При этом

наряду с выявлением патологических изменений в органах и тканях,

определяли внешний вид, и цвет поверхности туши, консистенцию мяса, запах,

состояние жира, сухожилий, прозрачность и аромат бульона.

Микробиологические исследования туш коров и их внутренних органов

проводили по ГОСТу 21237-75 «Мясо. Методы бактериологического анализа».

Физико-химические исследования (рН мяса, активности пероксидазы и наличия

продуктов первичного распада белков) – по ГОСТу 23392-78 «Мясо. Методы

химического и микроскопического анализа свежести мяса» и согласно «Правил

ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной

экспертизы мяса и мясных продуктов», М.1988

Пищевую ценность мяса устанавливали по относительному содержанию и

соотношению в нем влаги, жира, белков и минеральных веществ. Определение

влаги проводили по ГОСТу 9793-74 «Мясные продукты. Методы определения

содержания влаги», путем высушивания продуктов определения жира – по

ГОСТу 23042-86 «Мясо и мясные продукты. Метод определения жира». Жир

экстрагировали из сухой навески мяса летучими растворителями в приборе

Сокслета с последующей отгонкой растворителя и высушиванием жира до

постоянной массы. В качестве растворителя использовали этиловый спирт.

Содержание белка определяли по количеству общего азота минерализацией

пробы - по Кьельдалю (ГОСТ 25011-81 «Мясо и мясные продукты. Методы

53

определения белка»), отгонки аммиака в раствор серной кислоты с

последующим титрованием пробы. Содержание минеральных веществ (золы) в

мясе – путем сжигания навески в фарфоровом тигле в муфельной печи при

температуре 700°С.

Определение аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе

после кислотного гидролиза обезжиренной и высушенной навески в вакууме

при 105С в течение 24 часов.

Биологическую ценность мяса определяли на основании химических и

биологических методов. Санитарное качество мяса и других продуктов,

характеризующее их безопасность, определяли согласно П.П. 10.2.11, 10.11.

«Правил ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной

экспертизы мяса и мясных продуктов» М.1988 с помощью бактериологических,

физико-химических, молекулярно-биологических методов (ПЦР) исследования.

Токсичность мяса определяли с помощью реснитчатых инфузорий

Tetrachymena pyriformis, которые имеют сходство с высшими организмами по

основным параметрам обмена веществ (Долгов В.А., 1993). Опыты на

инфузориях проводили согласно «Методическим рекомендациям по

использованию инфузорий Tetrachymena pyriformis для токсико-биологической

оценки сельскохозяйственных продуктов», «Методическим рекомендациям для

использования экспресс-метода биологической оценки продуктов и кормов» и

методическим рекомендациям «Использование инфузорий (Tetrachymena

pyriformis) в качестве тест-культуры в приборе «Биотестер-2 (экспресс-метод)».

Цифровой материал экспериментальных исследований обрабатывали

согласно «Методическим указаниям к методу вычисления

среднеквадратической ошибки и доверительных интервалов средних

арифметических величин» (Жаков М.С., 1985; Плохинский Н.А., 1979).

54

2.2.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1.Ретроспективный анализ распространения лейкоза в некоторых

областях Российской Федерации

Лейкоз имеет широкое распространение среди крупного рогатого скота на

территории Российской Федерации. Количество больных лейкозом животных в

последние годы увеличивается, несмотря на снижение общего поголовья

крупного рогатого скота по стране в 2 и более раза. Официальный уровень

инфицированности скота вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в

среднем по стране составляет 10,0-12,3% от числа исследованных животных

(Федотов В.П., Иванов О.В., 2006), с колебаниями в различных регионах от 5

до 80%.

Мы поставили задачу – изучить ретроспективные данные по

эпизоотологической ситуации, распространению лейкоза в Калужской,

Брянской и Московской областях Центрального ФО Российской Федерации и

их корреляции с послеубойным выявлением болезни. Поскольку изучение

эпизоотологической ситуации является первым звеном в диагностике лейкозов

мы проанализировали данные ветеринарной отчетности и боенской статистики

по лейкозу крупного рогатого скота за 1994-2009гг и результаты собственных

исследований за последние 10 лет.

При оценке эпизоотологического статуса крупных территориальных

субъектов по лейкозу обычно используют только данные отчетов формы 1-

вет.А, отражающие изменение числа неблагополучных пунктов и заболевших

животных. Такая оценка недостаточно объективна. При этом не учитывается

целый комплекс других важных показателей, свидетельствующих об уровнях

охвата поголовья гематологическими и серологическими исследованиями,

количестве гематологически и РИД-положительных животных, частоте

выявления патологических изменений, свойственных лейкозу при

послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизе.

Учитывая сказанное, для сравнительной оценки распространенности

лейкоза, выявления инфицированности ВЛКРС и гематологически больных

55

животных мы сочли необходимым использовать комплекс доступных

статистических данных;

-Численность поголовья крупного рогатого скота как основной показатель

определения процента инфицированности, заболеваемости лейкозом и оценки

эффективности изменений эпизоотологической обстановки;

-Результаты и общее количество гематологических исследований.

Анализировали погодовую динамику числа положительных результатов и

плановых гематологических исследований, отраженных в официальной

ведомственной отчетности и в отчетах лабораторий;

-Показатели серологических исследований с учетом инфицированности

ВЛКРС. Анализировали и сравнивали погодовую динамику числа

положительных результатов серологического тестирования, отраженную в

ведомственных отчетах и отчетах лабораторий;

-Результаты ветеринарно-санитарной экспертизы, проведенной на

мясокомбинатах, убойных пунктах и рынках. Учет показателей выявления

животных с патологическими изменениями, характерными для лейкоза, и

данные о числе утилизированных туш позволяли уточнить эпизоотологический

статус соответствующих регионов;

-Результаты гистологических исследований – как подтверждение диагноза

на лейкоз и определение формы опухолевого процесса.

Калужская область

Статистические данные комплексных исследований крупного рогатого

скота на лейкоз в Калужской области представлены в таблице 3.

При анализе данных, представленных в таблице 3 видно, что поголовье

крупного рогатого скота в Калужской области с 1994года резко снизилось. Если

в 1994г. было 325000 голов крупного рогатого скота, то к 2009 г. стало в 2,5

раза меньше – 122000 голов. Однако количество зараженных ВЛКРС животных

не уменьшилось, в первую очередь потому что, количество РИД

положительных животных в течение 15 лет оставалось достаточно высоким

11,8-41,0%

56

Таблица 3

Динамика комплексных исследований крупного рогатого скота на лейкоз в

Калужской области

Годы Пог.

всего

Гем.

иссл.

Гем.

Поло

ж.

% Всего

РИД

Полож.

РИД

% мясокомбинат

Обна

р.

Утил. %

1994 325000 36906 1513 2,4 76593 21748 28,3 143 93 65,0

1995 296105 226261 8121 10,6 80078 68247 37,3 155 83 53,5

1996 296000 230948 1597 0,84 108111 44296 41 182 98 53,8

1997 223000 201843 2129 1,1 79831 22532 28,2 135 73 54,1

1998 197800 197562 2258 1,25 161553 43955 27,2 155 60 38,7

1999 182300 176631 2222 1,55 115133 22340 17,5 84 38 45,2

2000 172224 157693 1724 1,4 125162 23846 18,0 97 40 41,2

2001 167217 142522 2003 1,7 119890 21020 14,8 82 45 54,9

2002 157062 131852 1688 1,6 129379 28107 21,2 70 36 51,4

2003 137799 118996 1466 1,6 114850 21816 18,9 53 33 62,3

2004 152000 99300 1669 1,7 105000 15419 14,7 45 16 35,5

2006 137700 87660 1326 1,5 125000 19688 15,8 24 0 -

2007 121200 73454 1430 1,9 78932 10812 13,7 18 0 -

2008 119300 65924 2044 3,1 85158 10475 12,3 15 0 -

2009 122000 64521 1033 1,6 92354 10898 11,8 15 0 -

Небольшое число гематологически положительных животных (1466-8121

голов) связано с выбраковкой в хозяйствах РИД положительных животных.

Высокий процент утилизированных туш на мясокомбинатах показывает, что у

животных в опухолевой стадии болезни почти всегда поражаются внутренние

органы, но таких животных не много. Известно, что самым эффективным

методом ликвидации лейкоза является своевременный убой больных

животных. Вследствие этого ежегодно на мясокомбинатах Калужской области

перерабатывается значительное количество серологически позитивных

животных. Наибольшее число таких животных было убито в 1996 году – 182

головы. В 1998 году – 155 головы, а в 2000г это число резко сократилось до 84

голов и наблюдается тенденция к уменьшению числа таких животных (2009 –

15голов.)

57

0

10

20

30

40

50

60

70

1994 1996 1998 2000 2002 2004 2007 2009

% гем+

%РИД+

% утилиз.

Рис 1. Результаты прижизненной и послеубойной диагностики лейкоза у

крупного рогатого скота в Калужской области

Из гистограммы четко видно, что за весь период исследования

инфицированность коров ВЛКРС, определяемая в РИД, сохранялась на

высоком уровне, до 41%, гематологически положительных на лейкоз было от

0,84 до 10,6%. При ветеринарно-санитарной экспертизе на мясокомбинатах

было выявлено от 53 до 182 лейкозных туш, из них утилизировано лишь 65%.

Московская область

Московская область была и остается неблагополучной по лейкозу,

несмотря на это, как видно из таблицы, количество РИД положительных

животных (min 8,3%; max 24,0%) ниже, чем в Калужской области (min 12,0%;

max 18,5%), видимо, это связано с тем, что еще не все хозяйства области ведут

плановую и интенсивную борьбу с лейкозом. Есть фермы, на которых

уничтожение больных лейкозом животных привело бы к уничтожению всего

стада. В этой связи ветеринарные врачи удаляют из стад животных,

гематологически положительных на лейкоз и РИД положительных к антигенам

ВЛКРС. Поэтому при ветеринарно-санитарной экспертизе на мясокомбинатах

число обнаруженных туш с поражением скелетной мускулатуры и внутренних

органов невелико, а в последние годы (2000-2009гг.) такие туши не

выявляются. На рис 2 наглядно представлены перечисленные показатели.

58

Таблица 4

Динамика комплексного исследования крупного рогатого скота на лейкоз в

Московской области

Года Гемм.

иссл.

Гем.+

% Всего

РИД

РИД

+


Обнар. Утилиз. %

1994 448103 - 12,5 - - - 211 180 85,3

1995 388600 4580 1,4 381297 183456 24 70 50 71,4

1996 356068 5097 1,7 368769 67536 18,3 70 48 68,6

1997 290938 5641 2,1 290649 45798 15,8 52 40 76,9

1998 296674 4730 1,7 278578 44705 17,0 - - -

1999 291830 4423 6,7 310258 50715 16,3 57 25 43,9

2000 292991 5362 1,9 289772 46356 16,0 - - -

2001 282661 7027 2,5 294825 42366 14,4 - - -

2002 263259 5555 2,1 285496 39651 8,3 - - -

2003 256578 4781 1,7 295526 76665 16,1 - - -

2004 218400 8362 3,83 295000 42160 14,3 32 - -

2006 262467 5672 2,1 383139 48818 12,7 30 - -

2007 145381 6443 4,4 239907 25349 10,6 16 - -

2008 146674 10707 7,3 248100 28035 11,3 28 - -

2009 116700 5718 4,9 242479 27158 11,2 20 - -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1994 1996 1998 2000 2002 2004 2007 2009

% гем +

% РИД +

% Утилиз

Рис. 2. Результаты прижизненной и послеубойной диагностики лейкоза

крупного рогатого скота в Московской области

59

Брянская область

Таблица 5

Динамика комплексного исследования крупного рогатого скота на лейкоз в

Брянской области

Года Всего

погол.

Иссл.

гем.

Гем.

+

% Всего

РИД

РИД

+


Обнар. Утилиз. %

1994 487834 178358 3384 1,9 196724 21427 10,8 78 18 23,1

1995 445117 22894 3141 6,3 110653 14337 12,4 58 7 12,1

1996 365444 20586 1805 2,1 116613 15810 13,6 - - -

1997 287732 22844 1486 7,2 139483 20524 14,7 24 24 60

1998 267200 35195 2530 8,0 171808 29164 16 139 82 58,9

1999 258152 35498 2281 7,1 176908 25584 14,4 5 2 40,0

2000 279353 45009 2091 4,8 191857 35573 18,5 261 51 19,5

2001 229300 53088 2018 4,0 192886 29180 15,1 18 15 19,5

2002 337500 69194 2826 4,3 327475 58432 17,8 1 1 79

2003 315600 64860 2630 4,3 307770 45677 14,8 - - -

2004 275300 55900 1949 3,5 265900 29918 11,3 - - -

2006 237400 54851 1838 3,3 206867 26293 12,7 13 - -

2007 219500 38408 784 2,0 165146 13942 8,8 17 - -

2008 205200 34234 685 2,0 152303 11575 7,6 20 - -

2009 210500 33316 634 1,9 137732 11156 8,1 - - -

Как видно из таблицы 5 и гистограммы 3, процент инфицированности

ВЛКРС и больных животных значительно колеблется по годам. Наибольший

процент инфицированности (18,5%) зарегистрирован в Брянской области в

2000 году. Поголовье крупного рогатого скота в последующие годы резко

сократилось, с 487834 гол.(1994) осталось 210500 гол.(2009г.) – количество

больных лейкозом животных с 1,9% возросло до 4,3%, инфицированность

ВЛКРС осталась на высоком уровне до – 14,8%.

60

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1994 1996 1998 2000 2002 2004 2007 2009

% гем +

% РИД +

% Утилиз

Рис 3. Результаты прижизненной и послеубойной диагностики лейкоза у

крупного рогатого скота в Брянской области

Таким образом, анализ статистических данных по трем областям

Центрального ФО России, в хозяйствах, которых мы работали, показал, что

несмотря на совершенствование профилактических мероприятий мер борьбы с

лейкозом, уменьшением численности поголовья крупного рогатого скота в два

с лишним раза, количество инфицированности животных неуклонно растет.

Небольшое количество туш и органов с признаками лейкоза, выявляемые на

мясокомбинатах, говорит о том, что большинство животных сдают на убой в

стадии вирусоносительства, в бессимптомный или субклинический

(гематологический) период развития лейкоза и поэтому туши и органы этих

животных поступают на реализацию без ограничений.

2.2.2.Сравнительная оценка прижизненных методов диагностики

лейкоза крупного рогатого скота

Ввиду отсутствия специфических средств по профилактики и лечению

лейкоза крупного рогатого скота, основу борьбы с данной болезнью составляют

диагностические исследования, позволяющие своевременно выявить и

провести соответствующие противолейкозные мероприятия. В первую очередь

– удаление из неблагополучных по лейкозу стад животных инфицированных

ВЛКРС и больных лейкозом и их убой на мясоперерабатывающих


61

Сведенья об оценке мяса и продуктов убоя крупного рогатого скота

больных лейкозом противоречивы и требуют уточнения, начиная с

прижизненной диагностики.

В связи с вышесказанным мы поставили первоначальную задачу провести

прижизненную, предубойную диагностику крупного рогатого скота на лейкоз с

помощью комплекса классических и современных молекулярно-биологических

методов исследования.

Клинический метод

Исследования проведены на поголовье крупного рогатого скота СПК

«Уручье» Брянской области и совхоза «Можайский» Московской области

неблагополучных по хроническому лимфолейкозу.

В СПК «Уручье» было проведено клиническое обследование 233 голов

крупного рогатого скота (в возрасте 5-8 лет). У 5-ти животных наблюдали

опухолевую стадию лейкоза. Больные коровы угнетены, едят не охотно, много

лежат, температура, пульс, дыхание в пределах нормы. Эти признаки не

являются специфическими для лейкоза.

Характерными клиническими признаками лейкоза крупного рогатого скота

является прогрессирующее увеличение поверхностных лимфоузлов. У больных

коров отмечали:

-увеличение разной степени нижнечелюстных, поверхностных паховых,

надколенных и параанальных. Лимфатические узлы увеличены в несколько раз,

при этом не наблюдали их воспалительных реакций. При пальпации

лимфатические узлы плотной консистенции, холодные, безболезненные,

подвижные.

- у одного животного выявили опухоли размером 4-6 см под кожей в

различных участках тела.

- у другого животного наблюдали экзофтальм

- при ректальном исследовании у 2-х коров обнаруживали увеличение

тазовых (глубоких паховых) лимфоузлов. Все животные с опухолевой стадии

болезни были старше 5-ти лет.

62

В таблице 6 представлены данные клинического обследования больных

лейкозом животных.

Таблица 6

Клиническое обследование коров, больных лейкозом.

п/п

порода

Воз

раст

Исследования поверхностных

лимфоузлов

исследования

тазовых лимфоузлов

1

2

3

4

5

2116

1308

8651

6231

2131

6

8

8

5

7

Увеличены лимфоузлы коленной

складки, поверхностно шейные,

они плотные, подвижные,

эластичные, размер 5 – 8 см.

Увеличены нижнечелюстные,

околоушные и надвымянные

лимфоузлы.

Симметричное увеличение

лимфоузлов коленной складки

Увеличение нижнечелюстные

лимфоузлы

Увеличены все поверхностные

лимфоузлы - головы, шеи,

коленной складки

Без изменений


Увеличены, плотной

конс.,

размер с куриное

яйцо


Увеличены

У животного №2131 установили перкуссией увеличение селезенки.

На рисунке 4 коровы с четко выраженными клиническими признаками

лейкоза: экзофтальм, увеличение нижнечелюстных, наружных подвздошных,

лимфоузлов коленной складки. Животные на момент исследования сохраняли

удовлетворительную и хорошую упитанность и удои.

Перечисленные животные находились в клинической (терминальной,

опухолевой) стадии лейкоза.

63

Рис. 4 Увеличение нижнечелюстных лимфоузлов.

Рис. 5. Увеличение лимфатического узла коленной складки.

Остальные 228 животных не имели клинических признаков лейкоза

крупного рогатого скота. Из литературных данных известно, что клинические

признаки лейкоза крупного рогатого скота проявляются лишь в 2-5 % случаев

из числа больных животных. В этой связи только клиническое обследование не

позволяет поставить диагноз на лейкоз. В исследуемом хозяйстве у животных

выявлялась патология с похожей на лейкоз клинической картиной:

эндометриты, маститы, заболевания печени и почек, травматические

64

ретикулиты, которые сопровождались увеличением регионарных

лимфатических узлов и лейкемоидными показателями крови. Для более точной

диагностики требовались дополнительные исследования.

Серологический метод

Для комплексной прижизненной диагностики лейкоза КРС согласно

«Правилам по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота»

М.1999г, мы провели серологические, гематологические, цитоморфологические

(ЭМ) и молекулярно-биологические (ПЦР) исследования. У животных

зараженных ВЛКРС вырабатываются антитела к вирусным антигенам, которые

выявляются с помощью серологических реакций и в первую очередь в реакции

иммунодиффузии (РИД). Характерная особенность вируса лейкоза КРС

появление специфических антител в крови через 2-8 недель после заражения

животных и их пожизненное сохранение в организме инфицированных особей.

Поэтому серологические методы обнаружения специфических сывороточных

антител являются наиболее практичными, экономичными и широко

используются в диагностике онкорновирусной инфекции (особенно в

бессимптомной стадии лейкозогенеза) у крупного рогатого скота.

Для выявления вирусоспецифических антител мы брали пробы крови от

233 голов крупного рогатого скота черно-пестрой породы и исследовали в

реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) по стандартной методике.

Установлено, что сыворотки крови 155 животных были положительными в

РИД (таблица 7) к антигенам ВЛКРС.

Таблица 7

Результаты серологической диагностики

ВОЗРАСТ

ЖИВОТ

НОГО, ЛЕТ

ИССЛЕДО

ВАНО С

ПОМОЩЬЮ

РИД

ВЫЯВЛЕНО

ЗАРАЖЕННЫХ ВЛКРС,

РИД ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ

ОТРИЦАТЕЛЬНО

РЕАГИРУЮЩИЕ

В РИД.

%

ИНФИЦИР

ОВАННОС

ТИ

2-5 153 100 53 65,36

6-8 80 55 25 68,75

65

Сыворотки 78 голов крупного рогатого скота дали отрицательную реакцию

в РИД к антигену ВЛКРС. Это может определятся специфичностью реакции,

недостаточностью количества антител или их отсутствием на момент

исследования.

Животные, сыворотки которых дали положительный результат в РИД,

считаются зараженными вирусом лейкоза, их необходимо исследовать

гематологическим методом.

Гематологический метод

Развитие лейкозного процесса характеризуется нарушением гемопоэза. В

периферической крови наблюдают количественные и качественные изменения

клеток, особенно лейкоцитов, являющихся одним из существенных признаков

лейкоза. Увеличение количества лимфоцитов в крови появляется через

несколько лет после начала заболевания и предшествует клиническим и

патологоанатомическим изменениям у больного лейкозом крупного рогатого

скота.

Гематологический метод заключается в количественной и качественной

оценке лейкоцитов периферической крови животных для ранней диагностики

болезни на всех стадиях ее развития.

Кровь для этих исследований брали из яремной вены в пробирку с

антикоагулянтом (ЭДТА). Подсчет количества лейкоцитов проводили при

помощи гематологического анализатора COBAS MIRA (Щвейцария).

Гематологическим исследованиям подверглись 155 проб крови РИД

положительных животных, из них при оценке по «лейкозному ключу» 10

оказались положительными на лейкоз, то есть количество лейкоцитов было от

10,8тыс до 32,0 тыс/мкл. Процент лимфоцитов выше 70%.

Основным диагностическим критерием в определении ранних стадий

лейкоза является дифференциальный подсчет лейкоцитов (выведение

лейкоцитарных формул) для установления относительного и абсолютного

количества лимфоцитов.

66

Таблица 8

Лейкограмы крупного рогатого скота на разных стадиях ХЛЛ.

п/№ Стад

ии

ХЛЛ

Количество

лейкоцитов

крови

Тыс/мкл; 109

%

лимфоцитов

в крови

нейтрофилы Эоз

%

Баз

%

Моноц

% пал% Сегм

%

2670

377

2661

1847

845

I

6,200

9,000

8,600

5,500

5,500

60

62

68

49

44

2

1

4

3

2

33

30

26

37

37

2

4

1

7

16

1

0

1

2

3

1

3

1

221

2949

519

194

2503

II

14,000

19,400

12,500

10,800

12,500

70

78

72

75

81

1

0

1

4

1

24

18

20

16

16

1

2

4

1

1

2

0

1

1

0

2

2

2

3

1

2116

1308

8651

6231

2131

III

14,600

29,600

18,000

27,000

32,000

80

84

80

82

90

2

2

1

1

2

10

8

16

14

6

2

1

2

3

1

2

2

0

0

0

4

3

1

0

1

р≤0,05

I -бессимптомная (онкорновирусная инфекция);

II – гематологическая (без клинических признаков)

III - опухолевая (терминальная).

В таблице 8 представлены исследования лейкограмм 15 РИД

положительных коров, в том числе пяти с клиническими признаками лейкоза и

сформировали 3 группы животных с разными стадиями развития лейкозного

процесса.

Данные таблицы показывают достоверное увеличение лейкоцитов на

ранних стадиях лейкозогенеза. Из лейкограмм исследованных животных видно

увеличение содержания количества лейкоцитов и % лимфоцитов как

показателей развития болезни. Гематологический метод прижизненной

67

диагностики довольно трудоемкий и практически не позволяет распознать

больных животных при алейкемическом течении болезни.

Исследование крови коров с помощью ПЦР

Гематологические изменения также как патологоанатомические

появляются довольно поздно. Им обычно предшествуют появление в

лимфоцитах онкорновируса типа С ВЛКРС. Выявить вирус лейкоза

инкорпорированный в геном лимфоцита можно с помощью реакции

полимеразных цепей (ПЦР).

Для постановки ПЦР на выявление провирусной ДНК лейкоза крупного

рогатого скота были получены пробы ДНК, выделенные из цельной крови

коров. Всего в ПЦР было исследовано 15 проб ДНК крови с праймерами,

направленными на выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Использовали диагностический набор серии Pak DNA PCR test BLV(gag).

В качестве положительного контроля использовали ДНК выделенную из

перевиваемой культуры клеток почки эмбрионы овцы, хронически

инфицированной ВЛКРС (FLK), в качестве отрицательного контроля

использовали дистиллированную воду.

Результаты исследованной крови серологически положительных и

серологически отрицательных коров с помощью ПЦР представлены в таблице

9.

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР после амплификации

фрагмента гена gag вируса лейкоза крупного рогатого скота.

68

Таблица 9

Исследование крови серологически положительных и серологически

отрицательных коров с помощью ПЦР

Инв.№

жив.

Сентябрь 2004 гг. март 2005 гг. Сентябрь 2005 гг.

РИД ПЦР РИД ПЦР РИД ПЦР

563

1062

2017

969

1869

2670

377

2661

1847

845

221

2949

519

194

2503

2116

1308

8651

6231

2131

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

-

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

-

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

-

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Исследования показали, что используя ПЦР можно выявить положительно

реагирующих животных на 10% больше, чем при серологическом методе –

РИД.

С помощью ПЦР подтверждено наличие провирусной ДНК вируса лейкоза

у серологически положительных животных, а также у отдельных серологически

отрицательных животных.

Таким образом, примененный метод ПЦР дает возможность более точно

определить животных, инфицированных ВЛКРС на ранних стадиях развития

болезни до выявления антител и решать судьбу животных на завершающем

этапе оздоровления хозяйства, а также учитывать эти данные при оценке

качества и безопасности продуктов убоя.

69

Электронно-микроскопический метод

В настоящее время для прижизненной дифференциальной и экспресс

диагностики гемабластозов на начальных стадиях лейкозного процесса в

хорошо оснащенных центрах применяется трансмиссивная электронная

микроскопия.

Рис. 7. Лимфоцит из периферической крови здоровой коровы.

Мы провели электронно-микроскопические исследования лимфоидных

клеток крови 15 животных. 5 клинически здоровых, но серологически

положительных, 5 больных лейкозом коров в гематологической стадии и 5

голов в опухолевой стадии болезни. Лимфоидные клетки крови здоровых

животных в основном были представлены малыми и средними лимфоцитами с

ровной или извилистой поверхностью, изредка встречались менее

дифференцированные клетки типа больших лимфоцитов и лимфобластов. У

инфицированных ВЛКРС животных в лимфоцитах находили аномальные

образования в ядрах лимфоцитов – ядерные карманы. У здорового скота из

благополучных по лейкозу хозяйств аномалий ядра не обнаружили. На рис 7

представлен лимфоцит из периферической крови здоровой коровы. Хорошо

70

видны все органеллы клетки: ядро цитоплазматические включения,

митохондрии, эндоплазматические вакуоли.

На гематологической и опухолевой стадиях в периферической крови

выявляли лимфоциты небольших размеров (до 10 мк), которые имели

нормальную величину, но существенно отличались от нормальных клеток по

ультраструктуре отдельных органелл. Как в малых, так и в больших

лимфоцитах и лимфобластах, обнаружили характерные изменения

митохондрий (дискомплексацию и деструкцию крист), увеличение их

количества, гипертрофию эндоплазматического ретикулума и аппарата

Гольджи. Наиболее важные ультраструктурные изменения находили в ядре –

были многочисленные карманы, инвагинаты, фибриллярные комплексы. У

инфицированных ВЛКРС животных в бессимптомной стадии находили от 1 до

6% лимфоцитов с ядерными карманами, при гематологической от 7 до 20%, в

терминальной от 28% и выше.

На рисунках 8, 9 представлены лейкозные лимфоциты с характерными

ядерными аномалиями в виде ядерных карманов. В нативных лимфоцитах

крови на всех стадиях лейкозного процесса мы не обнаружили вирионов вируса

лейкоза.

Однако в 16,5-48,3% короткоживущих 48 часовых культурах лейкоцитов

крови серопозитивных животных выявили лимфоидные вирусопродуцирующие

клетки. Вирионы ВЛКРС имели типичные для ретровируса типа С размеры и

структуру: двухконтурную поверхностную мембрану, электронно-прозрачный

промежуточный слой, электронно-плотный нуклеоид. Размер зрелой вирусной

частицы составляет до 120 нм. На рисунках 8,9 многочисленные вирионы

ВЛКРС.

71

Рис. 8. Электронограма вирионов ВЛКРС на поверхности

лимфоидных клеток из 48 часовой культуры лейкоцитов крови

коровы больной лейкозом. х 52000

Рис 9. Культура лейкоцитов крови больной лейкозом коровы.

х 38000

72

Рис. 10. Ультратонкий срез лимфоцита из крови коровы с

онкорновирусной инфекцией, (РИД+) x 22000

Рис. 11. Ультратонкий срез лимфоцита крови с ядерными

карманами, при хроническом лимфолейкозе.

(Гематологическая стадия) x 18000.

73

Таблица 10

Комплексное исследование здорового и больного лейкозом крупного рогатого

скота.

животные Кол-во

лейкоцитов

тыс/мкл

min-max

% лимфоцитов

min-max

Электронная

микроскопия

Наличие

ВЛКРС

in vitro

%

лимфоцитов

с ЯК на

250кл

Контроль

Клинически

здоровые n=5,

РИД-; ПЦР -;

5500-6700

50-60

-

-

Инфицированные

ВЛКРС n=5,

РИД+; ПЦР+

6960-13500

65-70

+

2,91+0,85

Больные ХЛЛ

n=5,

Гематологическая

стадия ПЦР +

13800-21700 80-87

+

7,12+1,61

Опухолевая

стадия n=5, ПЦР+

24200-45100 90-93

+

28,01+5,01

p ≤ 0,05

Из таблицы 10 видно, что данные по ПЦР и электронной микроскопии

полностью совпадают. Четко показано, что в периферической крови на всех

стадиях лейкоза имеются лейкознотрансормированные лимфоциты, в геном

которых включен провирус лейкоза крупного рогатого скота.

Эти два метода позволяют прижизненно прогнозировать качество

получаемой продукции после убоя животных.

Современные методы прижизненной диагностики гемабластозов

позволяют с меньшей (РИД) или большей (ПЦР, ЭМ) степенью достоверности

установить наличие вируса лейкоза и наличие лейкознотрансформированных

лимфоцитов в периферическом пуле крови крупного рогатого скота на всех

стадиях лейкозного процесса.

74

Однако основные изменения при лейкозе заключаются в

патологоанатомическом разрастании злокачественно трансформированных

клеток кроветворной ткани в органах гемопоэтической системы и в других

жизненноважных органах не связанных с кроветворением. Эти изменения

выявляются при послеубойной диагностике методами патологоанатомических

и гистологических исследований.

Предубойный осмотр животных. Перед убоем животные на разных

стадиях лейкозного процесса подверглись клиническому осмотру,

взвешиванию, определению упитанности. У животных в бессимптомной и

гематологической стадиях отклонений от физической нормы не выявлено. У

животных в опухолевой стадии отмечали угнетение, вялость, бледность

видимых слизистых оболочек, расстройство сердечной деятельности.

2.2.3.Послеубойная диагностика

Патологоанатомические исследования

Патологоанатомические исследования проводят при послеубойном

осмотре туш и органов животных. Они являются заключительным этапом в

диагностике лейкоза крупного рогатого скота и определении стадий

лейкозогенеза, а также основными при ветеринарно-санитарной экспертизе

туш и органов.

Нами был собран материал от 15 голов крупного рогатого скота,

подозреваемого в заболевании лейкозом из СПК «Уручье», а также от 68 коров

черно-пестрой породы из неблагополучных хозяйств Бабынинского,

Думинического, Жиздренского, Людиновского и других районнов Калужской

области, убой которых был произведен на Калужском мясокомбинате и от 20

коров на Можайском мясокомбинате.

На Можайском мясокомбинате при убое 20 коров только у одной

определили опухолевую стадию заболевания с изменениями в лимфатических

75

узлах и селезенке. 19 животных были с бессимптомной стадией течения

лейкозного процесса.

На Калужском мясокомбинате из 68 животных в опухолевой стадии

обнаружено 3 головы. Возраст коров с видимыми изменениями в органах был

от 8 до 10 лет. 25 животных поступивших на мясокомбинат были

гематологически положительными и 40 серологически положительными.

При послеубойном осмотре туш и органов больных лейкозом животных

установлено, что опухолевые образования в большей мере появляются у

животных с количеством лейкоцитов в крови 25-30 тыс/мкл и содержанием

лимфоцитов 75-80%

Послеубойная диагностика лейкозов при системном поражении (48%)

или поражении отдельных групп лимфатических узлов и др. органов (31-35%)

особых трудностей не представляет, так как в них можно обнаружить

макроскопически или гистологически характерные для лейкоза

морфологические изменения. Однако послеубойная статистика

свидетельствует, о том, что в настоящее время поступают на убой и подлежат

ветеринарно-санитарной экспертизе животные на ранних стадиях развития

лейкоза, в том числе и до проявления клинико-анатомических изменений.

Также доказано, что нет прямой корреляции между патоморфологическими и

гематологическими изменениями.

Следует помнить, что послеубойные и патоморфологические изменения

при лейкозе крупного рогатого скота достаточно характерные для данной

болезни и в комплексе с другими методами позволяет убедительно ставить

диагноз, что обязывает ветеринарно-санитарных экспертов

мясоперерабатывающих предприятий использовать объективные возможности

этого метода в сомнительных и спорных случаях.

В этой связи мы провели тщательные патанатомические и

гистологические исследования с четкой ориентацией на прижизненную

76

диагностику, а также осмотр туш и органов животных при трех стадиях

лейкозогенеза. (бессимптомной, гематологической и опухолевой.)

В бессимптомной стадии (РИД+) в тушах и органах животных не было

обнаружено ни патологоанатомических ни гистологических изменений,

свойственных ХЛЛ. При послеубойной осмотре туш и органов животных во II

и III-ей стадиях развития лейкозного процесса отмечали разную степень

увеличения селезенки, лимфоузлов, печени, сердечной мышцы и других

органов. Мы обращали внимание на величину органов, распространение

опухолевых разрастаний, их связь с лимфоузлами и другими органами и

тканями, наиболее постоянны изменения наблюдали в селезенке.

Рис. 12. Лимфоидный лейкоз. Селезенка увеличена, капсула напряжена.

При осмотре селезенки при гематологической стадии ХЛЛ отмечали

незначительное увеличение этого органа в 1,5-2 раза, консистенция плотная, на

разрезе четко выделяются красная и белая пульпа, хорошо видны увеличенные

фолликулы, величиной с зерна гороха. В третьей (терминальной) стадии

лейкоза селезенка светло-красного цвета с бурым или темно-коричневым

оттенком, на разрезе малинового цвета. При этом масса селезенки была 27 кг,

капсула напряжена, поверхность бугристая, серо-белые фолликулы. Все

вышеизложенное хорошо видно на рисунке 12.

77

При лимфоидном лейкозе крупного рогатого скота поражаются в

большинстве случаев внутренние (II стадия) и поверхностные лимфатические

узлы (III стадия). При опухолевой стадии течении процесса лимфатические

узлы увеличены в 1,5- 2 раза, сливались в сплошные конгломераты.

Лимфатические узлы оказались системно равномерно увеличены у

четырех животных в гематологической, и у 5 в тушах животных в опухолевой

стадиях.В туше коровы 2131 лимфоузлы имели размеры 16х6 см и более.

Рис13.

Рис. 13. Увеличение надвымянного лимфоузла.

Разрост лимфоидной ткани.

Рис. 14. Кровоизлияния в надвымянном лимфатическом узле.

78

Они были плотной консистенции, между собой и окружающей тканью не

сращены, капсула снимается легко, поверхность гладкая. На разрезе ткань

сочная, саловидная, грязно-серого цвета со сглаженным рисунком и

небольшими некротическими участками желтого или коричневатого цвета и

очаговыми кровоизлияниями.

При всех формах лейкоза лимфатические узлы тазовой области

поражены чаще и интенсивнее, чем в грудной и брюшной полостях.

Из некроветворных органов чаще находили опухолевые разрастания в

сердце. Преимущественно в правом предсердии и ушке. При диффузном

поражении органа отмечали серо-белые разлитые разрастания.

Печень поражается реже, чем селезенка. Мы обнаружили изменения в

печени в виде саловидных, серо-белых узелков размером с горошину в тушах

2х животных 2-ой гематологической стадии и 3-х животных в опухолевой

стадии лейкозного процесса. В опухолевой стадии болезни в других органах –

сычуге, почках, легких, матке, скелетных мышцах наблюдали отдельные

очаговые или диффузные разрастания серо-белого или серого цвета. У одного

животного (в III стадии) обнаружили опухолевые разрастания в тонком и

толстом отделах кишечника.

Анализируя проведенные исследования можно сделать вывод,

лимфоидный лейкоз крупного рогатого скота является болезнью всего

организма и проявляется специфическими изменениями большинства органов.

Именно патоморфологические изменения в мясных тушах и органах лежат в

основе существующей ветеринарно-санитарной экспертизы, оценке их

качества и определения путей реализации мясной продукции.

Гистологические исследования

Проводятся для уточнения формы и стадии лейкозного процесса. При этом

мы учитывали морфологию клеток различных органов (лимфоузлов, селезенки,

сердца, печени, почек), их величину, форму, число незрелых

79

пролиферирующих и нормальных клеток, характер распространения

опухолевых клеток в паренхиму.

С учетом сказанного при гистологическом исследовании перечисленных

органов, мы установили отсутствие изменений в строении и морфологии

клеток при бессимптомной стадии (онкорновирусной инфекции РИД+

животных) лейкоза крупного рогатого скота.

Начальная гематологическая стадия болезни характеризуется

незначительным увеличением лейкоцитов крови (9-20 тыс/мкл), стойким

лимфоцитозом до 80%, отсутствием других клинических изменений.

При гистологическом исследовании у некоторых животных выявили

инфильтрацию капсулы лимфоузлов головы и шеи лимфоидными клетками.

Рисунок строения лимфоузлов слегка стерт, фолликулы теряли четкость

границ, паренхима была интенсивно гиперплазирована лимфоидными

клетками. Находили расширение реактивных центров, лимфоидную

инфильтрацию трабекул и синусов лимфоузлов. (рис 15,16.)

Рис. 15. Лимфоидная инфильтрация капсулы лимфотического узла

коленной складки. Окраска гематоксилин-эозином. Ув.10х20

80

Рис. 16. Заглоточный лимфотический узел больной хроническим

лимфолейкозом коровы. Инфильтрация трабекулы и синусов опухолевыми

лимфоцитами. Окраска гемотоксилин-эозином; ув.10х20

В зависимости от интенсивности лейкозного процесса находили

изменения размеров и строения селезенки. Микроскопически в селезенке

выявляли очаговую или диффузную лимфоидную инфильтрацию паренхимы,

стирание границ белой и красной пульпы засчет инфильтрации лимфоидными

клетками, инфильтрацию трабекул лимфоидными клетками и атрофию

соединительной ткани трабекул.

При гистологическом исследовании печени, почек, сердца при

гематологической стадии выявлены единичные очаговые лимфо-

гистиоцитарные инфильтраты. Изменения в сердце, скелетной мускулатуре

отсутствовали. У 5 коров в опухолевой стадии ХЛЛ (с выраженными клинико-

анатомическими изменениями, с увеличением, количества лейкоцитов крови

до 35 и более тыс/мкл) установлены четкие лейкозные поражения отдельных

наружных (поверхностных шейных, коленной складки, нижнечелюстных) и

внутренних (средостенных, брыжеечных, почечных) лимфатических узлов.

При микроскопическом исследовании установили диффузные и диффузно-

81

очаговые лейкозные инфильтраты в паренхиматозных органах: сердце, печени,

почках.

Рис. 17. Селезенка. Стирание границ белой и красной пульпы. Окраска

гемотоксилин-эозином; ув.10х20

Рис. 18. Лейкозная инфильтрация почки при хроническом

лимфолейкозе. Ув.10х40

82

Рис. 19. Лимфоидная инфильтрация синусов и зернистая дистрофия

печени при хроническом лимфолейкозе. Окр. гем.-эозином; ув.10х40

Рис. 20. Заглоточный лимфатический узел. Лимфоидная инфильтрация

коркового синуса, стирание границ фолликулов. Окраска гем.-эозином.

Ув.10х20

Более выраженные лейкозные поражения селезенки и лимфатических

узлов- стирание границ коркового и мозгового слоя лимфоузлов.

83

Обширную инфильтрацию лимфоидными клетками различной степени

зрелости.

Рис. 21. Подчелюстной лимфотический узел при ХЛЛ, инфильтрация

трабекулы и синусов опухолевыми лимфоцитами. Окр. гем.-эозином; ув.10х40

Рис. 22. Подвздошный лимфотический узел. Лимфоидная инфильтрация

мозговых синусов при хроническом лимфолейкозе. Окр. гем.-эозином;

ув.10х40.

84

В селезенке выявляют инфильтрацию трабекул лимфоидными клетками,

стирание специфического рисунка, увеличение диффузных фолликулов,

уменьшение красной пульпы. Атрофия соединительной ткани. Особенно это

наблюдали в опухолевой стадии течения болезни

Рис. 23. Стирание границ белой и красной пульпы селезенки при ХЛЛ.

Окр. гем.-эозином; ув. 10х40

При опухолевой стадии у 3-х животных выявили характерные для лейкоза

изменения в сердце. Миокард был красно-серого цвета, дряблой консистенции,

под эпикардом и эндокардом множественные кровоизлияния. В одном случае

отмечали утолщение стенки правого предсердия до 4,5см и ушка. У 2 животных

в опухолевой стадии находили ограниченные опухолевые саловидные

разрастания в основном в правом предсердии. При микроскопическом изучении

миокарда выявили лимфоидную инфильтрацию мышечных волокон. На

рисунке 24 опухолевые лимфоидные клетки в виде сплошных тяжей между

мышечными волокнами.

85

Рис. 24. Сердце. Лимфоидная инфильтрация миокарда при хроническом

лимфолейкозе. Окраска гем.-эозином, ув. 10х40

Таким образом, специфические для лейкоза патолого-морфологические

изменения характеризуются:

-увеличением лимфоузлов и других органов;

-поражением соединительнотканной стромы лимфоузлов и органов за

счет инфильтрации опухолевой тканью;

-атрофия паренхимы, замещение ее лейкозной тканью, очаговые

кровоизлияния, казеозный некроз в пораженных участках органов и тканей.

-степень поражения органов и тканей коррелирует с тяжестью

лейкозного процесса.

Животное считали больным лейкозом при наличии одного из следующих

показателей: положительного гематологического исследования, клинических

признаков болезни, характерных патологоанатомических изменений,

положительных результатов гистологических и электронно-микроскопических

86

исследований – выявления в лимфоцитах маркерных для лейкозных клеток –

ядерных карманов и положительных данных по ПЦР исследованиям.

С учетом проведенных современных прижизненных и послеубойных

исследований мы окончательно определили животных 3 групп лейкозогенеза –

бессимптомной, гематологической (начальной) и опухолевой (терминальной) и

провели ветеринарно-санитарную экспертизу мяса и мясопродуктов по оценке

качества и безопасности продуктов убоя крупного рогатого скота при

различных стадиях лейкозного процесса.

2.2.4. Ветеринарно-санитарная характеристика продуктов убоя при

различных стадиях течения лейкозного процесса у крупного рогатого скота

Послеубойную ветеринарно-санитарную экспертизу туш и органов

производили в соответствии с требованиями действующих «Правил

ветеринарно-санитарного осмотра убойных животных и ветеринарно-

санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов» и ГОСТу 7269-79 «Мясо.

Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести».

При этом наряду с выявлением патологоанатомических изменений в

органах и тканях определяли внешний вид и цвет туши, консистенцию мяса,

запах, прозрачность и аромат бульона.

Органолептическая оценка мяса крупного рогатого скота больного

лейкозом

Для органолептического исследования нами были взяты пробы мяса от

93 голов крупного рогатого скота больного лейкозом и 10 проб мяса от

здорового крупного рогатого скота контрольной группы. Первоначально

осматривали туши для выявления внешних органолептических признаков и

они суммированы в таблице 11.

87

Таблица 11

Основные органолептические показатели туш больных ХЛЛ коров

При оценке качества мяса, полученного при убое крупного рогатого

скота больного лейкозом, особенно при его хранении, одним из основных

контрольных показателей считается свежесть. Она характеризует степень

глубины изменения мяса, которую оценивают в зависимости от уровня

расщепления белков и их производных ферментами микробного

происхождения и окислительных изменений жира при длительном контакте с

кислородом воздуха.

В настоящее время принята следующая классификация свежести мяса:

свежее, сомнительной свежести и несвежее. Это состояние в соответствии с

нормативными документами определяется органолептической оценкой (ГОСТ

7269-79), пробой с сернокислой медью, определением содержания летучих

жирных кислот, микроскопией мазков-отпечатков исследуемых образцов

Наименование

показателей

Группы животных на разных стадиях ХЛЛ

Контрольная

n=10

Инфицирован.

ВЛКРС n=59,

РИД+; ПЦР+

Больные ХЛЛ

n=25,


стадия


Стадия n=9

Состояние места

зареза

Неровное,

пропитанное

кровью

Неровное,


кровью

Неровное,


кровью

ровное

Степень

обескровливания

хорошая хорошая удовлетворительная Удовл – 3

Плохая - 2

Наличие гипостазов отсутствуют отсутствуют отсутствуют Есть, в

единичных

случаях

Изменение

лимфатических узлов

Не увеличены,

без

кровоизлияний,

с четкими

границами

Не увеличены, без

кровоизлияний, с

четкими границами

Увеличены

единичные

лимфоузлы, без

кровоизлияний

Увеличены

Кровоизлияни

я, рисунок

сглажен

88

(ГОСТ 23392-78), гистологической оценкой (ГОСТ 19496-93), используется

также исследования амино-аммиачного азота. Показатели исследования мяса

крупного рогатого скота на свежесть представлены в таблице 12.

Таблица 12

Органолептические показатели туш и мяса крупного рогатого скота

Наименование

показателей

Группы животных на разных стадиях ХЛЛ


n=10

Инфицированн

ые ВЛКРС n=59,

РИД+; ПЦР+

Больные ХЛЛ n=25,


стадия


Стадия n=9

Внешний вид и

цвет:

•поверхности туши

Имеет корочку

подсыхания

бледно-розового

цвета


подсыхания

бледно-розового

цвета


подсыхания бледно-

розового цвета


подсыхания бледно-

розового цвета

Мышцы на разрезе Слегка влажные,

не оставляют

влажного пятна

на

фильтровальной

бумаге, красного

цвета

Слегка

влажные, не

оставляют

влажного пятна

на



цвета

Слегка влажные, не

оставляют влажного

пятна на



цвета

Влажные, слегка

липкие, оставляют

пятно на


бумаге темно-

красного цвета

консистенция Мышцы упругие,

плотные, при

надавливании

образуется ямка,

которая быстро

выравнивается

Мышцы

упругие,






Мышцы упругие,






Мышцы менее

упругие, плотные,

при надавливании



медленно

запах Специфический,

свойственный

свежему мясу

Специфический,



Специфический,



Специфический

свойственный мясу

несвежему или

сомнительной

свежести

Состояние жира Жир желтоватого

цвета, плотный.

Консистенция

твердая, при

раздавливании -

крошится

Жир

желтоватого





крошится

Жир желтоватого





крошится

Жир имеет

серовато-матовый

оттенок, мягкий

при раздавливании

мажется.

Состояние

сухожилий

Сухожилия

упругие,

плотные,

поверхность

суставов гладкая,

блестящая

Сухожилия

упругие,

плотные,


суставов

гладкая,

блестящая

Сухожилия упругие,

плотные,


суставов гладкая,

блестящая

Сухожилия менее

плотные, матового

белого-цвета.

Суставные

поверхности слегка

покрыты слизью.

89

Из представленных в таблице данных видно, что по органолептическим

показателям, мясные туши от животных в стадиях бессимптомной инфекции и

гематологической заметно не отличаются от таковых, полученных от

здорового скота той же категории упитанности. Мясные туши, полученные от

животных, убитых в опухолевой стадии болезни, даже при кратковременном

хранении (2-3 суток) имеют органолептические признаки, характерные для

мяса сомнительной свежести или несвежего, причем быстрота и степень порчи

находится в прямой зависимости от поражения опухолевым процессом

органов и тканей больных лейкозом животных.

Согласно «Правилам ветеринарного осмотра и ветеринарно-санитарной

экспертизы мяса и мясных продуктов (1988)» при лейкозе при поражении

мышц, лимфатических узлов туши, нескольких органов или выявлении

лейкозных разрастаний (бляшек) на серозных покровах туши – сами туши в

независимости от упитанности и продукты убоя – утилизируют. Животных с

такими поражениями мы выявили 5 голов из третьей опухолевой группы.

В тушах из 2 –ой гематологической (25 голов) и у 3-х туш (III группа)

выявили поражение отдельных лимфоузлов и органов и не обнаружили

изменений в мускулатуре, поэтому в соответствии с нормативной

документацией они подверглись бактериологическому исследованию. Мы

провели бактериологические исследования мяса крупного рогатого скота на 3-

х стадиях лейкозогенеза. Контролем служило мясо, полученное от здоровых

животных.

Физико-химические показатели мяса крупного рогатого скота

Далее мы провели физико-химические исследования мяса крупного

рогатого скота.

Проведенными исследованиями выявлены отличия физико-химических

показателей от животных больных лейкозом по сравнению с мясом здоровых

животных. рН мяса у контрольных животных снизился через сутки до 5,7.

Данные по физико-химическим показателям мяса приведены в таблице 13.

90

Таблица 13

Физико-химические показатели мяса крупного рогатого скота больного

лейкозом.

p≤0,05

Из таблицы видно, что при лейкозе диагностируемом в РИД

(бессимптомная стадия) увеличение рН отмечается через 96 часов. В

гематологической стадии отмечали увеличение рН с увеличением сроков

хранения мяса животных.

При определении количества летучих жирных кислот (ЛЖК) наблюдали

увеличение их количества с удлинением сроков хранения от 2,5 (контрольная

группа) до 5,3.

При постановке реакции на пероксидазу выявлены следующие

показатели: контрольная группа – положительная реакция; бессимптомная –

положительная; гематологическая – сомнительная; опухолевая –

преимущественно отрицательная.

группы результаты исследования мяса КРС

рН реакция на реакция с Формольная количество

пероксидазу CuSO4 проба ЛЖК

24ч 48ч 96ч 24ч 48ч 96ч 24ч 48ч 96ч 24ч 48ч 96ч 24ч 48ч 96ч

контрольная

группа n=10

5,8 5,7 5,9 + + + - - - - - - 2,5 2,8 2,7

5,79 + 0,04 2,67 + 0,07

бессимптомная

стадия n=59

5,8 5,8 5,9 + + + - - + - - + 2,7 2,8 2,8

5,84+ 0,02 2,77 + 0,02

гематологическая

стадия n=25

5,8 6,3 5,9 + + + - - + - + + 2,7 3,0 3,4

6,00+ 0,05 3,12 + 0,04

опухолевая

стадия n=9

6,3 6,4 6,5 + - - + + + + + + 4,0 4,1 5,3

6,38+ 0,03 4,68 + 0,01

91

При определении формольной пробы: контрольная группа –

отрицательная; бессимптомная – отрицательная; гематологическая –

отрицательная, иногда отмечались положительные результаты; опухолевая

стадия – положительная.

Таким образом, после проведенных физико-химических исследований

мяса можно сделать вывод, что в мясе животных убитых в бессимптомной

стадии процессы созревания существенно не нарушаются, в гематологической

– процесс созревания нарушается, быстро накапливаются продукты распада

белка. В опухолевой стадии установлены явные отклонения от нормы по

физико-химическим показателям мяса крупного рогатого скота.

Определение химического состава мяса крупного рогатого скота

Химический состав характеризует питательную ценность мяса.

Качественные показатели складываются из сбалансированности содержания

белка, жира, влаги и других веществ.

Изучен химический состав мяса крупного рогатого скота на разных

стадиях заболевания. Данные представлены в таблице 14.

Из данных таблицы видно, что содержание влаги в мышцах животных в

бессимптомной, гематологической и опухолевой стадиях увеличивалось по

отношению к контрольной группе. В мышцах контрольной группы влага

составляла 74,90; в бессимптомной на больше 0,55%; в гематологической –

больше на 2,76%; в опухолевой стадии – больше на 3,08%.

Содержание белка в мышечной ткани имело тенденцию к уменьшению. В

контрольной группе 20,6; в бессимптомной стадии - меньше на 0,96%; в

гематологической - меньше на 1,95%; в опухолевой - меньше на 2,43%. Также

отмечается снижение белка и в паренхиматозных органах.

92

Таблица 14

Химический состав длиннейшей мышцы спины крупного рогатого скота

показатели Единицы

измерения

Группы животных

контроль Бессимпт.

РИД+

РИД+,

Гем+


стадия

ВЛАГА % 74,90+ 0,05 75,31+ 0,19 76,97+ 0,07 77,21+0,02

%к контролю 100 100,55 102,76 103,08

ЖИР % 3,52+0,02 3,49+0,01 3,47+0,01 3,46+0,09

%к контролю 100 99,15 98,58 98,30

БЕЛОК % 20,6+ 0,14 20,4+ 0,05 20,2+ 0,09 20,1+ 0,03

%к контролю 100 99,03 98,05 97,57

ЗОЛА % 1+ 0,01 1,1+ 0,02 1,1+ 0,01 1,2+0,02

%к контролю 100 110 110 120

р≤ 0,05

Отмечалось также снижение жира в контрольных пробах 3,52, в

бессимптомной стадии ниже на 0,85%; в гематологической ниже на 1,42%; в

опухолевой 1,7%. Содержание минеральных веществ в мышечной ткани и

внутренних органах больных животных существенно не отличалось от

контрольной группы.

Из вышеперечисленного можно сделать вывод, что у животных больных

лейкозом, уже в бессимптомной стадии происходят изменения химического

состава – увеличение содержания влаги, понижается уровень белка и жира. При

дальнейшем течении лейкозного процесса (гематологическая, опухолевая

стадии) эти изменения выражены еще более заметно. Все эти данные

свидетельствуют о том, что качественные характеристики мяса изменяются,

таким образом, ухудшается пищевая ценность мяса.

Аминокислотный состав

При исследовании аминокислотного состава в белках мяса были

выявлены различия у больных лейкозом и здоровых животных. Данные

представлены в таблице 15.

93

Таблица 15

Содержание аминокислот в длиннейшей мышце спины КРС

Показатели

Единицы

Измере

ния

Группы животных

контроль Бессимпт.

РИД+

РИД+, Гем+ Опухолев

ая стадия

НЕЗАМЕНИМЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ

валин

мг% 5,74 + 0,54 5,45 + 0,15 5,18 + 0,12 5,31 + 0,26

% к контролю 100 94,95 90,24 92,50

изолейцин

мг% 4,69 + 0,31 4,44 + 0,06 4,51 + 0,19 4,34+ 0,46

% к контролю 100 94,67 96,16 92,53

лейцин мг% 8,14+ 0,39 7,71+ 0,16 6,88+ 0,19 6,74+ 0,30

% к контролю 100 94,72 84,52 82,80

лизин мг% 8,21+ 0,47 7,87+ 0,21 6,90+ 0,21 6,86+ 0,52

% к контролю 100 95,85 84,04 83,56

метионин мг% 2,94+ 0,25 2,79+ 0,14 2,48+ 0,25 2,43+ 0,31

% к контролю 100 94,9 84,4 82,7

треонин мг% 4,37+ 0,40 4,15+ 0,18 3,70+ 0,23 3,62+ 0,81

% к контролю 100 94,97 84,67 82,84

триптофан мг% 1,37+ 0,33 1,30+ 0,16 1,16+ 0,33 1,13+ 0,42

% к контролю 100 94,89 84,67 82,48

фенилаланин мг% 4,52+ 0,51 4,07+ 0,15 4,25+ 0,31 3,86+ 0,51

% к контролю 100 90,04 94,02 85,40

ЗАМЕНИМЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ

аланин мг% 6,82+ 0,63 6,48 + 0,28 6,15 + 0,22 5,83 + 0,28

% к контролю 100 95,01 90,18 85,48

аргинин мг% 6,48 + 0,27 6,82 + 0,33 6,92 + 0,29 7,08 + 0,45

% к контролю 100 105,25 106,80 109,30

аспаргиновая

кислота

мг% 11,63+ 0,27 11,00+ 0,11 9,82+0,10 9,94+0,36

% к контролю 100 94,58 84,44 85,47

гистин мг% 3,98 + 0,36 3,81 + 0,28 3,40+ 0,19 3,36 + 0,34

% к контролю 100 95,73 85,43 84,42

глицин мг% 4,39 + 0,41 4,20 + 0,12 3,75 + 0,28 3,71 + 0,64

% к контролю 100 95,67 85,42 84,51

глутаминовая

кислота

мг% 18,01+ 0,44 17,25+0,11 15,22+0,17 15,40+0,29

% к контролю 100 95,78 84,50 84,51

оксипролин мг% 0,29 + 0,25 0,28 + 0,12 0,25 + 0,24 0,27 + 0,26

% к контролю 100 96,55 86,21 93,10

Пролин

мг% 3,29 + 0,36 3,15 + 0,13 2,78 + 0,25 2,81 + 0,36

% к контролю 100 95,74 84,99 85,41

серин мг% 4,52 + 0,44 4,33 + 0,23 3,82 + 0,23 3,87 + 0,39

% к контролю 100 95,79 84,52 85,62

тирозин мг% 4,00 + 0,36 3,83 + 0,14 3,38 + 0,26 3,42 + 0,40

% к контролю 100 95,75 84,5 85,5

цистин мг% 1,55 + 0,37 1,48 + 0,12 1,32+ 0,16 1,31 + 0,21

% к контролю 100 95,48 85,16 84,51

р≤0,05

94

Из приведенных в таблице данных видно, что аминокислотный состав

мяса меняется в зависимости от стадии лейкозного процесса. Эти изменения

наиболее выражены на поздних стадиях развития лейкоза. Наблюдается

уменьшение треонина на 5,03% в бессимптомной стадии; на 15,33% в

гематологической и на 17,16% в опухолевой стадии, валин – 5,05%, 9,76%,

7,5%, метионин -5,1%, 15,6%, 17,3%, фенилаланин – 9,96%, 5,98%, 14,6%,

лизин – 4,15% 15,6%, 16,44% соответственно стадиям лейкозного процесса.

Таким образом, после проведенных исследований можно сделать вывод,

что мясо животных на поздних стадиях лейкозного процесса (гематологическая

и опухолевая) по комплексу химических показателей не соответствует нормам,

установленным для доброкачественного мяса.

Бактериологические исследование

Отбор проб и бактериологические исследования проводили согласно

ГОСТу 21237-75. «Мясо. Методы бактериологического анализа». Для

бактериологического исследования были отобраны пробы мышечной ткани

(сгибатели и разгибатели передней и задней конечности), сердца, печени,

почек и лимфатические узлы. В случае, если при послеубойном осмотре туш и

внутренних органов макроскопических изменений не обнаружено или они

слабо выражены, для исследования необходимо брать кусочки из органов,

рано и часто поражаемых лейкозом – лимфоузлов из разных областей тела и

органов, сердца, печени, почек, независимо от их поражения, а из других

органов – при наличии в них изменений. При этом кусочки берут из тех мест

органов, где имеются какие-либо подозрительные участки – узелковые

поражения, утолщения, неестественная окраска. Толщина кусочков должна

быть 0,5 – 1см.

Бактериологическое исследование начинали с бактериоскопии мазков-

отпечатков из органов, лимфатических узлов и контрольных животных и

животных убитых в разной стадии инфекционного процесса лейкоза.

95

При микроскопии мазков-отпечатков из органов животных контрольной

группы микрофлора не обнаружена.

Микроскопия мазков-отпечатков проб от животных в бессимптомной

стадии показала, что в поверхностных слоях мяса, полученного от животных в

различной стадии течения лейкозного процесса, в поле зрения микроскопа

обнаруживали от 15 до 45 бактериальных клеток различных форм (кокковых и

палочковидных). При этом в глубоких слоях мышц встречалось уже до 30

микроорганизмов. При микроскопии мазков-отпечатков из проб мяса,

полученных от животных в опухолевой стадии лейкоза, в большинстве

обнаруживали в поле зрения более 30 микроорганизмов. Эти данные

свидетельствуют, что по микробиологическим показателям мясо отобранных

нами проб не соответствует свежему мясу и согласно «Правилам

ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной

экспертизы мяса и мясопродуктов» должно быть рекомендовано не для

реализации в сыром виде, а для промышленной переработке – изготовление

консервов и вареных колбасных изделий.

Результаты бактериологического исследования продуктов убоя крупного

рогатого скота, убитого в различных стадиях инфекционного процесса лейкоза,

представлены в таблице 16. Так, из мышечной ткани здоровых (контрольных)

животных были выделены следующие микроорганизмы: единичные споро-

образующие палочки; кокки. В одном случае из мышечной ткани был выделен

S.epidermicus и в другом -B.subtilis. Микроорганизмы рода Proteus и Salmonella

не обнаружены.

Из мышечной ткани опытной группы животных в бессимптомной стадии

лейкоза были выделены также микрококки, аэробные бациллы и кокковые

микроорганизмы. В двух случаях из мышечной ткани были выделены аэробные

бациллы, в одном случае - B.subtilis, в другом - B.mycoides. Из печени были

выделены бактерии рода Proteus, из лимфатических узлов в двух случаях были

обнаружены бактерии группы кишечных палочек.

96

В мышечной ткани больных животных в гематологической стадии

лейкоза патогенных и условно-патогенных микроорганизмов не обнаружено.

Бактерии группы кишечных палочек выделены в пяти случаях: в двух -из

печени, в двух - из лимфатических узлов и в одном случае - из почек.

В опухолевой стадии из мышечной ткани больных животных выделены

бактерии группы кишечных палочек. Сальмонеллы выделены в одном случае

из мышечной ткани и во всех 5 случаях из лимфатических узлов.

Таблица 16

Бактериологические исследования мяса и лифоузлов КРС больного лейкозом

Здоровые

животные

Больные животные (опытные)

(контрольные) Положительные

в РИД

Положительные

по гематологии


стадия

Мыш

цы

Лимфо

узлы Мыш

цы

Лимфо

узлы Мыш

цы

Лимфо

узлы Мыш

цы

Лимфо

узлы

БРКП 0 1 0 3 2 2 2 5 Бактерии рода

Salmonella 0 0 0 0 0 0 1 5

Бактерии рода

Proteus 0 0 0 0 0 0 1 3

Анаэробные

клостридии 0 0 0 0 0 0 2 2

Бактерии рода

Pasteurella 0 0 0 0 0 0 0 2

ко-

ко-

вые

Staphylococcus 0 0 0 1 0 0 0 2 Enterococcus 0 0 0 0 3 0 0 0 Micrococcus 0 0 2 0 0 0 3 0 Streptococcus 0 1 0 0 0 0 0 0

Таким образом, по результатам бактериологических исследований

установлено, что наибольшую микробную обсемененность образцов мышечной

ткани и внутренних органов наблюдали у животных, отобранных в опухолевой

стадии.

Определение биологической ценности мяса

Биологическую ценность мяса определяли с помощью реснитчатых

инфузорий Тетрахимена пириформис. Опыты на инфузориях проводили

согласно «Методическим рекомендациям по использованию инфузорий

Тетрахимена пириформис для токсико-биологической оценки

97

сельскохозяйственных продуктов» (1983), «Методическим рекомендация для

использования экспресс-метода биологической оценки продуктов и кормов»

(1990) и методическим рекомендациям «Использование инфузорий

(Тетрахимена пириформис) в качестве тест-культуры в приборе «Биотестер-2»

(экс пресс-метод)» (1991).

При биологической оценке мяса на инфузориях тетрахименах вначале

определяли его возможное токсическое действие на простейших, а затем про-

водили изучение относительной биологической ценности (ОБЦ) продукта

(контрольных животных - 10, в бессимптомной -15, гематологической – 15,

опухолевой 9).

Выживаемость тетрахимен на мясе больных животных (в различной

стадии болезни) была меньше, чем у контрольной группы при максимальной

величине навески мяса.

При определении показателя ОБЦ, основанного на генеративной

(ростовой) реакции тетрахимен, нами установлено его снижение у мяса

больных лейкозом животных по сравнению со здоровыми.

Таблица 17

Относительная биологическая ценность (ОБЦ) мяса больных лейкозом

животных

Группа животных Среднее количество в 1 мл клеток

инфузорий

ОБЦ % к контролю


группа

44,2х104 100,0

Бессимптомная

стадия

42,48 х104 96,1±1,2


стадия

40,8 х104 92,3±0,9


стадия

38,19 х104 86,4±0,8

Из таблицы видно, что в бессимптомной стадии заболевания ОБЦ мяса

снижается по сравнению с контрольной группой на 3,9%, в гематологической

на 7,7% и в опухолевой на 13,6%. В опухолевой стадии отмечается сильное

98

снижение ОБЦ мяса по сравнению с другими стадиями и контрольной группой.

Очевидно, что это связанно с изменением химического состава мяса,

ухудшением его пищевой ценности. Из всего вышеперечисленного можно

сделать вывод, что мясо больных лейкозом животных является менее

полноценным продуктом.

Полимеразная цепная реакция

Для проведения исследования использовались образцы мышечной ткани

КРС отобранных на разных стадиях лейкозного процесса: 5 – бессимптомная

стадия; 5 – гематологически положительные; 5 – опухолевая и 5 проб от

контрольной животных. Исследования проводились 3 раза с периодичностью в

один месяц. Пробы мышечной ткани хранились в морозильной камере.

Для постановки ПЦР на выявление провирусной ДНК вируса лейкоза КРС

использовались наборы серии GenePak DNA PCR test BLV (gag).

В необходимое количество пробирок с лиофилизированной полимеразой

добавляли 10 мкл ПЦР-растворителя. В наборе для обнаружения ВБЛ праймеры

(gag) уже внесены. После полного растворения сухого содержимого в пробирки

добавляли по 5 мкл пробы ДНК исследуемых образцов, меняя каждый раз

наконечники пипетки. В пробирку для отрицательного контроля вместо ДНК

добавляли 5 мкл буфера ТЕ. Затем содержимое всех пробирок перемешивалось

на вортексе. После этого в пробирки добавляли по 2 капли минерального масла

(20 – 25 мкл). Пробирки центрифугировались 10 сек при 2000 оборотах в

минуту. После этого смесь помещали в амплификатор. Для регистрации

результатов использовался метод электрофореза в 1,5% агарозном геле. Для

окраски агарозного геля использовали бромистый этидий, в концентрации 0,5

мкг/мл. Результаты исследований представлены в таблице 18

99

Таблица 18

Исследование мяса крупного рогатого скота с помощью ПЦР на разных

стадиях лейкоза

Пробы мышечной ткани,

селезенки, печени, сердца

СРОК ХРАНЕНИЯ, ДНЕЙ t -20°C

1 30 60 90

Контроль - - - -

Бессимптомная стадия + + + +

Гематологическая стадия + + + +

Опухолевая стадия + + + +

Таким образом, с помощью ПЦР-тест системы, как самого

чувствительного на сегодняшний день метода обнаружения провирусного ДНК

при ВЛКРС инфекции, доказана его длительная сохранность в мышечной ткани

и органах при t -20°С.

2.2.5.Обсуждение результатов исследования

Анализируя полученные данные собственных исследований, современные

сведения по инфекционной патологии сельскохозяйственных животных можно

констатировать, что лейкоз остается важной социальной и ветеринарно-

биологической проблемой и имеет широкое распространение как за рубежом,

так и в нашей стране. (Меграбян Д.С. и соавторы, 2006).

Для краткости изложения и представления о ситуации по лейкозу мы

приводим официальные сведения по данной болезни в нижеследующей таблице

19.

Таблица 19

Распространение энзоотического лейкоза КРС (по данным МЭБ)

Статус Страны

1 2

Н е б л а г о п о л у ч и е Австралия, Аргентина, Барбадос, Белоруссия, Болгария, Босния и

Герцеговина, Бразилия, Венгрия, Венесуэла, Гваделупа, Германия,

Гондурас, Греция, Доминиканская Республика, Израиль, Индонезия,

Иран, Испания, Италия, Канада, Колумбия, Корея, Коста Рика, Куба,

Латвия, Литва, Македония, Марокко, Мексика, Молдавия, Монголия,

Нидерланды, Никарагуа, Новая Зеландия, Франция, Французская

Гвиана, Французская Полинезия, Панама, Парагвай, Перу, Польша,

Португалия, Россия, Румыния, Сербия и Монтенегро, Словения, США,

Украина, Филиппины, Хорватия, Чили, Швеция, Эквадор, Эстония,

Южная Африка, Япония

100

1 2

Б л а г о п о л у ч и е ,

д о с т и г н у т о е

о з д о р о в и т е л ь н ы м и

м е р о п р и я т и я м и ( в

с к о б к а х ук а з а н г о д

р е г и с т р а ц и и

и н ф е к ц и и )

Австрия (2001), Андорра (1994), Бельгия (1997), Великобритания

(1996), Грузия (1996), Дания (1990), Египет (1997), Ирландия (1999),

Кипр (1995), Намибия (1993), Норвегия (2002), Республика Чехия

(1996), Словакия (2003), Тринидад и Тобаго (1996), Тунис (2000),

Финляндия (1996), Швейцария (1996)

С т а б и л ь н о е

б л а г о п о л у ч и е

( з а б о л е ва н и е

н и к о г д а н е

д и а г н о с т и р о ва л и )

Ботсвана, Британские Виргинские острова, Гаити, Джибути, Иордания,

Исландия, Западное Самоа, Капе Верде, Кения, Ливия, Мадагаскар,

Малайзия, Мьянма, Непал, Новая Каледония, Северная Ирландия и

Джерси, Сент-Винсент и Гренадины, Сингапур, Судан, Филиппины,

Фолклендские о-ва, Шри Ланка

Как видно из таблицы Российская Федерация имеет статус

неблагополучного по лейкозу Государства. В России болезнь зарегистрирована

в 56 субъектах и имеется тенденция к увеличению. Наиболее

неблагополучными являются Московская, Брянская, Калужская,

Ленинградская, Вологодская, Новгородская, Псковская области, республики

Башкортостан, Татарстан, а также территория Северного Кавказа.

Анализ ретроспективных статистических данных по распространению

лейкоза по трем областям Центрального Федерального округа РФ

(Московской, Калужской, Брянской) показал, что, несмотря на

совершенствование методов диагностики, мер борьбы с лейкозом, уменьшение

численности поголовья КРС в два с лишним раза, количество инфицированных

ВЛКРС животных неуклонно растет, при этом уменьшается количество

животных в гематологической и опухолевой стадиях болезни. Этой ситуацией

объясняется небольшое количество туш и органов с признаками лейкоза,

выявляемых на мясокомбинатах, в частности на Калужском и Можайском.

В «Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого

скота» внесены современные достижения в области эпизоотологии,

диагностики, но недостаточно полно отражены ветеринарно-санитарные

требования к переработке животных, больных лейкозом. В настоящее время в

соответствии с нормативными документами: «Правилами ветеринарного

осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и

мясных продуктов» ветеринарные эксперты при диагностике лейкоза

101

ориентируются на выявление поражений лимфоузлов, внутренних органов,

мышечной ткани, но такие признаки имеются лишь в 5 – 11% туш лейкозных

животных. Большинство животных сдают на убой в стадии

вирусоносительства, в бессимптомной или субклинической стадиях развития

лейкозного процесса, которые характеризуются отсутствием видимых

лейкозных поражений. Поэтому лейкоз крупного рогатого скота в стадии

онкорновирусной инфекции, диагностируемой в РИД, с гематологически

положительными показателями на лейкоз или с поражением отдельных

лимфатических узлов при ветеринарно-санитарной экспертиза не

диагностируется и мясо выпускается без ограничений. При этом не

учитывается роль онкорновируса типа С как этиологического фактора лейкоза.

Доказано, что развитие инфекционного процесса, вызываемого ВЛКРС,

сопровождается иммунодепрессивными свойствами вируса. Поэтому

инфицированный скот в 2-6 раз чаще выбраковывают из-за повышенной

заболеваемости маститами, метритами или другими патологиями не

лейкозного характера. Онкорновирусная инфекция сопровождается снижением

удоев на 3 – 10%, а в неблагополучных хозяйствах на 18%, ухудшением

качества молока, увеличением сервис-периода. Молоко и мясо больных

животных содержит вредные метаболиты триптофана и других циклических

аминокислот, которые являются вредными для человека.

Основой организации мер борьбы и профилактики лейкоза является

ранняя и наиболее точная диагностика ХЛЛ. В странах ЕС в соответствии с

Директивой 06/23 от 20.04.1996 года требуется контроль качества и

безопасности готовой животноводческой продукции осуществлять в процессе

производства при мониторинге и надзоре от «фермы до стола» (Смирнов А.М.,

2006, Посконная Т.Ф, Бутко М.П,2007).

В этой связи мы провели два этапа сравнительных исследований

животных (в хозяйстве «Уручье», Брянской области и на Калужском и

Можайском мясокомбинатах), используя основные классические и

молекулярно-биологические методы исследования. Этот подход позволил нам

102

придти к выводу, что диагностика лейкоза крупного рогатого скота должна

быть комплексной, так как каждый из известных методов дополняет друг

друга, повышается эффективность противолейкозных мероприятий.

Принципы ликвидации лейкоза базируется на элиминации

инфицированных ВЛКРС животных из стада и замены их здоровыми особями,

поэтому серологический метод (РИД) считается основным методом

прижизненной диагностики, т.к. является доступным и недорогим,

гематологический и гистологический методы более затратные и они, в

основном позволяют контролировать течение болезни, а не искоренять ее. Но

имеются и другие мнения. Некоторые исследователи (Федоров В.П., Иванов

О.В., 2006) считают, что параллельно с РИД необходимо проводить поголовное

гематологическое исследование (выведение лейкоформулы) для исключения

алейкемических, сублейкемических форм лейкоза, которые по разным данным,

могут составлять 5 – 10% от общего числа больных животных.

Нами впервые для прижизненной и послеубойной диагностики лейкоза

использован комплекс современных диагностических методов, включавших в

себя серологические, гематологические, вирусологические, морфологические

(электронная микроскопия) и молекулярно-биологические методы

исследования (ПЦР).

После внедрения в организм возбудителя болезни наступает

инкубационная стадия, которая распознается лишь серологическими,

вирусологическими, электронно-микроскопическими методами и в реакции

полимеразных цепей (ПЦР). Используя ПЦР на различных группах животных

мы установили, что ПЦР с большей степенью достоверности выявляет

вирусоносительство до выработки достаточных количеств антител,

выявляемых в РИД. В наших опытах с помощью ПЦР выявлено на 10% больше

инфицированных животных, чем в РИД, в т.ч. серонегативных животных. Для

массовых исследований всего поголовья КРС в СПК «Уручье» была

использована РИД с антигенами ВЛКРС. Оказалось, что 68,75%

исследованных животных являлись серологически положительными. В

103

практическом плане серологические и гематологические исследования

позволяют ветеринарной службе осуществлять профилактику лейкоза и

сохранять его сравнительно низкий уровень.

ВЛКРС присутствует в организме в виде встроенной в геном хозяйской

клетки ДНК – копии (провируса). Интегрированный в клеточный геном

провирус может длительное время не экспрессироваться. Такой латентный

период, в течение которого не наблюдается образование антител к вирусу и

клинико-гематологических изменений в организме животного, может

продолжаться от нескольких месяцев до нескольких лет.

В этой связи согласно «Методическим рекомендациям по диагностике

лейкоза крупного рогатого скота (2000)». Первичный диагноз на лейкоз

рекомендуется устанавливать серологическими и гематологическими

исследованиями проб крови и сыворотки. Международное эпизоотическое

бюро считает РИД и ИФА оптимальными тестами для диагностики лейкоза и

рекомендует использовать их в международной торговле КРС. ПЦР

рассматривается в качестве альтернативного теста (санитарный кодекс

наземных животных, МЭБ,2006).

При более современных методах исследования крупного рогатого скота

(электронной микроскопии) даже в предлейкозный период, при

онкорнавирусной инфекции и далее в других стадиях можно обнаружить

характерные морфологические признаки лейкозной трансформации

лимфоидных клеток крови in vitro и in vivo.

Нами установлены изменения в субмикроскопическом строении

лимфоцитов на всех стадиях лейкозогенеза, которые выражались в появлении

наноструктурных аномалий (ядерных карманов) в ядре и цитоплазматических

органеллах – деструкции и дискомплексации крист митохондрий, аппарата

Гольджи, гипертрофии мембранного аппарата клеток. Ранее установлено, что

ядерные аномалии – ядерные карманы являются маркерами

малигнизированных клеток при ХЛЛ. (Шишков В.П. и соавторы 1976,

Меньшикова З.Н. и соавторы, 2007) и появляются в крови животных уже на

104

стадии онкорновирусной инфекции. Количество этих аномалий не имеет

прямой корреляции с лейкоцитозом, но имеет тенденцию к увеличению от

бессимптомной к гематологической и опухолевой стадиям болезни. У

инфицированных ВЛКРС животных в бессимптомной стадии находили от 1 до

6 % лимфоцитов с ядерными карманами, при гематологической от 7 до 20%, в

терминальной от 28% и выше. Ядерные аномалии (ядерные карманы)

отсутствуют в лимфоцитах крови при других болезнях с лейкемоидными

проявлениями. ( Pomeroy К. et al.1977 Weber A et al 1981, Меньшикова З.Н.

2000, 2003). Поскольку 30 и более % крови остается в туше и органах убитых

животных, соответственно можно с уверенностью сказать, что все они будут

контаминированы малигнизированными лимфоидными клетками.

Вирус лейкоза находили только в культивированных in vitro лейкоцитах.

Процент вирусопродуцирующих клеток был от 3,5 до 32% и более, в

зависимости от стадии развития лейкоза.

Таким образом, в настоящее время комплекс методов прижизненной

диагностики позволяет не только установить факт инфицирования животных,

выявить наличие возбудителя (ВЛКРС) и лейкозных клеток в крови,

определить стадию заболевания, но и прогнозировать качество получаемой

продукции. Это соответствует современным требованиям оценки качества и

безопасности животноводческой продукции на мясоперерабатывающих


Послеубойная диагностика основывается на патологоанатомических и

гистологических исследованиях. Проведенные нами исследования позволили

определить, что в основном, встречается лимфоидный лейкоз (83%), реже

лимфосаркома (14%). Лимфоидный лейкоз характеризуется поражением

селезенки, лимфатических узлов, печени, сердца, почек. Гистологически это

проявляется различной степенью лимфоидно-клеточной пролиферацией, кроме

того присутствуют деструктивные изменения клеток паренхимы пораженных

органов и тканей.

105

При лимфосаркоме в лимфатических узлах, органах пищеварения,

воспроизводства, в сердце, скелетной мускулатуре и других органах и тканях

отмечали разрастания опухолей, недифференцированных и

слабодифференцированных клеток лимфоидного ряда. Селезенка и костный

мозг, как правило, были без изменений.

Патологоанатомические исследования при лимфоидном лейкозе

крупного рогатого скота подтверждают ранее проводимые клинико-

гематологические наблюдения. На мясокомбинатах наиболее часто лейкоз

обнаруживали у взрослого крупного рогатого скота в возрасте 7 – 12 лет,

значительно реже в возрасте 4 – 7 лет, у молодых животных в возрасте до

четырех лет лейкоз не находили. Установлено, что в настоящее время

поступают на убой и подлежат ветеринарно-санитарной экспертизе животные

на ранних стадиях развития лейкоза, в том числе и до проявления клинико-

анатомических изменений. Поэтому требуются более тонкие

микроскопические, гистологические исследования.

При гистологических исследованиях нами установлен целый комплекс

морфологических специфических изменений. В пораженных лимфатических

узлах обнаруживали сплошную массу из лимфоидных клеток. Цитоплазма этих

клеток слабо заметна и имела вид узкого ободка. В некоторых местах были

видны участки некрозных клеток по типу кариопикноза. Усиленную

пролиферацию лимфоидных клеток наблюдали в мякотных шнурах мозгового

слоя. Фолликулы мозгового вещества были сдавлены и нередко находились с

состоянии атрофии. Рисунок строения лимфоузлов полностью нарушался. В

селезенке, печени, почках, сердечной мышце выявляли значительную

пролиферацию лимфоидных клеток, которая приводила к деструкции клеток

перечисленных органов.

При онкорнавирусной инфекции вышеперечисленные изменения не

выявлялись. Они обнаруживались в 60% случаев при гематологической и 100%

в опухолевой, терминальной стадии.

106

Следовательно, патоморфологическая картина при лейкозе крупного

рогатого скота широко варьирует и в зависимости от стадии лейкозогенеза и не

полностью характеризует патологический процесс. Для достоверности

диагноза необходимо проведение гистологических исследований и отбор тех

частей органов и тканей, где раньше и чаще появляются лейкозные изменения.

В случае четко выраженных изменений характерных для заболевания, в

комплексе с другими методами, возможно, достаточно убедительно ставить

послеубойный диагноз на лейкоз.

Органолептические исследования мяса. Важным этапом в определении

ценности мяса является определение его свежести. В первую очередь этот

показатель определяется с помощью органолептических, а при необходимости

лабораторных методов исследования. При органолептической оценке мяса

больного лейкозом крупного рогатого скота, установлено, туши и другие

продукты убоя животных, находившиеся на бессимптомной стадии болезни

одной и той же категории упитанности не имели сенсорных отличий от

здорового скота, т.е. по цвету и состоянию поверхности туши, мышц на

разрезе, консистенции, запаху, состоянию жира и сухожилий. Мясные туши

животных, убитых в опухолевой стадии болезни имели органолептические

признаки характерные для мяса сомнительной свежести или несвежего даже

при кратковременном хранении (2-3 суток) в холодильнике. Полученные нами

данные согласуются с исследованиями Пипираса Ю.Ю. (1972), Лемеша В.М. и

соавторов (1978), Пахомова П.И. (1998).

Авторы обнаружили микроскопические изменения в тканях лишь у 5-

20% животных, убитых в гематологической стадии болезни, потерю свежести и

последующую порчу (через 2-3 суток) связывают в первую очередь с

категорией упитанности животных и затем со стадией лейкозного процесса. В

наших исследованиях животных тощей и ниже средней категории упитанности

не было, и мы считаем, что скорость биохимических изменений в мясе

находится в прямой зависимости от степени поражении опухолевыми

107

малигнизированными клетками органов и тканей животных, больных

лейкозом.

При проведении бактериологических исследований нами установлено

что микробная контаминация мышечной ткани и паренхиматозных органов

крупного рогатого скота зависит от стадии развития лейкозного процесса. Из

мышечной ткани и органов животных в бессимптомной стадии были выделены

микрококки и аэробные бациллы. В мышечной ткани у 9 из 25 больных

животных в гематологической стадии бактерии группы кишечных палочек и

рода Proteus. В стадии поражения множественных лимфоузлов (опухолевой) из

мышечной ткани больных животных выделены бактерии кишечной палочки,

сальмонеллы, которые были идентифицированы как S.dublin и S.holeraesuis.

Кроме патогенных и условно-патогенных бактерий были выделены кокковые

формы в том числе Staphylococcus albus не обладавший ДНК-азной,

плазмокоагулирующей и гемолитической активностью.

Следует отметить, микробиологические показатели являются важными

факторами, определяющими направленность использования продуктов убоя

животных и безопасность их для здоровья потребителей. Известны два пути

проникновения микрофлоры в мясо: прижизненное и послеубойное.

Прижизненное (эндогенное) контаминирование продуктов убоя происходит

при болезнях и ослаблении резистентности организма, микроорганизмами из

кишечного тракта и проникают в другие органы и ткани животного.

Послеубойное (экзогенное) проникновение микроорганизмов в мясо и

другие продукты убоя происходит в результате нарушения ветеринарно-

санитарных правил убоя животных, послеубойной транспортировке и хранении

мяса.

В нашем случае, выделенная микрофлора из мяса, паренхиматозных

органов после убоя коров, больных лейкозом, позволяет считать, что

контаминация микроорганизмами произошла при жизни животных.

По результатам бактериологического исследования установлено, что

наибольшую микробную обсемененность образцов из мышечной ткани и

108

внутренних органов установили у животных с опухолевой стадией лейкозного

процесса. По частоте обнаружения микроорганизмов в органах и тканях на

первом месте стоят лимфоузлы (62,8%) затем печень (52,8%), почки (37,18%) и

мышечная ткань (30%).

Нами впервые установлено, что в пробах охлажденного и хранившегося

при -20°С мясе, внутренних органах, взятых на разных стадиях лейкоза

(бессимптомная, гематологическая и опухолевая) с помощью реакции

полимеразных цепей (ПЦР) выявлено наличие ДНК ВЛКРС, т.е. провирус

лейкоза в отличие например, от вируса ящура (Никифоров В.В., 2006),

сохраняется в мясной туше и в период созревания мяса, при накоплении

молочной кислоты и снижении рН с 7,2 – 7,6 до 6,0. Согласно «Санитарному

Кодексу наземных животных МЭБ», (2006) созревание продуктов убоя

крупного рогатого скота должно происходить при t 2 – 4 °С в течение минимум

24 часов после убоя, величина рН мяса в длиннейшей мышце спины

(m.longissimus dorsi) должно быть ниже 6,0. Кроме того доказано, что ВЛКРС

не инактивируется не только при рН 5,8-6,5 но при длительном хранении (3

месяца) мяса, органов и эндокринного ферментного сырья при t - 20°С. Эти

данные свидетельствуют о том, что по микробиологическим и

вирусологическим показателям мясо и продукты убоя крупного рогатого скота

(по отобранным нами пробам) в бессимптомной и гематологической стадиях и

в начальной стадии (поражения единичных лимфоузлов) болезни не

соответствует ГОСТу и согласно «Правилам ветеринарного осмотра убойных

животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» не

должны выпускаться в свободную реализацию в сыром виде, продукты убоя

необходимо направлять в промышленную переработку на изготовление

консервов и вареных колбасных изделий.

Физико-химические показатели мяса. Физико-химические показатели

мяса, полученные от больных животных, свидетельствуют, что процессы его

созревания протекают замедленно, в мясе снижается активность тканевых

ферментов, быстро накапливаются продукты распада. Данное обобщение

109

основано на показателях рН, реакции на пероксидазу, распаде полипептидов.

Так мясо от здоровых животных имело реакцию среды (рН) 5,79 + 0,04,

реакцию на пероксидазу положительную, на полипептиды – отрицательную.

При хранении такого мяса в холодильнике в течение 2 суток отклонений от

нормы по физико-химическим показателям не обнаруживали. Однотипные

показатели были в мясе животных в стадии онкорновирусной инфекции

(бессимптомной). Более заметные отклонения от нормы были обнаружены в

мясе животных больных лейкозом в гематологической стадии лейкозогенеза.

Показатель рН мяса составлял 6,00 + 0,05 через 48 часов 6,3, реакция на

пероксидазу в большинстве случаев была сомнительной, также как реакция с

сернокислой медью и на формалин. Еще более явные отклонения от нормы по

физико-химическим показателям находили в мясе от животных с опухолевой

стадией лейкоза.

Наиболее выраженные изменения физико-химических показателей,

признаки порчи в охлажденном мясе наблюдали через 96 часов хранения в

холодильнике (в бессимптомной стадии) и через 48-96 часов в

гематологической и начальной опухолевой стадиях.

Для исследования полноценности мяса полученного от больных

лейкозом животных проводили исследования химического состава мяса и

продуктов убоя.

Химический состав продуктов убоя животных – важный критерий их

качества. Установлено, что по мере развития болезни ухудшается пищевая

ценность мяса. В мясе больных животных возрастало количество влаги,

снижалось количество белка, жира и только в содержании минеральных

веществ в мышечной ткани больных и здоровых животных достоверных

отличий не установлено. В белках мышечной ткани снижается содержание

незаменимых аминокислот: метионина, триптофана, фениллаланина, лизина.

Одним из основных показателей качества является биологическая

ценность продуктов питания. Которая характеризует степень их соответствия

потребностям организма.

110

Проведенными исследованиями по определению биологической

ценности и токсичности мяса крупного рогатого скота, больного лейкозом с

использованием инфузорий Тетрахимена пириформис установлено, что

относительная биологическая ценность (ОБЦ) – по отношению к контролю

достоверно снижается в стадии бессимптомной инфекции на 3,9%, в

гематологической на 7,7%, а в опухолевой на 13,6% по сравнении с мясом

здоровых животных.

При изучении безвредности мяса больного скота нами установлено его

токсичное действие для тест-объекта инфузорий Тетрахимена Пириформис. В

суспензии из мяса животных в бессимптомной, гематологической и

опухолевой стадиях болезни, только в последних двух стадиях встречалось

большое количество клеток с измененной формой тела, многочисленными

включениями, что свидетельствовало о токсическом действии исследованного

мяса. В бессимптомной стадии количество клеток инфузорий с

патологическими изменениями достоверно не отличалось от количества этих

простейших в водной вытяжке мяса здоровых животных.

Проведенные нами исследования позволяют заключить, что продукты

убоя животных в бессимптомной стадии болезни (РИД+), а также при

поражении единичных лимфоузлов и лейкоцитозе. Не могут выпускаться без

ограничений.

Все вышесказанное подтверждает выводы отечественных и зарубежных

ученых о необходимости дифференциального подхода к санитарной оценке

лейкозных туш и органов в зависимости от стадии течения лейкозного

процесса.

Наши данные дополняют и расширяют исследования, ученых по

ветеринарно-санитарной экспертизе в том плане, что мясо и другие продукты

убоя крупного рогатого скота являются продукцией ограниченной

биологической ценности и не безопасными для потребителей т.к.

контаминированы микробными и вирусными патогенами.

111

При ветеринарно-санитарной оценке мяса больного лейкозом крупного

рогатого скота необходимо учитывать снижение биологической ценности

такого мяса, повышенную микробную и вирусную контаминацию. Такое мясо

и мясопродукты уже на ранних стадиях заболевания уступают по пищевой и

биологической ценности таковым здоровым животным. Контаминация

мясопродуктов ВЛКРС и его сохранность при низких температурах

заслуживают особого внимания, т.к. выделяемые онкогенные вирусы от

больных животных могут преодолевать межвидовые барьеры, а формы

клинического и патоморфологического проявления являются общими для

животных и человека. (Сенченко Б.С., 2000; Соколов Д.С., 2004).

За рубежом в ветеринарной практике приняты правила, по которым мясо

крупного рогатого скота с признаками лейкоза в органах, лимфатических узлах

и крови утилизируют, в пищевых целях используется мясо только от

животных с онкорновирусной инфекцией (РИД +) с предварительной

термической обработкой в виде консервов или колбасных изделий. В сыром

виде такое мясо в свободную реализацию не допускается.

В практике отечественных перерабатывающих предприятий

ветеринарно-санитарная оценка мясопродуктов крупного рогатого скота,

больного лейкозом необоснованно упрощена, не учитывается накопление

токсических и канцерогенных метаболитов в мясе больных животных,

преодоление вирусом лейкоза межвидовых барьеров, контаминация ВЛКРС и

лейкознотрансформированными клетками. Поэтому свободная реализация

продуктов убоя больных и инфицированных ВЛКРС может способствовать

распространению болезни во внешней среде и является небезопасным

действием по отношению к здоровью потребителей.

Учитывая вышесказанное в «Правилах ветеринарного осмотра убойных

животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов»

необходимо ввести более аргументированную, строгую ветеринарно-

санитарную оценку мяса и продуктов убоя, как животных больных лейкозом,

так и только инфицированных ВЛКРС (т.е. РИД+).

112

Мы считаем обоснованным что мясо и продукты убоя животных

находящихся на всех стадиях лейкозного процесса, необходимо подвергать

термической обработке для обезвреживания возбудителя. Нельзя использовать

органы и ткани инфицированных ВЛКРС животных на биотехнологические и

медицинские цели: получения зигот, гипериммунных сывороток, сбора крови

и ферментно-эндокринного сырья для изготовления медицинских препаратов.

Убой больного и инфицированного скота должен проводится отдельно

от здорового. Мясо и субпродукты могут использоваться для изготовления

колбас и консервов при температуре не ниже 73-74°С.

Туши, в мышцах которых будут выявляться очаги лейкозных поражений

и все продукты убоя необходимо направлять на изготовление сухих животных

кормов.

Таким образом, более строгая ветеринарно-санитарная оценка продуктов

убоя при лейкозах, на наш взгляд, даст положительные результаты, как для

получения экологически чистой продукции, так и для предотвращения

потенциальной возможности трансгенных изменений вируса лейкоза крупного

рогатого скота.

113

ВЫВОДЫ

1. Ретроспективный анализ статистических данных по распространению

лейкоза крупного рогатого скота в Калужской, Московской и Брянской

областях Российской Федерации в период с 1994-2009 г свидетельствует о

наличии тенденции к увеличению числа инфицированных животных и

уменьшению количества случаев послеубойного выявления болезни.

2. Прижизненные методы диагностики позволяют прогнозировать

качество получаемой продукции и пути ее реализации в зависимости от стадий

лейкозогенеза. С помощью новых методов исследования (ПЦР, электронная

микроскопия), более точно определены животные с онкорновирусной

инфекцией и выявлены малигнизированные лимфоидные клетки в

периферическом пуле крови крупного рогатого скота больного лейкозом.

Опухолевые клетки имеют маркерные аномалии (ядерные карманы).

Количество ядерных карманов коррелирует со степенью тяжести лейкозного

процесса.

3. Послеубойными методами диагностики установлено, что основными

формами лейкоза крупного рогатого скота являются лимфолейкоз и

лимфосаркома. Характерные для лейкоза патологоанатомические и

гистологические изменения обнаруживали в лимфоузлах, сердце, селезенке,

реже в мышечной ткани. Патогномоничными признаками для лейкозного

процесса были: увеличение органов в размере, нарушение их качественного и

количественного клеточного состава, инфильтрация опухолевыми

лимфоидными клетками, очаговые кровоизлияния и казеозный некроз. Такие

признаки не могут быть информативными для ветеринарно-санитарной

экспертизы туш и органов в начальных стадиях болезни, так как они характерны

для развернутого опухолевого процесса.

4. Мясо и продукты убоя крупного рогатого скота больного лейкозом

отличались по органолептическим и физико-химическим показателям от

продуктов убоя здоровых животных:

114

-мясо животных убитых в опухолевой стадии болезни имело

органолептические признаки характерные для мяса сомнительной свежести

или несвежего даже при кратковременном хранении (2-3 суток) в

холодильнике.

-физико-химические показатели мяса больного лейкозом крупного

рогатого скота отличались от мяса здоровых животных повышением рН,

изменением реакции на пероксидазу, результатами формольной пробы,

увеличением содержания летучих жирных кислот. Это свидетельствует о

замедлении процессов созревания, снижение активности тканевых ферментов и

накоплении продуктов метаболизма белка в мясе больных животных.

5. По мере развития болезни ухудшается пищевая ценность и санитарное

качество мяса. В мясе больных животных возрастало содержание влаги. У

здоровых животных этот показатель составил 74,90% при бессимптомной

стадии от был больше на 0,55%, при гематологической на 2,76% и опухолевой

стадии на 3,08% (р ≤ 0,05). Содержание белка снижалось от 20,6% до 20,13% (р

≤ 0,05); жира от 3,52% (р ≤ 0,05) до 3,46% (р ≤ 0,05) соответственно. В белках

мышечной ткани снижается содержание аминокислот метионина, триптофана,

фенилаланина, лизина.

6. Бактериологическими исследованиями установлена контаминация

образцов мышечной ткани и внутренних органов крупного рогатого скота

больного лейкозом условно-патогенной и патогенной микрофлорой,

присутствие которой не допускается СанПиН и ветеринарно-санитарными

правилами. При исследовании выделяли бактерии из рода Salmonella, группы

E.coli, рода Proteus, кокки. По частоте обнаружения микроорганизмов в органах

и тканях на первом месте стоят лимфоузлы, затем печень, почки и мышечная

ткань.

7. В первые с помощью ПЦР и электронной микроскопии доказано

наличие в пробах охлажденного, замороженного мяса и внутренних органах от

больных лейкозом животных провируса лейкоза крупного рогатого скота, его

длительная сохранность при t-20°С а также присутствие

115

лейкознотрансформированных лимфоидных клеток в мясе и мясопродуктах на

разных стадиях лейкозогенеза.

8. Относительная биологическая ценность мяса больных животных в

стадии бессимптомной инфекции снижается на 3,9%, в гематологической на

7,7%, в опухолевой на 13,6%. Установлено токсическое действие лейкозного

мяса на тест-объект Tetrahymena Pyriformis. Оно выражается в отрицательном

влиянии на выживаемость, характере движения и морфологии инфузорий.

9. На основании проведенных исследований доказано, что мясо крупного

рогатого скота с прижизненными положительными серологическими и

гематологическими результатами исследования на лейкоз необходимо

направлять на термическую обработку по разработанным режимам с

последующим использованием на пищевые мясные продукты. В виду

контаминации мяса и других продуктов убоя бактериальными, вирусными и

клеточными (опухолевыми) патогенами, они не могут быть разрешены к

свободной реализации.

4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

По результатам исследований разработаны и утверждены:

1. Учебное пособие «Лейкоз крупного рогатого скота (диагностика,

ветеринарно-санитарная экспертиза, профилактика и оздоровительные

мероприятия)» утв. УМО Вузов по образованию в области ветеринарии и

зоотехнии, гриф N06-426; М.2005

2. Рекомендации «Противоэпизоотические мероприятия при лейкозе

крупного рогатого скота в фермерских и личных подсобных хозяйствах граждан»

М.2007., утв. на заседании секции «Инфекционная патология животных»

отделение ветеринарии РАСХН М. 2006г.

3. Учебное пособие «Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов убоя

сельскохозяйственных животных при лейкозе» утв. УМО вузов РФ по

образованию в области ветеринарии и зоотехнии 11.10.2010 №63-138

116

4. Результаты исследований и иллюстрации по диссертационной работе

используются при чтении лекций по ветеринарно-санитарной экспертизе

студентам факультета ветеринарной медицины и слушателей Факультета

повышения квалификации в ФГОУ ВПО Московской государственной академии

ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина и будут полезны

в других высших учебных заведениях по специальности «Ветеринария» и по

курсу специализации «Ветеринарно-санитарная экспертиза».

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Апробация современных методов исследований (реакции полимеразных

цепей, электронная микроскопия) позволяет рекомендовать использование этих

методов для дальнейшей дифференциальной диагностики лейкоза от болезней с

лейкемоидными реакциями, для отбора животных (крупного рогатого скота) для

биотехнологических целей, получения биопрепаратов, послеубойной заготовке

сырья для медицинской и биологической промышленности.

2. Метод ПЦР может быть полезен для индикации провирусной ДНК

ВЛКРС в охлажденном, замороженном отечественном и импортном мясном

сырье от крупного рогатого скота.

3. Регламент проведенных исследований по оценке продуктов убоя при

лейкозе может использоваться как модель в экспериментальных исследованиях

по другим инфекционным патологиям крупного рогатого скота.

6. ИСПОЛЬЗОВАННАЯ НОРМАТИВНАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ

Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота.

М.,1999 Утверждены Минсельхозпрода России от 11 мая 1999 года.

Диагностика лейкоза крупного рогатого скота: Методические указания.-

М.,2000. Утверждены Департаментом ветеринарии Министерства сельского

хозяйства Российской Федерации. 23.08.2000 года.

117

Противоэпизоотические мероприятия при лейкозе крупного рогатого

скота в фермерских хозяйствах и личных подсобных хозяйствах граждан.

Рекомендации. М., 2007.

Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-

санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов. М.,1988.

Гост 7269-79 «Мясо. Методы отбора образцов и органолептические

методы определения свежести».

Гост 21237-75 «Мясо. Методы бактериологического анализа».

Гост 23392-78 «Мясо. Методы химического и микроскопического анализа

свежести мяса».

Гост 9793-74 «Мясные продукты. Методы определения содержания

влаги».

Гост 23042-86 «Мясо и мясные продукты. Методы определения жира».

Гост25011-81 «Мясо и мясные продукты. Методы определения белка».

7. Список использованной литературы

1. Аарт, Х.К. Выявление влияния факторов, повышающих риск

заболевания лейкозом крупного рогатого скота / Х.К.Аарт, Ю.А. Симоварт,

Э.М. Нымм // Теоретические и практические вопросы ветеринарии. – 1988. –

Т.2-С.165-166.

2. Адуцкевич, В.А. Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса при

лейкозах. – М., 1967.

3. Андриян, Е.А. Результаты изучения действия лазерных лучей на

лейкозогенность крови больных лейкозом овец / Е.А. Андриян, Г.В. Сноз, Н.Г.

Ененко // Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней

животных. Сборник научных трудов. М., 1993. – С. 96-97.

4. Альбикова, Г.М. Биологические свойства мяса крупного рогатого

скота, полученного от животных при различных стадиях течения лейкозного

процесса / Г.М.Альбикова // Материал 4-ой международной научно-

технической конференции «Пища. Экология. Человек». М. 2001. – С. 16.

118

5. Альбикова, Г.М. Лейкоз крупного рогатого скота в Пензенской области

(распространение, морфологическое проявление, особенности ветеринарно-

санитарной экспертизы продуктов убоя) / Г.М.Альбикова: автореферат

диссертации кандидата ветеринарных наук. – М., 2001. – 24 с.

6. Аналькин, В.А. Лейкоз крупного рогатого скота / В.А.Аналькин,

М.И.Гулюкин, Н.И.Петров. – СПб., 2005.

7. Бузераиб Абдель Крим. Электронно-микроскопические,

серологические и гематологические показатели при инфицировании овец

вирусом лейкоза крупного рогатого скота / Бузераиб Абдель Крим: автореферат

диссертации кандидата ветеринарных наук – М., 1986. – 24 с.

8. Бурба, Л.Г. Диагностика лейкозов сельскохозяйственных животных /

Л.Г.Бурба, А.А.Кунаков. – М: «Колос», 1983. – 190 с.

9. Бурба, Л.Г. Профилактика и борьба с лейкозом крупного рогатого скота

/ Л.Г.Бурба // Вестник сельскохозяйственной науки. – 1986. - №10. – С.109 –

113.

10. Бурба, Л.Г. Профилактика лейкозов и меры борьбы с ним // Лейкозы и

злокачественные опухоли животных / Л.Г.Бурба, В.М.Нахмансон; под ред.

В.П.Шишкова, Л.Г.Бурбы // М.: «Колос», 1988. – С.321 – 329.

11. Бусол, В.А. Методические рекомендации по эпизоотологическому

исследованию при лейкозе крупного рогатого скота / В.А.Бусол. – М., 1982. –

12 с.

12. Бусол, В.А. Тест-система для выявления ВЛКРС полимеразной

цепной реакцией / В.А.Бусол, О.Ю.Лиманская, А.П.Лиманский, В.И.Цымбал //

Ветеринария. – 1999. - №6. – С.27-30.

13. Валихов, А.Ф. Изучение онкорновируса, выделенного при лейкозе

крупного рогатого скота / А.Ф.Валихов // Проблемы экспериментальной

онкологии лейкозов человека и животных. – М. 1979. – С.75 – 79.

14. Валихов, А.Ф. Биологические свойства вируса лейкоза крупного

рогатого скота; диагностика и профилактика инфекции / А.Ф.Валихов:

автореферат диссертации доктора биологических наук. – М., 1992.

119

15. Винокурова, З.В. Гельмобластозы крупного рогатого скота в Якутии

(патоморфологическая характеристика). – Якутск, 2000.

16. Гаврилова, Г.А. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота / Г.А.

Гаврилова, Ю.А.Макаров, С.В.Бахметьева // Ветеринария. – 2004. - №1. – С. 20-

23.

17. Гладырь, Е.А. Создание и экспериментальная апробация

высокочувствительной тест-системы диагностики лейкоза крупного рогатого

скота / Е.А.Гладырь, Н.А.Зиновьева, А.А.Ермилов и др. // Вет. Патология. –

2006. - №3. – С.87-90.

18. Гулюкин, М.И. Эпизоотологическая оценка методов прижизненной

диагностики лейкоза крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин, Е.А. Дун, Н.В.

Замараева и др. // Вестник РАСХН. – 2000. - №3. – С. 60-62.

19. Гулюкин, М.И. Разработка эффективных мероприятий против лейкоза

крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин, Л.А.Иванова, Н.В. Замараева и др. //

Ветеринария. – 2002.- №12.- С.3-8.

20. Гулюкин, М.И. Состояние, перспективы профилактики и

совершенствования мер борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в РФ /

М.И. Гулюкин, Л.А.Иванова, З.Н.Меньшикова и др. // Материал

Международной учебно-методической и научной конференции, посвященной

85-летию МВА. – М. – 2005. – С. 2.

21. Гулюкин, М.И. Эпизоотологическая эффективность системы ВИЭВ

борьбы с лейкозом крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин, В.М. Нахмансон,

Л.А.Иванова и др. // Веткорм. – 2006. - №1. – С.14-16.

22. Гусева Е.В. Применение ПЦР в диагностике инфекционных

заболеваний животных / Е.В.Гусева, Г.А.Сатина. – Владимир, 1995. – 44 с.

23. Двоеглазов, Н.Г. Значение ИФА, ПЦР в диагностике вирусного

лейкоза крупного рогатого скота / Н.Г. Двоеглазов, С.В. Чичунина, О.П.Иванов,

М.Н.Ткаченко // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: материалы

сибирского международного ветеринарного конгресса. – Новосибирск, 2005. –

С. 123-124.

120

24. Джапаралиев, Н.Т. Молекулярно-биологические методы диагностики

лейкоза крупного рогатого скота: автореферат диссертации кандидата

биологических наук. – Владимир, 2002.

25. Джапаралиев, Н.Т. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота

методом ПЦР – ИФА / Н.Т. Джапаралиев, Н.Ф.Ломакин, Л.Б. Прохватилова //

Вет. и мед. аспекты зооантропонозов. – Покров, 2003, - ч.2, - С.414-418.

26. Донник, И.М. Утилизация туш крупного рогатого скота по причине

лейкоза / И.М.Донник, В.М.Мельникова, Е.И. Корсонова // Всероссийская

конференция к 65-летию Свердловской НИВС: Материалы. – Екатеринбург,

2000. – С.212-122.

27. Донченко, А.С. Анализ эпизоотического процесса лейкоза крупного

рогатого скота / А.С. Донченко, С.И.Логинов // Ветеринарная медицина. – 2007.

-№1. – С.80-82.

28. Дрогун, А.Г. Клиником-морфологические исследования крупного

рогатого скота при лейкозе и лейкемоидных реакциях / А.Г. Дрогун,

В.М.Лемеш, В.Н.Якубов // Патоморфология, патогенез и диагностика болезней

сельскохозяйственных животных. – М., 1980.- С.199-200.

29. Иванова, Л.А. Разработка и испытание метода иммуноферментного

анализа для диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Л.А.Иванова:

автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук. – М., 2000. – 21 с.

30. Иванова, Л.А. Опыт использования секретов молочной железы коров

для выявления антител к вирусу лейкоза / Л.А.Иванова, М.И. Гулюкин,

А.В.Васин и др. // Бюллетень ВИЭВ. – М., 1996. – Вып. 77. – С.67. 32

31. Ивчина, Е.Ю. Актуальные вопросы ветеринарной санитарии на

мясоперерабатывающих предприятиях / Е.Ю. Ивчина // Ветеринария. – 2007. -

№8. – С.42-46.

32. Калашников, А.Е. Применение полимеразной цепной реакции в

диагностике лейкоза крупного рогатого скота / А.Е.Калашников,

Н.Е.Калашникова, Л.А.Калашникова // Современные достижения и проблемы

121

биотехнологии сельскохозяйственных животных. ВНИИЖ. – Дубровицы, 2006.

– С.65-67.

33. Ковтун В.Я. О патоморфологической диагностике гемобластозов у

крупного рогатого скота / В.Я.Ковтун // Патоморфология, патогенез и

диагностика болезней сельскохозяйственных животных. – М., 1980. – С.189-

190.

34. Комарова, И.Н. Разработка ПЦР-теста для видовой идентификации и

количественной оценки мясного сырья / И.Н.Комарова: автореферат

диссертации кандидата биологических наук. – М., 2005. – 21с.

35. Коромыслов, Г.Ф. Лейкозы и опухолевые болезни

сельскохозяйственных животных / Г.Ф. Коромыслов, Л.Г. Бурба, В.М.

Нахмансон и др. // Труды ВИЭВ. Т.70. – М.: ВИЭВ., 1991. – С.146.

36. Крикун, В.А. Слизистая носа – наиболее вероятный путь заражения

животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота / В.А.Крикун // Лейкозы

крупного рогатого скота: сб. научных трудов МВА им. К.И.Скрябина. – М.,

1985. - С.5-7.

37. Куделева, Г.В. Связь экспрессии поверхностных антигенов

лимфоидных клеток, ассоциированных с лейкозом крупного рогатого скота, с

уровнем заболеваемости лейкозом / Г.В. Куделова, Л.И. Нагаева, Е.А. Молявко

и др. // Доклады ВАСХНИЛ. – 1991. - №4. – С.50-54.

38. Кудрявцева, Т.П. Лейкоз животных / Т.П.Кудрявцева // М.

Россельхозиздат. – 1980. – С.150.

39. Кудряшов, А.А. Патологоанатомические изменения при лимфоидном

лейкозе крупного рогатого скота / А.А.Кудряшов, Н.И.Петров // Ветеринария. –

1999. - №10. – С.14-15.

40. Кузнецов, А.П. Влияние некоторых факторов на интенсивность

перезаражения коров лейкозом / А.П.Кузнецов, Е.А.Маринин, Л.К.Семина //

Ветеринария. 2006. - №7. – С.16-18.

122

41. Кузнецова, Н.В. Использование полимеразной цепной реакции для

выявления инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота /

Н.В.Кузнецов, Г.А.Симонян // Ветеринария. – 1997. - №5. – С.15-16.

42. Кукайн, Р.А. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / Р.А.Кукайн,

Л.И.Нагаева, В.П.Ложа и др. // Рига. «Зинатне». – 1982.

43. Кумков, В.Т. Эффективность реакции иммунодиффузии с двойным

антигеном онкорнавируса типа С при оценке эпизоотического состояния

хозяйств по лейкозу скота / В.Т. Кумков, В.А. Крикун, Л.И. Нагаева //

Этиология и иммунодиагностика лейкоза крупного рогатого скота. – Рига, 1979.

– с.131-135.

44. Кунаков, А.А. Ветеринарно-санитарная характеристика продуктов

убоя при различных стадиях лейкоза у крупного рогатого скота / А.А.Кунаков,

Г.М. Альбикова // Материал 4-ой международной научно-практической

конференции «Актуальные проблемы медицины и ветеринарно-санитарного

контроля сельскохозяйственных продуктов». – М., 2002. – С.18-19.

45. Кунаков, А.А. К вопросу ветсанэкспертизы и оценки продуктов убоя

при лейкозе / А.А.Кунаков, И.Г.Серегин // Труды ВИЭВ. – М.1999 – С.232-234.

46. Кухаренко, Н.С. Электронно-микроскопическое изучение органов

лимфопоэза при лимфоидном лейкозе крупного рогатого скота / А.С.

Кухаренко, Г.А. Севостьянов, В.В.Федоров и др. // Материалы VI Всесоюзной

конференции по патологической анатомии животных – Тарту., 1988. т.1, -

С.263-267.

47. Лазарев, И.М. Опухоли лимфатических узлов (цитологическая

диагностика) / И.М.Лазарев // Атлас. – Кишинев, 1990.

48. Лемеш, В.М. О доброкачественности мяса при лейкозе крупного

рогатого скота / В.М. Лемеш, П.И.Пахомов // Тез. докладов 2-ой

международной научно-практической конференции. – М., 1997. – С.45-46.

49. Лемеш, В.М. Изменение качества мяса при заболевании крупного

рогатого скота лейкозом / В.М. Лемеш, П.И. Пахомов // Проблемы

123

производства молока и говядины. Материалы Международной конференции. –

Жодино., 1996. – С.68-69.

50. Макаров, В.В. ПЦР-диагностика лейкоза крупного рогатого скота /

В.В.Макаров, Д.Н.Гринишин // Ветеринария. – 2005. - №4. – С.9-11.

51. Маккерди, Б.Д. Обнаружение и идентификация патогенных

микроорганизмов молекулярными методами / Б.Д. Маккерди, Д.А. Чимера // В

кн.: Молекулярная клиническая диагностика. – М.: Мир. – 1999. – С.496-506.

52. Максимова, Е.В. Особенности иммуноморфологических изменений с

лейкемической формой лейкоза / Е.В.Максимова, Л.В.Губайдуллина //

Эффективность адаптивных технологий в животноводстве. – Ижевск. – 2004. –

С.65-70.

53. Мальцева, Н.А. Использование диагностических ДНК-зондов для

обнаружения провируса бычьего лейкоза у инфицированных коров / Н.А.

Мальцева, А.С. Каледина, Е.И. Олейник и др. // Вопросы вирусологии. – 2002. –

Т.47. - №:. – С.38-41

54. Мандыгра, Н.С. Эпизоотологическое значение прижизненной

диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Н.С. Мандыгра // Ветеринария.

– 2000. - №6. – С.15-17.

55. Меграбян, Д.С. Лейкоз крупного рогатого скота. 1. Характеристика

болезни и ее этиологии / Д.С. Меграбян, А.В. Метелев, В.В. Колотвин и др. //

Российский ветеринарный журнал. – 2006. - №3. – С.5-7.

56. Меграбян, Д.С. Методы диагностики в борьбе с лейкозом крупного

рогатого скота (РИД, ИФА, ПЦР) / Д.С. Меграбян // Ветеринарная патология.-

2009.-№2.-С.85-87.

57. Меньшикова, З.Н. Электронно-микроскопическая характеристика

вариантов морфогенеза бычьего лейкозного вируса / З.Н.Меньшикова, Махмуд

Абдель З.С. // Сборник научных трудов МВА. – 1980. – Т.107, - С.13-19.

58. Меньшикова, З.Н. Особенности морфологии лимфоидной ткани и

качества мяса при хроническом лимфолейкозе крупного рогатого скота / З.Н.

Меньшикова, Т.В. Курмакаева, М.И. Гулюкин и др. // Материалы

124

Всероссийской конференции к 65-летию Свердловской НИВС. – Екатеринбург,

2001. – С.115-117.

59. Меньшикова, З.Н. Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса крупного

рогатого скота на разных стадиях лейкоза / З.Н. Меньшикова, Т.В. Курмакаева

// Материал методической и научно-практической конференции МГАВМиБ им.

К.И.Скрябина: сб. трудов. – М.2001. – С.226-228.

60. Меньшикова, З.Н. Электронно-микроскопическая характеристика

вариантов морфогенеза бычьего лейкозного вируса / З.Н. Меньшикова, А.В.

Махмуд, В.П. Шишков // В кн.: Теоретические и практические вопросы

лейкозов и злокачественных опухолей сельскохозяйственных животных, М. –

МВА. – 1979. – Т.107. – С.13-19.

61. Меньшикова, З.Н. Морфологическая оценка лимфатической системы

при лейкозе крупного рогатого скота / З.Н.Меньшикова, Г.В.Сноз,

М.Ф.Боровков // Материалы методической и научной конференции: сб. науч.

Трудов. – М., 2001. – С.228-230.

62. Москалик, Р.С. Лейкоз крупного рогатого скота (меры профилактики

и борьбы Молдавии) / Р.С. Москалик, Е.В. Ренице. – Кишинев, 2003.

63. Мурватуллаев, С.А. Трансплацентарная передача ВЛКРС от матери к

потомству / С.А. Мурватуллаев // Бюллетень ВИЭВ. – 1983. – В.50. – С.13-14.

64. Надточей, Г.А. Морфологическая характеристика и

иммунологические свойства онкорнавируса типа С крупного рогатого скота /

Г.А. Надточей, А.Ф. Валихов, Л.Г. Бурба, В.А.Горбатов // Доклады ВАСХНИЛ.

– 1976. - №5. – С.31-34.

65. Нахмансон, В.Н. Особенности инфекционного и эпизоотического

процесса при лейкоза крупного рогатого скота / В.М. Нахмансон //

Ветеринария. – 1990. - №7. – С.32-36.

66. Нахмансон, М.В. Ведущее звено в системе профилактики и борьбы с

лейкозом / В.М.Нахмансон // Ветеринария. – 1994. - №3. – С.9-13.

125

67. Нахмансон, В.М. Особенности инфекционного процесса лейкоза

крупного рогатого скота / В.М. Нахмансон, Н.И.Петров, С.В. Лопунов //

Веткорм. – 2005. - №6. – С.12-13.

68. Облап, Р.В. Выявление провирусной ДНК крупного рогатого скота

методом полимеразной цепной реакции / Р.В. Облап, С.Б. Зеленый, В.И. Глазко

// Материалы Сибирского международного ветеринарного конгресса. –

Новосибирск. – 2005. – С.44-45.

69. Обухов, И.А. Применение ПЦР в ветеринарии / И.А.Обухов //

Аграрная Россия. – М. – 2002. - №2. – С.62-64.

70. Орлов, А.А. Перекисное окисление липидов и морфология сыворотки

крови при лейкозе крупного рогатого скота / А.А.Орлов, И.А. Пахмутов // Тез.

докладов III Российской конференции патофизиологии с международным

участием. – М. – 2004. – С.51.

71. Орлянкин, Б.Г. Таксономия ретровирусов и характеристика вируса

лейкоза крупного рогатого скота / Б.Г. Орлянкин, М.И. Гулюкин, Н.В.

Замараева и др. // Труды ВИЭВ, т.72. – М.: ВИЭВ. – 1999, - С.16-22.

72. Орлянкин, Б.Г. Классификация ретровирусов и характеристика вируса

лейкоза крупного рогатого скота / Б.Г.Орлянкин, М.И.Гулюкин, Н.В.Замараева

// Ветеринария. – 2000. - №5. – С.17-19.

73. Парфанович, М.И. О возможной роли молока в горизонтальном пути

передачи лейкоза крупного рогатого скота / М.И.Парфанович, А.Г.Коломиец,

В.А.Бусол и др. // Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с

болезными сельскохозяйственных животных. Труды ВИЭВ. – 1999. – С.94-96.

74. Парчинский, О.Ч. Сопоставление клинической картины и

патоморфологических изменений органов желудочно-кишечного тракта при

лимфатическом лейкозе у крупного рогатого скота / О.Ч. Парчинский //

Проблемы лейкоза. – М. Колос. – 1967.

75. Пахомов, П.И. Ветеринарно-санитарная и биологическая оценка мяса

крупного рогатого скота больного лейкозом / П.И.Пахомов: автореф. дис. канд.

ветеринарных наук. – Минск. – 1998. – 19 с.

126

76. Петров, Н.И. Эффективность оздоровительных мероприятий при

лейкозе крупного рогатого скота в племенных хозяйствах / Н.И.Петров,

П.Г.Захаров, А.Г.Левашов // Актуальные вопросы диагностики, профилактики и

борьбы с лейкозом сельскохозяйственных животных и птиц: Материалы

Всероссийской конференции к 65-летию Свердловский НИВС. – Екатеринбург,

2000. – С.144-147.

77. Петров, Н.И. Диагностика и методы борьбы с лейкозом крупного

рогатого скота / Н.И.Петров // Материалы Всероссийского совещания-

семинара. – Брянск., - 2004. – С.104-106.

78. Пиголкина, В.В. Ультраструктура лейкоцитов крови и кроветворных

органов крупного рогатого скота при гемобластозах/ В.В.Пиголкина // Труды

ВИЭВ, т. 70. – М.: ВИЭВ, 1983. – С.141.

79. Пипирас, Ю.Ю. Оценка мяса крупного рогатого скота при лейкозе /

Ю.Ю. Пипирас: автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук.

Литература СХА., - 1972. – 18с.

80. Прохватилова, Л.Б. Применение ПЦР для раннего обнаружения

провируса лейкоза крупного рогатого скота у экспериментально

инфицированных животных / Л.Б. Прохватилова, С.Н.Козлов, А.И.Ломакин и

др. // Ветеринария. – 2001. - №8. – С.17-21.

81. Пышко, И.И. Ветеринарно-санитарная оценка мяса крупного рогатого

скота больного лейкозом в субклинической стадии развития болезни /

И.И.Пышко: автореферат диссертации кандитата ветеринарных наук. Беларусь.

- НИВИ. – 1972.

82. Разумовская, В.В. Роль гематологической диагностики в системе

противолейкозных мероприятий /В.В.Разумовская, В.Н. Васанова //

Актуальные вопросы ветеринарной медицины: материалы Сибирского

международного ветеринарного конгресса. – Новосибирск, 2005. – С.155-156.

83. Русинович, А.А. Эпизоотическая характеристика лейкоза крупного

рогатого скота / А.А. Русинович // Издание Академии аграрных наук

Республики Беларусь. – 2002. - №1. – С.73-77.

127

84. Рыбаков, С.С. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом

полимеразной цепной реакции / С.С.Рыбаков // Вестник РАСХН. – 1998. - №5. –

С.65-68.

85. Салимов, Х.С. О методах индикации онкорнавирусной инфекции /

Х.С. Салимов // С.-х. биол. – 1986. - №12. – С.99-103.

86. Светличкин, В.В. Теоретическое обоснование и разработка теста

систем ускоренной оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-

санитарного контроля / В.В. Светличкин: автореферат диссертации доктора

ветеринарных наук. – М.2002. – 40 с.

87. Свириденко, Г.М. Пути обеспечения безопасности молока при лейкозе

крупного рогатого скота / Г.М. Свириденко, Е.Г.Семов // Молочная

промышленность. – 2003. - №7. – С.8-10.

88. Симонян, Г.А. Цитоморфологическая диагностика гемобластозов

крупного рогатого скота / Г.А.Симонян, В.А.Горбатов, Г.С.Петровский // Труды

ВИЭВ. Т.59. – М.: ВИЭВ, 1983. – С.35-42.

89. Симонян, Г.А. Методы прижизненной диагностики лейкоза /

Г.А.Симонян // Лейкозы и злокачественные опухоли животных: под ред.

В.П.Шишкова, Л.Г.Бурды. – М. Агропромиздат, - 1988. – С.133-153.

90. Симонян, Г.А. Ветеринарная гематология / Г.А.Симонян, Ф.Ф.

Хисамутдинов // - М. Колос. – 1995. – 256 с.

91. Симонян, Г.А. Цитоморфология клеток кроветворения у крупного

рогатого скота при гемобластозах / Г.А. Симонян // Российский ветеринарный

журнал. – М. – 2006. - №3. – С.9-12.

92. Смирнов, А.М. Контроль качества и безопасности мяса и

мясопродуктов / А.М.Смирнов // Ветеринария. – 2006. - №8. – С.3-5.

93. Смирнов Н.П. Научные и практические основы оздоровления стад от

лейкоза крупного рогатого скота в Сибири / П.Н.Смирнов, В.В.Храмцов,

В.В.Смирнова // Всероссийская конференция к 65-летию Свердловской НИВС:

материалы. – Екатеринбург. – 2000. – С.104-114.

128

94. Смирнов, П.Н. Лейкоз крупного рогатого скота: проблемы и их

решения на уровне субъектов Федерации / П.Н.Смирнов // Ветеринария. – 2007.

- №8. – С.4-6.

95. Смирнов Ю.П. Основные пути распространение лейкоза /

Ю.П.Смирнов // Ветеринарная газета. – 1999. - №4. – с.3-4.

96. Смирнов, Ю.П. Социально-экономические, биологические аспекты

канцеро- и лейкогенеза и эффективность мер борьбы с лейкозом крупного

рогатого скота / Ю.П.Смирнов, А.В. Жаркова, Н.Г.Молочкова и др. // Научные

основы профилактики и лечения инфекционных, инвазионных и незаразных

болезней сельскохозяйственных животных : Сб. научных трудов ГНУНИВИ

НЗРФ. – Н.Новгород. – 2004. – С.12-21.

97. Смирнова, В.В. Гемобластозы крупного рогатого скота /

В.В.Смирнова // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как

основа улучшения качества и здоровья сельскохозяйственных животных. –

Ставрополь. – 2003. – С.404-406.

98. Снежков, Н.И. Биологические свойства молока и его роль в

распространении возбудителя лейкоза крупного рогатого скота / Н.И.Снежков,

М.И. Гулюкин, Л.Г. Бурба и др. // Ветеринария. – 1991. - №1. – С.30-34.

99. Сноз, В.Г. Патолого-морфологические особенности органов и тканей

крупного рогатого скота при спонтанных и экспериментальных лимфолейкозе и

лимфобластозной лимфосаркоме / Г.В. Сноз // Лейкозы крупного рогатого

скота: сборник научных трудов / МВА им. К.И.Скрябина. – 1985. – С.74-78.

100. Сноз В.Г. Локализация патолого-анатомических и гистологических

изменений в органах и тканях крупного рогатого скота при гемобластозах на

разных стадиях развития патологического процесса / Г.В. Сноз // Материал

Всероссийской научно-методической конференции по патанатомии

сельскохозяйственных животных. – Воронеж. – 1994. – С.67-68.

101. Соколов, Д.С. Краткий аналитический обзор состояния изученности

проблемы ветеринарно-санитарной оценки мяса при лейкозе крупного рогатого

129

скота / Д.С.Соколов // Материалы Международного Сибирского ветеринарного

конгресса. – Новосибирск. – 2004. – 200.

101. Сюрин, Н.В. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я.

Самуйленко, Б.В.Соловьева, Н.В.Фомина // М.: ВНИТИБП. – 1998.

102. Таджибаев, А.А. Патоморфологические изменения при спонтанном и

экспериментальном лейкозе / А.А. Таджибаев: автореферат диссертации

кандидата ветеринарных наук, 1984. – 19 с.

103. Туник, А.Н. Обеспечение эпизоотологического и ветеринарно-

санитарного благополучия Москвы / А.Н.Туник // Труды ВНИИВ СГЭ.

«Проблемы ветеринарной санитарии и экологии». – М. – 2006. – Т.118. – С.12-

17.

104. Туник, А.Н. Состояние и пути совершенствования обеспечения

безопасности пищевых продуктов и продовольственного сырья в ветеринарном

отношении в городе Москве / А.Н.Туник // Продовольственная безопасность

России: Сборник материалов научно-практической конференции. – М. – 2005. –

С.47-56.

105. Федоров, В.С. Особенности проявления эпизоотического процесса

лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах различных форм собственности /

В.С.Федоров, А.Г.Иванов, В.В.Храмцов // Научное обеспечение ветеринарных

проблем в животноводстве: сборник научных трудов ИЭВ Сибири и Дальнего

Востока. – Новосибирск. – 2000. – С.81-83.

106. Федотов, В.П. Лейкоз крупного рогатого скота в Ивановской области

/ В.П.Федотов, О.В.Иванов // Ветеринария. – 2006. - №3. – С.23-25.

107. Хисамутдинов, Ф.Ф. Племенной молодняк – источник вируса

лейкоза крупного рогатого скота / Ф.Ф. Хисамутдинов, И.Н.Никитин //

Ветеринария. – 1996. - №. – С.11-14.

108. Храмцов, В.В. Влияние эпизоотического состояния на сроки

оздоровления стад от лейкоза (на примере Красноярского края) / В.В.Храмцов,

С.И.Логинов, А.Т. Анишин // Научное обеспечение ветеринарных проблем в

130

животноводстве: сборник научных трудов ИЭВ Сибири и Дальнего Востока. –

Новосибирск. – 2000. – С.196-198.

109. Шкаева, Н.А. Лейкоз крупного рогатого скота на территории Урала /

Н.А.Шкаева, В.А. Бударков // Ветеринария. – 2005. - №9. – С.9-11.

110. Шкута, А.Б. Краткий обзор диагностической эффективности

гематологического метода диагностики лейкоза крупного рогатого скота / А.Б.

Шкута // Материалы Международного Сибирского ветеринарного конгресса. –

Новосибирск. – 2005. – С.172.

111. Шишкин, А.В. Современные особенности распространения лейкоза

крупного рогатого скота в субъектах Российской Федерации / А.В.Шишкин:

автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук. – 2006. – 21с.

112. Шишков, В.П. Наступление на лейкозы животных / В.П.Шишков //

Наука и человечество. – М – 1988. – С.103-113.

113. Шишков, В.П. Электронно-микроскопическое, серологическое и

гематологическое исследование, инфицированных вирусом лейкоза крупного

рогатого скота / В.П.Шишков, З.Н.Меньшикова, А.Бузераиб, В.А.Крикун //

Экспериментальная онкология. – 1990. - №1. – С.45-53.

114. Шишков, В.П. Ультраструктурная характеристика

вирусопродуцирующих лимфоцитов при лейкозе крупного рогатого скота //

В.П.Шишков, З.Н.Меньшикова // Архив патологии. – 1989. - №4.- С.45-52.

115. Эрнст, Л.К. Новые аспекты селекции крупного рогатого скота на

устойчивость к лейкозу / Л.К.Эрнст, В.П.Шишков // Сельскохозяйственная

биология. – 1984. - №2. – С.96-104.

116. Alencar Filno, R. Estudo ultrastructurae de linfocitos de bovines

infectodos pelo virus da leucose / de T.R.Alencar, J.July, W.Oliveira et al. //

Biologico. – 1982. - №5. – P.135-137.

117. Ballagi – Pordany, A. Direct defection of bovine leukemia virus infection:

practical applicability of a double polymerase chain reaction // A.Ballagi - Pordany,

K.Klinvevall, M.Merza et al. // J.Vet.Met. B. – 1992. – №39.- P.69-77.

131

118. Baliga, V. Expression of the bovine leukemia virus and it’s internal

antigen in blood lymphocytes / V.Baliga, J.Ferrer // Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. –

1977.

119. Bendixen, N. Bovine enzootic leucosis / N.Bendixen // Adv. Vet. Sci. –

1972. – №10. – P.129-204.

120. Bolognesi, D. Assembly of type concornaviruses a model / D.Bolognesi,

H.Frank, R.Montelaro et al. // Science. – 1987, 199. - №25. – P.183-186.

121. Bruck K. Biologically active epitopes of bovine leukemia virus

glycoprotein egp 51: their dependence on protein glycosylation and genetic

variabieitty / K.Bruck, N.Rensonnet, D.Portetelle et al. // Virology. – 1984. – 136,

№L. – P.20-31.

122. Burny A. Laleucemie bovine: systeme modele de leucemogenisation par

un retrovirus / A.Burny, Y.Cleuter, C.Dandoy et al. // Ann. Med. Vet. – 1986, 130. -

№4. – P.287-294.

123. Burny, A. Bovine leukemia: Facts and hypotheses derived from the study

of an infections cancer / A.Burny, Y.Cleuter, R.Kettmann et al. // Vet. Microbiol. –

1988. – 17. - №3. - P.197-218.

124. Buxton, B. Role of insects the transmission of bovine leucosis virus:

potential for transmission by stable flies horn and tabanids / B.Buxton, N.Hinkle,

R.Schuetz // Amer. J. Vet. Res. – 1985. - №46. – P.123-126.

125. Calafat J. Morphogenesis of bovine leukemia virus / J.Calafat, A.Ressang

// Virology, - 1978, 80. - №1., P.42-53.

126. Calafat J. Ultrastructural study of viruslike particles in Chiness hamster

lung cells / J.Calafat, J.Hilkens // J. Jen. Virol. – 1978. – 41. - №2. – P.417-420.

127. Deschamps, J. Experiments with cloned complete tumor – derived bovine

leukemia virus information prove that the virus is totally exogenous to it’s target

animal species / J.Deschamps, R.Kettmann // J.Virol. – 1981. – v.40. – P.605-609.

128. Driscol, D. Bovine leukemia virus associated antigens in lymphocyte

cultures / D.Druscol, C. Olson // J. vet. Res. – 1977. - №38. – P.1897-1898.

132

129. Evermann J. Prevalence of bovine leukemia virus antibody in seven heard

of Holstein-friesian cattle / J.Evermann //J. Veter. Res. – 1986. - #177. – P.549-550.

130. Ferrer, J.F. Bovine lymphosarcoma / J.F.Ferrer // Adv. Vet. Sci. Comp.

Med. – 1980. – v.24. – P.1-68.

131. Ferrer, J. F. Role of colostrum and milk in the natural transmission of the

bovine leukemia virus / J.Ferrer, C.Piper // Cancer. Res. – 1981. - №41. – P.4906-

4909.

132. Floris, A. Bovine leukaemia virus and peripheral blood lymphocytes

homeostasis / A.Floris, R.Kettmann, L.Willems // Biotechnol. Agron. Soc.

Environnew. – 2007. Vol. 11. - №1. – P. 69-78.

133. Gallo, R. Isolation and tissue distribution of type – c virus and viral

components from a gibbon age (Hylobates lar) with lymphocytie leukemia / R.Gallo,

R. Gallagher, F.Wong-Staal et al. // Virology. – 1982. – 84. - №2. – P.359-373.

134. Gupta, Ph. Exhanced expression of the c-myc gene in bovine leukemia

virus – induced bovine tumors / P. Gupta, S.Kashmiri, M.Erisman et al. // Cancer.

Res. – 1986. – 46. - №12. – P.6295-6298.

135. Johnson, K. Bovine leukemia virus: A herdbased control strategy /

R.Johnson, C.Osion, J.Kapeene // Prev. Veter. Med. – 1985. - №3. – P.359-340.

136. Hamomoto, H. Histopathological study on six cases of calf leucosis /

H.Hamomoto, T.Yoshino // Nat. Inst. Anim. Health. Q. – 1975. - №11. P.22-28.

137. Kelly, E. Early detection of bovine leukemia virus in cattle by use of the

polymerase chain reaction / E.Kelly // Amer. J. Vet. Res. – 1993. – v.54. - №2. –

P.205-209.

138. Klintevall, K. Evaluation of an indirect ELISA for the detection of

antibodies to bovine leukemia virus in milk and serum / K. Klintevall, K.Naslund,

S.Svedlund // J.Ovirol. Methods. – 1991. – Vol.33. – P.319-333.

139. Kono Y. Studies of fetuses from cows clinically affected with bovine

leucosis / Y.Kono, H.Sentsui, K.Arai et al. // Vet. Microbiology. – 1983. - №18. –

P.505-508.

133

140.Koyama, H. Optimal titer of bovine leukemia virus antigen for

immunodiffusion test / H. Koyama // J.Japan Veter. Med. Assn. – 1981. - №34. –

P.374-378.

141. Kono, X. Contact transmission of bovine leukemia virus under insect-free

conditions / Y.Kono, S.Hiroshi, A.Keigo et al. // Jap. J. Vet. S. C. – 1983, 45. - №6. –

P. 799-807.

142. Lorenz, R. Observation on serologically weak-positive reactions with the

immunodiffusion test (IDT) in the diagnosis of enzootic bovine leucosis (EBL)

infections / R. Lorenz et al. // Current topics in Vet.Med. and Anim.Sci. – 1982. -

№15. – P.413.

143. Mammerickx, M. Rapid detection of bovine leukemia virus infection in a

large cattle population with an ELISA performed on pooled sera grouped by heard /

M. Mammerickx et al. // Veterinarmedizin. – 1985. – Vol.32. - №8. – P.601-608.

144. Mamoum, R. Sequence variability of bovine leukemia virus env gene and

to the structure and antigenicity of the glycoproteins / R.Mamoun, M.Morisson,

N.Rebeyrotte // J. Virol. – 1990. – 64,№9. – P.4180-4188.

145. Meier, U. Ergebnisse des Einsatzes des Elzumimmunoassay bei der

Bekmpfung der enzootischen Rinderleikose in der DDR / U.Meier, W.F.Schilow,

W.Wittmann et al. // Tagunsbericht Akad. Der Landwirtschaftwiss. der DDR. – 1984.

146. Miller, J.M. Virus-Like particles in phytohemagglutinin-stimulated

lymphocyte cultures with referect to bovine lymphosarcoma / J.M.Miller, C.Olson,

K.G.Gillette // J.Nat.Cancer Inst. – 1969. – 43. - №6. - P.1297-1302.

147. Miller, L.D. Blood from bovine leukemia virus-infected cattle: Antigen

production correlated with infectivity / L.D.Miller, M.J. Van der Maaten,

M.J,F.Schmerr // Amer.J.Vet.Res. – 1985. - №46. P.808-810.

148. Mussgay, M. The bovine leucosis virus / M.Mussgay, B.Dietrshold,

B.Frenzel // Med.Microbiol. and Immunol. – 1987. – v. №1-3. – P.131-138.

149. Ohsnima, K. Pathological studies on aleukemic case of bovine leucosis /

K. Ohsnima, K.Omi, K.Okada et al.// Japan J.Veter.Sci. – 1980. - №42. – P.297-309.

134

150. Horvath, M. Electron microscopytool to diagnostics pathology /

M.Norvath // Vet.Med.Praha. – 1996. – 41. – P.191-195.

151. Olson, C. Role of C-type virus in bovine lymphosarcoma / C.Olson,

L.Miller, J.Miller // Bibliogr. Haematol. – 1973. - №39 – P.3249-3256.

152. Olson, C. C-type virus and lymphocyte nuiclear projections in bovine

lymphosarcoma / C.Olson, L.Miller, K.Gillette // J.Amer.Vet.Med.Ass. – 1970, 156.

– P.1880-1883.

153. Onuma, M. Integration of bovine leukemia virus DNA in the genomes of

bovine lymphosarcoma cells / M.Onuma, N.Sagata, K.Okata et al. // Microbiol. And

Immunology. – 1982. – 26. - №8.– P.813-820.

154. Onions, D. Animal models: lessons from feline and bovine leukemia virus

infections / D.Onions //Leuk. Res. – 1985,9 - №6. – P.709-711.

155. Ogawa, Y. No involvement of bovine virus in sporadic bovine

lymphosarcoma / Y.Ogawa, N.Sagata, M.Onuma et al. // 1986, 30. - №7. – P.697-

701.

156. Ressang, A. Transmissie en immunologische respons bij enzootische

bovine leukose / A.Ressang, N.Mastenbroek, J.Quak // Tijdschr.Diergeneesk. – 1987.

- №16. – P.657-660.

157. Results of veterinary inspection of slaughter animals and meat in Poland

in 2003 // Med. Weter. – 2005. – Vol. 61. - №10. – P. 1160-1161.

158. Ristan, E. Zur Funktion des humoralen und zelluralen Immun systems bei

Rindern mit Enzootischer leukose / E.Ristau, W.Wittmann // Monatsh. Veterinar.

Med. – 1985. - №6. – P.548-553.

159. Romero, C. Boophilus microplus. Bovine leucosis virus infectivity in

Boophilus microplus ticks / C.Romero, D.Abaracon, Ch.Rowe et al. // Vet.Rec. –

1984. - №17. – P.440-442.

160. Romero, C. Transmission of bovine leukemia virus in milk / C.Romero,

B.Cruz, Ch.Rowe // Trop. Anim.Health and Prod. – 1983. - №4. – P.215-218.

135

161. Prem, P. Evidence for the replication of bovine leukemia virus in the B-

lymphocytes / P.Prem, K.Pomeroy, D.Johson et al. // Amer. J. Vet. Res. – 1977. – 6.

– P.873-876.

162. Sagata, N. Comparison of the entire genomes of bovine leukemia virus

and characterization of their unidentified open reading frames / N.Sagata,

T.Yasunaga, K.Ohishi et al. // Embo J. – 1985.v3. - №13. - P.3231-3237

163. Theilen, G. Bovine lymphosarcoma in California / G.Theilen,

D.Dungworth, J.Lengyel // Epizootologic and Hematoloc aspects. Health Lab. Sci. –

1961. - №1. – P.96-106.

164. Van der Maaten, M. Role of the spleen in the path genesis of

experimentally induced bovine leukemia virus infection / M. Van der Maaten,

J.Miller, M.Schmerr // Veterinary Microbiol. – 1982. - №7. – P.411-418.

165. Von Melcher. Zur Atiologic und Pathogenese der leukamien / H. von

Melcher, K.Hoffken, C.Schmidth // Dtsch. Med. Wochenschr. – 1983. – 108. - №44.

– P.1686-1692.

166. Watanabe, K. A case of ovine lymphosarcoma / K.Watanabe et al. //

J.Japan.Ket.Med.Assn. – 1999, v.47. - №3. – P. 172-173.

167. Weber, A. Relationship between nuclear pockets in bovine peripheral

blood lymphocytes and C-type virus particles in cultures of these cells / A.Weber,

M.Fahning, R.Hammer et al. // J.Natl.Cancer.Just. – 1973. - №51. – P.81-88.

168. Weber, A. Ensootic bovine leucosis: Frevaleuce of Blood Lymphocyte

Nuclear Pockets in Dairy Bulls in the United States and Foreign Contries / A.Weber,

C.Bingham, K.Pomeroy et al. // Amer.J.Vet.Res. – 1980. – v.41. - №1. – P.14-18.

169. Weiland, F. Ultrastructural comparison of bovine leukemia virus (BLV)

with C-type particles of other species / F. Weiland, S.Ueberschar // Arch.Virol. –

1976, 52. - №1-2. – P.157-190.

170. Yoshikawa, T. Scanning electron microscopic study of bovine leukemic

cells / T. Yoshikawa, T.Oyamada, H.Yoshikawa et al. // Amer.J.Vet.Res. – 1983, 44.

- №7. – P.1358-1362.

136

171. Wittman, W. Grundlagen einer konzeption fur ein leukoze bekam pfungs

– program unter Nutzung des Embryotras – fers / W.Wittman et al. // Mh.Veter. –

Med. – 1990. – N45. – S.300-303.

137

П Р И Л О Ж Е Н И Е

Рудакова Оксана Николаевна : G : E B A < J ? F ? G G U O F...

Documents

Transcript of Рудакова Оксана Николаевна : G : E B A < J ? F ? G G U O F...