Comparing allele specific expression and local expression ...
express your protein - Fachbereich · PDF file1 Protein Expression Expression, homolog oder...
Transcript of express your protein - Fachbereich · PDF file1 Protein Expression Expression, homolog oder...
1
Protein Expression
Expression, homolog oder heterolog?
• Heterologe Expression in anderem Host• Kompartment• Codon usage• Posttranslationale Modifikationen• Kofaktoren• Chaperone
2
lacPromoter
Lac OperonlaclacRepressorRepressor
genomische DNA
LacI laclacOperatorOperator
Gen Gen zurzurExpressionExpression
laclacOperatorOperator
laclacRepressorRepressor
laclacPromoterPromoter
Polymerase
Zielprotein
lac promoter Expressionssystem
Polymerase
Non-leaky Expression• Ein Expressionsytem soll möglichst “dicht”- non-leaky sein.
• Grund: Proteine, die exprimiert werden sollen, können toxisch sein.
• Das kann zur Folge haben, dass sich der Expressionshost gar nicht transformieren lässt, da die transformierten Zellen sofort sterben.
• Stirbt der Expressionshost nicht, kann aber das Zielprotein, dasdurch leaky Expression produziert wird, eine negative Selektion gut exprimierender Zellen bewirken. Erklärung: Gut exprimierende Zellen produzieren viel Zielprotein, aber weniger eigene Proteine, d.h. wachsen schlechter. Die gut exprimierendensind nach einigen Verdopplungsrunden fast nicht mehr vorhanden. Man selektioniert also auf schlecht exprimierende Zellen.
• Das pET System von Studier für Expression in E.coli ist extrem “dicht” aufgrund verschiedener Vorkehrungen.
3
lacPromoter
GenT7 PolymeraselaclacRepressorRepressor
genomische DNA
LacI laclacOperatorOperator
Gen Gen zurzurExpressionExpression
laclacOperatorOperator
laclacRepressorRepressor
T7 T7 PromoterPromoter
T7 Polymerase
Zielprotein
laclacOperatorOperator
laclacRepressorRepressor
T7 T7 Promoter
Promoter
laclacOperatorOperator
laclacRepressorRepressor
T7 T7 Promoter
Promoter laclacOperatorOperator
laclacRepressorRepressor
T7 T7 Promoter
Promoter
E.coli BL21 (DE3)- pET Expressionssystem
High copy plasmid
T7 T7 PolymerasePolymeraselaclac
OperatorOperator
laclacRepressorRepressor
E.coli BL21 (DE3)- pET Expressionssystem
Lac Lac PromoterPromoter
Keine Expression ohne Induktion
• da lac-Repressor Protein auf Operatorregion sitzt und Bindung der E.coli Polymeraseverhindert, d.h es wird keine T7 Polymerasesynthetisiert.
• Ohne T7 Polymerase keine Expression des Zielproteins.
• Als zusätzliche Sicherung sitzt auch beim T7 Promoter noch eine lac Operatorregion. Sollten T7 Polymerase dennoch in geringen Mengen synthetisiert worden sein, kann das Gen trotzdem nicht abgelsen werden.
• Zusätzliche Kopien des Lac Repressors sind Plamid kodiert. So wird genügend lac Repressorsynthetisiert.
Gen Gen zurzurExpressionExpressionlaclac
OperatorOperator
laclacRepressorRepressor
T7 T7 PromoterPromoter
E.c
oliG
enom
Pla
smid
E.coli Polymerase
4
T7 T7 PolymerasePolymeraselaclac
OperatorOperator
E.coli BL21 (DE3)- pET Expressionssystem
Lac Lac PromoterPromoter
Zusätzliche Sicherung
• Eine weitere Absicherung gegen T7 Polymerase, die in geringen Mengen synthetisiert wurde, ist die Co-Expression von Lysozym, welches auch als Inhibitor der T7 Polymerase wirkt. Die T7-Polymerase wird abgefangen, bevor die Expression des Zielgensstattfindet. • Das Lysozym wird auf einem zweiten Vektor kodiert.
LysozymLysozym
E.c
oliG
enom
E.coli Polymerase
Gen Gen zurzurExpressionExpressionlaclac
OperatorOperator
laclacRepressorRepressor
T7 T7 PromoterPromoterP
lasm
id
T7 T7 PolymerasePolymeraselaclac
OperatorOperator
laclac RepressorRepressorINAKTIVINAKTIV
E.coli BL21 (DE3)- pET Expressionssystem
Lac Lac PromoterPromoter
Expression erst nach Induktion
• da lac-Repressor von Operator (Genom) abfällt
• E.coli Polymerase liest Gen für T7 Polymeraseab.
• lac Repressor von Operator (Plasmid) fällt ab.
• T7 Polymerase liest Gen für Zielprotein ab.
Gen Gen zurzurExpressionExpressionlaclac
OperatorOperatorT7 T7 PromoterPromoter
E.c
oliG
enom
Pla
smid
Gal
acto
se
/ IP
TG
Gal
acto
se
/ IP
TG
laclac RepressorRepressorINAKTIVINAKTIV
Zielprotein
5
Kompartment• Cytosol => Cytosol (E.coli, Hefe, Insektenzellen)
• Membran => Spezieller E.coli Stämme„Walker strains“ C41, C43
• ExtrazellulärExpression in Hefe, Sekretion ins MediumSignalpeptid & Sekretion ins Periplama von E.coliExpression im Cytosol in E.coli Stämmen mit defizienter
Thioredoxin- und Glutathionreduktase
Expression, homolog oder heterolog?
• Heterologous Expression in different Host• Compartment• Codon usage• Posttranslational Modifications• Cofaktors• Chaperone
6
Codon usage
• Verschiedene Codon Präferenz • Verschiedene tRNA levels in Organismen• Bei seltenen Codons => Translationsstop
7
Rare Codons
8
BL21(DE3)Rosetta
BL21(DE3)pLys
BL21(DE3)Nicht induziert
Rare Codons- Expression in Rosetta
• Gensynthese• Zielgen wird synthetisiert optimiert für
codon usage des Hosts• Synthese durch PCR mit überlappenden
Primern
Rare Codons- Synthetische Gene
5‘ 3‘
9
• Expression; Inclusion bodies – was nun
• Löslich, aber auch gefaltet?
Inclusion bodies
• Intrazelluläre Aggregate von missgefaltetemProtein
• Bilden sich bei Expression, wenn Protein sich nicht richtig faltet.
10
Inclusion bodies, im Mikroskop erkennbar
Inclusion bodiesEM Bild
11
Inclusion bodies• Proteine teils gefaltet; oder IB enthalten auch gefaltetes Protein; Bsp
Green Fluorescent Protein GFP, leuchte nur wenn es gefaltet ist. Bild C, E, die Punkte sind Inclusion bodies, die gefaltetes GFP enthalten. Cytoplasmatische Expression als lösliches Protein z.B. in Bild B.
Inclusion BodiesSind also eine Mischung aus ungefaltetem Protein, teilgefaltetemProtein und auch gefaltetem Protein.
12
Inclusion bodies vermeiden• Richtiges Expressionskompartiment ?
BspExpression einer Ig Domäne mitessentiellem Disulfid in Origami Stamm(erlaubt Disulfide im Cytoplasma) in Bild A, Gelspur 1, Gesamtzellprotein, Protein wird exprimiert.Gelspur 3, Lösliche Proteine=> Protein ist löslich
In Bild B, Expression in normalen Stämmen: Gelspur 1 und 3 Gesamtzelllprotein, eswird also Zielprotein exprimiert.Aber die Fraktionen mit löslichemProtein in Gelpsur 2 und in 4 zeigen keinZielprotein=> Inclusion bodies
Inclusion bodies vermeiden
Optimierung ExpressionskonstruktVerkürzung / Verlängerung um wenige Aminosäuren kann Faltung extrem beeinflussen
Verminderung Protein de Novo Synthese durch
• Induktionsstärke / Tuner B StrainsErniedrigen der IPTG Konzentration
• ExpressionstemperaturVermindern der Expressionstemperatur auf 30 oder 20 °C
13
Inclusion bodies vermeiden
• Durch Chaperone Induktion
Ethanol 3%Zugabe von EthanolInduziert Expression vonHeat Shock Proteinen=Chaperonen=Faltunsghelfern
Inclusion bodies vermeiden• Chaperone Co-expression seit ca 20 Jahren
bekannt.
14
Inclusion bodies vermeiden
• Chaperone Co-expression
Inclusion bodies vermeiden• Chaperone Co-expression
15
Inclusion bodies vermeiden
• Chaperone Co-expressionKombination von Chaperonenermöglicht auch Expression von “Schwierigen Proteinen”
Refolding
16
UnfoldingChaotrope Substanzen – stören die geordnete Wasserstruktur, => vermindern den hydrophoben Effekt. Dadurch wird der hydophobe Corevon Proteinen zerstört, => das Protein entfaltet sich.
Kosmotrope Substanzen – fördern die geordnete Wasserstruktur, => verstärken den hydrophoben Effekt; z.B. Ammoniumsulfatfällung.
Refolding=> Es sollten verschiedene Refoldingpuffer probiert werden. Man kann hier auf eien Reihe von Publikationen zurückgreifen.
Bsp
17
Refolding
Refolding
Während dem Refolding können teils gefalteteIntermediate aggregierenund die vollständige Faltungins Native Protein verhindern.
Abhilfe: Zugabe von Aggregationshemmern, z.B.Arginin, Glycerin
18
CD SpectroscopyOptisch aktive Substanzen können polarisiertes Licht drehen
PolarisationsfilterPolarisationsfilterLicht besteht aus E-Vektor und H-vektor.Bei Polarisation werden E-Vektoren ausgeblendet.
Proteine sind optisch akive Substanzen
Jeder Sekundärstrukturtyp hat charakteristisches CD Spektrum.
Aus Kombination von den drei Grundtypen lassen sich CD Spektren von Proteinen fitten => Gehalt an α-Helix, β-Sheet, random coil.
Beispiele
19
Overlay and elimination of CD bands => β-sheets diffcult to predict
Co-factors contribute to CD spectrum => wrong prediction
Far UV CD So weit wie möglich
•CD Spektren sollten soweit wie möglich ins kurzwellige UV aufegnommen werden. •Anteile der Spektren mit hohem Anteil and struktureller Informationen befindensich gerade auch zwischen 200 und 180 nm. •Problem: Viele Puffersubstanzen, Salze, etc absorbieren sehr stark ab ca. 210 nm und maskieren so das Spektrum des Peptidbindungen des Proteins.
Bsp. Prion Protein imVergleich zu Mutante: Strukturelle Änderungen erstunter 200 nm im Spektrumdutlich erkennbar.
20
CD: Nahes und fernes UV
Fernes UV: Bereich zwischen250 und 180 nm
Nahes UV zwischen 350 und 250 nm.
“Nah”, wegen Nähe zumsichtbaren Bereich (ca 380 -780 nm).
CD Signale im nahen UVvon den Aromaten istFingerprint für gefalteteProteine
FTIR of ProteinsFourier Transformierte InfraRot Spektroskopie
Infrared bands of peptide bond (s) : stretch ; (b): bend; (t): torsion
Band Wavenumber /cm-1 Origin
A 3300 N-H (s)B 3100 N-H (s)I 1690-1600 C=O (s) 80%, N-H (b) 10%, C-N (s) 10%II 1575-1480 N-H (b) 60%, C-N (s) 40%III 1301-1229 C-N (s) 30%, N-H (b) 30%, C=O (s) 10%
O=C-N (b) 10%,
O
NH
(s)
(s)(s)
Bands cm-1 secondary structurein D2O
1620-1635 β-sheet, 310 helix, α-helix,unordered
1648-1657 α-helix
1644 unordered
1659-1683 turn, β-sheet
21
FTIR spectra of model peptides
M. Holtzhauer, „Methoden in der Proteinanalytik“ p. 145; p. 150;
IR Absorption of H2O
Wellenzahl / cm-1
Experimental setup
Measurement in H2O => 6-10 µM cell path 10 mg/mlMeasurement in D2O => 100µM (= 0.1 mm) cell path 1 mg/ml-> complete exchange of H2O to D2O-> complete exchange of N-H to N-D-> no H2O in atmosphere (dry N2 chamber)-> time expense ~ like in CD spectroscopy
Advantage of FTIR over CD:
no contribution from cofactors like flavins, heme, Zn2+, other metals ... In region for secondary structure analysis.
22
Analyse FTIR
Analyse mittels Fit derKurve durch ein Set vonGausskurven.
Die Lage der Maxima, die im Gesamtspektrumnur als Schulternsichtbar sind, lässt sichdurch die zweiteAbleitung der Spektrenbestimmen.
Analyse FTIR
Je mehr Maxima erkennbar sind, destomehr Gausskurven lassensich fitten. Der Gesamtfirwird dadurch besser und zuverlässiger.
23
Analyse FTIR
Bsp. Anwendung von FTIR bei Prion Protein Mutante: Die MutanteΔTM zeigt etwas mehr ß-sheet als der Wildtyp, was zu einerStabilisierung führt. Thaa et al. BBA Mol Cell Res. 1783, 1076-84.