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UMS 3725 Cemipai CNRS/UM Test COVID19 sur MetalSkin Medical®

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Evaluation de l’activité virucide de la solution MetalSkin Medical®

sur le virus SARS-CoV2 (COVID19)

Montpellier, le 29/05/2020

UMS 3725 Cemipai CNRS/UM

CONFIDENTIEL

Pour la TPE MetalSkin Technologies

Contact : Stéphane PENARI

Projet suivi par : Sébastien Lyonnais – Nathalie Gros

Expériences réalisées par : Mathilde Hénaut

Directrice CEMIPAI : Delphine Muriaux


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I. Objectif et contexte

La TPE MetalSkin Technologies souhaite tester l’activité biocide de sa solution MetalSkin

Medical® sur le virus SARS-CoV2.

Les expériences d’évaluation virucide sont effectuées en environnement L3 à partir d’un stock

viral de SARS-CoV2 produit par le CEMIPAI.

Les expériences sont réalisées selon un protocole établi par le Cemipai.

Après contact du virus COVID19 avec la surface MetalSkin Medical®, les échantillons viraux

sont déposés sur cellules et l’infectivité résiduelle est déterminée par la méthode de « plages

de lyse ».

II. Matériels et produits utilisés

A. Fourni par le client MetalSkin : - Surfaces de cuivre MetalSkin Medical® sous forme de coupons : 26

- Protocole de nettoyage des surfaces

B. Fourni par l’UMS 3725 : - Stock viral de SARS-CoV2 à 8.105pfu /mL (origine Institut Pasteur) - Cellules Vero C1008 (E6) (ECACC lot 15A033)

Réactifs :

- DMEM SVF 2% hepes - Oxoid Agar - Overlay Media (MEM2X) - PFA 4% - Crystal violet - PBS 1X Eurobio

Environnement : PSM en L3

III. Déroulement du service A. Traitement des coupons avant essai

Traitement effectué d’après un protocole fourni par le client : rinçage à l’eau distillée

stérile pendant 2x10 secondes puis contact de 15min à l’isopropanol 70% et séchage par

évaporation sous flux d’air laminaire. Dépôt des coupons de cuivre Metalskin Medical® dans

une plaque 6 puits.


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B. Mise en contact du virus SARS-CoV2 avec MetalSkin Medical®

1- Conditions expérimentales

Température ambiante : (20 ± 0,5)°C

Humidité : (50 ± 2) %

Souche virale : SARS-CoV2

Temps de contact : 30 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures

Température d’incubation : ambiante

2- Protocole de contact virus/support

La mise en contact est réalisée par dépôt d’une goutte de 300µL de suspension virale à

8.105pfu/mL de virus SARS-CoV2 sur la face MetalSkin Medical® et la face témoin, en duplicat,

et à des temps différents (30min, 1h, 2h, 4h).

- Echantillon n°1 : 8.105pfu /mL SARS-CoV2 (contrôle d’infectivité)

- Echantillon n°2 : 8.105pfu /mL SARS-CoV2 30min sur face témoin

- Echantillon n°3 : 8.105pfu /mL SARS-CoV2 1h sur face témoin



- Echantillon n°6 : 8.105pfu /mL SARS-CoV2 30min sur MetalSkin Medical®

- Echantillon n°7 : 8.105pfu /mL SARS-CoV2 1h sur MetalSkin Medical®



- Echantillon n°10 : milieu de culture DMEM 2% SVF 4h sur MetalSkin Medical®

(contrôle de toxicité de MetalSkin Medical® pour les cellules)

Le point 4H (MetalSkin et témoin) ainsi que le contrôle d’infectivité ont été réalisés deux fois en

duplicat dans deux expériences indépendantes.

(1) MISE EN CONTACT

Suspension virale préparée sous forme de mix et dépôt d’une goutte de 300µL sur chaque

support en duplicat.

Face témoin MetalSkin Medical®


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Echantillons laissés en contact avec les supports à température ambiante pendant les temps

correspondants, couvercle de la plaque 6 puits fermé.

(2) RECOLTE DES GOUTTES DEPOSEES

Gouttes récoltées et déposées dans un tube Eppendorf attitré.

Un changement de couleur de la goutte récupérée (avec ou sans virus) s’est produit pour le

test 4H sur MetalSkin. Ceci témoigne d’un échange entre la solution MetalSkin Medical® et le

milieu. Ce changement n’a pas été observé pour les autres temps et pour la face témoin.

C. Test d’infectivité des échantillons par la méthode des « plages de lyse » :

1- Protocole

La méthode de plage de lyse consiste à dénombrer le nombre de particules virales infectieuses

contenues dans un échantillon. Cet échantillon est dilué en cascade et déposé sur une

monocouche cellulaire. S’il contient du virus, ce dernier infectera et lysera les cellules, ce qui

se traduira par un trou (une plage de lyse) dans la monocouche cellulaire. Celle-ci est colorée

en violet, les trous restent blancs. Les dilutions en cascade permettent de compter le nombre

de plages de lyse.

1- Ensemencer les cellules Vero E6 en plaque 12 puits de façon à être à 100% de

confluence le lendemain.

2- Incuber 24h à 37°C.

3- Diluer les échantillons de 10-1 à 10-5 en milieu DMEM 2% SVF hepes.

4- Eliminer le surnageant des cellules.

5- Incuber les cellules du puits 1 avec 200µL des échantillons 2 à 10 pendant 1h30 à 37°C.

Pour l’échantillon 1, le puits 1 est non infecté (200µL DMEM 2% SVF hepes). Les puits

2 à 6 sont incubés avec 200µL des dilutions respectives (10-1 à 10-5 ) pendant 1h30 à

37°C.

6- Retirer l’inoculum viral et ajouter l’overlay media (Oxoid Agar + MEM2X) à 0.6% final

d’agar.

7- Incuber 72h à 37°C.

8- Ajouter de la PFA 4% sur les galettes d’agarose et laisser 4h à 4°C.

(1) (2)

(3)

(1) : Virus sur MetalSkin 4H

(échantillon 9)

(2) : Virus sur face témoin 4H

(échantillon 5)

(3) : Milieu de culture sur

MetalSkin 4H (échantillon 10)


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9- Retirer la PFA puis la galette d’agarose et colorer les cellules avec du crystal violet

pendant 20min à température ambiante.

10- Compter les plages de lyse.

2- Résultats de l’essai

Les puits incubés avec l’échantillon 10 pur (milieu de culture seul sur le support)

présentent une destruction du tapis cellulaire traduisant une toxicité de MetalSkin

Medical® pour les cellules. Cette toxicité disparaît à la première dilution et n’influe donc

pas sur le comptage des plages de lyse.

Une moyenne de 14 plages de lyse est détectée à la dilution 10-4 de l’échantillon 1

(contrôle d’infectivité) ramenant le titre infectieux à 6,8.105 PFU/mL.

Les échantillons 2, 3, 4 et 5 (face témoin) ont une moyenne de 15 plages de lyse à la

dilution 10-4 , ramenant le titre infectieux à 7,5.105 PFU/mL.

Ceci démontre que, suite aux traitements des échantillons sur la face témoin et quel que

soit le temps de contact, le titre infectieux est très peu modifié par rapport au stock viral

de départ. Ce résultat permet de valider les témoins.

Les temps de contact de 30 minutes, 1 heure et 2 heures sur la surface MetalSkin

Medical® montrent une diminution de la charge virale inférieure à 1 Log10. Pour le temps

de contact de 4 heures, la diminution s’élève à 2,4 Log10 ± 0,18.


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VALIDATION ET CONTRÔLES ESSAIS

Nombre de plages de lyse comptées

Titre viral (PFU/mL)

Ecart type

Nombre de plages de lyse comptées

Titre viral (PFU/mL)

Ecart type

CONTRÔLE INFECTIVITE

Echantillon 1

Non infecté 0-0

6,80E+05 3,5E+04

METALSKIN MEDICAL®

Echantillon 6 (30min)

PUR >100->100

6,30E+05 3,5E+04

10-1 >100->100 10-1 >100->100

10-2 >100->100 10-2 >100->100

10-3 ->100->100 10-3 - >100->100

10-4 14-13 10-4 12-13

TEMOINS

Echantillon 2 (30min)

PUR >100->100

8,50E+05 1,4E+05

Différence avec le témoin (log) 0,13 ± 0,06

10-1 >100->100

Echantillon 7 (1H)

PUR >100->100

3,00E+05 7,1E+04

10-2 >100->100 10-1 >100->100

10-3 - >100->100 10-2 >100->100

10-4 15-19 10-3 - >100->100

Echantillon 3 (1H)

PUR >100->100

8,80E+05 2,5E+05

10-4 7-5

10-1 >100->100 Différence avec le témoin (log) 0,46 ± 0,13

10-2 >100->100

Echantillon 8 (2H)

PUR >100->100

1,50E+05 7,1E+04

10-3 - >100->100 10-1 >100->100

10-4 7-5 10-2 >100->100

Echantillon 4 (2H)

PUR >100->100

8,50E+05 7,1E+04

10-3 34-29

10-1 >100->100 10-4 4-2

10-2 >100->100 Différence avec le témoin (log) 0,78 ± 0,18

10-3 - >100->100

Echantillon 9 (4H)

PUR lyse totale

4,50E+03 2,1E+03

10-4 18-16 10-1 50-25

Echantillon 5 (4H)

PUR >100->100

1,10E+06 1,8E+05

10-2 12-6

10-1 >100->100 10-3 0-0

10-2 >100->100 10-4 0-0

10-3 - >100->100 Différence avec le témoin (log) 2,4 ± 0,18

10-4 25-20


7

CO

NTR

ÔLE

S

Echantillon 1 (contrôle d’infectivité) Echantillon 10 (test de toxicité du métal)

30min (échantillon 2) 1H (échantillon 3) 2H (échantillon 4) 4H (échantillon 5)

30min (échantillon 6) 1H (échantillon 7) 2H (échantillon 8) 4H (échantillon 9) Inversion des 2 puits

PUR 10-1

10-2 10

-3

10-4 10

-5

PUR 10-1

10-2 10

-3

10-4 10

-5

Réplicat 1 Réplicat 2

MET

ALS

KIN

M

EDIC

AL®

TE

MO

INS

Organisation des plaques

Résultats des plages de lyse


8

Résultats présentés sous forme graphique

Valeurs brutes en nombre de particules infectieuses / mL :

Temps de dépôt (h) PFU/ml MetalSkin Medical® PFU/ml Contrôle (plastique)

0 650000 850000 1300000 900000 650000 850000 1300000 900000

0,5 600000 650000 750000 950000

1 350000 250000 700000 1100000

2 200000 100000 900000 800000

4 200 8500 6000 3000 500000 650000 1300000 1000000


9

Valeurs en pourcentage par rapport à la moyenne du contrôle d’infection (avec et sans barres

d’erreur) :

Temps de dépôt (h) % Inhibition MetalSkin Medical® % Inhibtion Contrôle (plastique)

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,5 35,14 29,73 18,92 -2,70

1 62,16 72,97 24,32 -18,92

2 78,38 89,19 2,70 13,51

4 99,98 99,08 99,35 99,68 45,95 29,73 -40,54 -8,11


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3- Conclusion :

Les échantillons viraux mis en contact avec la solution MetalSkin Medical® aux temps de

30 minutes, 1 heure et 2 heures (échantillons 6 à 8) montrent une infectivité résiduelle de

moins d’1 Log10 de différence avec les témoins respectifs.

Le temps de contact de 4 heures avec la solution MetalSkin Medical® présente une

infectivité résiduelle diminuée de 2.4 Log10 ± 0.18.

La solution MetalSkin Medical® apparaît donc comme élément perturbateur du pouvoir

infectieux des SARS-CoV2 après 4 heures de contact avec ces derniers.

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