EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE AUXILIARES DE FORMULACIÓN PARA …
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1 EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE AUXILIARES DE FORMULACIÓN PARA LA FOTOESTABILIZACIÓN DE LA LEVADURA BIOCONTROLADORA Pichia onychis FRENTE A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA YULY LILIANA VEGA CUEVAS TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL Laura Fernanda Villamizar Rivero M.Sc Directora Carlos Andrés Moreno Velandia Codirector PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C. AGOSTO DE 2007
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EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE AUXILIARES DE FORMULACIÓN PARA
LA FOTOESTABILIZACIÓN DE LA LEVADURA BIOCONTROLADOR A
Pichia onychis FRENTE A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA
YULY LILIANA VEGA CUEVAS
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al tít ulo de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
Laura Fernanda Villamizar Rivero M.Sc Directora
Carlos Andrés Moreno Velandia
Codirector
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D.C.
AGOSTO DE 2007
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario
al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”.
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Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo establecido
en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, los
cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Atendiendo lo
anterior, siempre que se consulte la obra, mediante cita bibliográfica se debe dar crédito al
trabajo y a su(s) autor(es). Este documento se firma, sin perjuicio de los acuerdos que el
autor(es) pacte con la Unidad Académica referentes al uso de la obra o a los derechos de
propiedad industrial que puedan surgir de la actividad académica.
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DESCRIPCIÓN TRABAJO DE GRADO AUTORES
Apellidos Nombres Vega Cuevas Yuly Liliana DIRECTORA
Apellidos Nombres Villamizar Rivero Laura Fernanda ASESOR
Apellidos Nombres Moreno Velandia Carlos Andrés TRABAJO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE : MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO: Evaluación y selección de auxiliares de formulación para la fotoestabilización de la levadura biocontroladora Pichia onychis frente a la radiación ultravioleta. FACULTAD : CIENCIAS PROGRAMA : Carrera __X__ Especialización ____ Maestría ____ Doctorado ____ NOMBRE DEL PROGRAMA : MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL CIUDAD: BOGOTÁ D.C AÑO DE PRESENTACIÓN DEL TRABAJO : 2007 NÚMERO DE PÁGINAS : TIPO DE ILUSTRACIONES : Tablas y figuras. DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES: Bioplaguicida, Fotoestabilización, Pichia onychis, Radiación ultravioleta. RESUMEN DEL CONTENIDO: Las levaduras han demostrado un alto potencial como antagonistas para el control de patógenos foliares, sin embargo su eficacia en la filosfera puede verse afectada por factores abióticos como la radiación solar. En el Laboratorio de Control Biológico de CORPOICA se desarrolló un prototipo de bioplaguicida formulado como granulado dispersable a base de la levadura Pichia onychis (Lv 027) y fue aplicado en un cultivo comercial de cilantro reduciendo la incidencia de Alternaria dauci en un 82%, sugiriendo su posible uso para el control de fitopatógenos en precosecha. Considerando que al utilizar la formulación en campo, ésta se verá expuesta al efecto deletéreo de la radiación ultravioleta, es necesario incluir agentes fotoprotectores para obtener resultados de control más eficientes. El objetivo del presente trabajo fue evaluar y seleccionar auxiliares de formulación para la fotoestabilización de la levadura P. onychis (Lv 027). Inicialmente se realizó un estudio de compatibilidad de la levadura con ocho auxiliares de formulación con
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capacidad fotoestabilizadora codificados como UV 03, UV 05, UV 06, UV 07, UV 08, UV 09, UV 10 y UV 11 (0.5% p/v). Solamente los fotoprotectores de naturaleza química UV 03 y UV 10 tuvieron un efecto tóxico sobre la levadura, ya que se observó un retraso en su crecimiento durante 48 horas de incubación en presencia de estas sustancias. Los fotoprotectores compatibles con la levadura fueron seleccionados para determinar su efecto fotoestabilizador frente a la radiación ultravioleta tipo A (365 nm), tipo B (302 nm) y tipo C (254 nm) durante uno, cinco y diez minutos de exposición. Se observó que la radiación UV A no tuvo un efecto negativo sobre la viabilidad del microorganismo; mientras que la radiación UV B causó una reducción significativa de la misma. Los fotoprotectores de naturaleza física UV 08 y UV 09 presentaron un efecto fotoestabilizador al mantener la viabilidad de la levadura en un 98% y 55% respectivamente después de 10 minutos de exposición a la radiación UVB, valores significativamente superiores a la viabilidad de la levadura no fotoestabilizada. La exposición a la radiación UV C ocasionó la perdida total de viabilidad de las células de levadura luego de 10 minutos de exposición, a excepción de cuando fue fotoestabilizada con los filtros UV 08 y UV 09. Debido al efecto fotoestabilizador mostrado por el fotoprotector UV 08 frente a la radiación UV B y UV C, éste fue seleccionado para determinar su efecto al 0.5% (p/v) y al 1% (p/v) sobre la actividad biocontroladora de la levadura expuesta y no expuesta a la radiación UV B (302 nm) contra Botrytis cinerea en segmentos de tallo de tomate. Aunque no se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos, se evidenció un efecto biocontrolador de la levadura, el cual fue mayor cuando ésta no fue fotoestabilizada. Se concluyo que el fotoprotector UV 08 fue compatible y tuvo un efecto fotoestabilizador sobre las células de la levadura, sin embargo su adición afectó la actividad biocontroladora.
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A Dios y a mi familia, a quienes dedico mi sueño y mi esperanza de ser cada día mejor
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AGRADECIMIENTOS
A Dios
A mi familia por su respaldo incondicional en todas las decisiones tomadas.
A la Doctora Alba Marina Cotes, por darme la oportunidad de hacer parte de su excelente
grupo de trabajo de investigación durante este tiempo.
A Laura Fernanda Villamizar, por su confianza, guía y apoyo durante el desarrollo de este
trabajo, así como su valioso aporte en mi formación profesional.
A Carlos Andrés Moreno por su valiosa colaboración y aportes en el desarrollo de este
trabajo.
A todos los investigadores, estudiantes y auxiliares del Laboratorio de Control Biológico por
su amistad y colaboración, así como por hacer de cada uno de los días una experiencia
agradable durante todo este tiempo.
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
Página
1. INTRODUCCIÓN
1
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA 3
2.1. Desarrollo de bioplaguicidas 3
2.2. Formulación de bioplaguicidas 3
2.2.1 Tipos de formulación de bioplaguicidas 4
2.2.1.1 Formulaciones líquidas 4
2.2.1.2 Formulaciones sólidas 5
2.3 Bioplaguicidas de aplicación foliar 6
2.4 Características de la filosfera 7
2.5 Factores abióticos que afectan la filosfera 7
2.5.1 Lluvia y viento 8
2.5.2. Temperatura 8
2.5.3. Humedad 9
2.5.4. Radiación solar 9
2.5.4.1
2.5.4.1.1.
2.5.4.1.2.
2.5.4.1.3.
2.5.4.1.3.1
Radiación ultravioleta
Radiación ultravioleta tipo C
Radiación ultravioleta tipo B
Radiación ultravioleta tipo A
Formación de radicales libres
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10
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2.5.4.1.2. Efectos de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos
en la filosfera
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2.6. Fotoprotección 14
2.6.1. Estrategias de fotoprotección de los organismos vivos 14
2.6.1.1. Mecanismos de fotoprotección a la radiación UV de bacterias 16
2.6.1.2. Mecanismos de fotoprotección a la radiación UV de hongos 17
2.6.2. Fotoprotección artificial 18
2.6.2.1. Filtros solares químicos o absorbentes 18
2.6.2.2. Filtros solares físicos o bloqueadores 20
2.6.2.3. Filtros solares biológicos 21
10
2.6.2.4 Abrillantadores ópticos 21
2.6.2.5. Microencapsulación 21
2.6.2.6. Protección de agentes de biocontrol a la radiación ultravioleta 22
2.6.2.6.1. Fotoprotección de bacterias 22
2.6.2.6.2. Fotoprotección de virus 23
2.6.2.6.3 Fotoprotección de hongos 24
2.7 Uso de levaduras como agentes de control biológico 24
2.7.1. Mecanismos de acción 25
2.7.2. Generalidades de las levaduras 27
2.7.2.1. Taxonomía y características de Pichia onychis 29
2.7.3. Bioplaguicidas comerciales a base de levaduras 30
2.8. Patógenos de la superficie foliar 31
2.8.1. Generalidades de Botrytis cinerea 31
2.8.2. Taxonomía y características de Botrytis cinerea 32
2.8.3. Ciclo de la enfermedad 33
2.8.4. Métodos de control 36
2.8.4.1. Control cultural 36
2.8.4.2. Control químico 36
2.8.4.3. Control biológico
37
3 JUSTIFICACIÓN
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4. OBJETIVOS 42
4.1. Objetivo general 42
4.2. Objetivos específicos
42
5. MATERIALES Y MÉTODOS 43
5.1. Recuperación del microorganismo biocontrolador 43
5.2. Recuperación del microorganismo patógeno 43
5.3. Evaluación de la compatibilidad de la levadura Pichia onychis (Lv027)
con auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora
44
5.4. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación frente a la radiación ultravioleta monocromática
45
5.5. Efecto de la radiación ultravioleta sobre la actividad biocontroladora de
la levadura Pichia onychis (Lv027) fotoestabilizada
47
11
5.5.1. Material vegetal 47
5.5.2. Inóculo 47
5.5.3. Inoculación 48
5.5.4. Tratamientos 48
5.5.5. Diseño experimental y análisis de datos 49
5.5.6. Variables de estudio
49
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51
6.1. Evaluación de la compatibilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027)
con auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora
51
6.2. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta
monocromática
55
6.2.1. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo A
(λ= 365 nm)
55
6.2.2. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo B
(λ= 302 nm)
58
6.2.3. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo C
(λ= 254 nm)
65
6.3. Efecto de la radiación ultravioleta sobre la actividad biocontroladora de
la levadura Pichia onychis (Lv027) fotoestabilizada
69
7. CONCLUSIONES
82
8. RECOMENDACIONES
83
9. BIBLIOGRAFÍA
84
10. ANEXOS 95
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Características microscópicas de Pichia onychis (Lv 027).
Figura 2. Características macroscópicas de Pichia onychis (Lv 027).
Figura 3. Características microscópicas de Botrytis cinerea (Bo 006).
Figura 4. Características macroscópicas de Botrytis cinerea (Bo 006).
Figura 5. Lesiones características de Botrytis cinerea sobre las hojas, los
tallos y los frutos en plantas de tomate.
Figura 6. Esquema de inoculación por cuadrantes en medio de cultivo YM por
tratamiento y control para cada tiempo de exposición evaluado.
Figura 7. Crecimiento de la levadura Pichia onychis (Lv 027) en presencia de
los auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora.
Figura 8. Concentración de células de la levadura Pichia onychis (Lv 027) a
las 48 y 96 horas de incubación en medio líquido suplementado con los
auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora.
Figura 9. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre la
viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación
ultravioleta tipo A (365 nm).
Figura 10. Efecto de la radiación ultravioleta tipo A (365 nm) sobre la
población de la levadura Pichia onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar durante los
tiempos de exposición evaluados.
Figura 11. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre la
viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación
ultravioleta tipo B (302 nm).
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Figura 12. Efecto de la radiación ultravioleta tipo B (305 nm) sobre la
población de la levadura Pichia onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar y
fotoestabilizada con el filtro UV 08 (0.5% p/v) durante los tiempos de
exposición evaluados.
Figura 13. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre
viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación
ultravioleta tipo C (254 nm).
Figura 14. Efecto de la radiación ultravioleta tipo C (254 nm) sobre la
población de la levadura Pichia onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar y
fotoestabilizada con el filtro UV 08 (0.5% p/v) (B) durante los tiempos de
exposición evaluados.
Figura 15. Progreso de la incidencia de la enfermedad causada por Botrytis
cinerea (Bo 006) en los segmentos de tallo de tomate.
Figura 16. Efecto de la radiación ultravioleta tipo B (302 nm) sobre la
viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar y
fotoestabilizada con el filtro UV 08 al 0.5% (p/v) y al 1% (p/v), durante 30
minutos de exposición.
Figura 17. Adhesión de las partículas insolubles del filtro UV 08 a la pared celular de
la levadura Pichia onychis (Lv 027) en medio acuoso.
Figura 18. Progreso de la severidad de los síntomas causados por Botrytis
cinerea (Bo 006) en los segmentos de tallo de tomate.
Figura 19. Progreso de la incidencia de la esporulación de Botrytis cinerea
(Bo 006) en los segmentos de tallo de tomate.
Figura 20. Intensidad de la esporulación de Botrytis cinerea (Bo 006) en
segmentos de tallo de tomate.
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Escala de severidad de los síntomas de la enfermedad moho gris y
de la esporulación de Botrytis cinerea.
Tabla 2. Índice de severidad de los síntomas de la enfermedad veinte días
después de la inoculación de los tratamientos.
Tabla 3. Eficacia de control de B. cinerea por los tratamientos evaluados.
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LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Concentración de células de levadura expresada en logaritmo con
base 10 (células.ml-1) en los tratamientos sustancias fotoestabilizadoras y
control al cabo de 48 y 96 horas de incubación.
Anexo 2. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para la concentración
de levadura (células.ml-1) expresada en logaritmo con base 10 para la prueba
de compatibilidad de la levadura con auxiliares de formulación con capacidad
fotoestabilizadora.
Anexo 3. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo A
(λ= 365 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1
por réplica.
Anexo 4. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el conteo de
colonias (UFC.ml-1) expresada en logaritmo con base 10 en los tratamientos
expuestos a la radiación ultravioleta tipo A.
Anexo 5. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo B
(λ= 302 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1
por réplica.
Anexo 6. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el conteo de
colonias (UFC.ml-1) expresada en logaritmo con base 10 en los tratamientos
expuestos a la radiación ultravioleta tipo B.
Anexo 7. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo C
(λ= 254 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1
por réplica.
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Anexo 8. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el conteo de
colonias (UFC.ml-1) expresada en logaritmo con base 10 en los tratamientos
expuestos a la radiación ultravioleta tipo C.
Anexo 9. Porcentaje de incidencia de los síntomas de la enfermedad para
cada día de lectura.
Anexo 10. Porcentaje de incidencia de la esporulación de Botrytis cinerea
para cada día de lectura.
Anexo 11. Número de segmentos de tallo correspondiente al grado de
severidad de los síntomas de la enfermedad por cada día de lectura.
Anexo 12. Número de segmentos de tallo correspondiente al grado de
esporulación de B. cinerea por cada día de lectura.
Anexo 13. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el área bajo la
curva del progreso de la incidencia de síntomas de la enfermedad.
Anexo 14. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el área bajo la
curva del progreso de la severidad de los síntomas de la enfermedad.
Anexo 15. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el área bajo la
curva del progreso de la incidencia de la esporulación de B. cinerea.
Anexo 16. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el área bajo la
curva del progreso de la intensidad de la esporulación de B. cinerea.
Anexo 17. Interacción de los factores evaluados (concentración de la
sustancia fotoestabilizadora y exposición a la radiación UV B) (α=0.05).
Anexo 18. Comparación de medias de Tukey para el factor concentración de
la sustancia fotoestabilizadora y la variable incidencia de los síntomas
(α=0.05).
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Anexo 19. Comparación de medias de Tukey para el factor concentración de
la sustancia fotoestabilizadora y la variable incidencia de la esporulación
(α=0.05).
Anexo 20. Comparación de medias de Tukey para el factor concentración de
la sustancia fotoestabilizadora y la variable severidad de los síntomas
(α=0.05).
Anexo 21. Comparación de medias de Tukey para el factor concentración de
la sustancia fotoestabilizadora y la variable intensidad de la esporulación
(α=0.05).
Anexo 22. Comparación de medias de Tukey para el factor exposición a la
radiación UV B y la variable incidencia de los síntomas (α=0.05).
Anexo 23. Comparación de medias de Tukey para el factor exposición a la
radiación UV B y la variable severidad de los síntomas (α=0.05).
Anexo 24. Comparación de medias de Tukey para el factor exposición a la
radiación UV B y la variable incidencia de la esporulación (α=0.05).
Anexo 25. Comparación de medias de Tukey para el factor exposición a la
radiación UV B y la variable intensidad de la esporulación (α=0.05).
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RESUMEN
Las levaduras han demostrado un alto potencial como antagonistas para el control de patógenos foliares como Botrytis cinerea. Sin embargo, su eficacia en la filosfera puede verse afectada por factores abióticos como la radiación solar. En el Laboratorio de Control Biológico de CORPOICA se desarrolló un prototipo de bioplaguicida formulado como granulado dispersable a base de la levadura Pichia onychis (Lv 027). En estudios previos la formulación mostró alta actividad biocontroladora de Botrytis alli, Rhizopus stolonifer y Alternaria alternata en condiciones de poscosecha de hortalizas y cuando fue aplicada en un cultivo comercial de cilantro redujo la incidencia de Alternaria dauci en un 82%, sugiriendo su posible uso para el control de fitopatógenos en precosecha. Considerando que al utilizar la formulación en campo, ésta se verá expuesta al efecto deletéreo de la radiación ultravioleta, es necesario incluir agentes fotoprotectores para obtener resultados de control más eficientes. Por tal razón el objetivo del presente trabajo fue evaluar y seleccionar auxiliares de formulación para la fotoestabilización de la levadura P. onychis (Lv 027). Inicialmente se realizó un estudio de compatibilidad de la levadura con ocho auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora codificados como UV 03, UV 05, UV 06, UV 07, UV 08, UV 09, UV 10 y UV 11 (0.5% p/v). Solamente los fotoprotectores de naturaleza química UV 03 y UV 10 tuvieron un efecto tóxico sobre la levadura, ya que se observó un retardo en su crecimiento durante 48h de incubación en presencia de estas sustancias. Teniendo en cuenta que los demás fotoprotectores no afectaron el crecimiento de la levadura, éstos fueron seleccionados para determinar su efecto fotoestabilizador frente a la radiación ultravioleta tipo A (365 nm), tipo B (302 nm) y tipo C (254 nm) durante uno, cinco y diez minutos de exposición. Se observó que la radiación UV A no tuvo un efecto negativo sobre la viabilidad del microorganismo; mientras que la radiación UV B causó una reducción significativa de la misma. Los fotoprotectores de naturaleza física UV 08 y UV 09 presentaron un efecto fotoestabilizador al mantener la viabilidad de la levadura en un 98% y 55% respectivamente después de 10 minutos de exposición a la radiación UVB, valores significativamente superiores a la viabilidad de la levadura no fotoestabilizada. La exposición a la radiación UV C ocasionó la perdida total de viabilidad de las células de levadura luego de 10 minutos de exposición, a excepción de cuando fue estabilizada con los filtros UV 08 y UV 09. Debido al efecto fotoestabilizador mostrado por el fotoprotector UV 08 frente a la radiación UV B y UV C, éste fue seleccionado para determinar su efecto al 0.5% (p/v) y al 1% (p/v) sobre la actividad biocontroladora de la levadura expuesta y no expuesta a la radiación UV B (302 nm). Aunque no se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos, se evidenció un efecto biocontrolador de la levadura, el cual fue mayor cuando ésta no fue fotoestabilizada. Aunque el fotoprotector UV 08 mantuvo la viabilidad de las células expuestas a la radiación ultravioleta tipo B, los resultados sugieren que la adición de dicha sustancia afectó la actividad biocontroladora.
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1. INTRODUCCIÓN
Actualmente el control biológico se utiliza como una alternativa ecológica para limitar el
impacto destructivo de insectos plaga y de poblaciones de agentes patógenos causantes de
enfermedades en el sector agrícola (Atlas & Bartha, 2002). Este método de control hace uso
de agentes bióticos o sus productos para lograr tal fin (Llácer et al., 2000). Dentro de los
microorganismos biocontroladores de plagas se encuentran agentes patógenos para
insectos, para nematodos, para malezas y microorganismos antagonistas para hongos
fitopatógenos. Estos microorganismos presentan un potencial para desarrollar bioplaguicidas
(Gómez & Villamizar, 2000).
Entre las ventajas de estos productos se encuentran su compatibilidad con la naturaleza, su
baja toxicidad para plantas, animales y humanos; su poca o nula probabilidad de inducir
resistencia y su producción no depende de una sola materia prima (Gómez & Villamizar,
2000). Sin embargo, la utilización de bioplaguicidas microbianos depende de varios factores,
tales como la especificidad por el hospedero, el hábitat, la capacidad de control de la plaga o
del patógeno y la susceptibilidad a las condiciones ambientales, tales como la temperatura,
la radiación ultravioleta y la humedad, entre otros (Kloepper, 1996 citado por Atlas & Bartha,
2002).
Dado que el proceso de formulación de agentes microbianos es una etapa clave en la
producción comercial de bioplaguicidas, este debe considerar aspectos como la ecología de
la planta y el microorganismo antagonista, permitiendo definir las interacciones entre el
bioplaguicida, el agente fitopatógeno y el ambiente (Hynes & Boyetchko, 2006).
La filosfera es un hábitat adecuado para el desarrollo de diferentes poblaciones de
microorganismos, principalmente bacterias y hongos. Entre la planta y los microorganismos
se establecen varias asociaciones, tanto benéficas para la planta como patógenas (Atlas &
Bartha, 2002).
Un importante componente físico en el ambiente de la filosfera es el flujo diario de la
radiación solar, la cual incluye la radiación visible, la radiación ultravioleta y la radiación
infrarroja (Lindow et al., 2004). El rango de longitud de onda de radiación ultravioleta entre
290 a 320 nm de la radiación solar, es particularmente perjudicial para los organismos
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vivientes, porque los fotones de estas longitudes de onda son de alta energía y causan
daños directos e indirectos al DNA. Es por esto que los efectos de la radiación ultravioleta
sobre la microflora de las plantas son importantes, ya que pueden influir notablemente en las
asociaciones mutualistas y patógenas que estos organismos pueden establecer con las
plantas (Jacobs & Sundin, 1999).
Una de las razones que ha limitado la implementación de agentes de control biológico para
el control de enfermedades foliares, ha sido la inactivación que en algunos casos sufre el
principio activo (células, esporas o toxinas) como consecuencia de la acción de la radiación
solar. Varias formulaciones no son lo suficientemente estables cuando son aplicadas bajo
condiciones de campo y rápidamente pierden su actividad biológica (Saxena et al., 2002).
Sin embargo, una estrategia para asegurar la estabilidad y la efectividad para el uso de estos
agentes es su formulación (Niegel & Dylan, 2003). Uno de los factores a tener en cuenta en
la formulación de bioplaguicidas es incrementar su resistencia a condiciones ambientales
tales como la lluvia y la degradación por la luz ultravioleta. Para lograr lo anterior, se han
desarrollado diferentes tipos de formulaciones con la adición de aditivos con efecto
fotoprotector (Gómez & Villamizar, 1996).
Un gran número de trabajos han sido dedicados a encontrar técnicas y materiales
adecuados para inhibir o retardar la fotoinactivación de los microorganismos utilizados como
agentes de control biológico. Entre los intentos por fotoproteger a los biocontroladores del
daño producido por la radiación, se incluyen técnicas de encapsulación y formulaciones
granulares, como también el uso de pantallas solares, materiales dispersantes, materiales
fluorescentes y colorantes entre otros (Cohen et al., 2003).
Teniendo en cuenta que la viabilidad de la implementación de bioplaguicidas a base de
microorganismos antagonistas para aplicación foliar, se basa en la consistencia de la
actividad biocontroladora, la cual a su vez depende de la estabilidad de la formulación frente
a los efectos de las condiciones ambientales, se hace necesario diseñar estrategias que
permitan mejorar la sobrevivencia de los agentes de control biológico en la superficie foliar
frente a la radiación ultravioleta. Además de la selección de genotipos de agentes de
biocontrol resistentes a los daños ocasionados por la radiación ultravioleta, el desarrollo de
formulaciones que incorporen componentes que provean algún tipo de protección se
constituye en una estrategia potencial para lograr tal fin (Niegel & Dylan, 2003).
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2. MARCO TEÓRICO
2.1. DESARROLLO DE BIOPLAGUICIDAS
El desarrollo de un bioplaguicida implica el cumplimiento de diversas etapas que garanticen
la obtención de un producto seguro, eficaz y confiable. La etapa inicial comprende el
aislamiento del microorganismo y la evaluación de su actividad biocontroladora, seguido de
su caracterización y conservación para mantener sus características genéticas y fisiológicas
(Cotes, 1997).
Posteriormente se requiere la definición de un medio de cultivo óptimo y el mejor sistema
para la obtención masiva del inóculo que permita una buena relación costo - rendimiento en
la producción. Se continua con los estudios de preformulación y formulación que buscan
lograr la combinación correcta de excipientes, con el fin de garantizar la estabilidad del
producto en condiciones de almacenamiento y durante su aplicación (Fernández & Juncosa,
2002).
Las últimas etapas involucran la estandarización de procesos, la elaboración de fórmulas
maestras de producción, la determinación de dosis y formas de aplicación, la realización de
estudios de toxicidad y de impacto ambiental, la ejecución de ensayos de campo, la
realización de estudios de mercado y patentamiento entre otros (Gómez & Villamizar, 2000).
2.2. FORMULACIÓN DE BIOPLAGUICIDAS
La preformulación y formulación son etapas fundamentales en el desarrollo de un
bioplaguicida, ya que la formulación asegura que el ingrediente activo junto con otros
materiales forme un producto estable, seguro, efectivo, fácil de aplicar y aceptable para su
uso. Sin embargo, para desarrollar un producto con estas características, es indispensable
realizar previamente un estudio de preformulación para determinar las propiedades físicas,
químicas y microbiológicas del principio activo solo o en combinación con los auxiliares de
formulación (Gómez & Villamizar, 1996).
Una formulación óptima debe asegurar la estabilidad biológica y física del producto en
condiciones de almacenamiento, debe optimizar la viabilidad y actividad biocontroladora
22
del principio activo, debe mejorar las características físicas y químicas del producto para su
aplicación, debe incrementar la capacidad del microorganismo biocontrolador para adaptarse
a condiciones adversas del medio ambiente y debe garantizar el valor comercial del agente
biocontrolador (Chiou & Wu, 2003).
En toda formulación se distinguen dos tipos de componentes: el principio activo responsable
de la actividad biocontroladora (hongos filamentosos, levaduras, bacterias, virus o
nematodos) y los excipientes. Estos últimos comprenden: el vehículo que puede ser sólido o
líquido y los coadyuvantes que ayudan a mejorar o modificar la acción del ingrediente activo.
Los excipientes deben ser inertes frente al microorganismo y frente a las plagas (Gómez &
Villamizar, 2000).
2.2.1. Tipos de formulación de bioplaguicidas
Los bioplaguicidas pueden ser formulados en diferentes presentaciones:
2.2.1.1. Formulaciones líquidas
• Concentrados emulsionables
Los concentrados emulsionables se caracterizan porque al ser mezclados con agua forman
una emulsión. Una emulsión consta de dos fases, una continua y una discontinua. Para que
la emulsión sea estable y sus componentes no se separen se requiere adicionar un agente
emulsificante. Un concentrado emulsionante consta básicamente de un solvente no polar, el
principio activo suspendido en dicho solvente y un agente emulsificante (De Piedrahita et al.,
1984).
• Suspensiones acuosas
Este tipo de formulación está compuesto por el ingrediente activo suspendido en un medio
acuoso. Los productos más comunes formulados de esta forma contienen el ingrediente
activo de muy pequeño tamaño de partícula suspendido en un líquido. La apariencia de
estos productos en su forma comercial es la de un líquido espeso, que para ser aplicado
debe ser diluido en agua por el usuario (De Piedrahita et al., 1984).
23
2.2.1.2. Formulaciones sólidas
• Polvos para reconstituir o polvos mojables
Este tipo de polvos forman una suspensión al ser mezclados con agua. Se preparan
mezclando el ingrediente activo con un material inerte como la arcilla, que sirve como agente
transportador y agregando un humectante y un dispersante. El humectante ayuda a mojar el
producto cuando éste se mezcla con agua y el dispersante reduce la cohesión de las
partículas permitiendo que se dispersen en la fase acuosa (De Piedrahita et al., 1984).
La producción de este tipo de formulación normalmente involucra el secado de células o de
esporas provenientes de la etapa de producción, junto con un portador. Al polvo seco
resultante pueden adicionarse varios adyuvantes para mejorar la eficacia de la formulación
antes de la resuspensión en el agua. Una característica importante de esta formulación es el
tamaño de partícula del principio activo, pues cuanto más pequeño, mejor es su
redistribución en la superficie del material que va a proteger, por lo que va a conseguir una
mayor eficacia (Boland & Kuykendall, 1998 citado por Higuera, 2003).
• Polvos para espolvoreo
Son aplicados directamente sobre las plantas o sobre el suelo. El principio activo se
encuentra disperso en un vehículo inerte sólido (Gómez & Villamizar, 2000).
• Granulados
Son partículas agregadas de mayor tamaño, reunidas o agrupadas con un aglutinante en
solución adicionado a la mezcla de los polvos, ingrediente activo y auxiliares. Tiene como
ventaja que mejora la cohesividad y comprensibilidad del polvo, debido a que aglutinante
cubre las partículas individuales, haciendo que se adhieran unas a otras formando gránulos,
mejorando la fluidez, permitiendo la uniformidad de contenido para formulaciones con bajo
contenido de ingrediente activo (Bravo et al., 2004).
Los gránulos son de forma irregular pero con un tamaño bastante uniforme. El tamaño de
partícula oscila entre 0.2 y 1.5 mm. Se emplean frecuentemente para el control de insectos
cuyo ciclo de vida transcurre la mayor parte del tiempo en el suelo (Gómez & Villamizar,
2000).
24
• Gránulos dispersables en agua
La presentación comercial del producto es igual a la de los productos granulados, pero a
diferencia de estos, los gránulos dispersables deben reconstituirse en agua para su
aplicación con un equipo común de aspersión (De Piedrahita et al., 1984).
• Comprimidos, pastillas y bolas
Son formas de dosificación sólidas elaboradas mediante técnicas de moldeo o método de
compactación de una formulación (Bravo et al., 2004). En estos tipos de formulaciones las
partículas son de mayor tamaño que las de los productos granulados. Tienen la ventaja que
no necesitan equipo para su aplicación. Estas formulaciones son poco comunes en el
mercado (De Piedrahita et al., 1984).
2.3. BIOPLAGUICIDAS DE APLICACIÓN FOLIAR
El tipo de formulación diseñado, depende de las características y del comportamiento de la
plaga o fitopatógeno a controlar, el sitio en que el bioplaguicida debe ser aplicado, las
condiciones medioambientales y el tipo de usuario al cual el producto será vendido.
Teniendo en cuenta el ciclo de vida del organismo blanco, los biocontroladores pueden ser
aplicados sobre la superficie de las plantas, en el suelo o en el agua (Gómez & Villamizar,
2000).
En el desarrollo de bioplaguicidas de aplicación foliar para el control de insectos plaga y de
patógenos foliares es importante considerar la fotoestabilidad, la persistencia, la resistencia
al lavado de lluvias, la adherencia y el mecanismo de acción del biocontrolador (Gómez &
Villamizar, 2000).
La formulación de estos bioplaguicidas en condiciones de aplicación comercial, debe
asegurar que el microorganismo biocontrolador tenga la capacidad de adaptarse al ambiente
de la superficie de las plantas, el cual se caracteriza por ser deficiente en nutrientes, hay
exposición directa a la radiación ultravioleta, ocurre una rápida fluctuación de la temperatura
y de la humedad relativa, además de competir contra otros microorganismos epifitos (Chiou
& Wu, 2003).
25
2.4. CARACTERÍSTICAS DE LA FILOSFERA
El tallo, las hojas y los frutos de las plantas son los hábitat adecuados para las poblaciones
microbianas denominadas epífitas. Poblaciones de bacterias heterótrofas y fotosintéticas,
hongos (particularmente levaduras), líquenes y algunas algas se desarrollan regularmente
en estas superficies de las plantas. El hábitat adyacente a la superficie de las hojas de las
plantas se conoce como filosfera, y el que se encuentra directamente sobre la superficie de
la hoja es el filoplano (Atlas y Bartha, 2002).
La superficie de las hojas de las plantas es usualmente hidrofóbica, debido a la presencia de
cutina y cera, cuyas cantidades varían con la especie de planta o cultivo y por las
condiciones ambientales. Esta capa impermeable no sólo restringe la pérdida de agua de la
hoja, sino también reduce la cantidad de nutrientes, los cuales son lixiviados desde la hoja
(Campbell, 1989).
Algunas hojas son planas, a menudo tienen cristales de cera de varias formas y las células
epidérmicas tienen superficies convexas con canales entre ellas. Estos detalles en la
topografía de las hojas proveen a muchos microhábitats disponibilidad de agua, nutrientes o
protección a la excesiva radiación solar (Campbell, 1989).
La filosfera permite el establecimiento de diversas bacterias, levaduras y hongos
filamentosos, que crecen a través de la utilización de recursos limitados que están
disponibles en este hábitat y su supervivencia depende de su habilidad para adaptarse al
estrés generado por condiciones ambientales como: fluctuaciones en la disponibilidad de
agua y en la temperatura, estrés osmótico y exposición a la radiación solar (Jacobs &
Sundin, 2001).
2.5. FACTORES ABIÓTICOS QUE AFECTAN LA FILOSFERA
La distribución ecológica y el funcionamiento de las poblaciones microbianas están
fuertemente influenciados por factores abióticos diversos (Atlas & Bartha, 2002). Las
superficies aéreas de las plantas se encuentran sujetas a fluctuaciones en la temperatura, en
la radiación solar, en la humedad relativa y humedad superficial, y en el movimiento del aire
26
circundante (Burrage, 1971 citado por Elad et al., 1994a). Estas condiciones además
de afectar directamente la microflora de la filosfera, pueden tener efectos indirectos al
modificar las características de las hojas en su morfología, su estado metabólico y en la
química de su superficie (Cutter, 1976 citado por Elad et al., 1994a).
2.5.1. Lluvia y viento
El movimiento del agua y del aire contribuye a la dispersión pasiva de los microorganismos
(Atlas & Bartha, 2002). La lluvia permite una distribución del agua sobre las plantas y el
suelo. Cuando ocurre, inicialmente se produce un proceso de captación del agua por las
superficie de las hojas, tallos y otros órganos de las plantas (interceptación), que ocasiona la
redistribución y lavado de los microorganismos, los cuales normalmente son propios de ese
hábitat o son introducidos como agentes de biocontrol. Como consecuencia, el tamaño de la
población de los biocontroladores introducidos puede verse afectada en zonas donde la
precipitación es relativamente alta, afectando la eficacia del control biológico (Restrepo,
2003).
El viento puede causar daños mecánicos en las hojas tales como la remoción de la ceras
cuticulares debido al rozamiento o impactación de partículas, también puede derretir estas
ceras debido al calor generado por la fricción (Lindow et al., 2004). Por otra parte, el viento
puede reducir la temperatura de las hojas (Lambers et al., 1998).
2.5.2. Temperatura
La variación de la temperatura es debida al balance de la radiación entrante y saliente de la
superficie terrestre y del balance de la propia atmósfera. Esta cambia en espacio y tiempo
debido a las diferencias de radiación recibida, a la superficie, al relieve, a los vientos, entre
otros (Jaramillo, 1999 citado por Restrepo, 2003).
Varios estudios han demostrado que la temperatura del aire generalmente no coincide con la
temperatura de las hojas expuestas a la radiación solar. Por otro lado, la temperatura foliar
no es homogénea a lo largo de la hoja. Cada hoja o parte de ella tiene su propio nivel de
equilibrio y por lo tanto su propio microclima, lo cual conduce a diferentes valores de
temperatura (Burrage, 1971 citado por Restrepo, 2003).
27
Teniendo en cuenta que la aplicación de algunos agentes de biocontrol se ubica
principalmente sobre el haz de las hojas externas, es decir aquellas que están expuestas a
la radiación solar directa, se puede asumir que la actividad biocontroladora puede verse
afectada por las altas temperaturas que podrían alcanzar las hojas. Esto puede ocurrir si se
considera que los microorganismos poseen una temperatura óptima de crecimiento que los
caracteriza (Restrepo, 2003).
2.5.3. Humedad
El contenido de agua en la atmósfera generalmente es bajo y limita el crecimiento
microbiano (Atlas & Bartha, 2002). Rápidas fluctuaciones en la disponibilidad de humedad
son características en la superficie de las hojas y tiene una mayor consecuencia en la
colonización y establecimiento de las comunidades microbianas. La capacidad de la
superficie foliar para recoger y retener humedad ha sido relacionado con la composición
química de la cutícula y topografía de la superficie. Es así que la humedad libre (agua
proveniente de lluvia y gotas de rocío) puede estar frecuentemente ausente en la superficie
de las hojas debido a la naturaleza hidrofóbica de ésta (Lindow et al., 2004).
Por otro lado, la humedad relativa es atenuada en la superficie de las hojas por la presencia
de una capa laminar límite que regula los frecuentes cambios de este parámetro en el
ambiente (Lindow et al., 2004).
Los bioplaguicidas de aplicación foliar requieren en sus formulaciones adyuvantes como
humectantes que provean alguna protección contra la desecación o la presencia de aceites
que promuevan la adherencia y colonización del agente biocontrolador sobre la capa
hidrofóbica de la superficie y la reducción de la pérdida de humedad (Hynes & Boyetchko,
2006).
2.5.4. Radiación solar
Un componente importante en el ambiente físico de la filosfera es el flujo diario de la
radiación solar, la cual incluye la radiación visible, la radiación ultravioleta y la radiación
infrarroja, (Lindow et al., 2004). Alrededor del 98% de la radiación emitida por el sol está
entre el rango de 300 a 3.000 nm. La radiación ultravioleta (200 a 400 nm) tiene el
28
mayor contenido de energía por quantum (longitud de onda corta), ésta constituye
aproximadamente el 7% de la radiación solar y es potencialmente perjudicial para las
plantas. Las plantas absorben alrededor del 97% de radiación UV entrante a la tierra
(Lambers et al., 1998).
Alrededor de la mitad del contenido energético de la radiación solar está dentro del rango de
longitud de onda de 400 a 700 nm, correspondiente a la radiación visible, la cual es usada
para llevar a cabo procesos fotoquímicos en las plantas. Por otro lado, la radiación infrarroja
con un rango de longitud de onda de 700 a 3.000 nm, es absorbida en menor grado. Este
rango puede ser dividido en dos: 700 a 1.200 nm, el cual es principalmente reflejado o
transmitido por las hojas y 1.200 a 3.000 nm, el cual es principalmente absorbido por el agua
en las hojas. El resultado es que alrededor de un 50% de radiación infrarroja es absorbida
(Lambers et al., 1998).
2.5.4.1. Radiación ultravioleta
La luz ultravioleta es una radiación de longitudes de onda que comprenden desde 100 a 400
nm y se clasifican convencionalmente en tres tipos: UV C (100 a 280 nm), UV B (280 a 315
nm) y UV A (315 a 400 nm). Teniendo en cuenta sus propiedades se han considerado los
efectos biológicos y ecológicos que pueden inducir (Niegel & Dylan, 2003).
2.5.4.1.1. Radiación ultravioleta tipo C (UV C)
Si se considera que la energía de un fotón de radiación está relacionada inversamente con la
longitud de onda, este tipo de radiación es la de mayor energía al incluir longitudes de onda
corta en comparación con los otros dos tipos. Es absorbida por el oxígeno y el ozono en la
atmósfera, impidiendo que penetre a través de ésta. La UV C artificial puede llegar a causar
daños severos a nivel morfológico, fisiológico y bioquímico en los organismos (Niegel &
Dylan, 2003).
2.5.4.1.2. Radiación ultravioleta tipo B (UV B)
Es la radiación con más energía que tiene la propiedad de penetrar la biosfera aunque es
absorbida en parte por el ozono atmosférico y por consiguiente, su incremento es
29
el resultado del deterioro de la capa de ozono. Incluso la longitud de onda más corta entre el
rango de la UV B (280 nm), es la mayor responsable del daño de la capa de ozono (Niegel &
Dylan, 2003).
Es absorbida por muchas moléculas biológicas incluyendo macromoléculas como el DNA
provocando lesiones directas. El daño directo resulta de la formación de fotoproductos tales
como dímeros de pirimidinas (aparición de enlaces covalentes entre bases pirimidímicas
adyacentes: citosina-citosina o citosina-timina), hidratos de pirimidina y entrecruzamientos
entre DNA y proteínas. (Diffey, 1991 citado por Devoto et al., 2003).
2.5.4.1.3. Radiación ultravioleta tipo A (UV A)
No es absorbida por el ozono atmosférico por tanto penetra directamente a la biosfera.
Aunque de los tres tipos de radiación ultravioleta esta es de menor energía, está presente
en mayor intensidad en los rayos solares. Puede ser absorbida por muchas proteínas,
incluyendo importantes fotorreceptores. Tiene la capacidad de inducir algunos efectos como
la formación de pigmentos (Niegel & Dylan, 2003).
Causa lesiones indirectas en la molécula de DNA al no ser absorbido directamente
(Wakefield et al., 2004). El daño indirecto se debe principalmente a la formación de especies
reactivas de oxígeno (peróxido de hidrógeno, singletes de oxígeno, radicales hidroxilo) que
oxidan la pentosa presente en el DNA y rompen la hebra de la molécula (Diffey, 1991 citado
por Devotto & Gerding, 2003). Las especies reactivas de oxígeno pueden ser generadas a
partir de la absorción de UV A por parte de moléculas cromóforas como riboflavina, porfirinas
y quinonas (Wakefield et al., 2004).
Tanto las lesiones directas como indirectas interfieren en la replicación normal del DNA, si
superan los mecanismos de reparación de la célula y producen mutaciones o la muerte
celular, dependiendo de la cantidad de energía recibida (Cerda-Olmedo et al., 1996 citado
por Devotto & Gerding, 2003).
30
2.5.4.1.3.1. Formación de radicales libres
Los radicales libres son todas aquellas especies químicas, cargadas o no, que en su
estructura atómica presentan un electrón desapareado o impar en un orbital externo que les
da una configuración generadora de gran inestabilidad (Ballesteros, 2006).
Poseen una estructura birradicalaria, son muy reactivos, tienen una vida media corta, por lo
que actúan cercano al sitio en que se forman y son difíciles de dosificar. Desde el punto de
vista molecular son pequeñas moléculas que se producen por diferentes mecanismos entre
los que se encuentran la cadena respiratoria mitocondrial, la cadena de transporte de
electrones a nivel microsomal, en los cloroplastos y en las reacciones de oxidación, por lo
que producen daño celular (oxidativo), al interactuar con las principales biomoléculas del
organismo. Se pueden generar a nivel intracelular y extracelular (Ballesteros, 2006).
Las especies reactivas de oxígeno incluyen a los radicales libres y a otras especies no
radicalarias (que pueden participar en reacciones que llevan a la elevación de los agentes
prooxidantes). Los radicales libres del oxígeno se clasifican de la siguiente forma:
• Radicales libres inorgánicos o primarios: Se originan por transferencia de electrones
sobre el átomo de oxígeno, representan por lo tanto distintos estados en la reducción de
éste y se caracterizan por tener una vida media muy corta. Estos son el anión
superóxido, el radical hidróxilo y el óxido nítrico (Ballesteros, 2006).
• Radicales libres orgánicos o secundarios: Se pueden originar por la transferencia de
un electrón de un radical primario a un átomo de una molécula orgánica o por la reacción
de dos radicales primarios entre sí, poseen una vida media un tanto más larga que los
primarios; los principales átomos de las biomoléculas son: carbono, nitrógeno, oxígeno y
azufre (Ballesteros, 2006).
• Intermediarios estables relacionados con los radica les libres del oxígeno: Se
incluyen un grupo de especies químicas que sin ser radicales libres, son generadoras de
estas sustancias o resultan de la reducción o metabolismo de ellas. Se encuentran el
oxígeno singlete, el peróxido de hidrógeno, el ácido hipocloroso, el peroxinitrito y los
hidroperóxidos orgánicos (Ballesteros, 2006).
31
Los radicales libres pueden originarse en las células de diversos modos. Las radiaciones
externas, incluyendo la radiación UV, los rayos X y los rayos gamma procedentes de
material radioactivo, son una potente fuente de radicales libres. Dichas radiaciones actúan
rompiendo los enlaces entre átomos, dejando los radicales con sus electrones desapareados
para propagar su daño (Ballesteros, 2006).
2.5.4.1.4. Efectos de la radiación ultravioleta sob re los microorganismos en la filosfera
Para los microorganismos de la filosfera, la radiación ultravioleta es un factor de selección, al
originar cambios medibles tanto en especies microbianas individuales como en comunidades
complejas, y en la composición genotípica de la microflora de la superficie de las hojas, lo
que puede ocurrir en un tiempo tan corto, inclusive de horas (Niegel & Dylan, 2003).
La adaptación a este hábitat aparece como resultado de una incrementada tolerancia a la
radiación ultravioleta, lo cual puede incluir el desarrollo de diferentes mecanismos de
protección. La selección por tolerancia a la radiación ultravioleta es también evidente en
algunas bacterias y hongos que están expuestos a la radiación ultravioleta sólo en una parte
de su ciclo de vida, incluyendo microorganismos patógenos de plantas y descomponedores,
los cuales a veces son vulnerables a los efectos de la UV durante sus procesos de
esporulación, dispersión e infección. El daño al DNA es probablemente el mayor efecto de la
radiación sobre muchos microorganismos incrementando su variabilidad genética (Niegel &
Dylan, 2003).
El impacto de la radiación UV B sobre los organismos es de gran interés debido al deterioro
de la capa de ozono sobre la tierra. Entre los efectos directos de la radiación UV B sobre los
microorganismos que habitan la filosfera, se incluye el daño al DNA, por lo que la
supervivencia de los organismos depende de su habilidad para reparar las lesiones del DNA
y prevenir la incidencia de las mismas. La radiación UV B al actuar indirectamente, tiene un
efecto sobre la planta hospedera y puede incluir cambios fisiológicos en la química de las
hojas y cambios en la estructura de su superficie, estas alteraciones pueden afectar las
comunidades de la filosfera a través de muchos niveles tróficos (Lindow et al., 2004).
32
Los resultados de algunos estudios indican que la radiación ultravioleta a partir de fuentes
naturales y artificiales, causa efectos biológicos adversos como disminuir la germinación de
esporas; influir sobre los sitios de distribución y colonización y reducir significativamente la
recuperación de algunas levaduras, entre otros (Lindow et al., 2004).
Por otro lado, se conoce que la incidencia y progresión de ciertas enfermedades causadas
por hongos son particularmente influenciadas por la radiación UV. La esporulación de
algunos hongos en muchos casos es estimulada por esta radiación en el rango de longitudes
de onda del UV A. Por ejemplo, en un trabajo realizado por Nicot et al. (1996), se observó
que la remoción selectiva de longitudes de onda menores a 380 nm de la radiación solar,
redujo significativamente la producción de esporas de Botrytis cinerea sobre agar y en
tejidos de planta. El uso de materiales que absorben la radiación ultravioleta como la
cubierta de invernaderos también ha mostrado resultados efectivos en la reducción de
Botrytis cinerea en pepino y tomate y de Alternaria solani en tomate (Lindow et al., 2004).
2.6. FOTOPROTECCIÓN
El término fotoprotección hace referencia a las estrategias utilizadas para minimizar el daño
producido por la luz, en especial la radiación ultravioleta. La radiación ultravioleta comprende
la banda más reactiva de la radiación solar incidente sobre la superficie de la tierra (Vincent
& Nale, 2000 citado por Libkind et al., 2004).
2.6.1. Estrategias de fotoprotección de los organis mos vivos
Para evitar los daños celulares, los seres vivos han desarrollado en general cuatro tipos de
estrategias básicas (Vincent & Nale, 2000; Roy, 2000; Cockell & Knowland, 1999 citados por
Libkind et al., 2004):
1. La evasión del estrés, lo que se logra con respuestas de comportamiento tales como el
alejamiento de la fuente que lo origina.
2. La reducción del estrés originado, por medio de agentes protectores que funcionan como
pantallas solares y/o tienen actividad antioxidante. Entre los agentes protectores
producidos por diferentes organismos se pueden encontrar:
33
Pigmentos carotenoides: Los carotenos son los pigmentos más ampliamente
distribuidos en la naturaleza y sólo pueden ser sintetizados de novo por vegetales y
ciertos microorganismos (Libkind et al., 2004). Son compuestos terpenoides C40
formados por la condensación de ocho unidades de isopreno. La molécula es simétrica.
Una serie de dobles enlaces conjugados es responsable por la absorción de la luz en la
región visible del espectro (Ballesteros, 2006).
Su función primaria en los organismos fotosintéticos es servir como pigmentos
accesorios y como protectores contra la fotooxidación; en los organismos no
fotosintéticos su papel principal es el de secuestrar las especies tóxicas de oxígeno
(Libkind et al., 2004).
Melanina: Es un polímero que tiene propiedades entre las cuales la más sobresaliente
es el amplio espectro de absorción debido al alto grado de conjugación de la molécula.
El oscurecimiento del pigmento es el resultado de la gran absorción del espectro visible,
incluyendo radiación con baja cantidad de energía (Ballesteros, 2006).
Las melaninas además absorben en la región ultravioleta del espectro, envolviendo
transiciones de enlazantes a antienlazantes orbitales pi, los cuales ocurren en enlaces
de carbono insaturados. Las transiciones que provienen de orbitales enlazantes a
antienlazantes, son facilitadas por la conjugación, permitiendo deslocalización
electrónica (Ballesteros, 2006).
Antioxidantes: El daño hecho por los radicales libres se da por oxidación. Un
antioxidante es toda sustancia que retrasa o previene el deterioro, daño o destrucción
provocados por una oxidación. Durante muchos años, se ha tenido conocimiento de que
la acción oxidante de los radicales libres puede ser controlada, o incluso prevenida por
una serie de sustancias antioxidantes (Ballesteros, 2006).
Los antioxidantes impiden que otras moléculas se unan al oxígeno, al reaccionar o
interactuar más rápido con los radicales libres y las especies reactivas del oxígeno que
con el resto de las moléculas presentes en un determinado microambiente: membrana
plasmática, citosol, núcleo o líquido extracelular. La acción del antioxidante es de
sacrificio de su propia integridad molecular para evitar alteraciones de
34
moléculas (lípidos, proteínas, DNA) funcionalmente vitales o más importantes. Su acción
la realizan tanto en medios hidrofílicos como hidrofóbicos. Actúan como eliminadoras
(scavengers), con el objetivo de mantener el equilibrio prooxidante-antioxidante a favor
de estos últimos (Ballesteros, 2006).
Micosporinas: Son compuestos hidrosolubles que absorben la radiación UV y contienen
una unidad cíclica tipo aminociclohexenona unido a un aminoácido o amino-alcohol.
Fueron caracterizadas por primera vez en el hongo Ascochyta pisi. Favre-Bonvin et al.
(1976) fueron los primeros en describir la estructura química de una micosporina en el
hongo Stereum hirsutum y fue denominada micosporina-310. En los últimos años, se
han aislado una serie de derivados de la micosporina-310 de cianobacterias, algas y
otros organismos. Se trata de derivados imino-carbonil del cromóforo de ciclohexenona
de las micosporinas, y se denominan aminoácidos tipo micosporina (MAAs) (Korbee et
al., 2006)
Tanto las micosporinas como los MAAs tienen conjugado en el anillo sustituyentes
nitrogenados (amino), aminoácidos o sus amino-alcoholes correspondientes. La glicina
es el aminoácido más común presente en los MAAs. En cuanto a su localización, los
MAAs se pueden acumular intracelularmente o extracelularmente y su absorción máxima
de radiación está entre 310 y 360 nm (Korbee et al., 2006).
3. La reparación de los daños, causados principalmente en el material genético, mediante
fotoreactivación, escisión o recombinación.
4. Desarrollo de mecanismos de adaptación al estrés.
2.6.1.1. Mecanismos de fotoprotección a la radiació n UV de bacterias
En varios estudios de las comunidades microbianas de la filosfera, la mayoría de bacterias
aisladas producen pigmentos en cultivo, sugiriendo que la protección a UV es conferida por
la pigmentación, siendo un mecanismo importante para la supervivencia en la filosfera
(Jacobs & Sundin, 1999).
35
Estudios han demostrado que el pigmento amarillo ligado a la membrana, producido por
Xanthomonas campestris, posee propiedades antioxidantes y protege los lípidos de la
perooxidación. Similarmente, los pigmentos carotenoides producidos por Erwinia herbicola
(Pantoea aglomerans) juegan un rol importante en la protección celular frente a la radiación
UV A. (Jacobs & Sundin, 1999).
Por otro lado, la tolerancia a la UV de la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae, es
conferida por un plásmido codificado como rulAB DNA reparador operón. El rulAB operón
está ampliamente distribuido entre las cepas de P. syringae. De acuerdo con estudios
realizados por Sundin et al. (1996), las cepas de P. syringae que poseen este plásmido
están capacitadas para mantenerse en altas poblaciones en la filosfera de fríjol con una alta
exposición a la radiación UVB. También se ha evidenciado la producción de una capa de
polisacárido capaz de absorber la radiación UV, que está implicada en la tolerancia de
Xanthomonas campestris pv. phaseoli a dicha radiación (Jacobs & Sundin, 1999).
En el caso del agente biocontrolador Bacillus thuringiensis, la radiación UV tiene un impacto
negativo significativo en la supervivencia de sus esporas, sin embargo el efecto sobre sus
toxinas no es claro. Varios estudios demostraron algún impacto de la exposición de bandas
cortas de UV en la presencia de toxinas o encontrar una menor degradación (Bravo et al.,
2004). Por otro lado, la resistencia de sus esporas a la luz UV es causada por alteraciones
en la conformación del DNA, altas concentraciones de proteínas pequeñas ácido solubles
(SASP) y bajas concentraciones de ácido dipicolínico (DPA). Cepas mutantes de Bacillus
thuringiensis caracterizadas por su supervivencia y actividad biocontroladora pueden ser
aisladas después de sucesivas exposiciones a la radiación UV (Saxena et al., 2002)
2.6.1.2. Mecanismos de fotoprotección a la radiació n UV de hongos
En las levaduras la producción de pigmentos carotenoides se encuentra principalmente
asociada a los géneros Rhodotorula, Sporobolomyces, Sporidiobolus, Cryptococcus,
Rhodosporidium y Phaffia (Xanthophyllomyces). Los más característicos son el β-caroteno,
toruleno y la torularrodina. Las levaduras del género Phaffia sintetizan principalmente
astaxantina. Algunos estudios han revelado que especies de levaduras pigmentadas carecen
de algunos tipos de la enzima superóxido dismutasa (SOD) y presentan baja actividad de la
36
enzima catalasa, en comparación con levaduras no pigmentadas, lo que sugiere que la
producción de estos pigmentos es un mecanismo de fotoprotección necesario en este tipo de
levaduras para contrarrestar los efectos de la radiación UV (Libkind et al., 2004).
De igual forma, la síntesis de compuestos de absorción UV en levaduras fue asociada
recientemente a la estimulación con luz intensa o en mayor medida a la exposición a la
radiación UV. Se trata de un compuesto único de absorción máxima dentro del rango del
UV B (310 nm), identificado como micosporina-glutaminol-glucósido (MGG), nunca antes
encontrado en hongos basidiomicetos (Libkind et al., 2004).
Estos estudios indicaron que la acumulación de micosporinas en levaduras que crecieron
bajo radiación UV, puede alcanzar valores mayores a los observados para pigmentos
carotenoides (hasta un 0.5% en peso seco). Una producción elevada de micosporinas
estimulada por la radiación UV es un punto a favor de su papel fotoprotector en la
naturaleza. Sin embargo, no todas las especies de levaduras son capaces de sintetizar
micosporinas y su presencia en estos microorganismos parece estar más relacionada con
determinados grupos filogenéticos que con factores ambientales (Libkind et al., 2004).
2.6.2. Fotoprotección artificial
Existen diferentes grupos de sustancias utilizadas para la protección a la radiación solar.
2.6.2.1. Filtros solares químicos o absorbentes
Son moléculas que poseen un grupo carbonilo que se isomeriza bajo el efecto de la energía
de las radiaciones absorbidas. Estos filtros absorben una parte de las radiaciones cortas y
refleja la otra parte con una longitud de onda superior a 380 nm, la luz visible o la radiación
infrarroja, y por lo tanto inofensiva (Martín, 2005). Estas sustancias se caracterizan por sufrir
cambios estructurales químicos al activarse (Velásquez et al., 1998).
Existen básicamente tres tipos de filtros: filtros de espectro estrecho (fotoprotección UV B),
filtros de amplio espectro (fotoprotección UV B y UV A) y filtros de espectro moderado a
amplio (fotoprotección UV A) (Ballesteros, 2006).
37
Entre los grupos de filtros químicos más comunes se encuentran: derivados de ácidos
amino-benzoicos (PABA, gliceril PABA, Padimato, Roxadimato); benzofenonas
(dioxibenzona, oxibenzona, sulisonbenzona); cinamatos (octocryleno, octil metoxicinamato);
y salicilatos (homosalato, etilhexil salicilato, trolamina salicilato) (Ngan, 2005 citado por
Ballesteros, 2006).
• Filtros de espectro estrecho (fotoprotección UV B)
Acido para-aminobenzoico (PABA) y sus ésteres: Aminobenzoato glicerol, padimato A y
O, octildimetilpaba, etilexil dimetil PABA. El rango de absorbancia para PABA y
aminobenzoato glicerol es entre 260 y 313 nm en concentraciones del 5 al 15%. Los
padimatos A y O tienen un rango entre 290 y 313 nm. Los otros ésteres tienen menor
efectividad. Todas estas sustancias son solubles en agua (Velásquez et al., 1998).
Cinamatos y sus ésteres: Dietanolamina, parametoxicinamato, etilhexil p-metoxicinamato,
cinoxate. El ácido cinámico es un líquido viscoso, útil en concentraciones entre el 1% y el
4%. El octilmetoxicinamato tiene un rango de protección entre 280 y 310 nm y el cinoxate
entre 270 y 328 nm. Son prácticamente insolubles en agua (Velásquez et al., 1998).
Salicilatos y ésteres: Octilsalicilato, homosalicilato, salicilato de trietanolamina. El prototipo
de este grupo de filtros solares es el homosalicilato, cuyo rango de protección está entre 290
y 315 nm. Estos compuestos pueden incorporarse fácilmente a otros productos que permitan
aumentar su factor de protección solar. Entre otros derivados se encuentran el octilsalicilato
que cubre un rango entre 260 y 310 nm y la trietanolamina entre 260 y 320 nm. (Velásquez
et al., 1998)
• Filtros de espectro moderado a amplio (fotoprotecci ón UV A)
Benzofenonas: Oxibenzona, dioxibenzona, salisobenzona, benzofenona, dibenzoilmetano.
Absorben un espectro entre 206 y 380 nm. La oxibenzona tiene un rango entre 270 y 350 nm
y la dioxibenzona entre 206 y 380 nm (Velásquez et al., 1998).
Parsol 1789: Se utiliza en concentraciones del 3%, con un rango de absorbancia entre 310 y
400 nm con un pico en 360 nm. A causa de su falta de absorción de luz UVB o muy débil en
38
el espectro entre 290 y 320, el parsol debe ser combinado con otro protector que absorba en
dicho rango, como el padimato O (Velásquez et al., 1998).
Mexoryl SX: Protege de longitudes cortas de radiación UV A. Su máximo nivel de absorción
es de 345 nm, lo que corresponde al limite entre UV A cortos (320 a 340 nm) y UV A largos
(340 a 400 nm). Es hidrosoluble y aumenta su eficacia en combinación con filtros lipofílicos
(Velásquez et al., 1998).
2.6.2.2. Filtros solares físicos o bloqueadores
Estos filtros solares reflejan o dispersan la radiación ultravioleta. Son generalmente de origen
mineral y son efectivos frente a las radiación ultravioleta tipo A y tipo B y la radiación visible.
Deben usarse en bases oleosas y en capa gruesa para asegurar su eficacia (Velásquez et
al., 1998).
Los dos bloqueadores físicos más comunes son dióxido de titanio y óxido de zinc. Estos son
químicamente inertes, seguros y protegen contra el espectro completo de UV. Los óxidos de
hierro y el micatitanio son otro tipo de polvos pigmentarios, que son usados como pantallas
solares (Ballesteros, 2006).
Oxido de zinc: Principio activo muy efectivo para reflejar y disipar la radiación ultravioleta.
Se utiliza en concentraciones del 5 al 20%. Las partículas efectivas de este compuesto
deben tener un tamaño de partícula entre 1-3 µm (Velásquez et al., 1998).
Dióxido de titanio: Usado al 25% en crema, protege contra toda la gama de radiaciones UV
y actúa por la formación de una barrera física. Preparaciones con TiO2 y ZnO tienen una
fuerte banda de absorción en longitudes de onda entre 250 y 400 nm. El tamaño efectivo de
partícula debe ser de 0.3 µm (Velásquez et al., 1998).
Talco : Atenúa la radiación en el espectro de luz visible y ultravioleta por disipación. Sus
partículas deben tener un tamaño entre 0.4 y 0.7 µm. Entre los talcos más comunes se
encuentra el óxido de magnesio, el caolín, el cloruro férrico (absorbe radiación visible y UV) y
el ictamnol (Velásquez et al., 1998).
39
Los bloqueadores físicos han sido usados conjuntamente con filtros solares químicos para
alcanzar mayor protección a la luz UV y a la luz visible (Velásquez et al., 1998).
2.6.2.3. Filtros solares biológicos
Los captadores de radicales libres protegen las moléculas biológicas de los efectos de los
rayos UV A en particular. Completan así la acción de los productos que sólo contienen un
filtro UV B (Martín, 2005 citado por Ballesteros, 2006).
Beta-caroteno: Es un constituyente natural de muchos vegetales como zanahorias,
tomates, pimienta y naranja. No es tóxico y absorbe radiación en el espectro visible de 360 a
500 nm, pero no es efectivo contra la luz UV B (Velásquez et al., 1998).
Antioxidantes: Dentro de los antioxidantes están los de origen enzimático como la
superóxido dismutasa, la catalasa y el peróxido glutatión y dentro de los no enzimáticos, la
vitamina C, la vitamina E y el glutatión reducido. El ácido ascórbico o vitamina C, es una
cetolactona de seis carbonos que funciona como cofactor en reacciones de hidroxilación y
favorece la actividad de una enzima amidante (Velásquez et al., 1998).
2.6.2.4. Abrillantadores ópticos
También conocidos como abrillantadores fluorescentes, fueron descubiertos hace más de 50
años. Estos compuestos fácilmente absorben la radiación UV y transmiten luz en la porción
azul del espectro visible, por tanto, su mecanismo que explica el efecto del protección solar
está relacionado con la disipación de la energía por medio de la fluorescencia. Estos
compuestos son ampliamente usados en detergentes, en el blanqueado del papel, para
prevenir el desteñido de la ropa y como fluorocromos de microorganismos (Ragaei, 1999).
2.6.2.5. Microencapsulación
Durante los últimos años se ha aumentado el interés por desarrollar técnicas de
microencapsulación de microorganismos, encaminadas a mantener la estabilidad del
biocontrolador en condiciones de almacenamiento y condiciones extremas en campo. La
microencapsulación es un procedimiento que permite recubrir partículas sólidas, gotas de
líquidos o dispersiones de sólidos en líquidos con una capa delgada y uniforme de material
40
de recubrimiento. El tamaño de las microcápsulas debe encontrarse entre décimas de
micrómetro y 5000 µm. Están diseñadas para proteger el microorganismo, controlar su
liberación en condiciones de campo o mejorar las características de almacenamiento y
manipulación (Gómez & Villamizar, 2000).
El material más utilizado en la encapsulación es el alginato de sodio, que ha sido utilizado en
la formulación de bioplaguicidas formando esferas biodegradables en las que pueden
inmovilizarse microorganismos (Boland & Kuykendall, 1998 citado por Higuera, 2003).
También se ha reportado el uso de materiales como almidón pregelatinizado y carboximetil
celulosa en la encapsulación de Bacillus thuringiensis (Gómez & Villamizar, 2000).
2.6.2.6. Protección de agentes biocontrol a la radi ación UV
Varios compuestos naturales y sintéticos han sido evaluados como protectores de la
radiación solar para diferentes agentes de biocontrol como bacterias, virus, hongos y
nematodos (Ragaei, 1999).
2.6.2.6.1. Fotoprotección de bacterias
Varios métodos han sido probados recientemente para aumentar la persistencia de bacterias
como Bacillus thuringiensis (B.t.) expuestas a la radiación UV. Ignoffo y García (1978),
reportaron que la adición de sustancias antioxidantes (peroxidasa) incrementan la viabilidad
de las esporas, ya que pueden reaccionar con los radicales libres de oxígeno generados
luego de la exposición a la radiación ultravioleta (citado por Ragaei, 1999).
Algunos colorantes solubles en agua, como la benzofenona y la sal de sodio de formil-m-
ácido bencenodisulfónico, además del rojo congo han sido usados para la fotoprotección de
B.t., por la capacidad de absorción de cromóforos catiónicos como la acriflavina y rhodamina
(Cohen et al., 2001).
Además se han descrito técnicas de encapsulación con almidón que contienen pantallas
protectoras de UV, aunque las formulaciones de B.t. y sus δ-endotoxinas encapsuladas con
almidón y pantallas UV como rojo congo no son viables. El almidón es fácilmente
41
degradado por varios microorganismos y el rojo congo puede tener efectos adversos para el
ambiente por su naturaleza mutagénica. La fotoprotección de B.t. ha sido recientemente
lograda con melanina producida por Streptomyces lividans, sin embargo, la producción de
melanina por la cepa de B.t. subsp. kurstaki podría ser más económica (Saxena et al., 2002).
2.6.2.6.2. Fotoprotección de virus
Algunas sustancias como colorantes, abrillantadores ópticos y sustancias antioxidantes
parecen ser protectores de radiación ultravioleta promisorios.
Colorantes: Jaques (1971) en un estudio pionero evaluó colorantes como el amarillo
brillante, el negro búfalo, el azul de metileno y la safranina para la protección del virus de la
poliedrosis nuclear (NPV) del gusano falso medidor (Trichoplusia ni). Jones y McKinley
(1986) encontraron que colorantes solubles como el índigo, el carmín y el tinopal BRS200
proveen alguna protección al NPV de Spodoptera litoralis, sin embargo, materiales inertes
como atapulgita, montmorilonita pueden ser más efectivos (citados por Ragaei, 1999).
Shapiro y Robertson (1990) determinaron que colorantes como el verde de lissamida, el
amarillo de acridina, el azul alcalino y el mercurio cromo fueron efectivos al proveer
protección al NPV de la polilla gitana (Lymantria dispar).
Abrillantadores ópticos: Shapiro (1992) evaluó abrillantadores como protectantes UV del
NPV de la polilla gitana. Estos eran de diferente clase química (estilbeno, oxazol, pyrazolina,
ácido naftílico, lactona, cumarina). Los más efectivos fueron los pertenecientes al grupo de
los estilbenos como: Lucophor BS y BSB (Sandoz Chemical Corp., Charlotte, NC, USA),
Phorwite AR (Mobay Chemical Corp., Union, NJ, USA) y Tinopal LPW (citado por Ragaei,
1999).
Antioxidantes: Ignoffo & García (1994) reportaron que los antioxidantes propil galato, ácido
ascórbico y fenil sulfocarbamida, proveen algún nivel de protección a los cuerpos de
inclusión polihedrales del virus del NPV de Heliothis zea. Con respecto al uso de las enzimas
oxidativas, catalasa, superóxido dismutasa y peroxidasa, la catalasa fue la mejor de las tres
por proveer protección a los cuerpos de inclusión polihedrales de este mismo virus.
42
2.6.2.6.3. Fotoprotección de hongos
Los conidios de los hongos entomopatógenos son extremadamente sensibles a la radiación
solar. Devotto y Gerding (2003) demostraron la efectividad del abrillantador óptico
Blankophor P167 (Bayer, Alemania) derivado del ácido 4,4-diamino-estilbeno-2,2-disulfónico
en la protección de los conidios de dos aislamientos de Metarhizium anisopliae.
Pereira y Roberts (1991) demostraron el efecto protector de la utilización de almidón en la
formulación del micelio de Beauveria Bassiana y Metarhizium anisopliae (citado por Ragaei,
1999). Técnicas de encapsulación, también han sido usadas empleado alginato, almidón de
maíz y aceite vegetal como también oxibenzona como pantalla UV para la fotoprotección de
hongos entomopatógenos (Cohen et al., 2001).
De igual forma, un método basado en la coadsorción del agente de biocontrol y colorantes
como acriflavina, sulfoflavina y verde metil sobre la superficie de matrices de materiales
inertes, ha sido desarrollado para la fotoprotección de conidios del hongo entomopatógeno
Aschersonia spp. (Cohen et al., 2003).
2.7. USO DE LEVADURAS COMO AGENTES DE CONTROL BIOLÓ GICO
El control biológico se define como la reducción de la densidad del inóculo o la actividad
productora de enfermedad de un patógeno o parásito en su estado activo o latente, por uno
o más organismos antagónicos, en forma natural o por manejo del habitante, hospedero o de
los propios microorganismos (Baker & Cook, 1983 citado por Agrios, 2005).
El uso de agentes bióticos o sus productos para combatir enfermedades, tiende a interferir
de alguna manera con el ciclo biológico del patógeno o a estimular la reacción de la planta
atacada, favoreciendo la creación de barreras físicas, químicas o bioquímicas, de modo que
hayan alcanzado niveles suficientes para retrasar, disminuir o impedir el desarrollo del
patógeno cuando éste entre en contacto con la planta (Llácer et al., 2000).
Los estudios de investigación acerca del uso de levaduras como agentes biocontrol son
relativamente limitados y su énfasis ha sido en el control de patógenos en el filoplano (Dik &
Fokkema, 1993 citado por Schoeman et al., 1999). Sin embargo, las levaduras han sido
reportadas como microorganismos potencialmente antagonistas de patógenos en
43
postcosecha, para lo cual ya existen algunos tratamientos que previenen el deterioro de
frutas principalmente. Las levaduras Cryptococcus albidus, Candida oleophila, Candida
laurentii, Candida saitoana y Debaryomyces hansenii son representativas como agentes
para el control de patógenos en la superficie de heridas de cítricos y manzanas, tales como
B. cinerea, Penicillium expansum y Penicillium digitatum; la levadura Kloekera apiculata para
el control de R. stolonifer en uvas de mesa y la levadura Pichia anomala con alta actividad
antagónica en granos de trigo inhibiendo el crecimiento de Penicillium roqueforti (Druvefors
et al., 2005; García, 2002).
2.7.1. Mecanismos de acción
Dentro de los principales modos de acción de las levaduras contra fitopatógenos se
encuentran:
• Antibiosis
La secreción de sustancias antibióticas o metabolitos tóxicos por parte de los
microorganismos, es un fenómeno natural y frecuente. Estos metabolitos actúan en bajas
concentraciones (menores a 10 ppm) y son capaces de interferir en la germinación, el
crecimiento y la esporulación de microorganismos patógenos. Tales compuestos pueden ser
o no volátiles y su importancia en el rizoplano y la rizosfera ha sido comprobada (Sing &
Faull, 1990 citado por Pava, 2002).
Aunque este mecanismo de acción no es común en levaduras antagonistas contra
fitopatógenos, se encontró que fue efectivo cuando la levadura Candida oleophila se evaluó
en la postcosecha de manzanas inoculadas con B. cinerea y P. expansum (Wisniewski et al.,
1995 citado por García, 2002).
La habilidad de producir antibióticos contra hongos y bacterias de algunos microorganismos
de la filosfera, como los géneros Aureobasidium y Sporobolomyces, no se pone en duda
cuando esto es evaluado in vitro. Sin embargo, no hay información acerca de la producción
de estas sustancias sobre las hojas (Campbell, 1989).
44
Investigaciones recientes acerca del modo de acción de la levadura epifítica Sporothrix
flocculosa contra el mildeo polvoso de la rosa (Sphaerotheca pannosa var. rosae) y del
pepino (Sphaerotheca fuliginea), revelan que el antagonista no penetra el hospedero, sino
que induce la producción de ácidos grasos que causan una rápida plasmólisis de las células
del patógeno. Otros estudios similares realizados con las levaduras del género
Tilletiopsis spp., antagonistas del mildeo polvoso del pepino, sugieren que la antibiosis es su
principal modo de acción (Elad et al., 2000).
• Competencia
Puede definirse como el desigual comportamiento de dos o más organismos ante un
requerimiento común, siempre y cuando la utilización del mismo por uno de los organismos,
reduzca la cantidad disponible para los demás. Un factor esencial para que exista
competencia es que haya “escasez” de un elemento, si hay exceso no hay competencia. La
competencia más común es por nutrientes, oxígeno o espacio (Janisiewicz & Korsten, 2002).
La rápida colonización y supervivencia de las levaduras en la filosfera, requiere el uso de los
nutrientes y el espacio disponibles para su pronta proliferación, reduciendo así estos factores
críticos para el crecimiento y desarrollo del patógeno, la incidencia de la infección y el
establecimiento del patógeno en los tejidos de las frutas y vegetales (Droby et al., 1999).
Algunos reportes acerca de la competencia por espacio por parte de levaduras, mencionan
que éstas son efectivas colonizadoras de la superficie de plantas y destacan la producción
de materiales extracelulares (en especial polisacáridos) que restringen el espacio para la
colonización de otros microorganismos (Janisiewicz & Korsten, 2002).
Por otro lado, la germinación de las esporas fúngicas sobre la filosfera es una etapa crítica
en el desarrollo de la interfase hospedero-patógeno, y es un momento en el cual el patógeno
es a menudo muy vulnerable. Por ejemplo, la germinación de las esporas del hongo
fitopatógeno Botrytis spp. es inhibida sobre la superficie de las hojas por bacterias y
levaduras. La inhibición es reducida o eliminada al suministrar nutrientes exógenos,
especialmente azúcares y aminoácidos, lo que indica que la competencia por nutrientes es
un modo de acción empleado por estos organismos (Campbell, 1989).
45
• Interacción directa
La acción que puede ejercer el biocontrolador sobre el patógeno se debe a una necesidad
de crecimiento; existen reportes de la acción de levaduras sobre patógenos, las cuales
provocan la desintegración de las paredes celulares de éstos. Tal es el caso de la levadura
antagonista Pichia guillermondii para el control de Penicillium italicum en cítricos, como
también la lisis de las hifas de B. cinerea por β-1,3 glucanasas producidas por esta misma
levadura en la postcosecha de manzanas (Arras et al., 1998; Wisniewski et al., 1991 citados
por Janisiewicz & Korsten, 2002).
Jijakli & Lepoivre (1998) y Gravese et al. (1998) demostraron que la levadura Pichia anomala
cepa K, es efectiva en el control del moho gris en manzanas, al incrementar tres veces la
producción de exo-,β-1,3 glucanasa en presencia de preparados de pared celular de B.
cinerea en heridas hechas en manzanas, reduciendo el tamaño de la lesión a más de la
mitad comparado con el antagonista sin la presencia del patógeno, lo que sugiere que esta
enzima esta involucrada en el biocontrol del moho gris (citados por Janisiewicz & Korsten,
2002).
2.7.2. Generalidades de las levaduras
Las levaduras son hongos unicelulares durante todo o parte de su ciclo de vida, las células
tienen forma esférica, ovalada o alargada. La longitud de las levaduras varia entre 2 a 50
micras dependiendo del tipo de célula. Su ancho es menos variable y fluctúa entre 1 a 10
micras por 5 a 10 micrómetros. Las microestructuras de una célula de levadura están
conformadas básicamente por la pared celular, membrana citoplasmática, núcleo, varias
vacuolas, mitocondrias, glóbulos grasos, volutina o cuerpos polifosfatados y el citoplasma
(Cevallos, 1973 citado por Gutiérrez, 2001).
Los principales componentes de la pared celular de las levaduras son (1→3)-β-D-glucano
(50%) que también contiene algunos enlaces (1→6)-β- (5%); manoproteína, de la cual la
mayor cantidad son carbohidratos; (1→6)-β-D-glucano, que también contiene algunos
enlaces (1→3)-β- (14%), es un constituyente relativamente menor (15%); y quitina (0.6 a
9%) esta presente aún en un bajo nivel (Fleet, 1991; Kollár et al., 1995 citado por Santos et
al., 2000). Las diferencias en la estructura de su pared celular permite clasificarlas en
ascomicetas o basidiomicetas (Kurtzman & Fell, 1999).
46
Las levaduras se reproducen asexualmente, ya sea por gemación o fisión. En cuanto a la
primera forma de reproducción, el protoplasma de la célula se encuentra cubierto por una
membrana delgada, la cual empuja la pared de la célula para formar una yema que va dar
origen a una célula hija. Esta yema crece hasta dar estrangulamiento a la base; la célula hija
puede a su vez, producir una yema mientras esta adherida a la célula madre, formando así
una cadena de células. Durante este proceso, el núcleo se divide y uno pasa a la yema,
mientras que el otro permanece en la célula madre. En el caso de la fisión, la célula madre
se alarga, el núcleo se divide y ocurre por estrangulamiento una simple partición de la pared
celular (Alexopoulos et al., 1996). También pueden reproducirse sexualmente por medio de
la formación de ascosporas o basidiosporas (Kurtzman & Fell, 1999).
Las levaduras son organismos cosmopolitas, se pueden encontrar en climas húmedos y
secos, en los templados, cálidos y fríos. Pueden ser recuperadas del aire, tanto del agua
marina y agua dulce y del suelo. Usualmente crecen alrededor de un amplio rango de
valores de pH, permitiendo que puedan colonizar lugares donde haya ocurrido actividad
fermentativa por parte de bacterias. La máxima temperatura de crecimiento es de 45 a 48ºC
observado en especies de levaduras que habitan el tracto intestinal de animales y del
hombre. También su hábitat puede ser a menudo rico en fuentes simples de carbono
orgánico, líquido o con una humedad alta, ácido u ocasionalmente alcalino, nutricionalmente
complejo, tales condiciones las puede proveer tejidos de plantas, restos vegetales, exudados
de raíces, hojas o flores entre otros (Kurtzman & Fell, 1999).
El género Pichia se reproduce asexualmente por brotación multilateral sobre una base
angosta. Algunas especies pueden formar artroconidias. Las células son esféricas,
elipsoidales o elongadas y ocasionalmente pueden ser afiladas. Algunas especies pueden
producir pseudohifas e hifas verdaderas (Kurtzman & Fell, 1999).
Los ascos pueden producir una a cuatro ascosporas que tienen forma saliente de sombrero,
hemiesferoidales o esferoidales. Generalmente los ascos son delicuescentes, pero
ocasionalmente son persistentes. Las especies son homotálicas o heterotálicas (Kurtzman &
Fell, 1999).
47
2.7.2.1. Taxonomía y características de Pichia onychis ( Lv 027)
REINO Fungi
DIVISIÓN Eumycota
SUBDIVISIÓN Ascomycotina
CLASE Ascomycetes
SUBCLASE Hemiascomycetidae
ORDEN Endomycetales
FAMILIA Saccharomycetales
GÉNERO Pichia
ESPECIE Pichia onychis
(Kurtzman & Fell, 1999)
Las células de P. onychis son ovoides con un tamaño aproximado de 2 µm a 4.5 µm de
ancho y 2.8 µm a 7.8 µm de largo (Figura 1). Pueden encontrarse individualmente o en
parejas. Las colonias son de tamaño pequeño, de color beige y de aspecto brillante
(Figura 2). Es posible observar la presencia de pseudomicelio simple o escasamente
ramificado, pero esta especie nunca forma un micelio verdadero (Kurtzman & Fell, 1999).
Figura 1. Características microscópicas de
Pichia onychis (Lv 027) (Fuente: autor)
Figura 2. Características macroscópicas de
Pichia onychis (Lv 027) (Fuente: autor)
La reproducción sexual ocurre por ascas. Las ascas no son conjugadas y producen de una a
cuatro ascosporas en forma de sombrero, éstas son liberadas rápidamente después de su
formación. La formación de ascosporas puede observarse en agar extracto de malta al 5%,
Agar YM o Agar V8 tras 10 días de incubación a 25ºC. No se ha determinado si esta especie
48
es heterotálica u homotálica. La reproducción vegetativa ocurre por la formación de brotes
multilaterales (Kurtzman & Fell, 1999).
P. onychis se caracteriza por fermentar azúcares como la glucosa y la sacarosa, y asimilar
otros como la maltosa, la celobiosa, la trehalosa, la rafinosa, la D-xilosa, también puede
asimilar otros compuestos como el glicerol y el etanol, así como el gluconato, el lactato, el
citrato y el succinato (Kurtzman & Fell, 1999).
2.7.3. BIOPLAGUICIDAS COMERCIALES A BASE DE LEVADUR AS
Productos a base de levaduras como Aspire®, cuyo principio activo es la cepa Candida
oleophila I-182 (Ecogen, Langhorme, PA) y Yield plus® a base de Cryptococcus albidus
(Anchor Yeast, Cape Town, South Africa) se encuentran comercialmente disponibles para el
biocontrol de mohos en frutas como manzanas y cítricos en postcosecha (Druvefors et al.,
2005).
Aspire® es quizá el producto más importante a base de levaduras para el control de
enfermedades en postcosecha, por ser el primero de esta clase en obtener un registro
comercial y de venta. De acuerdo a la EPA (2000), la levadura Candida oleophila I-182,
inhibe el crecimiento de hongos cuando es aplicada después de la cosecha y puede ser
utilizado en frutas, vegetales, plantas de invernadero y ornamentales. Estudios demostraron
que no es tóxica ó patógena para los animales y que no causa ningún efecto adverso.
Recientemente se han desarrollado productos a base de levaduras con la adición de
sustancias bioactivas. Tal es el caso dos productos denominados Bio-Coat®, resultado de la
mezcla de Candida saitoana con sales de quitosan y Biocure®, una mezcla de C. saitoana
con enzimas líticas para el control de pudrición causada P. expansum, B. cinerea y P.
digitatum en manzanas, naranjas y limones. Estas formulaciones son novedosas porque
combinan las propiedades antifúngicas de las sales de quitosan y las enzimas líticas con la
actividad biocontroladora de la levadura (El Ghaouth et al, 2001 citado por García, 2002).
También ha sido desarrollado un producto denominado Sporodex-L® cuyo ingrediente activo
es levadura Pseudozyma flocculosa cepa PF-A22 UL para el control de mildeo polvoso en
rosa y pepino cultivados bajo invernadero. Este producto ha sido evaluado
49
conjuntamente por Health Canada’s Pest Management Regulatory Agency (PMRA) y U.S.
Environmental Protection Agency (EPA), determinando que este producto es de bajo riesgo
para la salud humana (EPA, 2002).
Shemer® (AgroGreen, Minrav Group, Israel) es un producto registrado para su uso en Israel.
Su principio activo es la levadura recientemente identificada como Metschnikowia fructicola,
siendo efectivo contra un amplio rango de patógenos de frutas como uvas, fresas y batatas
(Elmer & Reglinski, 2006).
2.8. PATÓGENOS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
Se conocen más de 100.000 especies de hongos que son estrictamente saprofitos, los
cuales se desarrollan en la materia orgánica muerta. Más de 10.000 especies de hongos
causan enfermedad en plantas. Todas las plantas son atacadas por algunas clases de
hongos y cada hongo parásito puede atacar una o varias clases de plantas (Agrios, 2005).
Existe una gran cantidad de hongos que afectan a las partes aéreas de los vegetales.
Patógenos biotróficos o parásitos obligados como los mildeos polvosos y patógenos
necrótrofos como Botrytis cinerea Pers.:Fr, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, y
Cladosporium fulvum son causantes de enfermedad en numerosos cultivos de hortalizas y
frutales (Elad et al., 2000).
2.8.1. Generalidades de Botrytis cinerea
Las enfermedades producidas por el género Botrytis son probablemente las más comunes y
ampliamente distribuidas en hortalizas, plantas ornamentales y frutales cultivados en campo
o en invernadero alrededor del mundo. Estas enfermedades aparecen en forma de tizones
de inflorescencias y pudriciones del fruto, pero también como pudriciones del tallo,
ahogamiento de las plántulas, manchas foliares, pudriciones de tubérculos, bulbos y raíces
(Agrios, 2005).
Botrytis cinerea Pers.: Fr (forma teleomorfa: Botryotinia fuckeliana), agente causal del moho
gris, infecta más de 200 especies vegetales, generando importantes pérdidas económicas
antes y después de la cosecha, puesto que el patógeno puede atacar el cultivo en cualquier
estado de desarrollo del mismo (Jarvis, 1977).
50
B. cinerea es un hongo cosmopolita que se desarrolla como saprófito sobre materia orgánica
muerta o material herbáceo en proceso de descomposición o como patógeno sobre plantas
vivas (Agrios, 1996). Las bajas temperaturas y altas humedades relativas, son factores que
favorecen la germinación de los conidios y el crecimiento del micelio, conllevando a la
infección de B. cinerea en las partes susceptibles de las plantas. Las temperaturas óptimas
para la infección de este hongo se encuentran entre 10ºC y 25ºC (Jarvis, 1977).
Por otro lado, los esclerocios de B. cinerea pueden ser considerados estructuras
importantes, ya que son los responsables de la supervivencia del patógeno cuando las
condiciones del medio ambiente son adversas. La formación de los esclerocios está
influenciada por la temperatura, la luz, el pH y la nutrición. Hay tres pasos fundamentales
para su formación: iniciación, desarrollo y maduración, siendo prerrequisito que haya una
gran cantidad de hifas aglomeradas (Jarvis, 1977)
2.8.2. Taxonomía y características de Botrytis cinerea
REINO Fungi
DIVISIÓN Ascomycota
CLASE Ascomycetes
SUBCLASE Leotiomycetidae
ORDEN Heliotiales
FAMILIA Sclerotiniaceae
GENERO Botrytis
ESPECIE Botrytis cinerea
(NCBI, 2007)
Los conidióforos de B. cinerea se pueden encontrar solos o agrupados. Los conidios se
encuentran en forma de racimo, más o menos rectos en la zona apical, son de color café
claro en la zona del ápice. La ultima agrupación de conidióforos está integrada a las células
terminales conidiogénicas, encontrándose hinchada en forma cilíndrica, esférica o
subesférica, holoblástica o poliblástica e hialina. Los conidios son lisos y pegados por un fino
dientecillo, se encuentran solos o aglomerados, son casi hialinos, no se encuentran septados
u ocasionalmente se encuentran 1-2 septados en un cultivo siendo de forma ovalada, elíptica
o globosa. En masas los conidios se pueden observar de color café (Jarvis, 1977).
51
En medios de cultivo, B. cinerea presenta colonias esparcidas inicialmente blancas que con
el tiempo se tornan grises polvosas, micelio inmerso o superficial, las hifas son ramificadas,
septadas y hialinas. Forma esclerocios tanto en sustratos naturales como artificiales,
necesita de la exposición a la luz del día o radiación UV para esporular (Pardo, 1995; Ellis et
al., 1991 citado por Zapata, 2003).
Figura 3. Características microscópicas de
Botrytis cinerea (Bo 006) (Fuente: autor)
Figura 4. Características macroscópicas de
Botrytis cinerea (Bo 006) (Fuente: autor)
2.8.3. Ciclo de la enfermedad
B. cinerea es un parásito facultativo en numerosas especies de plantas comerciales y
malezas, sobreviviendo como saprófito en residuos de plantas. Este hongo inverna en forma
de esclerocios o micelio sobre los restos de plantas en descomposición o en estructuras
senescentes o muertas de la planta (Agrios, 2005).
La mayoría de infecciones se inician a partir del micelio que crece saprofiticamente contiguo
al material vegetal o de conidios entre el material vegetal y la superficie del fruto. Los
conidios se desarrollan a partir de los esclerocios en los tallos y micelio presentes en las
hojas muertas y frutos momificados, siendo éstas las fuentes más importantes de inóculo
(Jarvis, 1977).
Los conidios tienen la capacidad de permanecer sobre la superficie de la planta sin penetrar
efectivamente el tejido del hospedero. Esto se denomina residencia en el filoplano. En esta
fase puede permanecer hasta que se presenten las condiciones ambientales propicias
52
o hasta que el tejido entre en una etapa susceptible (envejeciendo o muriendo). Los conidios
expuestos a las superficies secas no germinan rápidamente o simplemente no lo hacen, por
el contrario, aquellos que se encuentran en una superficie saturada de agua germinan
fácilmente. (Jarvis, 1977).
Las esporas de B. cinerea pueden ser producidas sobre cualquier material vegetal y
transportadas a grandes distancias por corrientes de aire (Jarvis, 1977). Una vez que el
conidio ha alcanzado la superficie del hospedero inicia el ciclo de infección que puede
considerarse dividido en varias fases (Benito et al, 2000):
1. Adhesión y germinación de los conidios sobre la superficie del hospedero.
2. Penetración en el tejido vegetal, bien a través de heridas o aberturas naturales, bien
directamente por la participación de distintas actividades enzimáticas o mediante la
participación de diversos procesos mecánicos (incluyendo la diferenciación de
estructuras de penetración en algunos sistemas).
La infección de los tejidos de la planta por el patógeno requiere la expresión coordinada
de una serie de enzimas que degradan la capa protectora de las células vegetales de las
superficies. Estas incluyen cutinasas, exo y endo poligalacturonasas, pectin-
metilesterasas, celulasas, β-glucosidasas, xilanasas, arabinasas, β-galactosidasas,
β-manosidasas, α-galactosidasas. La acción de estas enzimas permite degradar la
cutina y las paredes celulares del hospedero (Saligkarias et al., 2002a)
3. Establecimiento del patógeno en la zona de penetración, determinando la muerte de las
células adyacentes al punto de penetración y dando lugar a la formación de una lesión
primaria como consecuencia de la expresión de los mecanismos de defensa de la
planta.
4. En muchos casos se inicia entonces una fase de latencia durante la cual los
mecanismos de defensa de la planta parecen controlar el patógeno que permanece
localizado en áreas de necrosis correspondientes a las lesiones primarias.
53
5. Transcurrido un tiempo, el patógeno es capaz de vencer las barreras defensivas de la
planta en algunas lesiones primarias e inicia su diseminación en el tejido vegetal
circundante, determinando la colonización y maceración del tejido infectado en un breve
período de tiempo. El patógeno produce una nueva generación de conidios sobre el
tejido infectado, los cuales pueden iniciar un nuevo ciclo de infección.
El hongo se establece en los pétalos de la flor, los cuales son particularmente susceptibles
cuando comienzan a envejecer y ahí produce abundante micelio. Cuando el clima es
húmedo y fresco, el micelio del hongo produce numerosos conidios que ocasionan más
infecciones, pero el micelio también se desarrolla, penetra e invade el resto de la
inflorescencia, la cual se llena y cubre con un intrincado moho de color gris blanquecino o
café claro (Agrios, 2005).
Posteriormente el hongo avanza hacía el pedicelo, el cual se pudre y permite que las yemas
y las flores cuelguen. En caso de que algún fruto llegue a desarrollarse, el hongo se propaga
entre los pétalos hacia los frutos verdes o maduros y ocasiona la pudrición basal de los
frutos que entran en contacto con los que no han sido infectados. Los frutos infectados y los
tallos se ablandan y se vuelven húmedos, y más tarde los tejidos que han sido invadidos
adquieren un color café claro (Figura 5). Conforme se pudren los tejidos, la epidermis del
fruto se rompe y el hongo produce numerosos cuerpos fructíferos. Entonces, los tejidos se
arrugan y deshidratan y el hongo produce esclerocios de color negro sobre la superficie o
hundidos en el tejido (Agrios, 2005).
Figura 5. Lesiones características de Botrytis cinerea sobre las hojas (a), los tallos (b) y los frutos (c) en
plantas de tomate. Fuente: www.inta.gov.ar
a b c
54
2.8.4. MÉTODOS DE CONTROL
Cuando las condiciones de desarrollo de la enfermedad son favorables el control de Botrytis
es complicado debido a que tiene una rápida germinación, una elevada tasa de infección y
un rápido crecimiento (Forero de La Rotta, 2001).
2.8.4.1. Control cultural
Este es uno de los aspectos más importantes para el control de B. cinerea. Algunas
prácticas culturales involucran retirar restos de cultivo y plantas afectadas por la enfermedad,
realizando podas de tejidos senescentes o enfermos. Esto con el fin de no dejar estructuras
que permiten el desarrollo del parásito. Realizar solarización como medida efectiva para el
control de esclerocios. Controlar los niveles de nitrógeno en el suelo, ya que niveles
elevados favorecen el desarrollo de la enfermedad (Forero de La Rotta, 2001).
2.8.4.2. Control químico
Este método de control se basa en el uso de fungicidas. El control químico de B. cinerea en
precosecha se ha realizado de forma convencional, desde el inicio del cultivo y durante todo
el proceso de desarrollo de la planta; sin embargo, no existen productos químicos que
erradiquen la enfermedad (Forero de La Rotta, 2001).
Este tipo de control se realiza mediante el uso de fungicidas protectantes como el Captán,
Iprodion (3-(3,5-diclorofenil)-N-isopropil-2,4.dioxomidazolin-1-carboximida), y Vinclozolín (3-
(3,5-doclorofenil)-5-metil-5-viniloxazolina-2-4diona); fungicidas sistémicos como el benomilo
(metil 1-(butilcarbamoil)-2 bencimidazol) y triazoles, y fungicidas de amplio espectro como el
Clorotalonil (tretacloroisoftalonitrilo) (Agrios, 2005).
Sin embargo, el uso extendido de fungicidas químicos para prevenir o eliminar el moho gris
ha provocado la aparición de cepas altamente resistentes en poblaciones de B. cinerea, las
cuales desarrollan rápidamente resistencia a benzimidazoles y dicarboximidas. Por otro lado
ha causado la contaminación de aguas y suelos (Bollen, 1971 citado por Aleu et al., 2002).
55
Aunque el uso de los productos químicos tiene la ventaja de combatir diferentes
enfermedades con una sola aplicación, también atacan multitud de componentes de la
microflora natural, estableciendo desequilibrios en la misma, eliminando posibles agentes
antagonistas y favoreciendo ciertas irregularidades en las poblaciones fúngicas (Llácer et al.,
2000).
2.8.4.3. Control biológico
El uso de microorganismos antagonistas para el control de B. cinerea ha demostrado
resultados eficientes. Diferentes investigaciones hacen referencia a bacterias del género
Bacillus y Pseudomonas, hongos filamentosos como Clonostachys rosea, Trichoderma
harzianum T-39 y Ulocladium atrum (Berto et al., 2001) y levaduras epifíticas como Candida
sake, Galactomyces geotrichum, Trichosporium pullulans, Candida pulcherrima y
Aureobasidium pullulans, como antagonistas capaces de colonizar heridas causadas por B.
cinerea en plantas de tomate (Cook et al, 1997 citado por Saligkarias et al, 2002a). También
se ha reportado que las levaduras Pichia guillermondii, Rhodotorula glutinis y Criptococcus
albidus son potencialmente biocontroladoras en el control de este patógeno en postcosecha
(Janisiewicz & Korsten, 2002).
Entre los productos formulados a base de microorganismos antagonistas que se encuentran
disponibles comercialmente para el control de B. cinerea en campo, se encuentran:
Trichodex ® cuyo principio activo es T. harzianum (T-39); Binap TF. WP®, que tiene como
principio activo Trichoderma Harzianum y Trichoderma polysporum; Glio mix® con
Gliocladium spp. como principio activo; Poligandron®, a base del hongo Pythium oligandrum;
Primastop®, cuyo principio activo es el hongo Gliocladium catenulatum (Moyano et al., 2003
citado por Zapata 2003). Productos a base de levaduras como Bio-Coat®, Biocure®,
Shemer®, anteriormente descritos y Saccharopulvin 25 PU, cuyo principio activo es
Saccharomyces chevalieri; y productos a base de bacterias como Serenade (Agra Quest,
USA) (Elmer & Reglinski, 2006).
56
3. JUSTIFICACIÓN
En el Laboratorio de Control Biológico del Centro de Biotecnología y Bioindustrias de
CORPOICA, cuya misión es desarrollar bioplaguicidas microbianos, se han realizado
investigaciones en el tema de fotoestabilización de agentes de control biológico.
En este mismo lugar, desde el año 1999 se han venido realizando trabajos para desarrollar
bioplaguicidas a base de levaduras, a partir de aislamientos nativos provenientes de la
rizosfera de cebolla de bulbo. Se seleccionaron los aislamientos de la levadura Pichia
onychis codificados como Lv 027, Lv 006 y Lv 031, por producir niveles de protección
superiores al 85% contra Botrytis allí en cebolla de bulbo, tanto a 5ºC como a 20ºC (Jiménez
& Neisa, 1999). Al evaluar la actividad biocontroladora de estos aislamientos de levaduras
contra Alternaria alternata en la postcosecha de tomate, el aislamiento Lv 027 presentó los
mayores porcentajes de protección de 90.3% y del 75.6% a temperaturas de 6ºC y 17ºC
respectivamente (Fuentes, 2001). El aislamiento Lv 027 también fue seleccionado por García
(1999) por presentar porcentajes de protección superiores al 85% contra Rhizopus stolonifer
en frutos de tomate a temperaturas de 6ºC y 17ºC.
Desde el punto de vista tecnológico, el Laboratorio de Control Biológico ha desarrollado dos
prototipos de formulaciones a base de la levadura P. onychis (Lv 027): un
concentrado emulsionable y un granulado dispersable. Estos prototipos se diseñaron para
ser usados en la poscosecha de frutas y fueron evaluados para el control de Rhizopus
stolonifer en la poscosecha de frutos de tomate (Cotes & García, 2000; Gutiérrez, 2001;
Higuera, 2003).
El primer prototipo consiste en un concentrado emulsionable que debe ser reconstituido en
agua para posteriormente sumergir los frutos de tomate por un tiempo de 5 minutos en la
emulsión resultante. La formulación es elaborada a base de aceites vegetales, viscosantes y
tensoactivos junto con el principio activo que consiste en células de la levadura P. onychis
(Lv 027). Gutiérrez (2001) evaluó la actividad biocontroladora de dicha formulación,
encontrando niveles de protección del 93.3% a temperatura de refrigeración y del 93.6% a
temperatura ambiente cuando se uso la formulación inmediatamente después de ser
elaborada. Sin embargo, los niveles de protección cuando se uso la formulación luego de ser
almacenada durante cinco meses, fueron menores al 85% a temperatura de refrigeración y
57
ambiente. En cuanto a la estabilidad de la viabilidad durante cinco meses de
almacenamiento, ésta se mantuvo en 92.2% a temperatura de refrigeración (8ºC), en 90% a
temperatura ambiente (17ºC) y en 85.6% a temperatura de 27ºC. Estos resultados mostraron
que no se presentó una pérdida significativa de la viabilidad durante el almacenamiento, pero
si se produjo una pérdida de la actividad biocontroladora, posiblemente debida al efecto
negativo de la combinación de excipientes o de alguno de los procesos involucrados en la
formulación.
El segundo prototipo consiste en un granulado dispersable para ser reconstituido en agua,
elaborado mediante la mezcla del principio activo con diferentes excipientes inertes como
desintegrantes, diluentes y suspensores. De acuerdo con el estudio realizado por Higuera
(2003), este preformulado presentó un porcentaje de protección del 73% y su actividad
biocontroladora se mantuvo estable durante seis meses de almacenamiento. Estos
resultados sugirieron que la actividad biocontroladora no fue afectada por el tiempo de
almacenamiento ni por los excipientes utilizados en la formulación.
En el año 2004, este prototipo de granulado dispersable fue evaluado para el control de
Alternaria dauci en un cultivo de cilantro bajo condiciones de campo, realizando aplicaciones
foliares cada semana hasta diez días antes de la cosecha. Con este tratamiento se logró una
reducción considerable de la incidencia de la enfermedad y se obtuvó un nivel de
protección del 82%. Este resultado sugiere el potencial uso de este prototipo para prevenir
infecciones por fitopatógenos en la precosecha de frutas y hortalizas que son producidas a
nivel comercial (Villamizar et al. 2004).
La eficacia de un bioplaguicida depende altamente de la persistencia del agente de control
biológico y de su actividad bajo condiciones de campo; sin embargo, la fotosensibilidad de
los agentes de biocontrol a la radiación solar ha sido reconocido como el principal factor
medioambiental responsable de su pobre desempeño y baja actividad residual en campo
(Cohen et al., 2003).
La radiación solar es un componente importante en el ambiente físico de la filosfera.
Aproximadamente el 3.2% de la energía total de la radiación solar está dentro del rango de
longitudes de onda de la radiación ultravioleta (Jacobs & Sundin, 1999). Entre los efectos
que puede ocasionar la exposición a la radiación ultravioleta se encuentra el daño directo al
58
DNA, creando el rompimiento de hebras o el entrecruzamiento entre bases, lo cual puede
bloquear la síntesis normal de DNA y generar altos niveles de mutaciones. Por otro lado,
puede provocar la producción de radicales altamente reactivos y deletéreos. Como resultado
de ambos efectos se obtiene la reducción en la estabilidad del microorganismo, limitando
notablemente su actividad biocontroladora (Edgington et al., 2000).
La formulación del prototipo granulado dispersable a base de la levadura P. onychis (Lv 027)
no cuenta con agentes que le provean protección frente a las condiciones ambientales
limitantes a las que se verá expuesto si se utiliza bajo condiciones de campo, como la
radiación solar. Por tal razón, surge la necesidad de optimizar la formulación incluyendo en
ésta agentes fotoprotectores, así como otros aditivos que estabilicen el microorganismo y
permitan obtener resultados de control más eficientes.
59
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar y seleccionar auxiliares de formulación para la fotoestabilización de la levadura
Pichia onychis frente a la radiación ultravioleta.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Seleccionar auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora compatibles
con la levadura Pichia onychis.
• Determinar el efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados
frente a la radiación ultravioleta monocromática.
• Evaluar el efecto de la radiación ultravioleta sobre la actividad biocontroladora de la
levadura fotoestabilizada.
60
5. MATERIALES Y MÉTODOS
El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Control Biológico del Centro de
Biotecnología y Bioindustrias de CORPOICA (Corporación Colombiana de Investigación
Agropecuaria), ubicado en el Centro de Investigación Tibaitatá.
5.1. Recuperación del microorganismo biocontrolador
El aislamiento de la levadura Pichia onychis codificado como Lv 027, fue proporcionado por
el Banco de Germoplasma de Microorganismos con Interés en Control Biológico (Laboratorio
de Control Biológico, CORPOICA). Es un aislamiento proveniente de la rizosfera de cebolla
de bulbo y fue seleccionado por su alta actividad biocontroladora contra Botrytis alli en
cebolla de bulbo (Jiménez & Neisa, 1999) y contra Rhizopus stolonifer y Alternaria alternata
en frutos de tomate (García, 2001; Fuentes, 2001).
El aislamiento P. onychis (Lv027) se recuperó en medio de cultivo YM y posteriormente fue
crioconservado para conformar una colección de trabajo. Para esto se preparó una
suspensión de la levadura de 24 horas de edad en una solución crioprotectante (glicerol 10%
v/v, peptona 0.1% p/v) estéril. En condiciones de asepsia se adicionaron en un tubo
ependorff 1.5 ml de la suspensión. Los viales fueron debidamente marcados y almacenados
en un ultracongelador a una temperatura de -70ºC.
5.2. Recuperación del microorganismo fitopatógeno
El aislamiento identificado como Botrytis cinerea codificado como Bo 006, fue proporcionado
por el Banco de Germoplasma de Microorganismos con Interés en Control Biológico
(Laboratorio de Control Biológico, CORPOICA). Es un aislamiento proveniente de hojas
vivas de plantas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) realizado en el municipio de
Mosquera (Cundinamarca).
El aislamiento Bo 006 se recuperó en medio de cultivo PDA y posteriormente se reactivó en
segmentos de tallo de plantas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) tipo milano híbrido
Rocío®. Los segmentos de tallo de aproximadamente 5 cm de largo, se inocularon con el
patógeno y fueron colocados en una cámara húmeda a temperatura ambiente y en oscuridad
61
por aproximadamente diez días. A partir de su crecimiento y esporulación sobre los
segmentos de tallo de tomate, este aislamiento se purificó mediante sucesivos pases en
medio de cultivo PDA.
5.3. Evaluación de la compatibilidad de la levadura Pichia onychis (Lv027) con
auxiliares de formulación con capacidad fotoestabil izadora
Se preparó una suspensión de la levadura ajustada a una concentración de 5x107
células.mL-1 a partir de un cultivo de P. onychis (Lv 027) en medio de cultivo YM incubado a
una temperatura de 28ºC ± 1ºC durante 48 horas. Se inoculó 1 mL de la suspensión en 50
mL de medio YM líquido en un erlenmeyer de 100 mL. Se evaluaron las sustancias
fotoestabilizadoras codificadas como UV 03, UV 05, UV 06, UV 07, UV 08, UV 09, UV 10 y
UV 11, cada una correspondiente a un tratamiento. Estas se adicionaron previamente al
medio de cultivo al 0.5% (p/v), concentración recomendada en la industria farmacéutica para
el uso de filtros ultravioleta (Boylan et al., 1986). También se incluyó un control que consistió
en medio YM líquido sin adición de sustancia fotoestabilizadora. Posteriormente, los
erlenmeyers se colocaron en agitación a 110 r.p.m., a una temperatura de 25ºC por 96
horas.
Para determinar la compatibilidad de la levadura P. onychis (Lv 027) con las sustancias con
capacidad fotoestabilizadora, se evaluó la concentración de células.mL-1 mediante conteo en
cámara de Neubauer. Este conteo se llevó a cabo a las 48 y 96 horas post-inoculación,
realizando diluciones seriadas en tubos de ensayo con 9 mL de solución de Tween 80 al
0.1% (v/v).
Con los resultados obtenidos se analizó el crecimiento de la levadura P. onychis (Lv027)
para cada tratamiento, con el fin de evidenciar algún efecto tóxico de los auxiliares de
formulación con capacidad fotoestabilizadora evaluados. El diseño experimental tuvo un
arreglo completamente al azar con medidas repetidas en el tiempo. Para cada tratamiento se
realizaron tres repeticiones. Los resultados de concentración de células por mililitro a los
tiempos 48 y 96 horas de incubación se sometieron a un análisis de varianza (ANAVA) y se
realizó una prueba de comparación de medias de Tukey (α=0.05) usando el programa
Statistix versión 3.0. A partir de este análisis se seleccionaron las sustancias
fotoestabilizadoras compatibles con la levadura.
62
5.4. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación
seleccionados frente a la radiación ultravioleta mo nocromática.
Esta prueba fue realizada siguiendo la metodología descrita en el protocolo de valoración del
efecto de la exposición a luz ultravioleta sobre la viabilidad de aislamientos de levaduras,
estandarizada por el Laboratorio de Control Biológico del Centro de Biotecnología y
Bioindustrias de CORPOICA.
A partir de un cultivo de la levadura en medio YM incubado a una temperatura de 28ºC ± 1ºC
durante 48 horas, se preparó una suspensión en 10 mL de solución de Tween 80 al 0.1%
(v/v). La concentración de esta suspensión se determinó mediante recuento en cámara de
Neubauer y se ajustó a 2.5 x 106 células.mL-1. A partir de esta suspensión se realizaron tres
diluciones seriadas en solución estéril de Tween 80 al 0.1% (v/v) que contenía la sustancia
fotoestabilizadora por evaluar en una concentración de 0.5% (p/v).
Las sustancias fotoestabilizadoras evaluadas fueron aquellas seleccionadas a partir de los
resultados obtenidos en la prueba de compatibilidad con la levadura P. onychis (Lv 027)
descrita anteriormente. Cada una de estas sustancias correspondió a un tratamiento y se
usó como control una suspensión de levadura fresca en solución de Tween 80 al 0.1% (v/v)
sin adición de alguna sustancia fotoprotectora.
En cada caja de Petri con medio de cultivo YM dividida en cuatro partes, la dilución 10-2 se
inoculó en dos cuadrantes, tomando alícuotas de 10 µL y e inoculando cinco gotas por
cuadrante. En los dos cuadrantes restantes se inoculó de la misma forma la dilución 10-3 del
mismo tratamiento (Figura 6). El diseño experimental tuvo un arreglo completamente al azar
con una repetición en el tiempo. La unidad experimental consistió en una caja de Petri por
tratamiento (sustancia fotoestabilizadora), incluyendo un control (levadura fresca sin la
adición de alguna sustancia fotoestabilizadora) y por cada tiempo de exposición a la
radiación ultravioleta.
Las cajas inoculadas se dejaron en reposo por 15 minutos, hasta que el inóculo se seco
sobre el agar. Las cajas de Petri inoculadas fueron expuestas a 20 cm de la fuente de
emisión artificial de radiación ultravioleta durante diferentes tiempos de exposición. Se
empleó una lámpara de luz ultravioleta monocromática (3UV-38 Series) que emite tres
longitudes de onda: 254 nm, 302 nm, 365 nm.
63
Se evaluó el efecto de los tres tipos de radiación ultravioleta: UV A (365 nm); UV B (302 nm)
y UV C (254 nm). Los tiempos de exposición evaluados fueron: un minuto, cinco minutos y
diez minutos. Se incluyó un tiempo cero o de no exposición a la radiación ultravioleta para
cada uno de los tratamientos y el control.
Una vez finalizada la exposición, se colocó la tapa a cada caja de Petri y se protegieron de la
luz con papel aluminio. Todas las cajas fueron incubadas a una temperatura de 28ºC ± 1ºC
durante 48 horas en condiciones de oscuridad.
Terminada la incubación, se contó el número de colonias formadas en cada uno de los cinco
puntos de inoculación en cada cuadrante (cada gota), seleccionando la dilución donde se
observó la formación de colonias de forma definida en un rango de 10 a 30 UFC por punto.
Con los resultados del conteo de colonias se determinó el número de UFC.mL-1 en la dilución
inicial. También se calculó un porcentaje de viabilidad remanente de la levadura,
considerando la viabilidad obtenida al tiempo cero de exposición para cada tratamiento, el
100% para esta variable. Los datos obtenidos se sometieron a un análisis de varianza
(ANAVA) y a una prueba de comparación múltiple de medias de Tukey (α=0.05), empleando
el programa Statistix versión 3.0.
Figura 6. Esquema de inoculación por cuadrantes en medio de cultivo YM por tratamiento y control
para cada tiempo de exposición evaluado.
64
5.5. Efecto de la radiación ultravioleta sobre la a ctividad biocontroladora de la
levadura Pichia onychis (Lv 027) fotoestabilizada.
De acuerdo con los resultados obtenidos de la prueba descrita anteriormente, se seleccionó
una sustancia fotoestabilizadora entre las evaluadas, por su efecto fotoestabilizador frente a
la radiación ultravioleta tipo UV A, UV B y UV C. Posteriormente se evaluó el efecto de la
radiación ultravioleta tipo B sobre la actividad biocontroladora de la levadura fotoestabilizada
con esta sustancia, usando como modelo experimental segmentos de tallo de plantas de
tomate, siguiendo el procedimiento descrito por O´Neill et al. (1996), citado por Moreno
(2003).
5.5.1. Material vegetal
El material vegetal utilizado provino de un cultivo de tomate (L. esculentum) tipo milano
híbrido Rocío® establecido en CORPOICA. Este tomate es susceptible a las enfermedades
más frecuentes que ocurren durante la producción. Las “plantas madre” (origen de los
segmentos de tallo por inocular) recibieron fertilización, riego y tutorado. No se aplicó ningún
fungicida al cultivo.
Se colectaron brotes secundarios de 50 cm de largo. De estos tallos se eliminaron 10 cm del
ápice y el resto se cortó en secciones de 5 cm de largo. Estos segmentos se insertaron
verticalmente en cubos de icopor (10 cm * 10 cm * 2 cm) con la parte más joven hacia arriba.
Cada cubo de icopor tenía diez segmentos de tallo de diferente edad. Después de efectuar
las inoculaciones del biocontrolador y/o del patógeno, cada cubo se colocó en una cámara
húmeda que consistió en un recipiente plástico transparente (24 cm * 24 cm * 10 cm) con
dos capas de papel absorbente en el fondo, humedecido con agua destilada estéril. Las
cámaras húmedas se situaron sobre estantes en un cuarto oscuro con temperatura de 20ºC
y humedad relativa del 54%.
5.5.2. Inóculo
B. cinerea se recuperó en cajas de Petri con medio de cultivo PDA. Las cajas se incubaron
en un cuarto de crecimiento con luz constante y temperatura de 24ºC± 2ºC, durante 15 días.
65
A partir del medio de cultivo con el hongo crecido y esporulado se preparó una suspensión
de conidios en solución de Tween 80 al 0.1% (v/v). Dicha suspensión fue filtrada a través de
una tela de muselina plegada para retirar el micelio. La concentración se ajustó a 1X105
conidios mL-1.
A partir de un cultivo de la levadura en medio de cultivo YM de 48 horas de edad, se preparó
una suspensión en 10 mL de una solución de Tween 80 al 0.1% (v/v). Se determinó la
concentración de esta suspensión mediante recuento en cámara de Neubauer y se ajustó su
concentración a 1x108 células.mL-1. A partir de esta suspensión se realizó una dilución con
base 10 en solución de Tween 80 al 0.1% (v/v), que contenía la sustancia fotoestabilizadora
seleccionada a la concentración evaluada. Finalmente se obtuvieron suspensiones de cada
tratamiento y un control (suspensión de levadura fresca en solución de Tween 80 al 0.1%) en
una concentración de 1x107 células.mL-1
Para realizar la exposición de las suspensiones de la levadura sin fotoestabilizar y
fotoestabilizada a la radiación ultravioleta, éstas fueron dispensadas en una microplaca de
96 pozos. En cada pozo se colocó 150 µL de suspensión utilizándose 6 pozos por
tratamiento, incluyendo el control. Para los tratamientos y el control no expuestos a la
radiación ultravioleta se colocó una lámina de aluminio para impedir que esta penetrara. La
microplaca se colocó a 20 cm de una lámpara luz ultravioleta monocromática (3UV-38
Series) y fue expuesta a la radiación ultravioleta tipo B (λ= 302 nm) por 30 minutos.
5.5.3. Inoculación
Los segmentos de tallo recién cortados y ubicados en los cubos de icopor fueron inoculados
con cada uno de los tratamientos por aplicación puntual de 25µL de inóculo de los
tratamientos en la herida de cada tallo. Después de ocho horas de incubación, los tallos
fueron inoculados con el fitopatógeno mediante la aplicación puntual de 25µL de la
suspensión de B. cinerea.
5.5.4 Tratamientos
El ensayo constó de ocho tratamientos definidos así: testigo absoluto, testigo patógeno
(solución estéril de Tween 80 al 0.1% (v/v) y microorganismo fitopatógeno B. cinerea),
66
levadura P. onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar y fotoestabilizada usando la sustancia
seleccionada al 0.5% (p/v) y al 1% (p/v). Para la levadura fotoestabilizada y sin
fotoestabilizar se evaluaron dos tiempos de exposición a la radiación ultravioleta: tiempo cero
o de no exposición y 30 minutos.
5.5.5. Diseño experimental y análisis de datos
El diseño de este experimento tuvó un arreglo completamente al azar con arreglo factorial
(exposición a la radiación UV B y concentración de la sustancia fotoprotectora), con tres
repeticiones por tratamiento. Cada unidad experimental estuvó conformada por un cubo de
icopor con 10 segmentos de tallo. Cada unidad experimental se colocó dentro de una
cámara húmeda.
Los datos del área bajo la curva para las variables incidencia de síntomas, incidencia de
esporulación, severidad de los síntomas e intensidad de la esporulación obtenidos 20 días
luego de la inoculación se sometieron a un análisis de varianza (ANAVA). Para juzgar la
significacia de las posibles diferencias observadas, se uso una prueba de comparación de
medias de Tukey (α=0.05).
5.5.6. Variables de estudio
Se registró el período transcurrido hasta la aparición de las primeras lesiones de la
enfermedad causada por B. cinerea y se midió: a) el número de tallos que presentaron
lesiones por B. cinerea y se denominó “incidencia de síntomas”. b) el número de tallos que
presentaron lesiones que tenían esporulación y se denominó “incidencia de esporulación”, c)
la intensidad de las lesiones, que fue llamada “severidad de los síntomas” y d) la “intensidad
de la esporulación”. Las dos últimas variables se calificaron mediante una escala (Tabla 1).
Todos estos parámetros se midieron cada dos días durante 20 días.
Se calculó un índice de severidad (is) y un índice de esporulación de (ie) para el número de
segmentos de tallo (nx) que pertenecen a la clase x, de acuerdo con las fórmulas:
is= 1n1+2n2+3n3+4n4
n2 + n3 +n4
67
ie= is= 1n1+2n2+3n3+4n4
n1 + n2 + n3 +n4
Tabla 1. Escala de severidad de síntomas y escala de esporulación.
Escala de severidad de síntomas Escala de esporulac ión Grado Grado
0 Extremo tratado del tallo verde 0
No esporulación
1 Únicamente el extremo tratado del tallo afectado
1 Esporulación en el extremo del tallo
2 Hasta el 50% de la longitud del tallo afectada
2 Esporulación hasta el 50% de la longitud del tallo
3 El 51-75% de longitud del tallo afectada
3 El 51-75% de longitud del tallo esporulada
4 Mayor 75% de la longitud del tallo afectada
4 Mayor 75% de la longitud del tallo esporulada
Para establecer los valores de incidencia sólo se tuvieron en cuenta aquellos tallos que
tuvieron grados de severidad superiores a 1. Los segmentos en los cuales la superficie
inoculada se tornó de color marrón (severidad de síntoma 1) fueron excluidos a causa de
que este síntoma carece de especificidad para B. cinerea.
También se calculó la eficacia de control del antagonista al final del experimento de acuerdo
con la formula (a-b/a) * 100, donde, a= incidencia o índice de la enfermedad en el testigo
patógeno y b= incidencia o índice de la enfermedad en un tratamiento antagonista (Elad,
2000).
68
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Evaluación de la compatibilidad de la levadura Pichia onychis (Lv027) con
auxiliares de formulación con capacidad fotoestabil izadora.
Con el fin de seleccionar auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora
compatibles con la levadura Pichia onychis (Lv 027), se evaluó el efecto individual de dichas
sustancias sobre el crecimiento del microorganismo.
Se observó que el crecimiento de la levadura en presencia de los fotoprotectores de
naturaleza biológica (UV 05, UV 06, UV 07) y los fotoprotectores de naturaleza física (UV 08,
UV 09 y UV 11) usados al 0.5% (p/v), tuvo un comportamiento similar al obtenido con el
control (levadura sin fotoestabilizar) (Figura 7).
La concentración inicial de células de levadura para todos los tratamientos fue de 1 x 106
células.mL-1 (Higuera, 2003) y la evaluación del efecto de las sustancias fotoprotectoras se
realizó después de 48 y 96 horas de incubación. Se observó que en el caso del control, la
concentración de células en el medio de crecimiento fue de 3.89 x 108 células.mL-1 a las 48
horas y de 6.02 x 108 células·mL-1 a las 96 horas de incubación. En el caso de los
tratamientos UV 05, UV 06, UV 07, UV 08, UV 09 y UV 11, la concentración de células en el
medio de crecimiento se presentó en el rango de 3.13 x 108 a 3.95 x 108 células.mL-1 a las 48
horas de incubación, valores cercanos a los encontrados en el control. A las 96 horas de
incubación la concentración de células en los tratamientos mencionados estuvo en el rango
de 3.04 x 108 a 4.85 x 108 células.mL-1.
La prueba de comparación de medias de Tukey (α=0.05) no detectó diferencias significativas
entre las concentraciones finales de células de la levadura obtenidas con los tratamientos
UV 05, UV 06, UV 07, UV 08, UV 09 y UV 11 a las 48 y 96 horas de incubación en
comparación con el resultado obtenido con el control (P> 0.05) (Figura 8) (Anexo 2). Este
resultado indica que el crecimiento de la levadura P. onychis (Lv 027) no fue afectado por las
sustancias fotoprotectoras evaluadas, cuando fueron adicionadas al medio de cultivo líquido,
lo que permite sugerir que dichas sustancias no tienen un efecto inhibitorio o tóxico sobre las
células del microorganismo biocontrolador.
69
La compatibilidad de la levadura con dichas sustancias posiblemente se debió a que los
fotoprotectores de naturaleza biológica se encuentran entre las sustancias permitidas como
aditivos en la industria de alimentos, medicamentos y cosméticos, los cuales cumplen
algunas especificaciones para su uso tales como estabilidad, inocuidad y seguridad
(Marcano, 1990). De igual forma, los fotoestabilizadores de naturaleza física evaluados, son
de amplio uso en la industria farmacéutica, principalmente porque son compuestos inertes,
que no son afectados física o químicamente por el medio al cual se incorporan, son seguros
y protegen contra el espectro completo de radiación ultravioleta (Ballesteros, 2006).
Por el contrario, el crecimiento de la levadura en presencia de los fotoprotectores de
naturaleza química UV 03 y UV 10 fue significativamente inferior (P < 0.05) al crecimiento de
la levadura sin la adición de alguna sustancia fotoestabilizadora (Anexo 2). En el caso del
tratamiento con el fotoprotector UV 03, no hubo aumento de la población de levadura antes
de 48 horas de incubación. Sin embargo, después de 96 horas de incubación la
concentración de células en el medio de crecimiento fue de 1.76 x 108 células.mL-1. Este
comportamiento sugiere que el fotoprotector UV 03 tuvo un efecto negativo sobre el
crecimiento de este microorganismo, el cual se caracteriza por presentar una fase de
adaptación al medio de cultivo, una fase exponencial, una fase estacionaria y una fase de
muerte celular (Doran, 1999). En el presente estudio se observó que la fase de adaptación
se prolongó hasta las 48 horas en presencia de esta sustancia UV 03, hecho que retardó
notablemente el crecimiento (Figura 7).
Con el tratamiento fotoprotector UV 10 hubo un aumento en la población de levadura,
alcanzándose una concentración de células de 1.45 x 108 células.mL-1 a las 48 horas de
incubación y de 1.68 x 108 células.mL-1 a las 96 horas de incubación, valores que fueron
significativamente inferiores en comparación a los obtenidos con los demás tratamientos
incluyendo el control.
Los auxiliares de formulación UV 03 y UV 10 en la concentración evaluada (0.5% p/v)
retardaron el crecimiento de la levadura, teniendo un mayor impacto sobre este parámetro la
sustancia UV 03 en comparación con la sustancia UV 10, ya que ésta mantuvo a las células
en latencia hasta un tiempo cercano a las 48 horas, a partir del cual se inició el crecimiento
exponencial.
70
01
23
456
78
910
0 20 40 60 80 100
Tiempo (horas)
Log
10 (
célu
las.
ml
-1)
CONTROL UV 03 UV 05 UV 06 UV 07UV 08 UV 09 UV 10 UV 11
Figura 7. Crecimiento de la levadura Pichia onychis (Lv 027) en presencia de los auxiliares de
formulación con capacidad fotoestabilizadora.
cdcd
abababab ababab bc
e
d
bcbcabababa
0123456789
10
Contro
l
UV 05
UV 06
UV 07
UV 08
UV 09
UV 10
UV 03
UV 11
Tratamientos
Log
10 (cé
lula
s.m
l-1)
48 horas
96 horas
Figura 8. Concentración de células de la levadura Pichia onychis (Lv 027) a las 48 y 96 horas de
incubación en medio líquido suplementado con los auxiliares de formulación con capacidad
fotoestabilizadora. *Las columnas con la misma letra no presentan diferencias significativas de acuerdo con la
prueba de Tukey (α=0.05).
Numerosas sustancias de naturaleza química han sido utilizadas de forma efectiva para la
protección de bacterias y virus entomopatógenos contra la radiación ultravioleta, dadas sus
características para absorber de forma selectiva la radiación UV tipo B y transmitir energía
en la porción correspondiente a la radiación UV tipo A o en el espectro visible, o por
absorber la radiación UV tipo A en el caso de filtros de amplio espectro (Shapiro et al., 1983).
71
Sin embargo, los fotoprotectores UV 03 y UV 10 son colorantes sintéticos solubles en agua,
caracterizados por la presencia del grupo químico azo (-N=N-) en su molécula (Marcano,
1990), los cuales pueden tener un efecto tóxico sobre las células cuando son expuestas por
tiempos regulares o prolongados a dichas sustancias (Christie, 2001).
Tal efecto podría estar relacionado con la producción de aminas aromáticas altamente
toxicas, derivadas de la reducción enzimática de estos colorantes por la acción de
azoreductasas, efecto que ha sido reportado en tejidos de mamíferos, bacterias habitantes
del intestino y de la piel como Staphylococcus aureus y en un aislamiento de Pseudomonas
fluorescens (Golka et al., 2004).
Sin embargo, Shapiro & Robertson (1990) obtuvieron resultados eficientes de fotoprotección
con los auxiliares de formulación UV 03 y UV 10 cuando fueron evaluados junto con otros 76
colorantes químicos, para proveer protección al nucleopoliedrovirus de la polilla gitana
Lymantria dispar (Linnaeus) (LdMNPV) contra la radiación ultravioleta. Los colorantes
químicos evaluados en este trabajo seleccionados por no tener un efecto tóxico sobre las
larvas de la polilla gitana. Con el uso de los auxiliares protectores UV 03 y UV 10 a una
concentración de 1% (p/v), se mantuvo la actividad patogénica del LdMNPV en valores
mayores al 70% de la actividad original, luego de la exposición a la radiación ultravioleta
durante 60 minutos.
Otro factor que puede incidir en la toxicidad de los agentes fotoprotectores es la
concentración en la que estos son usados. Tal es el caso de un estudio reportado por Khan
(2004) donde el uso de fotoprotectores como el ácido fólico en solución acuosa, fue tóxico
para la germinación de los conidios de Rhynchosporium alismatis a una concentración del
5% (p/v) pero no lo fue a una concentración de 1% (p/v). Sin embargo, para el presente
estudio se empleó una concentración del 0.5% (p/v), la cual se encuentra dentro del rango
de concentración comúnmente utilizada para agentes fotoprotectores en el desarrollo de
formas farmacéuticas, concentraciones que oscilan entre 0.1% (p/v) y 1% (p/v) (Boylan et al.,
1986).
Aunque algunos colorantes pueden ser no tóxicos para los agentes de biocontrol cuando se
usan a bajas concentraciones, se ha reportado que la efectividad en la protección frente a la
radiación UV que puede proveer este tipo de compuestos es directamente proporcional a su
concentración, por lo que limita su empleo en el desarrollo de bioplaguicidas (Shapiro, 1990).
72
Entre los azo colorantes de mayor importancia comercial se encuentran los de color amarillo,
naranja y rojo ya que tienen la propiedad de absorber radiación de longitud de onda corta
(Christie, 2001). En el caso del auxiliar fotoprotector UV 03, este tiene diferentes picos de
absorción en el rango de 220 a 620 nm, teniendo un amplio espectro de absorción que lo
hace altamente eficiente (Dunkle & Shasha, 1989); pero el efecto tóxico sobre la levadura
biocontroladora en el presente estudio descarta la posibilidad de emplear esta sustancia en
el desarrollo de un bioplaguicida.
Estudios previos han reportado que varios de los auxiliares de formulación con capacidad
fotoestabilizadora evaluados en el presente estudio, actúan como agentes fotoprotectores
contra la radiación ultravioleta sin efectos desfavorables en la formulación de esporas y
cristales de B. thuringiensis (Dunkle & Shasha, 1989), cuerpos de inclusión del virus de la
poliedrosis nuclear de Heliothis zea (HzSNPV) (Ignoffo & García, 1994), de la polilla gitana
Lymantria dispar (Linnaeus) (Shapiro et al., 1983), así como para la protección de conidios
de B. bassiana (Inglis et al., 1995). Sin embargo, el uso de algunos auxiliares de formulación
puede ser excluido por presentar toxicidad para los microorganismos biocontroladores
(Khan, 2004), por lo que los fotoprotectores UV 03 y UV 10 fueron excluidos de los
siguientes experimentos del presente trabajo.
6.2. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación
seleccionados frente a la radiación ultravioleta mo nocromática.
Una vez seleccionadas las sustancias fotoprotectoras compatibles con la levadura (UV 05,
UV 06, UV 07, UV 08, UV 09 y UV 11), se evaluó su capacidad fotoestabilizadora frente a la
radiación ultravioleta tipo A (365 nm), tipo B (302 nm) y tipo C (254 nm) utilizando una
concentración del 0.5% (p/v).
6.2.1. Determinación del efecto fotoestabilizador d e los auxiliares de formulación
seleccionados frente a la radiación ultravioleta ti po A ( λ= 365 nm).
La viabilidad de la levadura en presencia de los fotoestabilizadores UV 05, UV 08 y UV 11 y
de la levadura sin fotoestabilizar no fue afectada por la exposición durante diez minutos a la
radiación UV A, ya que se mantuvó en el 100% durante los diferentes tiempos de exposición
evaluados. Con los auxiliares UV 06, UV 07 y UV 09 tampoco se observó un efecto de la
73
exposición a la radiación UV A, tratamientos para los cuales la viabilidad final fue del 99%
(Figura 9).
El análisis estadístico no detectó diferencias significativas (P> 0.05) entre los porcentajes de
viabilidad de la levadura obtenidos con los tratamientos correspondientes a las sustancias
fotoestabilizadoras y la levadura sin fotoestabilizar, luego de un minuto, cinco minutos y diez
minutos de exposición a la radiación UV A (Anexo 4).
a a a a a a aab a ab abab
ababab ab c ab ab ab aab ab ab ab ab ab ab
0
20
40
60
80
100
Control UV 05 UV 06 UV 07 UV 08 UV 09 UV 11
Tratamiento
Tiempo de Exposición
Via
bilid
ad (%
)
No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
Figura 9. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre la viabilidad de la levadura
Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación ultravioleta tipo A (365 nm). *Las columnas con la misma
letra no presentan diferencias significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (α = 0.05).
Los resultados con la levadura no fotoestabilizada, sugieren que posiblemente radiación
ultravioleta tipo A no tiene un efecto negativo sobre esta levadura durante el tiempo de
exposición evaluado en el presente trabajo (Figura 10). Dicho resultado permite sugerir que
no es necesario incluir en la formulación de esta levadura, un agente protector que exhiba
una absorción máxima dentro del espectro de la radiación ultravioleta tipo A. Sin embargo,
se recomienda para un trabajo posterior, evaluar mayores tiempos de exposición a dicha
radiación, con miras a determinar si en algún momento la levadura Pichia onychis (Lv 027)
se ve afectada por la radiación ultravioleta tipo A.
74
Figura 10. Efecto de la radiación ultravioleta tipo A (365 nm) sobre la población de la levadura
P. onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar durante los tiempos de exposición evaluados.
El efecto de la radiación ultravioleta tipo A sobre la viabilidad de los agentes de biocontrol, ha
sido evaluada en diferentes trabajos como el de Saxena et al., (2002) quienes reportaron
una pérdida del 90% en la viabilidad de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki después de 16
minutos de exposición a la radiación ultravioleta tipo A (λ= 366 nm), disminución que estuvo
relacionada con una pérdida de su actividad biocontroladora de Heliothis armigera en un
90%.
De igual forma, Braga et al., (2001), evaluaron la viabilidad de los conidios de tres
aislamientos del hongo entomopatógeno Metharhizium anisoplie, obteniendo una reducción
del 10% para el aislamiento ARSEF 324, del 40% para el aislamiento ARSEF 23 y del 60%
para el aislamiento ARSEF 2575, después de cuatro horas de exposición a la radiación UV A
(320 a 400 nm). En otro estudio realizado por Pavone (2003), se demostró que la radiación
UV A (λ= 365 nm) no ejerció ningún efecto negativo sobre los conidios de Nomuraea rileyi
(Farlow) Samson luego de una hora de exposición. Estas diferencias permiten sugerir que el
efecto de esta radiación es dependiente del género, especie y aislamiento del
microorganismo.
La radiación UV A conforma el 95% de la radiación solar y algunos fotoestabilizadores
químicos orgánicos como el parsol y los cinamatos, pueden sufrir una degradación
fotoquímica por acción de este tipo de radiación. La fotodescomposición disminuye la
capacidad de absorber la radiación UV A, generando un incremento del daño inducido por
esta radiación de forma directa, principalmente por la formación de radicales libres y otros
reactivos tóxicos (Damiani et al., 2006). Sin embargo, ninguno de los auxiliares
No expuesta 1 minuto 5 minutos 10 minutos
75
fotoprotectores evaluados en este experimento es de naturaleza química, por lo tanto no
debió presentarse dicho efecto.
6.2.2. Determinación del efecto fotoestabilizador d e los auxiliares de formulación
seleccionados frente a la radiación ultravioleta ti po B (λ= 302 nm).
La levadura no fotoestabilizada presentó una disminución de la viabilidad del 10% y del 52%
después de cinco y diez minutos de exposición a la radiación UV B respectivamente. Cuando
la levadura se expuso a la radiación UV B en presencia de los fotoestabilizadores UV 05, UV
06, UV 07 y UV 11, presentó una disminución de la viabilidad del 5%, 14%, 18% y 6%,
respectivamente para cada tratamiento, después de cinco minutos de exposición. Esta
pérdida fue mayor después de diez minutos de exposición, presentándose una reducción de
la viabilidad del 82% y del 87% en los tratamientos UV 05 y UV 11 y una pérdida total de la
misma en los tratamientos UV 06 y UV 07 (Figura 11).
Este resultado permite sugerir que posiblemente la capacidad de los filtros UV 05, UV 06 y
UV 07 de prevenir o retrasar el daño oxidativo no fue eficiente para minimizar el efecto de la
radiación UV B sobre las células de levadura, e inclusive estas sustancias podrían presentar
un efecto negativo después de ser expuestas a la radiación, puesto que la viabilidad final de
la levadura con estos tratamientos fue significativamente inferior a la del tratamiento control
(Figura 11).
Se observó que la radiación ultravioleta tipo B, a diferencia de la radiación ultravioleta tipo A,
tiene un efecto negativo sobre las células de la levadura Pichia onychis (Lv 027), ya que
causó una pérdida significativa de la viabilidad del microorganismo a medida que incrementó
el tiempo de exposición a dicha radiación (Figura 12). Este resultado sugiere la necesidad de
usar un agente fotoestabilizador que absorba la radiación en el rango de longitud de onda de
los 280 a los 315 nm, para proteger a la levadura del efecto nocivo de esta radiación y
reducir la pérdida de su viabilidad.
Varios estudios han demostrado el efecto detrimental de la radiación ultravioleta tipo B sobre
la viabilidad de microorganismos biocontroladores como algunos hongos entomopatógenos.
Tal es el caso de Paecilomyces fumosoroseus, para el cual la viabilidad de sus conidios fue
reducida a la mitad luego de la exposición a la radiación UV tipo B (280 a 320 nm) por
76
34 minutos (Smits et al., 1996). De igual forma, para Beauveria bassiana y Nomuraea rileyi
(Farlow) Samson, sus conidios fueron completamente inactivados luego de ser expuestos a
la radiación UV B (λ= 302 nm) por 20 segundos (Edgington et al., 2000) y 10 minutos
(Pavone, 2003) respectivamente.
El análisis estadístico no detectó diferencias significativas entre la viabilidad de la levadura
fotoestabilizada y sin fotoestabilizar después de un minuto de exposición a la radiación UV B,
ni entre estas viabilidades y la de la levadura no expuesta (P> 0.05) (Anexo 6). Este
resultado indica que la longitud de onda evaluada no tuvo un efecto negativo sobre la
levadura durante el primer minuto de exposición.
Después de cinco minutos de exposición se observó una reducción en la viabilidad de la
levadura para los tratamientos UV 05, UV 06, UV 07 y UV 11 incluyendo el control. Sin
embargo, sólo con el fotoprotector UV 07, la viabilidad después de dicho tiempo de
exposición fue inferior a la viabilidad de la levadura no expuesta (Figura 10). Este resultado
sugiere que esta sustancia tuvo un efecto negativo sobre el microorganismo, posiblemente
generado por la exposición a la radiación.
El auxiliar fotoprotector UV 07 es un compuesto flavonoide, estructuralmente derivado del
alloxano, termoestable y que se descompone entre 278ºC y 282ºC. Es soluble en agua y
muy soluble en soluciones alcalinas (Budavari et al., 1996). Este compuesto se destruye
rápidamente por descomposición fotoquímica de la cadena de ribosa, generando un
compuesto altamente oxidante (Marcano, 1990), el cual posiblemente se produjo después de
cinco minutos de exposición a la radiación UV B y disminuyó la viabilidad de la levadura
evaluada en el presente estudio.
Compuestos como porfirinas, carotenoides y flavinas entre otros, absorben la radiación
ultravioleta dejando su molécula en un estado excitado que puede reaccionar con las
moléculas de oxígeno, convirtiéndolas en varias especies reactivas. Tanto la radiación UV A
como la UV B generan efectos biológicos adversos como resultado de la formación de
especies reactivas de oxígeno y éstas pueden ser producidas directa e indirectamente a
través de reacciones fotoquímicas (Jurkiewicz, 1995).
La molécula fotoexcitada del auxiliar fotoprotector UV 07 tiene la capacidad de catalizar la
transferencia de electrones principalmente entre el ácido ascórbico y el oxígeno, con la
77
formación de peróxido de hidrógeno (H2O2). Este efecto ha sido observado principalmente en
preparaciones multivitamínicas expuestas a la luz ambiental (Lavoie et al., 2004).
Posiblemente las moléculas del auxiliar UV 07 fueron fotoexcitadas durante la exposición a
la radiación UV B, lo que pudo generar la formación de peróxido de hidrógeno. Este
compuesto posiblemente tuvo un efecto detrimental sobre la viabilidad de la levadura, ya que
es un compuesto químico intermediario en la formación de radicales libres de oxígeno como
el radical hidróxilo, capaz de desencadenar procesos como la peroxidación lipídica y la
oxidación de proteínas y del DNA (Ballesteros, 2006).
Cuando la levadura se expuso a la radiación UV B durante diez minutos en presencia y en
ausencia de los posibles fotoestabilizadores, con los filtros UV 06 y UV 07 se obtuvo una
pérdida total de la viabilidad (Figura 11). Este resultado confirma el efecto negativo del filtro
UV 07 y sugiere que el filtro UV 06 también tiene un efecto negativo sobre las células,
posiblemente generado por la exposición a la radiación como se explicó anteriormente para
el filtro UV 07.
El auxiliar fotoprotector UV 06 es una molécula soluble en agua, considerado uno de los
antioxidantes naturales no enzimáticos de menor poder tóxico. La propiedad antioxidante de
su molécula es conferida por la habilidad de donar dos átomos de hidrógeno a la molécula
oxidante. Ha mostrado ser efectivo en la eliminación de radicales libres de oxígeno como el
anión superóxido y el radical hidróxilo, así como de especies químicas intermediarias
relacionadas con los radicales libres de oxigeno como el peróxido de hidrógeno y el oxígeno
singlete (Lavoie et al., 2004).
A pesar de que varias investigaciones han sido exitosas usando el auxiliar UV 06 como
fotoprotector, en algunos trabajos incluyendo el presente estudio, no se ha observado dicho
efecto. Tal es el caso de un estudio realizado por Rossman et al. (1986) con E. coli, donde
este auxiliar incrementó notablemente la mutagénesis causada por radiación UV en la
bacteria (Steenvoorden et al., 1997).
De igual forma, luego de exponer la levadura P. onychis (Lv 027) a la radiación UV B durante
diez minutos en presencia de los filtros UV 05 y UV 11, se obtuvo un porcentaje de viabilidad
significativamente inferior al obtenido con los tratamientos UV 08, UV 09 y con la levadura no
fotoestabilizada pero estadísticamente mayor al obtenido con los filtros UV 06 y UV 07
(Figura 11) (Anexo 6). Este resultado indica que dichos auxiliares de formulación también
78
tuvieron un efecto negativo sobre la viabilidad de la levadura biocontroladora, pero este fue
menos drástico que con los filtros UV 06 y UV 07.
El auxiliar fotoprotector UV 05 es un ácido orgánico polivalente soluble en agua. Es
ampliamente usado como antioxidante natural y como radioprotector (Gromovaya et al.,
2002). Este compuesto ha sido descrito como un antioxidante efectivo por su efecto
sinérgico cuando es adicionado junto con otros antioxidantes como la vitamina E. Esto se
atribuye a su capacidad para quelar metales, consiguiendo ejercer un potente efecto
estabilizante de la oxidación a través del bloqueo de iones metálicos prooxidantes como el
hierro y el cobre, lo que limita la formación de iniciadores de la cadena, al prevenir la
homolisis de hidroperóxidos inducida por metales (Pokorny et al., 2001).
Por otro lado, el auxiliar fotoprotector UV 11 es un polímero del ácido metacrílico en el que
se encuentra disperso un pigmento. Es usado como material de recubrimiento de diferentes
formas farmacéuticas sólidas, orales y de liberación sostenida. Este compuesto es
dispersable en agua, protege contra los medios ácidos y se solubiliza a partir de un pH 5.5
(Colorcon, 2007). El ácido metacrílico es de origen orgánico y es un agente reductor fuerte
que reacciona con sustancias oxidantes. Es obtenido sintéticamente por polimerización en
presencia de radiación ultravioleta de longitud de onda corta por medio de reacciones con
radicales libres (Stellman et al., 2001). Probablemente el pigmento adicionado a este
polímero le confiere estabilidad cuando es expuesto a luz, sin embargo, esta propiedad no
fue observada en el presente estudio, pues este filtro no sólo no protegió a la levadura, si no
que afectó significativamente su viabilidad luego de ser expuesta durante 10 minutos a la
radiación UVB.
A pesar de que los agentes fotoestabilizadores biológicos seleccionados tienen diferentes
rangos de absorción dentro del espectro de la radiación UV B, como el auxiliar UV 06 (280 a
300 nm) (Khan, 2004) y UV 07 (220 a 475 nm) (Budavari et al., 1996), característica que en
el caso de los colorantes puede mejorar su efectividad (Shapiro & Robertson, 1990), en el
presente estudio estas sustancias no protegieron a la levadura durante los diez minutos de
exposición.
Aunque los procesos desencadenados por estrés oxidativo a nivel celular, generado por
factores bióticos y abióticos, como la exposición a la radiación ultravioleta, pueden ser
79
retardados por el uso de sustancias con propiedades antioxidantes (Gromovaya et al., 2002),
el desempeño de estas sustancias en el presente trabajo no fue eficiente.
Sin embargo, entre otros factores que pueden afectar considerablemente la actividad
antioxidante de las sustancias anteriormente mencionadas se encuentra la concentración en
la que son usadas. En un estudio realizado por Wills (1980), se observó que el efecto
protector de algunos de estos antioxidantes contra la peroxidación lipídica generada por la
irradiación de dietas artificiales con rayos gamma (γ), fue dependiente de su concentración y
para todos los antioxidantes evaluados, su uso en concentraciones más altas incrementó
considerablemente su capacidad protectora.
Por otro lado, los filtros UV 05, UV 06 y UV 07 han sido descritos como antioxidantes
sinérgicos. Se denomina sinergismo a la cooperación entre inhibidores, que produce un
refuerzo de su efecto individual durante la oxidación. Tal condición demuestra la pobre
actividad antioxidante de estos compuestos cuando son usados de forma individual, sin
embargo, es posible obtener resultados eficientes cuando son combinados con compuestos
como fosfolípidos y tocoferoles (Pokorny et al., 2001).
Contrario a lo anterior, con los fotoprotectores inorgánicos de origen sintético UV 08 y UV 09
se observó un efecto fotoestabilizador. Con el fotoestabilizador UV 08, no se presentó una
pérdida significativa de la viabilidad durante los diez minutos de exposición a la radiación UV
B, obteniéndose una viabilidad final del 98%, la cual no fue estadísticamente diferente de la
viabilidad de la levadura no expuesta y fue estadísticamente superior a la viabilidad de la
levadura no fotoestabilizada después de diez minutos de exposición a dicha radiación
(Figura 11) (Anexo 6). Este resultado indica que el filtro UV 08 protegió eficientemente a la
levadura frente a la radiación ultravioleta tipo B en la longitud de onda evaluada (Figura 12),
siendo un potencial auxiliar de formulación para ser incluido en el bioplaguicida desarrollado
a base de la levadura Pichia onychis (Lv 027).
El auxiliar UV 09 fue menos eficiente en comparación con el auxiliar fotoprotector UV 08.
Con este compuesto se presentó una disminución de la viabilidad del 45% después de diez
minutos de exposición a la radiación UV B. Esta viabilidad fue numéricamente mayor a la
80
obtenida con la levadura no fotoestabilizada. Aunque el análisis estadístico no detectó
diferencias significativas, esta tendencia numérica podría sugerir que el filtro UV 09 presentó
algún nivel de protección de las células (Figura 11) (Anexo 6).
Estos dos últimos filtros son pigmentos inorgánicos que se caracterizan por ser compuestos
incoloros, coloreados, o fluorescentes, insolubles en la mayoría de solventes y que no son
afectados física o químicamente por el medio al cual se incorporan. Están constituidos por
una sustancia colorante orgánica o inorgánica y una base o portador, en relación más o
menos definida y para aplicarse deben dispersarse en un vehículo sin combinarse con él.
Los pigmentos inorgánicos están constituidos por sales y óxidos inorgánicos (Christie, 2001).
Los auxiliares inorgánicos son uno de los grupos de compuestos ampliamente utilizados
dada su efectividad al proveer protección a los agentes biocontroladores frente a la radiación
ultravioleta, tal como en el caso del nucleopoliedrovirus de la polilla gitana Lymantria dispar
(Linnaeus) (Shapiro et al., 1983). Entre estos materiales se incluyen el óxido de zinc (ZnO),
el dióxido de titanio (TiO2), algunos silicatos y talcos (Shapiro et al., 1983).
aaaaaaa a aaaabaaab
aa
bab
abab
d
c
a
ee
d
c
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Control UV 05 UV 06 UV 07 UV 08 UV 09 UV 11
Tratamientos
Tiempo de Exposición
Via
bilid
ad (%
)
No expuesto Un minuto Cinco minutos Diez minutos
Figura 11. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre la viabilidad de la levadura
Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación ultravioleta tipo B (302 nm). *Las columnas con la misma
letra no presentan diferencias significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (α = 0.05).
81
Los protectores como el TiO2 y el ZnO se caracterizan por ser fotoestables y proveer
protección contra la radiación UV por reflexión o absorción. Los factores que determinan la
efectividad de las propiedades de reflexión son el índice de reflexión, el tamaño de partícula,
dispersión en la base y el grosor de la capa. Materiales con altos índices tienen mejores
propiedades de reflexión (Kullavanijaya & Lim, 2005).
Los fotoestabilizadores UV 08 y UV 09, por ser pigmentos inorgánicos de origen sintético
presentan ciertas ventajas tales como su pureza química y control de su forma física.
Corresponden a un grupo de pigmentos que se caracterizan por su excelente durabilidad,
alta opacidad, baja toxicidad y bajo costo. Su efecto fotoprotector ha sido atribuido
principalmente a la absorción de la luz como resultado de la transferencia de cargas a un
metal ligante (Christie, 2001).
El fotoprotector ideal debe ser fotoquímicamente estable y disolverse o dispersarse
fácilmente y permanentemente en el vehículo de la formulación (Kullavanijaya & Lim, 2005),
características que cumplen los filtros UV 08 y UV 09.
A
B
Figura 12. Efecto de la radiación ultravioleta tipo B (305 nm) sobre la población de la levadura
P. onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar (A) y fotoestabilizada con el filtro UV 08 (0.5% p/v) (B) durante
los tiempos de exposición evaluados.
No expuesta 1 minuto 5 minutos 10 minutos
No expuesta 1 minuto 5 minutos 10 minutos
82
Se ha reportado que la radiación ultravioleta tipo B es la principal causa de la inactivación de
agentes entomopatógenos. Sin embargo, algunos trabajos han demostrado que la radiación
ultravioleta tipo A y la radiación visible (400 nm) también presentan un efecto negativo sobre
los microorganismos biocontroladores como Bacillus thuringiensis. Algunos estudios han
permitido concluir que la sensibilidad de estos agentes a la radiación solar es causada por el
efecto sinérgico de múltiples longitudes de onda. Por tales razones, los auxiliares
fotoprotectores deben caracterizarse por absorber la radiación UV B y presentar buena
absorción en el rango de los 330 a 400 nm, lo que les permite proveer excelente protección
(Shapiro & Robertson,1990).
Los fotoprotectores inorgánicos presentan dicha característica y tienen un espectro amplio
de absorción, siendo capaces de reflejar la radiación UV B y UV A. Esto puede explicar la
efectiva protección obtenida en el presente estudio con los auxiliares UV 08 y UV 09, y
presentan gran potencial para ser incorporados como coadyuvantes en la formulación de
agentes biocontroladores.
6.2.3. Determinación del efecto fotoestabilizador d e los auxiliares de formulación
seleccionados frente a la radiación ultravioleta ti po C (λ= 254 nm)
Cuando la levadura fue expuesta a la radiación UV C en presencia o ausencia de las
sustancias fotoestabilizadoras se presentó una pérdida significativa de la viabilidad en todos
los tratamientos. Después de un minuto de exposición la levadura no fotoestabilizada
presentó una pérdida de viabilidad del 49 %, la cual no fue significativamente diferente de la
observada en los tratamientos UV 06 y UV 07, los cuales redujeron su viabilidad en un 51%
y un 50 % respectivamente (Figura 13) (Anexo 8). Este resultado sugiere que dichos filtros
no presentaron un efecto fotoprotector de la levadura.
La viabilidad del microorganismo combinado con los fotoprotectores UV 08, UV 09 y UV 11
después de un minuto de exposición fue del 86%, 78% y 80% respectivamente, valores que
no fueron estadísticamente diferentes entre sí (P> 0.05), pero si fueron significativamente
superiores a la viabilidad de la levadura no fotoestabilizada (Figura 11) (Anexo 8). Este
resultado sugiere que dichas sustancias fotoestabilizaron efectivamente al microorganismo
frente a la radiación evaluada.
83
a a a a a a a
c
d
c c
ab
b ab
dd
eeeee
d
d eeeee0
1020304050
60708090
100
Control UV 05 UV 06 UV 07 UV 08 UV 09 UV 11
Tratamientos
Tiempo de Exposición
Via
bilid
ad (%
)
No expuesto Un minuto Cinco minutos Diez minutos
Figura 13. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre viabilidad de la levadura
Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación ultravioleta tipo C (254 nm). *Las columnas con la misma
letra no presentan diferencias significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (α = 0.05).
La viabilidad de las células de levadura obtenida con el tratamiento UV 08 a los cinco y diez
minutos de exposición fue del 24% y del 15%, las cuales no fueron significativamente
diferentes de la viabilidad obtenida con el tratamiento UV 09, con el que se obtuvieron
resultados del 18% y del 3% respectivamente (Figura 11). Sin embargo, dichos valores
fueron significativamente superiores a los obtenidos con la levadura no fotoestabilizada a los
mismos tiempos de exposición, lo que confirma el efecto fotoestabilizador de dichas
sustancias.
Aunque la radiación UV C no tiene la capacidad de penetrar la atmósfera hasta la superficie
de la tierra, es reconocida por su carácter germicida, especialmente en los rangos de 260 a
265 nm y 220 a 280 nm, debido a que en estos se encuentra el máximo espectro de
absorción de la molécula de DNA y de las proteínas respectivamente (WHO, 1994). Por otro
lado, ha sido reportado que este tipo de radiación puede cambiar la permeabilidad de las
células por la pérdida de electrolitos, de aminoácidos y de carbohidratos, generando la
acumulación de polisacáridos (Nigro et al., 1998 citado por Marquenie et al., 2002).
El tiempo de exposición a la radiación UV C (λ= 254 nm) requerido para afectar
significativamente la viabilidad de algunos agentes de biocontrol normalmente es muy corto.
Devotto y Gerding (2003) reportaron para dos aislamientos de Metharhizium anisoplie
84
(Metchsnikoff) Sorokin, una reducción sustancial en germinación de los conidios del
aislamiento QU-M363 de un 95% a un 1.71% luego de 40 segundos de exposición, así como
la reducción total de la germinación de los conidios del aislamiento QU-M221b al ser
expuesto tan solo por 20 segundos a la radiación UV C. También Saxena et al. (2002)
observaron la pérdida de viabilidad de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki en un 80%
después de dos minutos de exposición a este tipo de radiación.
A
B
Figura 14. Efecto de la radiación ultravioleta tipo C (254 nm) sobre la población de la levadura
P. onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar (A) y fotoestabilizada con el filtro UV 08 (0.5% p/v) (B) durante
los tiempos de exposición evaluados.
Sin embargo, la susceptibilidad a la radiación depende del microorganismo, ya que por
ejemplo, en otros ensayos in vitro con los hongos entomopatógenos Lecanicillium lecanii y
Beauveria bassiana se han requerido varias horas de exposición a esta radiación para
generar un efecto significativo sobre la viabilidad. Para estos microorganismos hasta
después de 24 horas de exposición a la radiación UV C, se encontró que la germinación de
los conidios disminuyó en un 82.3% y 47.7% respectivamente. Así mismo, Espinel et al.
(2006) no observaron una pérdida significativa de la viabilidad de los conidios de
No expuesta 1 minuto 5 minutos 10 minutos
No expuesta 1 minuto 5 minutos 10 minutos
85
Paecilomyces fumosoroseus después de 24 horas de exposición, sugiriendo que este
microorganismo no es susceptible a la radiación ultravioleta tipo C, posiblemente debido a un
efecto protector de las células brindado por los pigmentos de las mismas.
Estas diferencias en la susceptibilidad de los biocontroladores a la radiación UV C, evidencia
la existencia de distintos mecanismos de defensa frente a la radiación, tales como la
producción y acumulación de pigmentos, producción de enzimas oxidativas y otras
sustancias antioxidantes (Ragaei, 1999). También puede deberse al origen geográfico de los
aislamientos evaluados, ya que existen antecedentes que indican una menor tolerancia a la
radiación a medida que aumenta la latitud del lugar de origen (Braga et al., citado por
Devotto & Gerding, 2003).
Resulta interesante confirmar que los auxiliares UV 08 y UV 09 dada su naturaleza son
ampliamente fotoestables (Christie, 2001) incluso a cortas longitudes de onda, lo que
posiblemente permitió mantener la viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) expuesta
por más de un minuto a este tipo de radiación (Figura 14).
En algunos estudios se ha observado la capacidad de atenuar el efecto negativo de la
radiación UV C sobre agentes de biocontrol por la adición de sustancias fotoestabilizadoras.
Tal es el caso de Devotto & Gerding (2003) quienes encontraron que el abrillantador óptico
Blankophor P147® al 1% (p/v) puede ser un potencial adyuvante en el desarrollo de
bioplaguicidas a base de Metharhizium anisoplie. La germinación de los conidios sin el
fotoprotector se redujo en un 75% y 93% para los aislamientos QU-M221b y QU-M363
respectivamente después de 40 segundos de exposición, mientras que con el fotoprotector
la germinación se redujo aproximadamente en un 30%.
Por otro lado, la radiación UV C por su efecto negativo sobre los sistemas biológicos es de
amplio uso en procesos de desinfección y esterilización (WHO, 1994). Tal es el caso de su
potencial uso como tratamiento físico para el control de patógenos en postcosecha. Se ha
encontrado que la exposición de la superficie de frutas y vegetales a bajas dosis de radiación
UV C puede tener un efecto letal sobre los conidios de hongos patógenos como Botrytis
cinerea y Monilinia fructigena, así como inducir reacciones fisiológicas en el producto
expuesto, incrementando la resistencia a patógenos fúngicos. Este tratamiento ha sido
86
combinado exitosamente con otros como el tratamiento térmico y el uso de agentes de
biocontrol como levaduras para el control de enfermedades en postcosecha (Marquenie et
al., 2002).
De acuerdo con los resultados de viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) en
combinación con auxiliar de formulación y expuesta durante un minuto, cinco minutos y diez
minutos a la radiación ultravioleta monocromática, se seleccionó el filtro UV 08 por presentar
un efecto fotoestabilizador de las células frente a las tres longitudes de onda evaluadas,
principalmente frente a la radiación ultravioleta tipo B y C. Por esta razón, la sustancia
fotoestabilizadora UV 08 fue seleccionada para llevar a cabo un bioensayo in planta con
miras a evaluar el efecto fotoprotector del filtro seleccionado y su relación con la actividad
biocontroladora de la levadura Pichia onychis (Lv 027).
6.3. Efecto de la radiación ultravioleta sobre la a ctividad biocontroladora de la
levadura Pichia onychis (Lv027) fotoestabilizada.
Una vez seleccionada la sustancia fotoestabilizadora UV 08 que presentó una protección
efectiva de la viabilidad de la levadura frente a la radiación ultravioleta tipo B (λ= 302 nm), se
evaluó el efecto de dicha sustancia y de la mencionada radiación sobre la actividad
biocontroladora del microorganismo. El excipiente seleccionado se empleó a dos
concentraciones 0.5% (p/v) y 1% (p/v), y la exposición se realizó por 30 minutos. Se
determinó la incidencia y la severidad de los síntomas de la enfermedad, así como la
incidencia y la intensidad de la esporulación de B. cinerea en segmentos de tallo de tomate
tratados con la levadura fotoestabilizada expuesta y sin exponer a la radiación UV B.
Diez días después de la inoculación, la incidencia de la enfermedad en las unidades
experimentales tratadas con la levadura sin fotoestabilizar expuesta y no expuesta a la
radiación, fue del 13.3% y del 3.3% respectivamente. Para los tratamientos levadura
fotoestabilizada con el filtro al 1% expuesta y no expuesta a la radiación, se observó que la
incidencia de la enfermedad fue del 13.3% y del 10% respectivamente. Los segmentos de
tallo correspondientes a los tratamientos levadura con el filtro al 0.5% no expuesta a la
radiación y testigo patógeno presentaron una incidencia del 20%, mientras que el tratamiento
levadura fotoestabilizada con el filtro al 0.5% expuesta a la radiación mostró una incidencia
del 16.7%. (Figura 15).
87
Todos los tratamientos que incluyeron la aplicación de la levadura, con excepción de aquel
donde se utilizó la levadura fotoestabilizada con el filtro al 0.5% no expuesta a la radiación,
presentaron un nivel de incidencia menor al obtenido con el testigo patógeno. Aunque el
análisis de varianza no detectó diferencias significativas entre los tratamientos, los
resultados numéricos sugieren que la levadura tuvo un efecto positivo en el control del moho
gris.
Al finalizar el experimento, se observó el progreso de la infección en todos los tratamientos.
Los mayores niveles de incidencia se obtuvieron en los tallos inoculados con la levadura más
el filtro al 0.5% no expuesta a la radiación UV B y el testigo patógeno con 40% y 36.7%
respectivamente. Los tratamientos levadura con el filtro tanto al 0.5% como al 1% expuesta a
la radiación presentaron una incidencia de la enfermedad del 33.3% y del 26.7%, mientras
que la incidencia en el tratamiento levadura con el filtro al 1% no expuesta a la radiación fue
del 13.3%. Con los tallos tratados con la levadura sin fotoestabilizar expuesta y no expuesta
se obtuvó una incidencia del 16.7% y 3.3% respectivamente (Figura 15)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
3 5 7 10 13 16 18 20
Tiempo después de la inoculación (días)
Inci
denc
ia d
e le
sion
es (
%)
SF NE SF E 0.5% NE 0.5% E 1% NE 1% E Bo 006
Figura 15. Progreso de la incidencia de la enfermedad causada por Botrytis cinerea (Bo 006) en los
segmentos de tallo de tomate. SF NE: Levadura sin filtro UV 08 no expuesta a la radiación; SF E:
Levadura sin filtro UV 08 expuesta a la radiación; 0,5% NE: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% no
expuesta a la radiación; 0,5% E: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% expuesta a la radiación; 1% NE:
Levadura con filtro UV 08 al 1% no expuesta a la radiación; 1% E: Levadura con filtro UV 08 al 1%
expuesta a la radiación; Bo 006: Testigo patógeno.
88
Aunque el análisis de varianza para el área bajo la curva (Anexo 13) no detectó diferencias
significativas entre tratamientos, los resultados indicaron algunas tendencias. Al comparar
los tratamientos levadura sin fotoestabilizar expuesta y no expuesta a la radiación se
evidenció una reducción de la actividad biocontroladora en el tratamiento expuesto,
posiblemente debida al efecto negativo de la radiación UV B sobre la levadura, lo cual podría
estar relacionado con la pérdida de viabilidad de la misma en dicho tratamiento (Figura 16).
Asimismo, al comparar el tratamiento levadura fotoestabilizada no expuesta con el
tratamiento levadura sin fotoestabilizar no expuesta, se observó mayor incidencia de la
enfermedad cuando la levadura fue combinada con el filtro seleccionado. Este resultado
sugiere que la adición del filtro UV 08 tuvo un efecto negativo sobre la actividad
biocontroladora de la levadura.
Aunque en el ensayo donde se evaluó la capacidad fotoestabilizadora del filtro, se demostró
que al ser combinado con la levadura, ésta mantiene su viabilidad después de ser expuesta
a la radiación ultravioleta tipo B, este resultado no fue coherente con el obtenido cuando se
evaluó la actividad biocontroladora, ya que la levadura con el filtro al 1% expuesta a la
radiación presentó mayor incidencia de la enfermedad comparado con el mismo tratamiento
sin exposición. Este comportamiento sugiere que el filtro seleccionado mantuvo la viabilidad
de la levadura, pero esta no fue eficiente en el control de la enfermedad, lo que podría
atribuirse a una posible interferencia del filtro solar en algunos de los mecanismos de acción
del agente biocontrolador.
a
b
a a a a
010
20
3040
50
6070
8090
100
Pér
dida
de
viab
ilida
d (%
)
Sin filtro Filtro UV 08 0.5% Filtro UV 08 1%
Tratamientos
No expuesta Expuesta
Figura 16. Efecto de la radiación ultravioleta tipo B (302 nm) sobre la viabilidad de la levadura Pichia
onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar y fotoestabilizada con el filtro UV 08 al 0.5% (p/v) y al 1% (p/v),
durante 30 minutos de exposición. *Las columnas con la misma letra no presentan diferencias significativas de
acuerdo con la prueba de Tukey (α = 0.05).
89
Diferentes mecanismos de acción intervienen en el control de patógenos foliares como
B. cinerea, para levaduras antagonistas se han reportado efectos sobre el proceso de
germinación de los conidios y la penetración del tejido vegetal. Entre dichos mecanismos se
encuentra la capacidad de adherirse a las células de la planta y del patógeno, la
competencia por nutrientes y espacio, la producción de enzimas que degradan la pared
celular y la inducción de resistencia vegetal (Elad, 1996).
La capacidad de adhesión del agente biocontrolador garantiza el establecimiento, la
competencia, la colonización y la persistencia sobre diferentes superficies. La adhesión de
las levaduras sobre el filoplano involucra mecanismos no específicos o altamente específicos
(Lindow et al., 2004). Los primeros implican interacciones hidrofóbicas y electroestáticas, tal
es el caso de Rhodosporidium toruloides donde la presencia de cargas positivas localizadas
en la superficie intervienen en la adhesión (Buck & Andrews, 1999). Los segundos
mecanismos involucran la producción de exopolisacarido (EPS), fenómeno observado en
levaduras como Aureobasidium pullulans sobre hojas de manzana (Andrews et al., 1994
citado por Lindow et al., 2004) y el reconocimiento de receptores o ligandos como las
lecitinas, en el caso de la adhesión de Pichia guillermondii a las hifas de B. cinerea
(Wisniewski et al., 1994 citado por Elad, 1996).
La adhesión puede ser bloqueada por la intervención de agentes tales como sales o
enzimas, que alteran la integridad de las proteínas y de algunos azúcares en las superficies
(Wisniewski et al., 1994 citado por Elad, 1996). Con respecto a los resultados obtenidos en
el presente estudio, es posible que la levadura fotoestabilizada no haya ejercido su actividad
biocontroladora debido a una posible interferencia del filtro UV 08 sobre el proceso de
adhesión de la levadura al tejido vegetal, como se mencionó anteriormente. Dicha
interferencia podría explicarse considerando que las partículas insolubles del filtro UV 08 se
encontraban suspendidas en el medio acuoso con las células y podrían haberse ubicado
directamente sobre la superficie vegetal, impidiendo que las células de la levadura entraran
en contacto con éste. De esta forma el filtro al 0.5% podría haber interferido los mecanismos
de reconocimiento entre la levadura y la planta, impidiendo el proceso de adhesión y
generando espacios que posiblemente fueron aprovechados por el patógeno. Cuando la
concentración de filtro fue aumentada al 1%, es posible que un mayor número de partículas
del filtro cubriera de una forma más homogénea la superficie vegetal, ocupando el sitio y
reduciendo la incidencia de la enfermedad.
90
Las partículas del filtro UV 08 no son incorporadas al interior de las células de la levadura P.
onychis y permanecen en el medio externo o pueden adherirse a la pared celular, como se
observa en la Figura 17. Este filtro ejerció efectivamente su actividad fotoestabilizadora como
barrera física, puesto que la levadura mantuvo su viabilidad durante la exposición a la
radiación UV B. Sin embargo, esta barrera podría haber interferido la adhesión de la
levadura al tejido vegetal, pero también su adhesión a los conidios o a las hifas de
B. cinerea, contribuyendo a una mayor incidencia y severidad de los síntomas de la
enfermedad en las unidades experimentales tratadas con la levadura fotoestabilizada.
La competencia por espacio es el principal mecanismo utilizado por las levaduras
antagonistas, jugando el proceso de adhesión un rol importante que determina el
establecimiento y la colonización del tejido vegetal, lo que permite que el agente
biocontrolador ocupe este nicho antes que el patógeno (Campbell, 1989). En este sentido, la
producción de enzimas que degradan la pared celular del patógeno (glucanasas y
quitinasas), también depende de que la levadura establezca una fuerte adhesión al
patógeno, lo que estimula los mecanismos enzimáticos, tal es el caso de P. guillermondii
(Wisniewski et al., 1994 citado por Elad, 1996). La formación de una matriz celular que
atrapa las esporas del patógeno y suprime su germinación, como en el caso de Candida
saitoana en el control de B. cinerea, es otro proceso que está determinado por la eficiente
adhesión del biocontrolador (El Ghaout et al., 1998 citado por Contreras, 2005).
Figura 17. Adhesión de las partículas insolubles del filtro UV 08 a la pared celular de la levadura
P. onychis (Lv 027) en medio acuoso.
De igual forma, los conidios de B. cinerea son susceptibles a compuestos tóxicos o
inhibitorios producidos por el tejido vegetal, cuya producción es inducida por la presencia de
91
microorganismos antagonistas o por el mismo patógeno. Sin embargo, en estudios
realizados por Elad et al. (1994) y Saligkarias et al. (2002b) con células viables de las
levaduras Rhodotorula glutinis, Cryptococcus albidus, Candida guilliermondii y Candida
oleophila, éstas no indujeron la producción de compuestos antifúngicos detectables cuando
fueron aplicadas en hojas de tomate. Por el contrario, se ha reportado que B. cinerea es
capaz de inducir la producción de compuestos antifúngicos como quitinasas, proteasas y
ácidos grasos en plantas de tabaco después de la aparición de los primeros síntomas de la
enfermedad (Elad, 1994). Otra posible explicación para la alta incidencia de la enfermedad a
pesar de haber tratado los tallos de tomate con células viables de la levadura
fotoestabilizada, podría ser que las partículas del filtro UV 08 hayan interferido en la difusión
hacia el patógeno, de estas sustancias antagonistas producidas por el tejido vegetal.
Aunque el filtro UV 08 pudo tener un efecto sobre la actividad biocontroladora de P. onychis,
no se puede descartar el hecho de que esta sustancia pueda ser tóxica para B. cinerea o
que tenga la capacidad de adherirse a la pared celular de sus conidios e hifas interfiriendo
directamente en el proceso de infección.
En el presente trabajo se evaluó la severidad de los síntomas causados por la enfermedad
del moho gris, expresada mediante un índice de severidad que representa el grado de
severidad de los síntomas en el que se encuentra el promedio de los segmentos de tallo
infectados (escala de valoración de 0 a 4) (Tabla 1). Los resultados obtenidos mostraron un
comportamiento progresivo de la severidad de los síntomas a través del tiempo (Figura 18).
Al finalizar el ensayo, los mayores índices de severidad se obtuvieron en los tallos tratados
con la levadura más filtro al 0.5% expuesta y no expuesta a la radiación y con el testigo
patógeno, siendo estos de 3.3, 3.8 y 3.9 respectivamente. En los tratamientos levadura con
filtro al 1% expuesta y no expuesta a la radiación, el índice de severidad fue de 2.4 y 2.2
respectivamente. En los tallos tratados con la levadura sin fotoestabilizar expuesta a la
radiación UV B se obtuvó un índice de severidad del 3.3, mientras que el índice de severidad
en el tratamiento levadura sin fotoestabilizar no expuesta fue del 1.3 (Tabla 2).
El análisis de varianza para el área bajo la curva (Anexó 14) no detectó diferencias
significativas entre tratamientos. Sin embargo, se observó un incremento mayor de la
severidad de los síntomas de la enfermedad en los tratamientos levadura con filtro al 0.5%
expuesta y no expuesta y levadura sin fotoestabilizar expuesta a la radiación en
comparación al tratamiento levadura con filtro al 1% expuesta. Este comportamiento sugiere
92
que la adición del filtro a una mayor concentración no solo contribuyó a reducir la incidencia
de la enfermedad sino también a retrasar el avance de la lesión ocasionada por el patógeno
en los tallos infectados. Esto se encuentra relacionado con la posible ocupación de sitio del
filtro UV 08 que fue sugerida anteriormente.
Tabla 2. Índice de severidad de los síntomas de la enfermedad obtenido con uno de los tratamientos
evaluados veinte días después de la inoculación. SF NE: Levadura sin filtro UV 08 no expuesta a la
radiación; SF E: Levadura sin filtro UV 08 expuesta a la radiación; 0,5% NE: Levadura con filtro UV 08
al 0.5% no expuesta a la radiación; 0,5% E: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% expuesta a la radiación;
1% NE: Levadura con filtro UV 08 al 1% no expuesta a la radiación; 1% E: Levadura con filtro UV 08 al
1% expuesta a la radiación; Bo 006: Testigo patógeno.
Tratamiento SF NE SF E 0.5% NE 0.5% E 1% NE 1% E Bo 006
Índice de severidad
1.3
3.0
3.8
3.3
2.2
2.4
3.9
Figura 18. Progreso de la severidad de los síntomas causados por Botrytis cinerea (Bo 006) en los
segmentos de tallo de tomate. SF NE: Levadura sin filtro UV 08 no expuesta a la radiación; SF E:
Levadura sin filtro UV 08 expuesta a la radiación; 0,5% NE: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% no
expuesta a la radiación; 0,5% E: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% expuesta a la radiación; 1% NE:
Levadura con filtro UV 08 al 1% no expuesta a la radiación; 1% E: Levadura con filtro UV 08 al 1%
expuesta a la radiación; Bo 006: Testigo patógeno.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
3 5 7 10 13 16 18 20
Tiempo después de la inoculación (días)
Indi
ce d
e S
ever
idad
SF NE SF E 0.5% NE 0.5% E 1% NE 1% E Bo 006
93
Con respecto a los resultados obtenidos para la incidencia de la esporulación de B. cinerea
en los segmentos de tallo veinte días después de la inoculación, los mayores porcentajes de
incidencia se obtuvieron en los tratamientos levadura con filtro al 0.5% expuesta y no
expuesta a la radiación y el testigo patógeno, siendo del 30%, del 40% y del 36.7%
respectivamente. En tallos tratados con la levadura más el filtro al 1% expuesta y no
expuesta a la radiación, se presentó una incidencia del 13.3% y del 10% respectivamente.
La menor incidencia de la esporulación se obtuvó en el tratamiento levadura sin
fotoestabilizar no expuesta con un 3.3%, mientras que en el tratamiento levadura sin
fotoestabilizar expuesta la radiación, la incidencia de la esporulación fue del 10%. El
progreso de la incidencia de la esporulación de B. cinerea a través del tiempo mostró un
comportamiento análogo al progreso de la incidencia de los síntomas de la enfermedad
como se observa en la Figura 19.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
3 5 7 10 13 16 18 20
Tiempo después de la inoculación (días)
Inci
denc
ia d
e es
poru
laci
ón (
%)
SF NE SF E 0.5% NE 0.5% E 1% NE 1% E Bo 006
Figura 19. Progreso de la incidencia de la esporulación de Botrytis cinerea (Bo 006) en los segmentos
de tallo de tomate. SF NE: Levadura sin filtro UV 08 no expuesta a la radiación; SF E: Levadura sin
filtro UV 08 expuesta a la radiación; 0,5% NE: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% no expuesta a la
radiación; 0,5% E: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% expuesta a la radiación; 1% NE: Levadura con
filtro UV 08 al 1% no expuesta a la radiación; 1% E: Levadura con filtro UV 08 al 1% expuesta a la
radiación; Bo 006: Testigo patógeno.
En cuanto a la intensidad de la esporulación, ésta se evaluó mediante un índice de
esporulación que representa el grado de esporulación de B. cinerea en el que se encuentra
el promedio de los segmentos de tallo infectados (escala de valoración de 0 a 4) (Tabla 1).
94
En los tratamientos testigo patógeno y levadura con filtro al 0.5% expuesta y no expuesta a
la radiación, el índice de esporulación fue 3.9. 3.8 y 3.6 respectivamente, resultado que
indica que el patógeno esporuló cubriendo completamente los segmentos de tallo infectados.
Con los tratamientos levadura fotoestabilizada con el filtro al 1% expuesta y no expuesta a la
radiación, se obtuvieron índices de esporulación de 2.7 y 2.2 respectivamente, mostrando
que el patógeno esporuló cubriendo en un 50% los segmentos de tallo infectados. Los
menores índices de esporulación se presentaron en los tratamientos levadura sin
fotoestabilizar expuesta y no expuesta a la radiación con valores de 3.3 y 1.3, resultado que
indica que el patógeno esporuló cubriendo hasta el 25% de la longitud de los segmentos de
tallo infectados (Figura 20).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
3 5 7 10 13 16 18 20
Tiempo después de la inoculación (días)
Indi
ce d
e E
spor
ulac
ión
SF NE SF E 0.5% NE 0.5% E 1% NE 1% E Bo 006
Figura 20. Intensidad de la esporulación de Botrytis cinerea (Bo 006) en segmentos de tallo de tomate.
SF NE: Levadura sin filtro UV 08 no expuesta a la radiación; SF E: Levadura sin filtro UV 08 expuesta a
la radiación; 0,5% NE: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% no expuesta a la radiación; 0,5% E: Levadura
con filtro UV 08 al 0.5% expuesta a la radiación; 1% NE: Levadura con filtro UV 08 al 1% no expuesta a
la radiación; 1% E: Levadura con filtro UV 08 al 1%) expuesta a la radiación. Bo 006: Testigo patógeno.
El análisis estadístico del área bajo la curva para la incidencia y la severidad de los síntomas
de la enfermedad (Anexo 13 y 14), así como para la incidencia y en la intensidad de la
esporulación de B. cinerea (Anexo 15 y 16), no detectó diferencias significativas (P> 0.05) al
comparar los tratamientos donde se inoculó P. onychis y B. cinerea con el testigo patógeno,
independientemente de los factores evaluados (exposición a la radiación UV B y
concentración de la sustancia fotoprotectora). Aunque la prueba de Tukey (α=0.05) para
95
cada una de estas variables no detectó diferencias significativas entre tratamientos debido a
que se presentaron altos coeficientes de variación, la menor incidencia de la enfermedad
para los tratamientos con la levadura sugiere que tuvieron un efecto biocontrolador sobre el
patógeno.
Al determinar la eficacia de los tratamientos evaluados en el control de la incidencia de los
síntomas y de la esporulación del moho gris, ésta disminuyó en los tratamientos expuestos a
la radiación UV B en comparación con los tratamientos no expuestos a este tipo de radiación
(Tabla 3). Este resultado sugiere que la radiación UV B causó un efecto negativo sobre la
actividad biocontroladora de la levadura P. onychis sin fotoestabilizar y fotoestabilizada con
el filtro UV 08.
El mayor porcentaje de eficacia de control de la incidencia de los síntomas y de la
esporulación se obtuvó con el tratamiento levadura sin fotoestabilizar no expuesta a la
radiación con el 91%, en comparación con los demás tratamientos, mientras que con el
tratamiento levadura sin fotoestabilizar expuesta a la radiación, la eficacia del control
disminuyó al 54.5% para incidencia de síntomas y al 72.8% para incidencia de la
esporulación, lo que confirma el efecto negativo de la radiación UV B.
Tabla 3. Eficacia de los tratamientos evaluados en el control de la incidencia de los síntomas y de la
esporulación de B. cinerea sobre segmentos de tallos de tomate.
EFICACIA DE CONTROL (%) Tratamiento Incidencia de los síntomas Incidencia de la esporulación
Levadura sin filtro no expuesta 91.0 91.0 Levadura sin filtro expuesta 54.5 72.8 Levadura con filtro al 0.5% (p/v) no expuesta 0.0 0.0 Levadura con filtro al 0.5% (p/v) expuesta 9.3 18.3 Levadura con filtro al 1% (p/v) no expuesta 63.8 63.8 Levadura con filtro al 1% (p/v) expuesta 27.2 36.5
La efectividad de las levaduras en el control de la infección y la severidad de los síntomas de
B. cinerea, ha sido determinada en diferentes ensayos in planta. Tal es el caso de los
aislamientos de Aureobasidium pullulans, Cryptococcus albidus, Cryptococcus laurentii var
96
flavescens, Cryptococcus luteus con los que se logró una reducción de la incidencia de la
enfermedad en un 97%, 49%, 44% y 90% respectivamente sobre segmentos de tallo de
tomate (Dik et al., 1999). Asimismo los aislamientos de las levaduras Rhodotorula glutinis
F147 y Cryptococcus albidus F131 y 053 fueron capaces de reducir la germinación de los
conidios de B. cinerea al 0%, 25% y 5% respectivamente, controlando la infección de flores y
hojas de plantas de fríjol (Elad et al., 1994).
El control de la incidencia e intensidad de la esporulación de B. cinerea sobre el tejido
vegetal necrótico, es importante en la supresión del inóculo secundario, lo cual en
condiciones de cultivo es importante para interrumpir el ciclo de vida de este patógeno y
evitar el desarrollo de una epidemia (Elad, 1996). Los resultados de la eficacia del control de
la esporulación de B. cinerea por parte de la levadura P. onychis , independientemente de su
combinación con auxiliares de formulación o de los efectos generados por factores como la
radiación UV, evidencian la efectividad de su actividad biocontroladora sobre este patógeno.
Resultados similares se han obtenido con levaduras como C. albidus, altamente efectiva con
una reducción del 86% en la incidencia de la esporulación sobre hojas de plantas de fresa a
10ºC (Jürgen, 2002). En otro trabajo se observó que un aislamiento de A. pullulans redujo la
esporulación de B. cinerea en más del 75% sobre segmentos de tallo de tomate (Dik et al.,
1999). Asimismo los aislamientos de las levaduras R. glutinis F147 y C. albidus F131 y 053
fueron capaces de reducir la esporulación sobre tejido vegetal muerto de flores, hojas y tallos
de fríjol y tomate (Elad et al., 1994).
Por otro lado, como se mencionó anteriormente, el análisis estadístico de la interacción de
los factores (concentración de la sustancia fotoestabilizadora y exposición a la radiación UV
B), no detectó un efecto significativo de los mismos sobre la actividad biocontroladora de la
levadura P. onychis (Anexo 17).
Al evaluar independientemente el factor concentración de la sustancia fotoprotectora UV 08,
el análisis del área bajo la curva para la incidencia de los síntomas y de la esporulación de la
enfermedad, detectó que estas variables fueron significativamente mayores en los
tratamientos donde se adicionó el fotoprotector UV 08 al 0.5% en comparación con aquellos
donde no fue adicionado (levadura sin fotoestabilizar). Sin embargo, la incidencia de la
infección y de la esporulación en los tratamientos donde se uso el fotoprotector UV 08 al
97
1% (p/v), no fue estadísticamente diferente de la obtenida con los tratamientos antes
mencionados (Anexo 18 y 19). Por el contrario, el factor concentración del filtro UV 08 no
afectó la severidad de los síntomas y la intensidad de la esporulación, ya que no se
encontraron diferencias estadísticas entre tratamientos al analizar estas variables (Anexo 20
y 21).
Al considerar independientemente el efecto de la exposición de las células de levadura a la
radiación UV B sobre su actividad biocontroladora, la prueba de Tukey (α=0.05) no detectó
diferencias estadísticas para las variables incidencia y severidad de los síntomas entre los
tratamientos donde se inoculó P. onychis y B. cinerea (P> 0.05) (Anexo 22 y 23) y tampoco
para las variables incidencia e intensidad de la esporulación de B. cinerea (Anexo 24 y 25), a
pesar de que hubo una pérdida total de la viabilidad para la levadura sin fotoestabilizar luego
de la exposición a la radiación UV B por 30 minutos. Esto sugiere que las células de la
levadura P. onychis a pesar de no ser viables en dicho tratamiento presentaron el mismo
efecto biocontrolador que las células viables.
El efecto de las células muertas de levaduras sobre la patogenicidad de B. cinerea ha sido
descrito en algunos estudios. Elad et al. (1994), evaluaron el efecto de las células muertas
de las levaduras saprofitas R. glutinis F147 y C. albidus F131 y 053, sobre la germinación de
los conidios de B. cinerea en la superficie de hojas de tomate y fríjol, obteniendo con las
células tratadas con rayos gamma (γ), una reducción significativa de la severidad de la
enfermedad. Los autores concluyeron que parte de la actividad biocontroladora de estas
levaduras no estaba asociada con la viabilidad celular.
El hecho de que células no viables puedan ejercer algún tipo de biocontrol ha sido asociado
con la inducción de resistencia en el tejido vegetal (Elad, 1996). Algunos estudios han
sugerido que parte del control de la pudrición de cítricos con levaduras puede estar
relacionado con la inducción de resistencia en el fruto (Wilson, 1989 citado por Elad, 1996).
Aunque, Elad et al. (1994) demostraron que no hay inducción de resistencia en plantas de
fríjol y tomate, al no detectar la producción de compuestos inhibitorios cuando las levaduras
evaluadas fueron aplicadas a grandes distancias de los conidios de B. cinerea, lo que
sugiere que este mecanismo ocurre necesariamente en presencia de la pared celular o de
células de levadura sobre el tejido vegetal. La presencia de carbohidratos y glicopéptidos en
la pared celular de las levaduras pueden actuar como elicitores capaces de desencadenar
98
respuestas de defensa en el hospedero como la producción de risitina, una de las principales
fitoalexinas sintetizadas por frutos y segmentos de tallo de tomate (D Harlingue et al., 1995).
También ha sido observado que las células viables y no viables de la levadura R. glutinis
(LS-11) son capaces de adherirse a las hifas de B. cinerea. Sin embargo, esta interacción
directa con el patógeno no fue asociada con el grado de eficacia de la actividad
biocontroladora de esta levadura (Castoria et al., 1997).
Contreras (2005) determinó la estabilidad de la actividad biocontroladora de prototipos a
base de la levadura P. onychis utilizada en el presente trabajo, sobre R. stolonifer,
inmediatamente después de la formulación, a los dos, cuatro y seis meses de
almacenamiento a 8ºC, 18ºC y 28ºC. Los resultados mostraron que a pesar de que hubo una
pérdida de viabilidad de las células, la actividad biocontroladora de la levadura se mantuvo
estable durante el almacenamiento a 8ºC y 18ºC. Este resultado fue atribuido a la
efectividad de las células muertas de la levadura en la ocupación de los sitios de adhesión
del patógeno, evitando que éste entrara en contacto con la herida e iniciara la infección en
frutos de tomate.
De acuerdo con los resultados del efecto de la radiación ultravioleta sobre la actividad
biocontroladora de Pichia onychis (Lv 027) fotoestabilizada con el filtro UV 08, se determinó
que no solo este tipo de radiación sino también el uso de la sustancia fotoprotectora UV 08
disminuyó la eficacia del control de la enfermedad del moho gris en comparación a la
levadura sin fotoestabilizar, a pesar de que esta sustancia tuvo un potencial efecto
fotoestabilizador frente a la radiación ultravioleta tipo B.
99
7. CONCLUSIONES
• El filtro UV 08 fue seleccionado por su compatibilidad y capacidad fotoestabilizadora de
la levadura Pichia onychis (Lv 027) frente a la radiación ultravioleta monocromática.
• Las radiaciones ultravioleta tipo B (302 nm) y tipo C (254 nm) redujeron
significativamente la viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027).
• La exposición de la levadura no fotoestabilizada a la radiación ultravioleta tipo B
disminuyó su actividad biocontroladora sobre Botrytis cinerea (Bo 006).
• La actividad biocontroladora de la levadura Pichia onychis (Lv 027) fue afectada
negativamente cuando se aplicó combinada con el filtro UV 08.
100
8. RECOMENDACIONES
• Realizar un estudio de susceptibilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) a la
radiación ultravioleta tipo A evaluando tiempos de exposición superiores a 10 minutos.
• Evaluar otros auxiliares de formulación de naturaleza química y biológica de forma
individual o combinada, que puedan proveer un efecto fotoestabilizador sin afectar la
actividad biocontroladora de la levadura Pichia onychis (Lv 027).
• Determinar la compatibilidad de auxiliares de formulación con efecto fotoprotector no
solo con las células de la levadura P. onychis sino con los demás excipientes que hacen
parte de la formulación del prototipo de bioplaguicida a base de esta levadura.
• Evaluar el efecto de la radiación solar sobre las células de levadura cuando son
aplicadas a la filosfera de las plantas de tomate en condiciones naturales.
101
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112
10. ANEXOS
Anexo 1. Concentración de células de levadura expresada en logaritmo con base 10
(células.ml-1) en los tratamientos sustancias fotoestabilizadoras y control al cabo de 48 y 96
horas de incubación.
48 Horas
Tratamiento R1 R2 R3 Promedio
Control 8,54257648 8,507855872 8,694605199 8,581679182
UV 03 5,93196611 5,981365509 6,103803721 6,005711782
UV 05 8,60852603 8,503790683 8,622214023 8,578176913
UV 06 8,44638181 8,568201724 8,57863921 8,531074249
UV 07 8,56820172 8,485721426 8,705863712 8,586595621
UV 08 8,43775056 8,463892989 8,572871602 8,491505051
UV 09 8,53655844 8,587710965 8,480006943 8,534758784
UV 10 7,86093662 8,217483944 8,292256071 8,123558879
UV 11 8,56702637 8,487138375 8,620136055 8,558100266
96 Horas Tratamiento R1 R2 R3 Promedio
Control 8,78675142 8,749736316 8,800717078 8,779068272 UV 03 8,28330123 8,307496038 8,120573931 8,237123733 UV 05 8,75587486 8,625312451 8,665580991 8,682256099 UV 06 8,51982799 8,657055853 8,662757832 8,613213893
UV 07 8,55870857 8,539076099 8,653212514 8,583665728 UV 08 8,43775056 8,389166084 8,575187845 8,467368164 UV 09 8,51851394 8,662757832 8,507855872 8,563042548 UV 10 8,26007139 8,264817823 8,1430148 8,22263467
UV 11 8,45939249 8,507855872 8,481442629 8,482896996
113
Anexo 2. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para la concentración de levadura
(células.ml-1) expresada en logaritmo con base 10 para la prueba de compatibilidad de la
levadura con auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora.
STATISTIX FOR WINDOWS 09/05/06, 10:33 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS HOMOGENEOUS VARIABLE MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- B 8.7791 I D 8.6823 I I F 8.6132 I I G 8.5866 I I H 8.5837 I I A 8.5817 I I C 8.5782 I I L 8.5630 I I R 8.5581 I I K 8.5348 I I E 8.5311 I I I 8.4915 .. I I S 8.4829 .. I I J 8.4674 .. I I Q 8.2371 .... I I O 8.2226 .... I I N 8.1236 ...... I P 6.0057 ........ I THERE ARE 5 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 5.301 REJECTI ON LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.2824 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.0753
114
Anexo 3. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo A
(λ= 365 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento CONTROL UV 05
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,079181246 6,255272505 6,113943352 5,903089987 6,113943352 6,278753601 6,230448921 6,255272505
2 6,041392685 5,954242509 6,301029996 6,041392685 6,079181246 6,230448921 6,113943352 6,301029996
3 5,84509804 6,146128036 6,176091259 6 6,322219295 6,342422681 6 6,322219295
4 6,278753601 5,903089987 6,146128036 6,079181246 6,113943352 6,278753601 6,301029996 6,342422681
5 6 6,301029996 6,301029996 6,041392685 6,278753601 6,230448921 6,230448921 6,079181246
6 5,903089987 6,079181246 6,079181246 6,079181246 6,079181246 6,204119983 6,176091259 6,255272505
7 6,041392685 5,954242509 6,176091259 6 6,278753601 6,204119983 6,146128036 6,113943352
8 6 5,77815125 6,079181246 5,903089987 6,113943352 6,301029996 6,079181246 6,113943352
9 6,041392685 6,079181246 6,204119983 6,079181246 6,079181246 6,342422681 6 6,146128036
10 6,255272505 6,041392685 6 6,079181246 6,176091259 6,278753601 6,176091259 6,255272505
11 6,113943352 6,176091259 6,146128036 6,278753601 6,204119983 6,322219295 6,204119983 5,84509804
12 6,113943352 6,079181246 6,255272505 6,322219295 6,230448921 6,301029996 6,146128036 6,301029996
13 6,041392685 6,230448921 6,146128036 6,301029996 6,255272505 6,079181246 6,079181246 6,301029996
14 6,301029996 6,255272505 6,176091259 6,204119983 6,255272505 6,079181246 6,079181246 6,204119983
15 6,255272505 6,278753601 6,176091259 6,204119983 6,230448921 6,176091259 6,230448921 6,204119983
16 6,204119983 6,146128036 6 6,230448921 6,447158031 6,113943352 6,230448921 6,278753601
17 6,342422681 6,113943352 6,278753601 6,146128036 6,342422681 6,176091259 6,230448921 6,278753601
18 6,255272505 6,361727836 6,041392685 6,146128036 6,380211242 6,176091259 6,113943352 6,255272505
19 6,041392685 6,255272505 6,146128036 6,176091259 6,255272505 6,301029996 6,113943352 6,301029996
20 6,301029996 6,176091259 6,204119983 6 6,301029996 6,255272505 6,176091259 6,342422681
Promedio 6,122769659 6,128241125 6,157345089 6,110736472 6,226842442 6,233570269 6,152864911 6,224815793
DS 0,142550657 0,148656657 0,088546168 0,122331871 0,106277374 0,081257405 0,080770435 0,118531014
115
Anexo 3. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo A
(λ= 365 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV 06 UV 07
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6 6,146128036 6,176091259 6,079181246 6,176091259 6,255272505 6,204119983 6,204119983
2 6,146128036 6,146128036 6,204119983 6 6,255272505 6,204119983 6,322219295 6,041392685
3 6,113943352 6 5,954242509 6,146128036 6,230448921 6,041392685 6,113943352 6,146128036
4 6,146128036 6,079181246 5,84509804 6,204119983 6,176091259 6,278753601 6,176091259 6,113943352
5 6,176091259 6 5,903089987 5,77815125 6,079181246 6 6,146128036 5,954242509
6 6,146128036 6,041392685 5,954242509 5,954242509 6,176091259 6,278753601 5,903089987 6,113943352
7 6,079181246 6,278753601 6 6,079181246 6,146128036 6,146128036 6,204119983 6
8 6,079181246 6,113943352 6 5,903089987 6,146128036 6,176091259 6,079181246 6,079181246
9 6,176091259 6,041392685 5,77815125 5,77815125 6,079181246 6,146128036 6,342422681 5,954242509
10 6,204119983 6,230448921 6,230448921 5,77815125 6,380211242 6,230448921 6,301029996 6,380211242
11 6,079181246 6 6,113943352 6,146128036 6,176091259 6,176091259 6,230448921 6,204119983
12 6,255272505 6,204119983 5,903089987 6,176091259 6,204119983 6,146128036 6,301029996 6,322219295
13 6,301029996 6,255272505 6,041392685 6,230448921 6,361727836 6,255272505 6,380211242 6,176091259
14 6,301029996 6,255272505 6,113943352 6,278753601 6,204119983 6,041392685 6,041392685 6,230448921
15 6,230448921 6,204119983 6,146128036 6,230448921 6,255272505 6,230448921 6,176091259 6,146128036
16 6,301029996 6,278753601 6,113943352 6,301029996 6,146128036 6,278753601 6,176091259 6,361727836
17 6,255272505 6,113943352 6,146128036 6,204119983 6,176091259 6,255272505 6,146128036 6,113943352
18 6,278753601 6,301029996 6,079181246 6,301029996 6 6,176091259 6,146128036 6,414973348
19 6,230448921 6,301029996 6,146128036 6,176091259 6,255272505 6,361727836 6,342422681 6,079181246
20 6,342422681 6,204119983 6,146128036 6,361727836 6,301029996 6,113943352 6,230448921 6,204119983
Promedio 6,192094141 6,159751523 6,049774529 6,105313328 6,196233918 6,189610529 6,198136943 6,162017909
DS 0,093156887 0,10588806 0,126648646 0,182657636 0,091605751 0,092275222 0,116065139 0,132911865
116
Anexo 3. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo A
(λ= 365 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV 08 UV 09
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,342422681 6,301029996 6,342422681 5,954242509 6,113943352 6,301029996 6,176091259 6
2 6,278753601 6,079181246 6,322219295 6,342422681 6,255272505 6,255272505 6,204119983 6
3 6 6,230448921 6,361727836 6,146128036 6,146128036 6,204119983 5,954242509 6,342422681
4 6,204119983 6,079181246 6,380211242 6,041392685 6,176091259 6,079181246 6,255272505 6,079181246
5 6,146128036 6,278753601 6,301029996 6,204119983 6,255272505 6,278753601 6,113943352 6,176091259
6 6,301029996 6,113943352 6,113943352 6,255272505 5,954242509 6,278753601 6,204119983 6,041392685
7 6,146128036 6,204119983 6,204119983 6,041392685 6,255272505 6,204119983 6,230448921 6,204119983
8 6,176091259 5,84509804 6,041392685 6,230448921 6,113943352 6,079181246 6,041392685 6,204119983
9 5,77815125 6,301029996 5,903089987 5,954242509 6,079181246 6,447158031 6,041392685 6,146128036
10 6,204119983 6,041392685 6,322219295 6,113943352 6,322219295 5,903089987 6,113943352 6,146128036
11 6,041392685 6,278753601 6,380211242 6,204119983 6,447158031 6,113943352 6,176091259 6,204119983
12 6,204119983 6,301029996 6,255272505 6,176091259 6,322219295 6,278753601 6,278753601 6,301029996
13 6,278753601 6,255272505 6,204119983 6,301029996 6,278753601 6,230448921 6,230448921 6,230448921
14 6,278753601 6,146128036 6,146128036 6,278753601 6,322219295 4,041392685 6,230448921 6,361727836
15 6,322219295 6,113943352 6,204119983 6,113943352 6,447158031 6,278753601 6,361727836 6,301029996
16 6,230448921 6,113943352 6 6,230448921 6,414973348 6,278753601 6,230448921 6,380211242
17 6,176091259 6,146128036 6,204119983 6,230448921 6,230448921 6,146128036 6,176091259 6,041392685
18 6,278753601 6,176091259 6,146128036 6,230448921 6,414973348 6,230448921 6,230448921 6,113943352
19 6,176091259 6,301029996 6,255272505 6,301029996 6,397940009 6,146128036 6,322219295 6,380211242
20 6,361727836 6,278753601 6,255272505 6,113943352 6,414973348 6,113943352 6,322219295 6,146128036
Promedio 6,196264843 6,17926264 6,217151056 6,173193208 6,26811919 6,094467714 6,194693273 6,18999136
DS 0,135282198 0,117816159 0,130049849 0,111478825 0,137950579 0,496411232 0,101729847 0,124048948
117
Anexo 3. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo A
(λ= 365 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV 11
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,113943352 6,079181246 6,342422681 5,84509804
2 6,204119983 6,146128036 6,176091259 6,176091259
3 6,230448921 6,146128036 5,903089987 6,079181246
4 6,204119983 5,903089987 6,204119983 6,230448921
5 6,176091259 6,146128036 5,84509804 6,204119983
6 6,079181246 6,301029996 6,041392685 6,176091259
7 6,041392685 6,301029996 6,176091259 6,176091259
8 6,342422681 6,301029996 6,176091259 6,146128036
9 6,230448921 6,146128036 6,278753601 6,146128036
10 6,204119983 6,176091259 6,255272505 6,255272505
11 6,322219295 6,230448921 6,301029996 6,322219295
12 6,301029996 6,146128036 6,278753601 6,176091259
13 6,255272505 6,255272505 6,322219295 6,255272505
14 6,230448921 6,146128036 6,431363764 6,230448921
15 6,342422681 6,255272505 6,380211242 6,322219295
16 6,278753601 6,301029996 6,255272505 6,278753601
17 6,204119983 6,230448921 6,255272505 6,397940009
18 6,301029996 6,278753601 6,322219295 6,301029996
19 6,255272505 6,301029996 6,322219295 6,301029996
20 6,255272505 6,414973348 6,397940009 6,278753601
Promedio 6,22860655 6,210272524 6,233246238 6,214920451
DS 0,08127304 0,110034046 0,152341675 0,115632392
118
Anexo 4. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el conteo de colonias (UFC.ml-1)
expresada en logaritmo con base 10 en los tratamientos expuestos a la radiación ultravioleta tipo A.
STATISTIX FOR WINDOWS DATUV, 03/26/07, 10:03 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS HOMOGENEOUS VARIABLE MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- UV9N 6.2681 I UV51 6.2336 I UV115 6.2332 I UV11N 6.2286 I UV5N 6.2268 I UV510 6.2248 II UV85 6.2172 II UV1110 6.2149 II UV111 6.2103 II UV75 6.1981 II UV8N 6.1963 II UV7N 6.1962 II UV95 6.1947 II UV6N 6.1921 II UV910 6.1900 II UV71 6.1896 II UV81 6.1793 II UV810 6.1732 II UV710 6.1620 II UV61 6.1598 II C5 6.1573 II UV55 6.1529 II C1 6.1282 II CN 6.1228 II C10 6.1107 II UV610 6.1053 II UV91 6.0945 II UV65 6.0498 .I THERE ARE 2 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 5.251 REJECTI ON LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.1760 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.0474
119
Anexo 5. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo B
(λ= 302 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento CONTROL UV 05
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,176091259 6,204119983 5,041392685 4,477121255 6,176091259 6,146128036 5,812913357 0
2 6,204119983 6,204119983 5,255272505 4,301029996 6,113943352 6,041392685 5,633468456 0
3 6,204119983 6,301029996 5,653212514 4,903089987 6,204119983 6,113943352 5,662757832 0
4 6,204119983 6,342422681 5,301029996 4 5,903089987 6,146128036 5,681241237 0
5 6,230448921 6,322219295 5,255272505 4,301029996 6,255272505 6 5,51851394 0
6 6,204119983 6,146128036 5,591064607 0 6,146128036 6,041392685 5,77815125 0
7 6,204119983 6,146128036 5,431363764 0 6,113943352 6,230448921 5,748188027 0
8 6,079181246 6,176091259 5,447158031 0 6,079181246 6,204119983 5,72427587 0
9 6,278753601 6,361727836 5,342422681 0 6,113943352 6,079181246 5,431363764 0
10 6,176091259 5,954242509 4,903089987 0 6,255272505 6,342422681 5,491361694 0
11 6,113943352 6,230448921 5,903089987 5 6,204119983 6,230448921 6 4,602059991
12 6,113943352 6,204119983 5,77815125 4,903089987 6,230448921 6,204119983 6 4
13 6,041392685 6,146128036 5,84509804 4,84509804 6,255272505 6,176091259 6,176091259 4
14 6,301029996 6,255272505 5,903089987 5 6,255272505 6,146128036 6,041392685 4,602059991
15 6,255272505 6,113943352 5,84509804 4,477121255 6,230448921 6,278753601 6,113943352 4,301029996
16 6,204119983 6,278753601 5,602059991 4,602059991 6,447158031 6,041392685 6,230448921 0
17 6,342422681 6,176091259 5,77815125 4 6,342422681 6,176091259 6,113943352 0
18 6,255272505 6,176091259 5,698970004 4 6,380211242 6,255272505 6,176091259 0
19 6,041392685 5,954242509 5,903089987 0 6,255272505 6,230448921 5,903089987 0
20 6,301029996 6,146128036 6 0 6,301029996 5,278753601 6,204119983 0
Promedio 6,1965493 6,19197245 5,57390389 2,94048203 6,21313214 6,11813292 5,87206781 1,0752575
DS 0,08418835 0,10810668 0,31298485 2,23480566 0,11836888 0,21695608 0,25687916 1,91576833
120
Anexo 5. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo B
(λ= 302 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV06 UV 07
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,380211242 6,079181246 4,301029996 0 6,38021124 6,04139269 4,30103 0
2 6,397940009 6,113943352 4,602059991 0 6,39794001 6,07918125 4,60205999 0
3 6,146128036 6 4,477121255 0 6,14612804 5,95424251 4,47712125 0
4 6 6,079181246 4,84509804 0 6 6 4,84509804 0
5 6,230448921 5,954242509 4,698970004 0 6,23044892 6,23044892 4,84509804 0
6 6,322219295 6,176091259 5,079181246 0 6,32221929 6 4,69897 0
7 6 6,079181246 5,301029996 0 6 5,95424251 5,07918125 0
8 6,230448921 5,698970004 5,176091259 0 6,23044892 6,07918125 5,30103 0
9 6,380211242 6,230448921 5,531478917 0 6,38021124 6,11394335 5,17609126 0
10 6,146128036 5,903089987 4,84509804 0 6,14612804 6,04139269 5,53147892 0
11 6,079181246 6,041392685 6,176091259 0 6,17609126 6,17609126 5,23044892 0
12 6,255272505 5,903089987 5,84509804 0 6,20411998 6 5,30103 0
13 6,301029996 5,903089987 5,77815125 0 6,36172784 6,20411998 5,32221929 0
14 6,301029996 6,204119983 5,77815125 0 6,20411998 6,20411998 5,23044892 0
15 6,230448921 6,255272505 5,77815125 0 6,25527251 6,2787536 5,34242268 0
16 6,301029996 6,113943352 5,698970004 0 6,14612804 6,07918125 5,20411998 0
17 6,255272505 6,079181246 6,041392685 0 6,17609126 6,23044892 5,32221929 0
18 6,278753601 6,342422681 5,903089987 0 6 6,11394335 5,04139269 0
19 6,230448921 5,954242509 5,903089987 0 6,25527251 6,14612804 5,38021124 0
20 6,342422681 6,230448921 5,954242509 0 6,30103 6,17609126 5,25527251 0
Promedio 6,2404313 6,06707668 5,38567935 0 6,21567945 6,10514514 5,07434721 0
DS 0,11555448 0,1533928 0,58593337 0 0,12319522 0,09784412 0,33510262 0
121
Anexo 5. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo B
(λ= 302 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV 08 UV 09
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,17609126 6,32221929 6,43136376 6 6 6,25527251 5,90308999 0
2 6,11394335 6,11394335 6,23044892 5,90308999 6,11394335 6,23044892 6 0
3 6,20411998 6,23044892 6,25527251 6,20411998 6,11394335 6,30103 6,11394335 0
4 5,90308999 6,23044892 6,04139269 6,36172784 6,14612804 6,20411998 5,84509804 0
5 6,25527251 6,2787536 6,34242268 6 6,11394335 6,23044892 6,14612804 0
6 6,14612804 6,34242268 6,07918125 6,34242268 6,04139269 6,20411998 6,04139269 0
7 6,11394335 6,41497335 6,30103 6,53147892 6,04139269 6,30103 5,95424251 0
8 6,07918125 6,50514998 6,20411998 6,5797836 6,04139269 6,34242268 6,04139269 5
9 6,11394335 6,34242268 6,2787536 6,39794001 6,11394335 6,34242268 6 5
10 6,25527251 6,25527251 6,07918125 6,41497335 5,77815125 6,2787536 6 5
11 6,04139269 6,17609126 6 5,77815125 6,44715803 6,2787536 6,14612804 5,07918125
12 6,20411998 6,2787536 6,17609126 5,77815125 6,32221929 6,34242268 6,23044892 5,17609126
13 6,2787536 6,17609126 6,20411998 6,07918125 6,2787536 6,17609126 6,25527251 5,38021124
14 6,2787536 6,23044892 6,04139269 5,84509804 6,32221929 6,23044892 6,17609126 5,38021124
15 6,32221929 6,17609126 5,95424251 5,95424251 6,44715803 6,34242268 6 5,32221929
16 6,23044892 6,30103 6,14612804 5,69897 6,41497335 6,34242268 6,25527251 5,30103
17 6,17609126 6,25527251 6,14612804 5,90308999 6,23044892 6,17609126 6,17609126 5,30103
18 6,2787536 6,2787536 6,2787536 5,69897 6,41497335 6,23044892 6,17609126 5,43136376
19 6,17609126 6 6,23044892 5,90308999 6,39794001 6,07918125 6,04139269 5,39794001
20 6,36172784 6,2787536 6,20411998 6 6,41497335 6,11394335 6,23044892 5,51851394
Promedio 6,18546688 6,25936706 6,18122958 6,06872403 6,2097524 6,25011479 6,08662623 3,4143896
DS 0,10694074 0,10696158 0,1215293 0,27953796 0,18652609 0,07744382 0,12048011 2,57458779
122
Anexo 5. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo B
(λ= 302 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV 11
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,39794001 6,30103 5,90308999 4
2 6,30103 6,34242268 5,84509804 4
3 6,25527251 6,23044892 5,47712125 4
4 6,34242268 6,04139269 5,47712125 0
5 6,23044892 6,30103 5,90308999 0
6 6,2787536 6,07918125 5,84509804 0
7 6 5,90308999 6,04139269 0
8 6,11394335 5,90308999 6,04139269 0
9 6,17609126 6,11394335 6,04139269 0
10 6,25527251 6,20411998 5,95424251 0
11 6,32221929 6,20411998 5,95424251 4
12 6,30103 6,2787536 6,04139269 0
13 6,25527251 6,23044892 6 0
14 6,23044892 6,11394335 6 0
15 6,34242268 6,17609126 5,84509804 0
16 6,2787536 6,17609126 6 0
17 6,20411998 6 5,90308999 0
18 6,30103 6,25527251 5,77815125 0
19 6,25527251 6,17609126 5,90308999 0
20 6,25527251 6,25527251 5,95424251 0
Promedio 6,25485084 6,16429167 5,8954173 0,8
DS 0,08665214 0,12607183 0,16221414 1,64156536
123
Anexo 6. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el conteo de colonias (UFC.ml-1)
expresada en logaritmo con base 10 en los tratamientos expuestos a la radiación ultravioleta
tipo B.
STATISTIX FOR WINDOWS DATUVB, 03/26/07, 10:09 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS HOMOGENEOUS VARIABLE MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- UV81 6.2594 I UV11N 6.2549 I UV91 6.2501 I UV6N 6.2404 I UV7N 6.2157 I UV5N 6.2131 I UV9N 6.2098 I CN 6.1965 I C1 6.1920 I UV8N 6.1855 I UV85 6.1812 I UV111 6.1643 I UV51 6.1181 I UV71 6.1051 I UV95 6.0866 I UV810 6.0687 I UV61 6.0671 II UV115 5.8954 II UV55 5.8721 II C5 5.5739 II UV65 5.3857 II UV75 5.0743 .I UV910 3.4144 ..I C10 2.9405 ..I UV510 1.0753 ...I UV1110 0.8000 ...I THERE ARE 4 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 5.199 REJECTI ON LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 0.9929 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.2701
124
Anexo 7. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo C
(λ= 254 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento CONTROL UV 05
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,17609126 4,30103 0 0 6,17609126 0 0 0
2 6,20411998 4,77815125 0 0 6,11394335 0 0 0
3 6,20411998 4,60205999 0 0 6,20411998 0 0 0
4 6,20411998 4 0 0 5,90308999 0 0 0
5 6,23044892 4,47712125 0 0 6,25527251 0 0 0
6 6,20411998 4,77815125 0 0 6,14612804 0 0 0
7 6,20411998 0 0 0 6,11394335 0 0 0
8 6,07918125 0 0 0 6,07918125 0 0 0
9 6,2787536 0 0 0 6,11394335 0 0 0
10 6,17609126 0 0 0 6,25527251 0 0 0
11 6,07918125 5,23044892 0 0 6,11394335 4 0 0
12 6,04139269 4,90308999 0 0 6,07918125 0 0 0
13 5,84509804 4,47712125 0 0 6,32221929 0 0 0
14 6,2787536 4,60205999 0 0 6,11394335 0 0 0
15 6 4 0 0 6,2787536 0 0 0
16 5,90308999 4,30103 0 0 6,07918125 0 0 0
17 6,04139269 4,47712125 0 0 6,2787536 0 0 0
18 6 4 0 0 6,11394335 0 0 0
19 6,04139269 0 0 0 6,07918125 0 0 0
20 6,25527251 0 0 0 6,17609126 0 0 0
Promedio 6,12233698 3,14636926 0 0 6,14980886 0,2 0 0
DS 0,12476458 2,1343806 0 0 0,09682052 0,89442719 0 0
125
Anexo 7. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo C
(λ= 254 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV 06 UV 07
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,38021124 5,11394335 0 0 6,38021124 5 0 0
2 6,39794001 5,23044892 0 0 6,39794001 5,47712125 0 0
3 6,14612804 5,20411998 0 0 6,14612804 5,60205999 0 0
4 6 5,23044892 0 0 6 6,14612804 0 0
5 6,23044892 5,14612804 0 0 6,23044892 6,04139269 0 0
6 6,32221929 4 0 0 6,32221929 5,60205999 0 0
7 6 4 0 0 6 5,69897 0 0
8 6,23044892 4,47712125 0 0 6,23044892 6,07918125 0 0
9 6,38021124 4,60205999 0 0 6,38021124 0 0 0
10 6,14612804 5 0 0 6,14612804 0 0 0
11 6 4 0 0 6,17609126 4 0 0
12 6,14612804 4 0 0 6,25527251 4 0 0
13 6,11394335 4 0 0 6,23044892 4 0 0
14 6,14612804 0 0 0 6,17609126 4,30103 0 0
15 6,17609126 0 0 0 6,07918125 0 0 0
16 6,14612804 0 0 0 6,17609126 0 0 0
17 6,07918125 0 0 0 6,14612804 0 0 0
18 6,07918125 0 0 0 6,14612804 0 0 0
19 6,17609126 0 0 0 6,07918125 0 0 0
20 6,20411998 0 0 0 6,38021124 0 0 0
Promedio 6,17503641 3,00021352 0 0 6,203928035 3,09739716 0 0
DS 0,12155395 2,30138464 0 0 0,121306903 2,676353611 0 0
126
Anexo 7. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo C
(λ= 254 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV 08 UV 09
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos N o expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,17609126 5,36172784 4 4,30103 6 4,60205999 4 4
2 6,11394335 5,38021124 4,30103 4,77815125 6,11394335 4,47712125 4 0
3 6,20411998 5,36172784 0 4,69897 6,11394335 4,77815125 4 0
4 5,90308999 5,20411998 0 0 6,14612804 4,30103 4,47712125 0
5 6,25527251 5,23044892 0 0 6,11394335 4,47712125 0 0
6 6,14612804 5,34242268 0 0 6,04139269 4,47712125 0 0
7 6,11394335 5,2787536 0 0 6,04139269 4,47712125 0 0
8 6,07918125 5,11394335 0 0 6,04139269 4,47712125 0 0
9 6,11394335 5,11394335 0 0 6,11394335 4,95424251 0 0
10 6,25527251 4,90308999 0 0 5,77815125 4,69897 0 0
11 6,34242268 5,36172784 4 4 6,11394335 4,60205999 4 0
12 6,2787536 5,44715803 4,47712125 0 6,25527251 4,47712125 0 0
13 6 5,38021124 4,47712125 0 6,14612804 4,84509804 0 0
14 6,20411998 5,2787536 4,30103 0 6,17609126 4,69897 0 0
15 6,14612804 5,25527251 4,30103 0 6,25527251 4,77815125 0 0
16 6,30103 5,462398 0 0 5,95424251 5,11394335 0 0
17 6,14612804 5,462398 0 0 6,25527251 5,30103 0 0
18 6,17609126 5,30103 0 0 6,11394335 5,20411998 0 0
19 5,77815125 5,34242268 0 0 6,07918125 5,11394335 0 0
20 6,20411998 5,39794001 0 0 6,32221929 5,36172784 0 0
Promedio 6,14689652 5,298985034 1,492866625 0,888907563 6,10878987 4,76081125 1,02385606 0,2
DS 0,133619845 0,136801402 2,090237853 1,829678925 0,12073166 0,31592112 1,82207213 0,89442719
127
Anexo 7. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo C
(λ= 254 nm). Datos correspondientes al logaritmo con base 10 de UFC.ml-1 por réplica.
Tratamiento UV 11
Réplica No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
1 6,39794001 4,30103 0 0
2 6,30103 4,69897 0 0
3 6,25527251 4,95424251 0 0
4 6,34242268 4,30103 0 0
5 6,23044892 4 0 0
6 6,2787536 5,25527251 0 0
7 6 5,2787536 0 0
8 6,11394335 5,36172784 0 0
9 6,17609126 4,60205999 0 0
10 6,25527251 4,69897 0 0
11 6,11394335 5,53147892 0 0
12 6,20411998 5,20411998 0 0
13 6,23044892 5,23044892 0 0
14 6,20411998 5,2787536 0 0
15 6,17609126 5,2787536 0 0
16 6,07918125 5,20411998 0 0
17 6,04139269 5,30103 0 0
18 6,34242268 5,11394335 0 0
19 6,23044892 5,11394335 0 0
20 6,20411998 5,17609126 0 0
Promedio 6,20887319 4,99423697 0 0
DS 0,10240113 0,41762257 0 0
128
Anexo 8. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el conteo de colonias
(UFC.ml-1) expresada en logaritmo con base 10 en los tratamientos expuestos a la
radiación ultravioleta tipo C.
STATISTIX FOR WINDOWS DATUVC, 03/26/07, 10:24 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS HOMOGENEOUS VARIABLE MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- UV11N 6.2089 I UV7N 6.2039 I UV6N 6.1750 I I UV5N 6.1498 I I UV8N 6.1469 I I CN 6.1223 I I UV9N 6.1088 I I UV81 5.2990 I I UV111 4.9942 I I UV91 4.7608 .. I C1 3.1464 .... I UV71 3.0974 .... I UV61 3.0002 .... I UV85 1.4929 ...... I UV95 1.0239 ...... I UV810 0.8889 ...... I UV51 0.2000 ...... I UV910 0.2000 ...... I THERE ARE 4 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 4.932 REJECTI ON LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 1.4247 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.4085
129
Anexo 9. Porcentaje de incidencia de los síntomas de la enfermedad para cada día de lectura.
INCIDENCIA DE SINTOMAS (%)
Tratamiento Repetición Día 3 Día 5 Día 7 Día 10 Día 13 Día 16 Día 18 Día 20 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Lv 027 *SF no expuesto + Bo006
3 0 0 10 10 10 10 10 10 1 0 0 10 20 20 20 20 20 2 0 0 10 10 10 10 10 10
Lv 027 SF expuesto + Bo006
3 0 0 0 10 10 10 20 20 1 0 0 0 20 30 30 40 50 2 0 0 0 10 20 30 30 30
Lv 027 + **CF 0.5% no expuesta + Bo006
3 0 0 20 30 30 30 40 40 1 0 0 10 10 20 30 30 30 2 0 0 10 30 30 30 40 50
Lv 027 + CF 0.5% expuesta + Bo006
3 0 0 10 10 10 10 20 20 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 10 10 20 20 20
Lv 027 +CF 1% no expuesta + Bo006
3 0 0 0 20 20 20 20 20 1 0 0 0 10 20 30 30 40 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Lv 027 + CF 1% expuesta + Bo006
3 0 0 20 30 20 40 40 40 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Testigo Absoluto
3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 10 10 10 10 10 10 10 2 0 0 0 20 40 40 60 60
Testigo Patógeno
3 0 0 10 30 30 30 30 40
130
Anexo 10. Porcentaje de incidencia de la esporulación de Botrytis cinerea para cada día de lectura.
INCIDENCIA DE ESPORULACIÓN (%) Tratamiento Repetición Día 3 Día 5 Día 7 Día 10 Día 13 Día 16 Día 18 Día 20
1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Lv 027 *SF no expuesto + Bo006
3 0 0 0 0 10 10 10 10 1 0 0 0 0 0 0 10 10 2 0 0 10 10 10 10 10 10
Lv 027 SF expuesto + Bo006
3 0 0 0 0 0 0 10 10 1 0 0 0 0 20 30 40 50 2 0 0 0 10 10 20 30 30
Lv 027 + **CF 0.5% no expuesta + Bo006
3 0 0 0 30 30 30 40 40 1 0 0 10 10 20 20 30 30 2 0 0 0 30 30 30 40 50
Lv 027 + CF 0.5% expuesta + Bo006
3 0 0 0 0 10 10 10 10 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 10 10 20 20 20
Lv 027 +CF 1% no expuesta + Bo006
3 0 0 0 10 20 20 20 20 1 0 0 0 10 20 20 30 30 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Lv 027 + CF 1% expuesta + Bo006
3 0 0 0 10 20 40 40 40 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Testigo Absoluto
3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 10 10 10 10 10 10 10 2 0 0 0 20 40 40 50 60
Testigo Patógeno
3 0 0 10 20 0 30 30 40
131
Anexo 11. Número de segmentos de tallo correspondiente al grado de severidad de los síntomas de la enfermedad por cada día de lectura.
GRADO DE SEVERIDAD DE LOS SINTOMAS (Número de segme ntos de tallo) Día 3 Día 5 Día 7 Día 10
Tratamiento Repetición 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Lv 027 *SF no expuesto +
Bo006 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 9 0 0 1 0 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 8 2 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 9 0 1 0 0
Lv 027 SF expuesto +
Bo006 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 8 2 0 0 0 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 8 0 1 1 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 0 0 1
Lv 027 + **CF 0.5% no
expuesta + Bo006
3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 8 0 2 0 0 7 0 0 0 3
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 9 0 0 0 1 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 1 0 0 7 0 0 0 3
Lv 027 + CF 0.5%
expuesta + Bo006
3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 9 0 1 0 0
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 0 0 1
Lv 027 +CF 1% no
expuesta + Bo006
3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 8 1 0 1 0
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 0 0 1 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Lv 027 + CF 1% expuesta
+ Bo006 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 8 2 0 0 0 7 1 0 2 0 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Testigo
Absoluto 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 1 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 9 0 1 0 0 9 0 0 0 1 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 8 0 2 0 0
Testigo
Patógeno 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 7 1 1 0 1
132
Anexo 11. Número de segmentos de tallo correspondiente al grado de severidad de los síntomas de la enfermedad por cada día de lectura.
GRADO DE SEVERIDAD DE LOS SINTOMAS (Número de segme ntos de tallo) Día 13 Día 16 Día 18 Día 20
Tratamiento Repetición 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Lv 027 *SF no
expuesto + Bo006
3 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1
1 8 1 1 0 0 8 0 0 2 0 8 0 0 2 0 8 0 0 2 0 2 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1
Lv 027 SF expuesto +
Bo006 3 9 1 0 0 0 9 1 0 0 0 8 1 1 0 0 8 1 0 1 0 1 7 0 1 0 2 7 0 0 0 3 6 0 1 0 3 5 0 1 1 3 2 8 0 1 0 1 7 0 1 0 2 7 0 0 1 2 7 0 0 0 3
Lv 027 + **CF 0.5%
no expuesta + Bo006
3 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 6 0 0 1 3 6 0 0 0 4
1 8 0 0 0 2 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 2 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 6 0 1 0 3 5 0 1 1 3
Lv 027 + CF 0.5%
expuesta + Bo006
3 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 8 1 0 0 1 8 1 0 0 1
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 9 0 0 0 1 8 1 0 0 1 8 1 0 0 1 8 1 0 0 1
Lv 027 +CF 1% no
expuesta + Bo006
3 8 0 1 0 1 8 0 0 0 2 8 0 0 0 2 8 0 0 0 2
1 8 0 0 0 2 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 6 1 0 0 3 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Lv 027 + CF 1%
expuesta + Bo006
3 8 0 0 0 2 6 0 0 0 4 6 0 0 0 4 6 0 0 0 4
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Testigo
Absoluto 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 2 6 0 0 1 3 6 0 0 0 4 4 1 1 0 4 4 0 0 1 5
Testigo
Patógeno 3 7 0 0 1 2 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 6 0 0 1 3
133
Anexo 12. Número de segmentos de tallo correspondiente al grado de esporulación de B. cinerea por cada día de lectura.
GRADO DE INTENSIDAD DE LA ESPORULACIÓN (Número de s egmentos de tallo) Día 3 Día 5 Día 7 Día 10
Tratamiento Repetición 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Lv 027 *SF no expuesto
+ Bo006 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 9 1 0 0 0
Lv 027 SF expuesto +
Bo006 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0
Lv 027 + **CF 0.5%
no expuesta + Bo006
3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 7 0 1 1 1
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 0 1 0 9 0 1 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 7 0 0 3 0
Lv 027 + CF 0.5%
expuesta + Bo006
3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 0 1 0
Lv 027 +CF 1% no
expuesta + Bo006
3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 1 0 0
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 1 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Lv 027 + CF 1%
expuesta + Bo006
3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 1 0 0
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Testigo
Absoluto 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 1 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 9 0 1 0 0 9 0 0 0 1 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 8 2 0 0 0
Testigo
Patógeno 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 8 0 1 1 0
134
Anexo 12. Número de segmentos de tallo correspondiente al grado de esporulación de B. cinerea por cada día de lectura.
GRADO DE INTENSIDAD DE LA ESPORULACIÓN (Número de s egmentos de tallo) Día 13 Día 16 Día 18 Día 20
Tratamiento Repetición 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Lv 027 *SF no expuesto
+ Bo006 3 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 0 0 1 0 9 0 0 1 0 2 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1
Lv 027 SF expuesto +
Bo006 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 9 1 0 0 0 9 0 0 1 0 1 8 0 2 0 0 7 0 1 0 2 6 0 1 0 3 5 0 1 1 3 2 9 0 0 0 1 8 0 1 0 1 7 1 0 1 1 7 0 1 0 2
Lv 027 + **CF 0.5%
no expuesta + Bo006
3 7 0 0 1 2 7 0 0 0 3 6 0 0 1 3 6 0 0 0 4
1 8 1 0 0 1 7 1 0 0 2 7 0 1 0 2 7 0 0 0 3 2 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 6 1 0 0 3 5 0 1 1 3
Lv 027 + CF 0.5%
expuesta + Bo006
3 9 0 1 0 0 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 9 0 0 0 1 8 1 0 0 1 8 1 0 0 1 8 1 0 0 1
Lv 027 +CF 1% no
expuesta + Bo006
3 8 0 1 0 1 8 0 0 1 1 8 0 0 0 2 8 0 0 0 2
1 8 1 0 0 1 7 0 1 0 2 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Lv 027 + CF 1%
expuesta + Bo006
3 8 0 0 2 0 6 0 0 1 3 6 0 0 0 4 6 0 0 0 4
1 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 2 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0
Testigo
Absoluto 3 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 9 0 0 0 1 2 6 0 1 0 3 6 0 0 0 4 5 1 0 0 4 4 0 0 1 5
Testigo
Patógeno 3 7 0 1 0 2 7 0 0 0 3 7 0 0 0 3 7 0 0 1 3
135
Anexo 13. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el área bajo la curva del
progreso de la incidencia de síntomas de la enfermedad.
Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 33657.14286 5609.52381 2.12 0.1154 Error 14 37000.00000 2642.85714 Corrected Total 20 70657.14286 R-Square Coeff Var Root MSE INCIDEN Mean 0.476345 59.48117 51.40873 86.42857 Test de Normalidad Test --Statistic--- -----p Value------ Shapiro-Wilk W 0.969809 Pr < W 0.7288 Prueba de Tukey (HSD) Tukey Grouping Mean N TRATAMIENTO A 136.67 3 3 A A 128.33 3 7 A A 111.67 3 4 A A 90.00 3 6 A A 68.33 3 2 A A 53.33 3 5 A A 16.67 3 1 Anexo 14. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el área bajo la curva del
progreso de la severidad de los síntomas de la enfermedad.
Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 351.320000 58.553333 1.22 0.3521 Error 14 670.821667 47.915833 Corrected Total 20 1022.141667 R-Square Coeff Var Root MSE IND_SEVE Mean 0.343710 55.74867 6.922126 12.41667 Test de Normalidad Test --Statistic--- -----p Value------ Shapiro-Wilk W 0.983162 Pr < W 0.9632
136
Prueba de Tukey (HSD) Tukey Grouping Mean N TRATAMIENTO A 16.983 3 4 A A 16.767 3 7 A A 16.600 3 3 A A 11.483 3 6 A A 9.750 3 5 A A 9.500 3 2 A A 5.833 3 1
Anexo 15. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el área bajo la curva del
progreso de la incidencia de la esporulación de B. cinerea.
Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 30990.47619 5165.07937 2.24 0.1007 Error 14 32333.33333 2309.52381 Corrected Total 20 63323.80952 R-Square Coeff Var Root MSE ESPORULA Mean 0.489397 68.88789 48.05751 69.76190 Test de Normalidad Test --Statistic--- -----p Value----- Shapiro-Wilk W 0.961578 Pr < W 0.5485 Prueba de Tukey (HSD) Tukey Grouping Mean N TRATAMIENTO A 116.67 3 3 A A 111.67 3 7 A A 96.67 3 4 A A 75.00 3 6 A A 50.00 3 5 A A 26.67 3 2 A A 11.67 3 1
137
Anexo 16. Comparación de medias de Tukey (α=0.05) para el área bajo la curva del
progreso de la intensidad de la esporulación de B. cinerea.
Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 291.4352786 48.5725464 1.28 0.3257 Error 14 529.4802667 37.8200190 Corrected Total 20 820.9155452 R-Square Coeff Var Root MSE IND_ESPO Mean 0.355012 58.15150 6.149798 10.57548 Test de Normalidad Test --Statistic--- -----p Value------ Shapiro-Wilk W 0.976296 Pr < W 0.8640 Prueba de Tukey (HSD) Tukey Grouping Mean N TRATAMIENTO A 16.340 3 7 A A 14.093 3 4 A A 12.652 3 3 A A 9.527 3 6 A A 9.250 3 5 A A 7.500 3 2 A A 4.667 3 1 Anexo 17. Interacción de los factores evaluados (concentración de la sustancia
fotoestabilizadora y exposición a la radiación UV B) (α=0.05).
Variable Incidencia de síntomas
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
DOSIS_FILTRO 2 20552.77778 10276.3888 9 4.60 0.0328 EXPOSICION 1 2005.55556 2005.5555 6 0.90 0.3619 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4952.77778 2476.3888 9 1.11 0.3613 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 20552.77778 10276.3888 9 4.60 0.0328 EXPOSICION 1 2005.55556 2005.5555 6 0.90 0.3619 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4952.77778 2476.3888 9 1.11 0.3613
138
Variable Severidad de síntomas
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 260.1975000 130.098750 0 2.36 0.1369 EXPOSICION 1 16.7234722 16.723472 2 0.30 0.5921 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 8.1702778 4.085138 9 0.07 0.9291
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 260.1975000 130.098750 0 2.36 0.1369 EXPOSICION 1 16.7234722 16.723472 2 0.30 0.5921 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 8.1702778 4.085138 9 0.07 0.9291
Variable Incidencia de esporulación
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 22969.44444 11484.7222 2 5.79 0.0174 EXPOSICION 1 200.00000 200.0000 0 0.10 0.7564 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 1675.00000 837.5000 0 0.42 0.6651 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 22969.44444 11484.7222 2 5.79 0.0174 EXPOSICION 1 200.00000 200.0000 0 0.10 0.7564 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 1675.00000 837.5000 0 0.42 0.6651
Variable Intensidad de esporulación
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 159.8571194 79.928559 7 1.86 0.1981 EXPOSICION 1 10.3588347 10.358834 7 0.24 0.6324 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4.9152528 2.457626 4 0.06 0.9447 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 159.8571194 79.928559 7 1.86 0.1981 EXPOSICION 1 10.3588347 10.358834 7 0.24 0.6324 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4.9152528 2.457626 4 0.06 0.9447
Anexo 18. Comparación de medias de Tukey para el factor concentración de la
sustancia fotoestabilizadora y la variable incidencia de los síntomas (α=0.05).
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
DOSIS_FILTRO 2 20552.77778 10276.3888 9 4.60 0.0328 EXPOSICION 1 2005.55556 2005.5555 6 0.90 0.3619 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4952.77778 2476.3888 9 1.11 0.3613
139
Source DF Type III SS Mean Squar e F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 20552.77778 10276.3888 9 4.60 0.0328 EXPOSICION 1 2005.55556 2005.5555 6 0.90 0.3619 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4952.77778 2476.3888 9 1.11 0.3613 Prueba de Tukey (HSD) DOSIS_ Tukey Grouping Mean N FILTRO A 124.17 6 0.5 A B A 71.67 6 1 B B 42.50 6 0
Anexo 19. Comparación de medias de Tukey para el factor concentración de la
sustancia fotoestabilizadora y la variable incidencia de la esporulación (α=0.05).
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 22969.44444 11484.7222 2 5.79 0.0174 EXPOSICION 1 200.00000 200.0000 0 0.10 0.7564 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 1675.00000 837.5000 0 0.42 0.6651 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 22969.44444 11484.7222 2 5.79 0.0174 EXPOSICION 1 200.00000 200.0000 0 0.10 0.7564 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 1675.00000 837.5000 0 0.42 0.6651
Prueba de Tukey (HSD) DOSIS_ Tukey Grouping Mean N FILTRO A 106.67 6 0.5 A B A 62.50 6 1 B B 19.17 6 0 Anexo 20. Comparación de medias de Tukey para el factor concentración de la
sustancia fotoestabilizadora y la variable severidad de los síntomas (α=0.05).
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 260.1975000 130.098750 0 2.36 0.1369 EXPOSICION 1 16.7234722 16.723472 2 0.30 0.5921 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 8.1702778 4.085138 9 0.07 0.9291
140
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 260.1975000 130.098750 0 2.36 0.1369 EXPOSICION 1 16.7234722 16.723472 2 0.30 0.5921 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 8.1702778 4.085138 9 0.07 0.9291 Prueba de Tukey (HSD) DOSIS_ Tukey Grouping Mean N FILTRO A 16.792 6 0 .5 A A 10.617 6 1 A A 7.667 6 0
Anexo 21. Comparación de medias de Tukey para el factor concentración de la
sustancia fotoestabilizadora y la variable intensidad de la esporulación (α=0.05).
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 159.8571194 79.928559 7 1.86 0.1981 EXPOSICION 1 10.3588347 10.358834 7 0.24 0.6324 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4.9152528 2.457626 4 0.06 0.9447 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 159.8571194 79.928559 7 1.86 0.1981 EXPOSICION 1 10.3588347 10.358834 7 0.24 0.6324 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4.9152528 2.457626 4 0.06 0.9447
Prueba de Tukey (HSD) DOSIS_ Tukey Grouping Mean N FILTRO A 13.373 6 0 .5 A A 9.388 6 1 A A 6.083 6 0
141
Anexo 22. Comparación de medias de Tukey para el factor exposición a la radiación
UV B y la variable incidencia de los síntomas (α=0.05).
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
DOSIS_FILTRO 2 20552.77778 10276.3888 9 4.60 0.0328 EXPOSICION 1 2005.55556 2005.5555 6 0.90 0.3619 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4952.77778 2476.3888 9 1.11 0.3613 Source DF Type III SS Mean Squar e F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 20552.77778 10276.3888 9 4.60 0.0328 EXPOSICION 1 2005.55556 2005.5555 6 0.90 0.3619 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4952.77778 2476.3888 9 1.11 0.3613 Prueba de Tukey (HSD) Tukey Grouping Mean N EXPOSICION A 90.00 9 EXPU ESTO A A 68.89 9 NO E XPUESTO
Anexo 23. Comparación de medias de Tukey para el factor exposición a la radiación
UV B y la variable severidad de los síntomas (α=0.05).
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 260.1975000 130.098750 0 2.36 0.1369 EXPOSICION 1 16.7234722 16.723472 2 0.30 0.5921 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 8.1702778 4.085138 9 0.07 0.9291
Source DF Type III SS Mean Squar e F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 260.1975000 130.098750 0 2.36 0.1369 EXPOSICION 1 16.7234722 16.723472 2 0.30 0.5921 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 8.1702778 4.085138 9 0.07 0.9291 Prueba de Tukey (HSD) Tukey Grouping Mean N EXPOSICION A 12.656 9 EXPU ESTO A A 10.728 9 NO E XPUESTO
142
Anexo 24. Comparación de medias de Tukey para el factor exposición a la radiación
UV B y la variable incidencia de la esporulación (α=0.05).
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 22969.44444 11484.7222 2 5.79 0.0174 EXPOSICION 1 200.00000 200.0000 0 0.10 0.7564 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 1675.00000 837.5000 0 0.42 0.6651 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 22969.44444 11484.7222 2 5.79 0.0174 EXPOSICION 1 200.00000 200.0000 0 0.10 0.7564 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 1675.00000 837.5000 0 0.42 0.6651
Prueba de Tukey (HSD) Tukey Grouping Mean N EXPOSICION A 66.11 9 EXPU ESTO A A 59.44 9 NO E XPUESTO Anexo 25. Comparación de medias de Tukey para el factor exposición a la radiación
UV B y la variable intensidad de la esporulación (α=0.05).
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 159.8571194 79.928559 7 1.86 0.1981 EXPOSICION 1 10.3588347 10.358834 7 0.24 0.6324 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4.9152528 2.457626 4 0.06 0.9447 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F DOSIS_FILTRO 2 159.8571194 79.928559 7 1.86 0.1981 EXPOSICION 1 10.3588347 10.358834 7 0.24 0.6324 DOSIS_FIL*EXPOSIC. 2 4.9152528 2.457626 4 0.06 0.9447
Prueba de Tukey (HSD) Tukey Grouping Mean N EXPO SICION A 10.373 9 EXPU ESTO A A 8.856 9 NO E XPUESTO
143
EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE AUXILIARES DE FORMULACIÓN
PARA LA FOTOESTABILIZACIÓN DE LA LEVADURA
BIOCONTROLADORA
Pichia onychis FRENTE A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA
1Vega, Y. L. 2 Villamizar, L. 2Moreno, C. A.
Resumen
Las levaduras han demostrado un alto potencial como antagonistas para el
control de patógenos foliares, sin embargo su eficacia en la filosfera puede
verse afectada por factores abióticos como la radiación solar. En el Laboratorio
de Control Biológico de CORPOICA se desarrolló un prototipo de
bioplaguicida formulado como granulado dispersable a base de la levadura
Pichia onychis (Lv 027) y fue aplicado en un cultivo comercial de cilantro
reduciendo la incidencia de Alternaria dauci en un 82%, sugiriendo su posible
uso para el control de fitopatógenos en precosecha. Considerando que al utilizar
la formulación en campo, ésta se verá expuesta al efecto deletéreo de la
radiación ultravioleta, es necesario incluir agentes fotoprotectores para obtener
resultados de control más eficientes. El objetivo del presente trabajo fue evaluar
y seleccionar auxiliares de formulación para la fotoestabilización de la levadura
P. onychis (Lv 027). Inicialmente se realizó un estudio de compatibilidad de la
levadura con ocho auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora
144
codificados como UV 03, UV 05, UV 06, UV 07, UV 08, UV 09, UV 10 y UV
11 (0.5% p/v). Solamente los fotoprotectores de naturaleza química UV 03 y
UV 10 tuvieron un efecto tóxico sobre la levadura, ya que se observó un retraso
en su crecimiento durante 48 horas de incubación en presencia de estas
sustancias. Los fotoprotectores compatibles con la levadura fueron
seleccionados para determinar su efecto fotoestabilizador frente a la radiación
ultravioleta tipo A (365 nm), tipo B (302 nm) y tipo C (254 nm) durante uno,
cinco y diez minutos de exposición. Se observó que la radiación UV A no tuvo
un efecto negativo sobre la viabilidad del microorganismo; mientras que la
radiación UV B causó una reducción significativa de la misma. Los
fotoprotectores de naturaleza física UV 08 y UV 09 presentaron un efecto
fotoestabilizador al mantener la viabilidad de la levadura en un 98% y 55%
respectivamente después de 10 minutos de exposición a la radiación UVB,
valores significativamente superiores a la viabilidad de la levadura no
fotoestabilizada. La exposición a la radiación UV C ocasionó la perdida total de
viabilidad de las células de levadura luego de 10 minutos de exposición, a
excepción de cuando fue fotoestabilizada con los filtros UV 08 y UV 09.
Debido al efecto fotoestabilizador mostrado por el fotoprotector UV 08 frente a
la radiación UV B y UV C, éste fue seleccionado para determinar su efecto al
0.5% (p/v) y al 1% (p/v) sobre la actividad biocontroladora de la levadura
expuesta y no expuesta a la radiación UV B (302 nm) contra Botrytis cinerea en
segmentos de tallo de tomate. Aunque no se detectaron diferencias
145
significativas entre los tratamientos, se evidenció un efecto biocontrolador de la
levadura, el cual fue mayor cuando ésta no fue fotoestabilizada. Se concluyo
que el fotoprotector UV 08 fue compatible y tuvo un efecto fotoestabilizador
sobre las células de la levadura, sin embargo su adición afectó la actividad
biocontroladora.
Palabras claves: Bioplaguicida, Fotoestabilización, Pichia onychis, Radiación
ultravioleta.
Abstract
The yeasts have demonstrated high potential as antagonists for controlling foliar
pathogens. However, its effectiveness in the phyllosphere could be affected by
abiotic factors such as solar radiation. The Biological Control Laboratory of
CORPOICA developed a biopesticide prototype formulated as dispersible
granulate based on the yeast Pichia onychis (Lv 027). This prototype was
applied on coriander commercial crop, Alternaria dauci incidence was reduced
in 82% suggesting its possible use for controlling plant pathogens in preharvest.
Considering that biopesticide application under field conditions will expose the
formulation to deleterious ultraviolet radiation damage, the inclusion of
photoprotectans into the formulation will be necessary in order to obtain more
efficient control results. The aim of the present work was to evaluate and to
select additives to photostabilize P. onychis (Lv 027). Compatibility of the
yeast with eight excipients with photostabilizing capacity codified like UV 03,
146
UV 05, UV 06, UV 07, UV 08, UV 09, UV 10 and UV 11 (0,5% p/v) was
evaluated. The photoprotectants of chemical nature UV 03 and UV 10 had a
toxic effect and slowed down the yeast growth during 48 hours of incubation.
The compatible photoprotectants with the yeast were selected for evaluating
their photostabilizing effect against ultraviolet radiation type A (365 nm), type
B (302 nm) and type C (254 nm) at different exposure times (one, five and ten
minutes) was determined. UV A radiation did not have a negative effect on
microorganism viability, while UV B radiation caused a significant reduction.
Photoprotectants UV 08 and UV 09 presented a photostabilizing effect
maintaining yeast viability in 98% and 55% respectively after 10 minute of
exposure, values significantly higher than non-photostabilized yeast. The
exposure to UV C radiation caused total viability lost after 10 minutes of
exposure excluding when cells were stabilized with photoprotectants UV 08
and UV 09. The photoprotectant UV 08 was selected because its
photostabilizing effect against UV B and UV C radiation and was selected for
evaluating its effect by using two concentrations 0.5% (p/v) and 1% (p/v) on the
biocontrol activity of the exposed and non-exposed yeast to UV B radiation
(302 nm) against Botrytis cinerea on stem pieces. Although significant
differences between the treatments were not detected, obtained results
demonstrated a yeast biocontrol effect, which was higher when microorganism
was not photostabilized. In conclusion, the sunscreen UV08 was compatible
147
and had photostabilizing effect of yeast cells, however the addition of this
substance affected yeast biocontrol activity.
Keywords: Biopesticide, Photostabilizing, Pichia onychis, Ultraviolet radiation
(UV)
1. INTRODUCCIÓN
Las levaduras han sido reportadas como microorganismos antagonistas
promisorios para el control de patógenos foliares como Botrytis cinerea (Cook,
2002). La eficacia de los agentes de biocontrol aplicados en el ambiente foliar
puede verse afectada por condiciones medioambientales, siendo la radiación
solar, específicamente el espectro de radiación ultravioleta, el principal factor
responsable de su pobre desempeño y baja actividad residual en campo (Cohen
et al., 2003). Aproximadamente el 3.2% de la energía de la radiación solar se
encuentra dentro del rango de longitudes de onda de la radiación ultravioleta
(Jacobs & Sundin, 1999). La exposición a esta radiación tiene un efecto
perjudicial al producir daños directos e indirectos sobre las macromoléculas de
los organismos vivos. Como resultado de este efecto se obtiene una reducción
en la estabilidad del microorganismo antagonista, limitando notablemente su
actividad biocontroladora (Edgington et al., 2000).
En el desarrollo de bioplaguicidas para el control de patógenos foliares, la
adición de aditivos con efecto fotoprotector en su formulación, incrementa la
148
resistencia de los agentes de biocontrol a la radiación ultravioleta. Son múltiples
los trabajos dedicados a encontrar técnicas (encapsulación) y materiales
(pantallas solares, colorantes, dispersantes) para inhibir o retardar la
fotoinactivación de agentes de control biológico (Cohen et al., 2003).
En el Laboratorio de Control Biológico se ha desarrollado un prototipo de
formulación a base de la levadura Pichia onychis (Lv 027) que consiste en un
granulado dispersable, el cual fue efectivo al ser evaluado en el control de
Alternaria dauci en un cultivo de cilantro bajo condiciones de campo
(Villamizar et al., 2004), sugiriendo su posible uso para el control de
fitopatógenos en precosecha. Sin embargo, es necesario incorporar en su
formulación agentes fotoprotectores para obtener resultados de control más
eficientes. Por tal razón el objetivo de este trabajo fue evaluar y seleccionar
auxiliares de formulación para la fotoestabilización de la levadura P. onychis
(Lv 027).
2. MATERIALES Y METODOS
2.1. Recuperación del microorganismo biocontrolador
El aislamiento de la levadura Pichia onychis codificado como Lv 027, fue
proporcionado por el Banco de Germoplasma de Microorganismos con Interés
en Control Biológico (Laboratorio de Control Biológico, CORPOICA). Es un
aislamiento proveniente de la rizosfera de cebolla de bulbo fue seleccionado por
su alta actividad biocontroladora contra Botrytis alli en bulbos de cebolla
149
(Jiménez & Neisa, 1999) y contra Rhizopus stolonifer y Alternaria alternata en
frutos de tomate (García, 2001; Fuentes, 2001). El aislamiento
P. onychis (Lv027) se recuperó en medio de cultivo YM y posteriormente fue
crioconservado a -70ºC.
2.1. Recuperación del microorganismo fitopatógeno
El aislamiento de Botrytis cinerea codificado como Bo 006, fue proporcionado
por el Banco de Germoplasma de Microorganismos con Interés en Control
Biológico (Laboratorio de Control Biológico, CORPOICA). Es un aislamiento
proveniente de hojas vivas de plantas de tomate (Lycopersicum esculentum
Mill.) realizado en el municipio de Mosquera (Cundinamarca). El aislamiento
Bo 006 se recuperó en medio de cultivo PDA y posteriormente se reactivó en
segmentos de tallo de plantas de tomate tipo milano híbrido Rocío®. A partir de
su crecimiento y esporulación sobre los segmentos de tallo, este aislamiento se
purificó mediante sucesivos pases en medio de cultivo PDA.
2.3. Evaluación de la compatibilidad de la levadura Pichia onychis (Lv027)
con auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora.
Se preparó una suspensión de la levadura ajustada a una concentración de 5x107
células.mL-1 a partir de un cultivo de P. onychis (Lv 027) en agar YM incubado
a una temperatura de 28ºC ± 1ºC durante 48 horas. Se inoculó 1 mL de la
suspensión en 50 mL de medio YM líquido en un erlenmeyer de 100 mL. Se
evaluaron las sustancias fotoestabilizadoras codificadas como UV 03, UV 05,
150
UV 06, UV 07, UV 08, UV 09, UV 10 y UV 11, cada una correspondiente a un
tratamiento. Estas se adicionaron previamente al medio de cultivo al 0.5% (p/v),
concentración recomendada en la industria farmacéutica para el uso de filtros
ultravioleta (Boylan et al., 1986). También se incluyó un control que consistió
en medio YM líquido sin adición de sustancia fotoestabilizadora.
Posteriormente, los erlenmeyers se colocaron en agitación a 110 r.p.m., a una
temperatura de 25ºC por 96 horas.
Se evaluó la concentración de células.mL-1 mediante conteo en cámara de
Neubauer. Este conteo se llevó a cabo a las 48 y 96 horas post-inoculación,
realizando diluciones seriadas en tubos de ensayo con 9 mL de solución de
Tween 80 al 0.1% (v/v). Con los resultados obtenidos se analizó el crecimiento
de la levadura P. onychis (Lv027) para cada tratamiento. El diseño
experimental tuvo un arreglo completamente al azar con medidas repetidas en
el tiempo. Para cada tratamiento se realizaron tres repeticiones. Los resultados
de concentración de células por mililitro a los tiempos 48 y 96 horas de
incubación se sometieron a un análisis de varianza y a la prueba de
comparación de Tukey (α=0.05) usando el programa Statistix versión 3.0.
2.4. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta
monocromática.
151
Esta prueba fue realizada siguiendo la metodología descrita en el protocolo de
valoración del efecto de la exposición a luz ultravioleta sobre la viabilidad de
aislamientos de levaduras, estandarizada por el Laboratorio de Control
Biológico del Centro de Biotecnología y Bioindustrias de CORPOICA.
A partir de un cultivo de la levadura en agar YM de 48 horas de edad, se
preparó una suspensión en 10 mL de solución de Tween 80 al 0.1% (v/v) con
una concentración de 2.5 x 106 células.mL-1. A partir de esta suspensión se
realizaron tres diluciones seriadas en solución estéril de Tween 80 al 0.1% (v/v)
que contenía la sustancia fotoestabilizadora por evaluar en una concentración de
0.5% (p/v).
Las sustancias fotoestabilizadoras evaluadas se seleccionaron por su
compatibilidad con la levadura P. onychis (Lv 027). Cada una de estas
sustancias correspondió a un tratamiento y se usó como control una suspensión
de levadura fresca en solución de Tween 80 al 0.1% (v/v) sin adición de alguna
sustancia fotoprotectora.
En cada caja de Petri con medio de cultivo YM dividida en cuatro partes, la
dilución 10-2 se inoculó en dos cuadrantes, tomando alícuotas de 10 µL e
inoculando cinco gotas por cuadrante. En los dos cuadrantes restantes se
inoculó de la misma forma la dilución 10-3 del mismo tratamiento. El diseño
experimental tuvo un arreglo completamente al azar. Se realizó un experimento
152
por cada longitud de onda evaluada con una repetición en el tiempo. La unidad
experimental consistió en una caja de Petri por tratamiento (sustancia
fotoestabilizadora), incluyendo un control (levadura fresca sin fotoestabilizar) y
por cada tiempo de exposición a la radiación ultravioleta.
Las cajas inoculadas se dejaron en reposo por 15 minutos, hasta que el inóculo
se secó sobre el agar. Las cajas de Petri inoculadas fueron expuestas a 20 cm de
la fuente de emisión artificial de radiación ultravioleta. Se empleó una lámpara
de luz ultravioleta monocromática (3UV-38 Series) que emite tres longitudes de
onda: 254 nm, 302 nm, 365 nm. Se evaluó el efecto de la radiación ultravioleta
UV A (365 nm); UV B (302 nm) y UV C (254 nm). Los tiempos de exposición
evaluados fueron: un minuto, cinco minutos y diez minutos. Se incluyó un
tiempo cero o de no exposición a la radiación ultravioleta para cada uno de los
tratamientos y el control.
Una vez finalizada la exposición, se colocó la tapa a cada caja de Petri y se
protegieron de la luz con papel aluminio. Todas las cajas fueron incubadas a
una temperatura de 28ºC ± 1ºC durante 48 horas en condiciones de oscuridad.
Terminada la incubación, se contó el número de colonias formadas en cada uno
de los cinco puntos de inoculación en cada cuadrante, seleccionando la dilución
donde se observó la formación de colonias de forma definida en un rango de 10
a 30 UFC por punto.
153
Con los resultados del conteo de colonias se determinó el número de UFC.mL-1
en la dilución inicial. Se calculó un porcentaje de viabilidad remanente de la
levadura, considerando la viabilidad obtenida al tiempo cero de exposición para
cada tratamiento, el 100% para esta variable. Los datos obtenidos se sometieron
a un análisis de varianza y a la prueba de comparación de Tukey (α=0.05),
empleando el programa Statistix versión 3.0.
2.5. Efecto de la radiación ultravioleta sobre la actividad biocontroladora
de la levadura Pichia onychis (Lv 027) fotoestabilizada.
Se seleccionó una sustancia fotoestabilizadora entre las evaluadas, por su efecto
fotoestabilizador frente a las tres longitudes de onda evaluadas. Se evaluó su
efecto y el de la radiación UV B sobre la actividad biocontroladora de la
levadura, usando como modelo experimental segmentos de tallo de plantas de
tomate, siguiendo el procedimiento descrito por O´Neill et al., (1996), citado
por Moreno (2003).
2.5.1. Material vegetal
El material vegetal utilizado provino de un cultivo de tomate (L. esculentum)
tipo milano híbrido Rocío® establecido en CORPOICA. Este tomate es
susceptible a las enfermedades más frecuentes que ocurren durante la
producción. No se aplicó ningún fungicida al cultivo.
154
Se colectaron brotes secundarios de 50 cm de largo. De estos tallos se
eliminaron 10 cm del ápice y el resto se cortó en secciones de 5 cm de largo.
Estos segmentos se insertaron verticalmente en cubos de icopor (10 cm * 10 cm
* 2 cm) con la parte más joven hacia arriba. Cada cubo de icopor tenía diez
segmentos de tallo de diferente edad. Después de efectuar las inoculaciones del
biocontrolador y/o del patógeno, cada cubo se colocó en un recipiente plástico
transparente (24 cm * 24 cm * 10 cm) con dos capas de papel absorbente en el
fondo, humedecido con agua destilada estéril. Las cajas se situaron sobre
estantes en un cuarto oscuro a temperatura ambiente.
2.5.2. Inóculo
B. cinerea se recuperó en cajas de Petri con agar PDA. Las cajas se incubaron
en un cuarto de crecimiento con luz constante y temperatura de 24ºC± 2ºC,
durante 15 días. A partir del medio de cultivo con el hongo crecido y
esporulado se preparó una suspensión de conidios en solución de Tween 80 al
0.1% (v/v). Dicha suspensión fue filtrada a través de una tela de muselina
plegada para retirar el micelio. La concentración se ajustó a
1x105 conidios mL-1.
A partir de un cultivo de la levadura en agar YM de 48 horas de edad, se
preparó una suspensión en 10 mL de una solución de Tween 80 al 0.1% (v/v).
Se determinó la concentración de esta suspensión y se ajustó su concentración a
1x108 células.mL-1. A partir de esta suspensión se realizó una dilución con base
155
10 en solución de Tween 80 al 0.1% (v/v), que contenía la sustancia
fotoestabilizadora seleccionada a la concentración evaluada. Finalmente se
obtuvieron suspensiones de cada tratamiento y un control (suspensión de
levadura fresca en solución de Tween 80 al 0.1% en una concentración de
1x107 células.mL-1
Para realizar la exposición de las suspensiones de la levadura sin fotoestabilizar
y fotoestabilizada a la radiación ultravioleta, éstas fueron dispensadas en una
microplaca de 96 pozos. En cada pozo se colocó 150 µL de suspensión
utilizándose 6 pozos por tratamiento, incluyendo el control. Para los
tratamientos y el control no expuestos a la radiación ultravioleta se colocó una
lámina de aluminio para impedir que esta penetrara. La microplaca se colocó a
20 cm de una lámpara luz ultravioleta monocromática (3UV-38 Series) y fue
expuesta a la radiación ultravioleta tipo B (302 nm) por 30 minutos.
2.5.3. Inoculación
Los segmentos de tallo recién cortados y ubicados en los cubos de icopor
fueron inoculados con cada uno de los tratamientos por aplicación puntual de
25µL de inóculo de los tratamientos en la herida de cada tallo. Después de ocho
horas de incubación, los tallos fueron inoculados con el fitopatógeno mediante
la aplicación puntual de 25µL de la suspensión de B. cinerea.
156
5.5.4 Tratamientos
El ensayo constó de ocho tratamientos definidos así: testigo absoluto, testigo
patógeno (solución estéril de Tween 80 al 0.1% v/v y microorganismo
fitopatógeno B. cinerea), levadura P. onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar y
fotoestabilizada usando la sustancia seleccionada al 0.5% p/v y al 1% p/v. Para
la levadura fotoestabilizada y sin fotoestabilizar se evaluaron dos tiempos de
exposición a la radiación ultravioleta: tiempo cero o de no exposición y 30
minutos.
2.5.5. Diseño experimental y análisis de datos
El diseño de este experimento tuvó un arreglo completamente al azar con
arreglo factorial (exposición a la radiación UV B y concentración de la
sustancia fotoprotectora), con tres repeticiones por tratamiento. Cada unidad
experimental estuvó conformada por un cubo de icopor con 10 segmentos de
tallo. Cada unidad experimental se colocó dentro de un recipiente plástico.
Los datos del área bajo la curva para la incidencia y severidad de los síntomas,
así como para la incidencia e intensidad de la esporulación obtenidos 20 días
luego de la inoculación se sometieron a un análisis de varianza. Para juzgar la
significacia de las posibles diferencias observadas, se uso una prueba de
comparación de medias de Tukey (α=0.05).
157
2.5.6. Variables de estudio
Se registró el período transcurrido hasta la aparición de las primeras lesiones de
la enfermedad causada por B. cinerea y se midió: a) el número de tallos que
presentaron lesiones por B. cinerea (incidencia de síntomas), b) el número de
tallos que presentaron lesiones que tenían esporulación (incidencia de
esporulación), c) la intensidad de las lesiones (severidad de los síntomas) y d) la
intensidad de la esporulación. Las dos últimas variables se calificaron mediante
una escala (Tabla 1). Todos estos parámetros se midieron cada dos días durante
20 días.
Se calculó un índice de severidad (is) y un índice de esporulación de (ie) para el
número de segmentos de tallo (nx) que pertenecen a la clase x, de acuerdo con
las fórmulas:
is= 1n1+2n2+3n3+4n4 ie= is= 1n1+2n2+3n3+4n4
n1 + n2 + n3 +n4 n1 + n2 + n3 +n4
Para establecer los valores de incidencia sólo se tuvieron en cuenta aquellos
tallos que tuvieron grados de severidad superiores a 1. Los segmentos en los
cuales la superficie inoculada se tornó de color marrón (severidad de síntoma 1)
fueron excluidos a causa de que este síntoma carece de especificidad para B.
cinerea.
158
También se calculó la eficacia de control del antagonista al final del
experimento de acuerdo con la formula (a-b/a) * 100, donde, a= incidencia o
índice de la enfermedad en el testigo patógeno y b= incidencia o índice de la
enfermedad en un tratamiento antagonista (Elad et al., 2000).
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Evaluación de la compatibilidad de la levadura Pichia onychis (Lv027)
con auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora.
La prueba de Tukey (α=0.05) no detectó diferencias significativas entre la
concentración de células de levadura con los tratamientos UV 05, UV 06, UV
07, UV 08, UV 09 y UV 11 a las 48 y 96 horas de incubación y el tratamiento
control (Figura 2). Este resultado indica que el crecimiento de la levadura P.
onychis no fue afectado por estos fotoprotectores al ser adicionados al medio de
cultivo líquido, lo que permite sugerir que estas sustancias no tuvieron un
efecto inhibitorio o tóxico sobre las células del microorganismo biocontrolador.
Este resultado posiblemente se debió a que los filtros de naturaleza biológica
UV 05, UV 06 y UV 07 fueron seleccionados dentro de los disponibles como
aditivos en la industria de alimentos, medicamentos y cosméticos, los cuales
cumplen para su uso especificaciones como estabilidad, inocuidad y seguridad
(Marcano, 1990). De igual forma, los filtros de naturaleza física UV 08, UV 09
y UV 11, son de amplio uso en la industria farmacéutica, principalmente porque
son compuestos inertes, que no son afectados física o químicamente por el
159
medio al cual se incorporan, son seguros y protegen contra el espectro completo
de radiación ultravioleta (Ballesteros, 2006).
Por el contrario, se observó que fotoprotectores de naturaleza química UV 03 y
UV 10 al 0.5% retardaron el crecimiento de la levadura, teniendo un mayor
impacto sobre este parámetro la sustancia UV 03 en comparación con la
sustancia UV 10, ya que ésta mantuvo a las células en latencia hasta un tiempo
cercano a las 48 horas (Figura 1). El crecimiento de la levadura en presencia de
estos fotoprotectores fue significativamente inferior
(P < 0.05) al crecimiento de la levadura sin la adición de alguna sustancia
fotoestabilizadora (Figura 2).
Numerosas sustancias de naturaleza química incluyendo los filtros UV 03 y UV
10 han sido utilizadas como agentes fotoprotectores frente a la radiación
ultravioleta sin efectos desfavorables en la formulación de esporas y cristales de
B. thuringiensis (Dunkle & Shasha, 1989), cuerpos de inclusión del virus de la
poliedrosis nuclear de Heliothis zea (HzSNPV) (Ignoffo & García, 1994), de la
polilla gitana Lymantria dispar (Linnaeus) (Shapiro et al., 1983). Sin embargo,
estos fotoprotectores son colorantes sintéticos que por tener grupos químicos
azo (-N=N-) en su estructura (Marcano, 1990), pueden ser tóxicos para las
células cuando son expuestas por tiempos regulares o prolongados a estas
sustancias (Christie, 2001).
160
Otro factor que pudo incidir en la toxicidad de los estos fotoprotectores fue su
concentración de uso. Aunque algunos colorantes pueden ser no tóxicos para
los agentes de biocontrol cuando se usan a bajas concentraciones, se ha
reportado que la efectividad en la protección frente a la radiación UV que puede
proveer este tipo de compuestos es directamente proporcional a su
concentración, por lo que limita su empleo en el desarrollo de bioplaguicidas
(Shapiro, 1990).
El uso de algunos auxiliares de formulación puede ser excluido por presentar
toxicidad para los microorganismos biocontroladores, por lo que los
fotoprotectores UV 03 y UV 10 fueron excluidos de los siguientes
experimentos del presente trabajo.
3.2. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo A
(λ= 365 nm).
El análisis estadístico no detectó diferencias significativas (P> 0.05) entre los
porcentajes de viabilidad de la levadura obtenidos con los tratamientos
correspondientes a las sustancias fotoestabilizadoras y la levadura sin
fotoestabilizar, luego de un minuto, cinco minutos y diez minutos de exposición
a la radiación UV A (Figura 3).
161
Los resultados con la levadura no fotoestabilizada sugieren que la radiación UV
A no tuvo un efecto negativo sobre esta levadura durante el tiempo de
exposición evaluado en el presente trabajo. Dicho resultado permite sugerir que
no es necesario incluir en la formulación de esta levadura, un agente protector
que exhiba una absorción máxima dentro del espectro de la radiación UV A.
Sin embargo, se recomienda para un trabajo posterior, evaluar mayores tiempos
de exposición a dicha radiación, con miras a determinar si en algún momento la
levadura Pichia onychis (Lv 027) se ve afectada por la radiación ultravioleta
tipo A.
3.3. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo B
(λ= 302 nm).
Se observó que la radiación UV B tuvo un efecto negativo sobre las células de
P. onychis, ya que causó una pérdida significativa de la viabilidad del
microorganismo a medida que incrementó el tiempo de exposición a dicha
radiación. Este resultado sugiere la necesidad de usar un agente
fotoestabilizador que absorba la radiación UV B, para proteger a la levadura del
efecto nocivo de esta radiación y reducir la pérdida de su viabilidad.
Después de cinco minutos de exposición se observó una reducción en la
viabilidad de la levadura para los tratamientos UV 05, UV 06, UV 07 y UV 11
incluyendo el control. Sin embargo, sólo con el fotoprotector UV 07, la
162
viabilidad después de dicho tiempo de exposición fue inferior a la viabilidad de
la levadura no expuesta. Este resultado sugiere que esta sustancia tuvo un efecto
negativo sobre el microorganismo, posiblemente generado por la exposición a
la radiación (Figura 4).
Cuando la levadura se expuso a la radiación UV B durante diez minutos en
presencia de los filtros UV 06 y UV 07 se obtuvo una pérdida total de la
viabilidad. Este resultado confirma el efecto negativo del filtro UV 07 y sugiere
que el filtro UV 06 también tuvo un efecto negativo sobre las células,
posiblemente generado por la exposición a esta radiación (Figura 4).
Aunque los procesos desencadenados por estrés oxidativo a nivel celular,
generado por factores abióticos como la exposición a la radiación ultravioleta,
pueden ser retardados por el uso de sustancias con propiedades antioxidantes
(Gromovaya et al., 2002), el desempeño de estas sustancias en el presente
trabajo no fue eficiente. Por otro lado, los filtros UV 05, UV 06 y UV 07 al ser
antioxidantes sinérgicos muestran una pobre actividad antioxidante cuando son
usados de forma individual, sin embargo, es posible obtener resultados
eficientes cuando son combinados con compuestos como fosfolípidos y
tocoferoles (Pokorny et al., 2001).
163
Con los filtros inorgánicos UV 08 y UV 09 se observó un efecto
fotoestabilizador. Con el filtro UV 08, no se presentó una pérdida significativa
de la viabilidad durante los diez minutos de exposición a la radiación UV B,
obteniéndose una viabilidad final del 98%. El auxiliar UV 09 fue menos
eficiente en comparación con el auxiliar fotoprotector UV 08, ya que hubo una
disminución de la viabilidad del 45% para el mismo tiempo de exposición
(Figura 4). Este resultado indica que el filtro UV 08 protegió eficientemente a la
levadura frente a la radiación UV B (302 nm), siendo un potencial auxiliar de
formulación para ser incluido en el bioplaguicida desarrollado a base de la
levadura Pichia onychis (Lv 027).
Los fotoprotectores inorgánicos a parte de tener una buena absorción en el
rango de los 330 nm a 400 nm, cuentan con un espectro amplio de absorción,
siendo capaces de reflejar la radiación UV B y UV A. Esto puede explicar la
efectiva protección obtenida en el presente estudio con los auxiliares UV 08 y
UV 09, y presentan gran potencial para ser incorporados como coadyuvantes en
la formulación de agentes biocontroladores.
164
3.4. Determinación del efecto fotoestabilizador de los auxiliares de
formulación seleccionados frente a la radiación ultravioleta tipo C
(λ= 254 nm)
Cuando la levadura fue expuesta a la radiación UV C en presencia o ausencia
de las sustancias fotoestabilizadoras se presentó una pérdida significativa de la
viabilidad en todos los tratamientos.
La viabilidad de las células de levadura obtenida con el tratamiento UV 08 a los
cinco y diez minutos de exposición fue del 24% y del 15%, las cuales no fueron
significativamente diferentes de la viabilidad obtenida con el tratamiento UV
09, con el que se obtuvieron resultados del 18% y del 3% respectivamente
(Figura 5). Sin embargo, dichos valores fueron significativamente superiores a
los obtenidos con la levadura no fotoestabilizada a los mismos tiempos de
exposición, lo que indica el efecto fotoestabilizador de dichas sustancias.
Diferencias en la susceptibilidad de los biocontroladores como Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki (Saxena et al., 2002), Metharhizium anisoplie
(Devotto y Gerding, 2003), Paecilomyces fumosoroseus, Lecanicillium lecanii
y Beauveria bassiana (Espinel et al., 2006) a la radiación UV C, evidencia la
existencia de distintos mecanismos de defensa frente a la radiación, tales como
la producción y acumulación de pigmentos, producción de enzimas oxidativas y
otras sustancias antioxidantes (Ragaei, 1999). También puede deberse al origen
165
geográfico de los aislamientos evaluados, ya que existen antecedentes que
indican una menor tolerancia a la radiación a medida que aumenta la latitud del
lugar de origen (Braga et al., citado por Devotto & Gerding, 2003).
Se seleccionó el filtro UV 08 por presentar un efecto fotoestabilizador de las
células frente a las tres longitudes de onda evaluadas, principalmente frente a la
radiación UV B y UV C. Por esta razón, con la sustancia fotoestabilizadora UV
08 se llevó a cabo un bioensayo in planta con miras a evaluar el efecto
fotoprotector del filtro seleccionado y su relación con la actividad
biocontroladora de la levadura Pichia onychis (Lv 027).
3.5. Efecto de la radiación ultravioleta sobre la actividad biocontroladora
de la levadura Pichia onychis (Lv027) fotoestabilizada.
El análisis de varianza para el área bajo la curva de la incidencia de B. cinerea
sobre segmentos de tallo de tomate, no detectó diferencias significativas entre
tratamientos. Sin embargo, los resultados indicaron algunas tendencias (Figura
5). Al comparar los tratamientos levadura sin fotoestabilizar expuesta y no
expuesta a la radiación se evidenció una reducción de la actividad
biocontroladora, posiblemente debida al efecto negativo de la radiación UV B
sobre la levadura, lo cual podría estar relacionado con la pérdida de viabilidad
de la misma (Figura 6). Asimismo, al comparar los tratamientos levadura
fotoestabilizada no expuesta con la levadura sin fotoestabilizar no expuesta, se
observó mayor incidencia de la enfermedad cuando la levadura fue utilizada en
166
combinación con el filtro seleccionado. Este resultado sugiere que la adición del
filtro UV 08 tuvo un efecto negativo sobre la actividad biocontroladora de la
levadura.
Aunque en el ensayo donde se evaluó la capacidad fotoestabilizadora del filtro,
se demostró que al ser combinado con la levadura, ésta mantiene su viabilidad
después de ser expuesta a la radiación UV B, este resultado no fue coherente
con el obtenido cuando se evaluó la actividad biocontroladora, ya que la
levadura con el filtro al 1% expuesta a la radiación presentó mayor incidencia
de la enfermedad comparado con el mismo tratamiento sin exposición. Este
comportamiento sugiere que el filtro seleccionado mantuvo la viabilidad de la
levadura la cual no fue eficiente en el control de la enfermedad posiblemente
porque el filtro interfirió en el proceso de adhesión de la levadura a la superficie
del tejido vegetal.
La adhesión puede ser bloqueada por la intervención de agentes tales como
sales o enzimas, que alteran la integridad de las proteínas y de algunos azúcares
en las superficies (Wisniewski et al., 1994 citado por Elad, 1996). Con respecto
a los resultados obtenidos en el presente estudio, es posible que la levadura
fotoestabilizada no haya ejercido su actividad biocontroladora debido a una
posible interferencia del filtro UV 08 sobre el proceso de adhesión de la
levadura al tejido vegetal. Las partículas insolubles del filtro UV 08 que se
encontraban suspendidas en el medio acuoso con las células, podrían haberse
167
ubicado directamente sobre la superficie vegetal impidiendo que las células de
la levadura entraran en contacto con este. De esta forma el filtro al 0.5% podría
haber interferido los mecanismos de reconocimiento entre la levadura y la
planta, impidiendo el proceso de adhesión y generando espacios que
posiblemente fueron aprovechados por el patógeno. Cuando la concentración de
filtro fue aumentada al 1%, es posible que un mayor número de partículas
permitiera una ocupación de sitio por parte del filtro y redujera la incidencia de
la enfermedad.
El análisis estadístico del área bajo la curva para la severidad de los síntomas de
la enfermedad así como para la incidencia y en la intensidad de la esporulación
de B. cinerea, no detectó diferencias significativas (P> 0.05) entre tratamientos.
Aunque la prueba de Tukey (α=0.05) para cada una de estas variables no
detectó diferencias significativas entre tratamientos debido a que se presentaron
altos coeficientes de variación, la menor incidencia de la enfermedad para los
tratamientos con la levadura sin fotoestabilizar sugiere que tuvieron un efecto
biocontrolador sobre el patógeno.
Al determinar la eficacia de los tratamientos evaluados en el control de la
incidencia de los síntomas y de la esporulación del moho gris, ésta fue superior
en los tratamientos no expuestos a la radiación UV B en comparación con a los
expuestos a esta radiación (Tabla 2). Este resultado confirmó el efecto negativo
de la radiación UV B sobre la actividad biocontroladora de la levadura
168
P. onychis. Por otro lado, los mayores porcentajes de eficacia de control para
estas variables se obtuvieron con los tratamientos con la levadura sin
fotoestabilizar, lo que confirma que la adición del filtro UV 08 tuvo un efecto
negativo sobre la actividad biocontroladora de la levadura. También, se observó
que hubo una mayor eficacia de control con los tratamientos donde se uso el
filtro UV 08 al 1% en comparación a los tratamientos donde fue usado al 0.5%.
Por último, con la levadura sin fotoestabilizar expuesta a la radiación se
obtuvieron porcentajes de eficacia de control que sugieren que las células no
viables de la levadura tuvieron un efecto biocontrolador.
El hecho de que células no viables puedan ejercer algún tipo de biocontrol ha
sido asociado con la inducción de resistencia en el tejido vegetal (Elad, 1996).
La presencia de carbohidratos y glicopéptidos en la pared celular de levaduras
pueden actuar como elicitores capaces de desencadenar respuestas de defensa
en el hospedero como la producción de risitina, una de las principales
fitoalexinas sintetizadas por frutos y segmentos de tallo de tomate (D Harlingue
et al., 1995). También, la efectividad de las células muertas de levadura como
P.onychis (Lv 027) en la ocupación de los sitios de adhesión del patógeno
(Contreras, 2005), evitó la infección de Rhizopus stolonifer en frutos de tomate.
De acuerdo con los resultados del efecto de la radiación ultravioleta sobre la
actividad biocontroladora de Pichia onychis (Lv 027) fotoestabilizada con el
filtro UV 08, se determinó que no solo este tipo de radiación sino también el
169
uso de la sustancia fotoprotectora UV 08 disminuyó la eficacia del control de la
enfermedad del moho gris en comparación a la levadura sin fotoestabilizar, a
pesar de que esta sustancia tuvo un potencial efecto fotoestabilizador frente a la
radiación ultravioleta tipo B.
4. CONCLUSIONES
El filtro UV 08 fue seleccionado por su compatibilidad y capacidad
fotoestabilizadora de la levadura Pichia onychis (Lv 027) frente a la radiación
ultravioleta monocromática.
Las radiaciones ultravioleta tipo B y C redujeron significativamente la
viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027).
La exposición de la levadura no fotoestabilizada a la radiación ultravioleta tipo
B disminuyó su actividad biocontroladora sobre Botrytis cinerea (Bo 006).
La actividad biocontroladora de la levadura Pichia onychis (Lv 027) fue
afectada negativamente cuando se aplicó combinada con el filtro UV 08.
5. AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Alba Marina Cotes por la oportunidad de realizar este trabajo en el
Laboratorio de Control Biológico del Centro de Biotecnología y Bioindustrias
de CORPOICA, a Laura Fernanda Villamizar por su orientación y el aporte de
sus conocimientos en el desarrollo de este trabajo y a Carlos Andrés Moreno
por su asesoría y colaboración.
170
6. LITERATURA CITADA
1. Ballesteros, J. 2006. Productos para protección solar con extracto de
zanahoria: estado del arte. Especialización en ciencia y tecnología
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173
6. FIGURAS
01
23
456
78
910
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (horas)
Log
10 co
ncen
traci
ón
CONTROL UV 03 UV 05 UV 06 UV 07
UV 08 UV 09 UV 10 UV 11
Figura 1. Crecimiento de la levadura Pichia onychis (Lv 027) en presencia de los
auxiliares de formulación con capacidad fotoestabilizadora.
cdcd
abababab ababab bc
e
d
bcbcabababa
0123456789
10
Contr
ol
UV 05
UV 06
UV 07
UV 08
UV 09
UV 10
UV 03
UV 11
Tratamientos
Log
10 c
once
ntra
ción
48 horas
96 horas
Figura 2. Concentración de células de la levadura Pichia onychis (Lv 027) a las 48 y
96 horas de incubación en medio líquido suplementado con los auxiliares de
formulación con capacidad fotoestabilizadora. *Las columnas con la misma letra no presentan
diferencias significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (α=0.05).
174
a a a a a a aab a ab abab
ababab ab c ab ab ab aab ab ab ab ab ab ab
0
20
40
60
80
100
Control UV 05 UV 06 UV 07 UV 08 UV 09 UV 11
Tratamiento
Tiempo de Exposición
Via
bilid
ad (%
)
No expuesto 1 minuto 5 minutos 10 minutos
Figura 3. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre la
viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación ultravioleta
tipo A (365 nm). *Las columnas con la misma letra no presentan diferencias significativas de acuerdo
con la prueba de Tukey (α = 0.05).
aaaaaaa a aaaabaaab
aa
bab
abab
d
c
a
ee
d
c
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Control UV 05 UV 06 UV 07 UV 08 UV 09 UV 11
Tratamientos
Tiempo de Exposición
Via
bilid
ad (%
)
No expuesto Un minuto Cinco minutos Diez minutos
Figura 4. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre la
viabilidad de la levadura Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación ultravioleta
175
tipo B (302 nm). *Las columnas con la misma letra no presentan diferencias significativas de acuerdo
con la prueba de Tukey (α = 0.05).
a a a a a a a
c
d
c c
ab
b ab
dd
eeeee
d
d eeeee0
1020304050
60708090
100
Control UV 05 UV 06 UV 07 UV 08 UV 09 UV 11
Tratamientos
Tiempo de Exposición
Via
bilid
ad (%
)
No expuesto Un minuto Cinco minutos Diez minutos
Figura 5. Efecto fotoestabilizador de los diferentes filtros evaluados sobre viabilidad
de la levadura Pichia onychis (Lv 027) expuesta a la radiación ultravioleta tipo C (254
nm). *Las columnas con la misma letra no presentan diferencias significativas de acuerdo con la prueba
de Tukey (α = 0.05).
Progreso de la incidencia de síntomas
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
3 5 7 10 13 16 18 20
Tiempo después de la inoculación (días)
Inci
denc
ia d
e le
sion
es (
%)
SF NE SF E 0.5% NE 0.5% E 1% NE 1% E Bo 006
176
Figura 15. Progreso de la incidencia de la enfermedad causada por Botrytis cinerea
(Bo 006) en los segmentos de tallo de tomate. SF NE: Levadura sin filtro UV 08 no
expuesta a la radiación; SF E: Levadura sin filtro UV 08 expuesta a la radiación; 0,5%
NE: Levadura con filtro UV 08 al 0.5% no expuesta a la radiación; 0,5% E: Levadura
con filtro UV 08 al 0.5% expuesta a la radiación; 1% NE: Levadura con filtro UV 08 al
1% no expuesta a la radiación; 1% E: Levadura con filtro UV 08 al 1% expuesta a la
radiación; Bo 006: Testigo patógeno.
a
b
a a a a
0102030405060708090
100
Pér
dida
de
viab
ilida
d (%
)
Sin f iltro Filtro UV 08 0.5% Filtro UV 08 1%
Tratamientos
Viabilidad Pichia onychis (Lv 027)
No expuesta Expuesta
Figura 6. Efecto de la radiación ultravioleta tipo B (302 nm) sobre la viabilidad de la
levadura Pichia onychis (Lv 027) sin fotoestabilizar y fotoestabilizada con el filtro UV
08 al 0.5% (p/v) y al 1% (p/v), durante 30 minutos de exposición. *Las columnas con la
misma letra no presentan diferencias significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (α = 0.05).
177
7. TABLAS
Tabla 1. Escala de severidad de síntomas y escala de esporulación.
Escala de severidad de síntomas Escala de esporulación Grado Grado
0 Extremo tratado del tallo verde 0
No esporulación
1 Únicamente el extremo tratado del tallo afectado
1 Esporulación en el extremo del tallo
2 Hasta el 50% de la longitud del tallo afectada
2 Esporulación hasta el 50% de la longitud del tallo
3 El 51-75% de longitud del tallo afectada
3 El 51-75% de longitud del tallo esporulada
4 Mayor 75% de la longitud del tallo afectada
4 Mayor 75% de la longitud del tallo esporulada
Tabla 3. Eficacia de los tratamientos evaluados en el control de la incidencia de los
síntomas y de la esporulación de B. cinerea sobre segmentos de tallos de tomate.
EFICACIA DE CONTROL (%)
Tratamiento Incidencia de los
síntomas Incidencia de la
esporulación Levadura sin filtro no expuesta 91.0 91.0 Levadura sin filtro expuesta 54.5 72.8 Levadura con filtro al 0.5% (p/v) no expuesta 0.0 0.0 Levadura con filtro al 0.5% (p/v) expuesta 9.3 18.3 Levadura con filtro al 1% (p/v) no expuesta 63.8 63.8 Levadura con filtro al 1% (p/v) expuesta 27.2 36.5
178
179
