Etude de l'induction de la triploïdie chez les mollusques...

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INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE DE PARIS-GRIGNON

Rapport de stage

ETUDE DE L'INDUCTION DE LA TRIPLOÎDIE CHEZ LES

MOLLUSQUES BIVALVES

Maitre de Stage : André GERARD

Unité de Recherche en Génétique et Ecloserie Ronce les Bains, BP 133 17390 La Tremblade

Claire CORNILLIER Septembre 1992

IFREMER Biblioth6que de Il Trembllde

1 11111111111111111111111111111111111111111 OLR 00511

SOMMAIRE

1. -INTRODUCTION ................................................................................................................... 2

2. -PROGRAMME DE CyTOGENETIQUE .................................................................................. 5

2.1 . -Objectifs .......................................................................................................... 5

2.2. -Enjeux socio-économiques et scientifiques ...................................................... 5

2.3. -Bases scientifiques .......................................................................................... 5

2.4. -Programme ..................................................................................................... 6

2.5. -Partenaires et coopérations internationales ..................................................... 6

3. -MATERIELS ET METHODES ................................................................................................ 8

3.1. -Production de phytoplancton ........................................................................... 8

3.2. -Origine,maintien et maturation des géniteurs ................................................... 8

3.3. -Ponte .............................................................................................................. 8

3.3.1. -Stimulation des géniteurs .................................................................... 9 3.3.2. -Prélèvement des gamètes .................................................................. 9

3.4. -Induction de la triploïdie .................................................................................. 9

3.4.1. -Principe .............................................................................................. 9 3.4.2. -Traitement à la cytochalasine B .......................................................... 12 3.4.3. -Traitement au 6-DMAP ....................................................................... 12

3.5. -Contrôle et détermination de la ploïdie ............................................................ 15

3.5.1. -Par caryologie .................................................................................... 15 3.5.2. -Par imagerie numérique ..................................................................... 15

3.6. -Elevage larvaire .............................................................................................. 16

3.7. -Micronurserie .................................................................................................. 21

3.8. -Contrôle des performances biologiques en milieu naturel et en laboratoirre ..... 21

4. -DEROULEMENT DU PROGRAMME ..................................................................................... 23

4.1. -Résultats sur l'induction de la triploïdie ............................................................ 23

4.2. Résultats du contrôle de performance ............................................................... 23

4.2.1. Evolution des paramètres biométriques ............................................... 26 4.2.2. Evolution des paramètres biochimiques ............................................... 26

5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .................................................................................... 31

BIBLIOGRAPHIE

2

1. -INTRODUCTION

Sur le littoral charentais, la conchyliculture revêt une importance considérable avec deux

grands bassins, le bassin ostréicole de Marennes Oléron et le bassin myticole de la baie d'Aiguillons.

La région produit chaque année en moyenne prés de 400001 d'huîtres, 80001 de moules

et 2001 de palourdes. Le chiffre d'affaire à l'exportation dépasse le milliard de francs. Cette activité

génère en Charente Maritime plus de 10000 emplois directs permanents. Ainsi par son chiffre

d'affaire et le nombre d'emplois qu'elle crée, la conchyliculture occupe la première place du secteur

primaire de la Charente Maritime.

D'autre part, si sur les zones découvrantes les possibilités d'extension sont faibles, les

marais sont eux actuellement sous exploités.

C'est dans le cadre du maintien, de l'amélioration, et du developpement de l'activité

conchylicole que la station d'IFREMER de La Tremblade trouve toute sa place.

Cette station dispose de 4 unités de recherche:

• l'Unité de Recherche sur les Ecosystèmes Aquacoles (UREA),

• l'Unité de Recherche Régionale en Aquaculture (URRA),

• l'Unité de Recherche en Pathologie, Immunologie et Génétique Moléculaire (URPIGM),

• l'Unité de Recherche en Génétique et Ecloserie (URGE)

Ces 4 unités de recherche sont regroupées en une structure unique, le Laboratoire de

Biologie et d'Ecologie des Invertébrés Marins (LABEIM).

Le stage a été effectué dans l'Unité de Recherche en Génétique et Ecloserie.

L'équipe de cette unité est constituée de :

• - 2 cadres: André GERARD et Yamama NACIRI,

• - 3 techniciens: Jean-Marie PEI GNON, Pascal PHELIPOT et Christophe LEDU,

• - 1/3 secrétaire: Yvette SIMIAN,

• - 1/2 entretien des locaux et gestion des achats: Ginette CAILLETEAU,

3

• - 1/3 comptable: Martine GRASSET,

• - 1/4 documentaliste: Yvonne FA VI NO.

L'écloserie comprend:

• - 1200 m2 de bâtiment aquacole divisé en 6 salles, une salle d'algues dans

laquelle est produit le phytoplancton, une salle de maturation, une salle d'élevage larvaire, une salle

de micro-nurserie, une salle de quarantaine, un laboratoire, une pièce d'informatique et une serre,

• - 22 points de pompage,

• - 1 station de stérilisation des eaux de rejet (schéma éclose rie IFREMER de La Tremblade).

Le Développement des recherches dans le domaine de la génétique quantitative et de la

cytogénétique des mollusques bivalves doit surtout viser l'obtention de méthodes et de produits

présentants des caractéristiques intéressantes pour la profession conchylicole. L'objectif au niveau

socio-économique est de contribuer à l'émergence de nouveaux pôles productifs créateurs ou

stabilisateurs d'emplois. Les principaux objectifs sont l'obtention de souches résistantes aux maladies,

la création de lignées ou de souches présentant de meilleures performances de croissance et de

qualité de chair, l'acclimatition de nouvelles espèces et l'hybridation pour limiter les risques liés à la

monoculture. Pour essayer de répondre à ces objectifs les programmes actuels de l'unité sont:

• sélection de souches d'huître plate résistantes aux parasitoses,

• obtention de lignées pures et recherche de marqueurs génétiques,

• introduction d'espèces nouvelles et hybridation,

• polyploïdisation des principales espèces commerciales.

Le sujet de stage, étude de l'induction de la triploïdie chez les mollusques bivalves,

s'inscrit dans le programme de cytogénétique de polyploïdisation.

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1 ECLOSERIE IFREMER DE LA TREMBLADE

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CIRCUIT HYDRAULIQUE

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BUREAUX ET LABORATOIRES

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SALLES HUMIDES ET LABORATOIRE 1200 m2

LOCAUX TECHNIQUES

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5

2. -PROGRAMME DE CYTOGENETIQUE (FIG 1)

2.1. -Objectifs

Les essais d'obtention de souches conchycoles performantes par polyploïdisation portent

sur les principales espèces françaises d'intérêt commercial: (anonymes, 1992)

• Crassostrea gigas (l'huître creuse),

• Ostrea edulis (l'huître plate),

• Ruditapes philippinarum (la palourde du pacifique),

• Ruditapes decassatus (la palourde autochtone).

2.2. -Enjeux socio-économiques et scientifiques

L'application des techniques génétiques de polyploïdisation aux mollusques bivalves

d'élevages est susceptible, par l'intermédiaire des écloseries, de déboucher sur la production de

populations stériles qui pourraient avoir pour avantage:

• d'améliorer les rendements (croissance et qualité),

• de mieux contrôler les risques de développement d'épizootie (populations plus résistantes aux stress),

• de permettre une commercialisation des produits conchylicoles tout au long de l'année,

• d'être un facteur de rentabilité pour les éclose ries de bivalves.

2.3. -Bases scientifiques

L'effort de reproduction chez les mollusques bivalves est prioritaire sur la croissance

somatique, il monopolise le métabolisme énergétique dès le printemps pour la gamétogénèse

induisant un retard de croissance et une modification des qualités organoleptiques de la chair (chute

du taux de glycogène). Il est notamment responsable d'une perte d'énergie de 63% chez l'huitre

Crassostrea gigas agées de 2 ans (Héral et Deslous-Paoli, 1983).

La triploïdisation est une des premières techniques de cytogénétique à déboucher sur

des applications aquacoles, surtout dans le domaine piscicole (Chevassus et al., 1984). Chez les

6

mollusques, les recherches ont surtout été menées aux Etats Unis sur plusieurs espèces :

Crassos/rea virginiea, Crassos/rea gigas, Argopee/en irridians, Haliolis diseus. Ces expériences ont

mis en évidence, notamment chez Crossos/rea gigas (Allen et Downing, 1986 ), une stérilité partielle

des individus triploïdes accompagnée d'une amélioration des performances de croissance et des taux

de survie supérieurs que ces auteurs interprètent comme étant une conséquence d'une meilleure

condition physiologique que leur confèrent leurs abondantes réserves glucidiques.

2.4. -Programme

Le programme se déroule en 3 étapes:

• mise au point de techniques de triploïdisation appliquées aux principales espèces d'intérêt commercial,

• production de populations diploïdes et triploïdes en vue du contrôle de leurs performances,

• contrôle des performances biologiques des différentes populations dans les eaux littorales françaises et en laboratoire.

2.5. -Partenaires et coopérations internationales

Les partenaires sont:

• le réseau génétique IFREMER,

• CNRS-ENSL,

Des coopérations internationales sont actuellement développées avec:

• Plymouth Marine Laboratory (Angleterre),

• Centre Océanographique de Rimouski (Canada),

• Institute of Marine and Costal Science (Etats-Unis),

• Université de Grenade (Andalousie).

7

fig.'\: PROGRAMME DE CYTOGENETIQUE

Demande de la profession 1.... 1 Exemples; Glgas aux USA conchyllcole Salmonidés en France

CONTRAINTES TECHNIQUES • Mise au point des techniques d'Induction pour chaque espèce

• Contrôle du taux de polyploïdie

dans les élevages

IFREMER 1 URGE Programme

POL YPLOIDIE

Soutfen des Réglons Poitou-Charentes

Pays de Loire

CONTRAINTES BIOLOGIQUES • Maîtrise de la reproduction et du conditionnement des géniteurs • Maîtrise des élevages larvaJres

et postlarvalres .

. ~_/

Bilan énergétique

Résistance aux maladies

Essais de production 1'" Recherches complémentaires de polyploïdes

/ , Contrôle des ~

performances , Bilan scientifique ,

IAbandon 1

non

. 1 TETRAPLOIDES 1 o~'-wo ___ IIIIIIIdI_

,..-----"

* COLLABORA nONS - Réseau génétique IFREMER - Participation du CREAA - UBO Brest

8

3. -MATERIELS ET METHODES

3.1. -Production de phytoplancton

Le phytoplancton, aliment des mollusques, conditionne, tant sur le plan quantitatif que

qualitatif, la croissance et la survie des élevages. Il est produit sur place, à partir de cultures

monospécifiques d'algues unicellulaires sur milieu de Conway (Walne, 1974), selon la méthode

classique: culture aseptique des souches en erlenmeyers de 500ml; ensemencements successifs de

2, 10, 20, 300 litres, dans lesquels sont atteintes, en 5 jours environ, les concentrations souhaitées,

entre 5 et 20 millions de cellules par ml selon espèce considérées. L'eau utilisée est pompée à 100m

de profondeur. Elle présente les caractéristiques chimiques de l'eau de mer. De plus, elle est limpide,

aseptique, et de qualité constante. Elle est, en revanche, riche en fer, on emploie donc de l'eau de

mer pour la production d'algues destinée à l'élevage larvaire. Les principales souches utilisées sont:

.Skeletonema costatum,

• Chaetoceros calcitrans (clône pumilum),

• Pavlova lutheri,

• Isochrysis sp.,

• Tetraselmis suecica.

3.2. -Origine,maintien et maturation des géniteurs

La période naturelle de reproduction, juin-juillet-août, étant trop courte pour les travaux

de recherche effectués dans l'écloserie, les géniteurs, fournis par des exploitations locales, sont

prélevés dès le mois de février dans le milieu naturel. Ils subissent une maturation artificiellement

dans de l'eau de mer renouvelée, à 22"C, enrichie en phytoplancton et sont nettoyés

quotidiennement, pendant une durée minimale d'l mois.

3.3. -Ponte

L'objectif est de réaliser une fécondation controlée (fécondation au moment voulu,

concentration connue des différentes gamètes pour effectuer des rapports spermatozoïdes/ovules

9

précis, vérification de l'état des gamètes ... ).Pour obtenir des gamètes, 2 méthodes actuellement sont

utilisées (planche photo 1).

3.3.1. -Stimulation des géniteurs

Des stress physiques (variations thermiques, mise à sec, augmentation de turbidité ... ) ou

chimiques (variation de pH, de salinité, injection de KCI ... ) réalisés sur les géniteurs peuvent induire

l'émission des gamètes. La ponte intervient 1 à 4h après les premiers chocs. Les ovules et les

spermatozoïdes sont récoltés séparément, et filtrés sur tamis, afin d'éviter des fécondations

incontrolées et d'éliminer des impuretés.

3.3.2. -Prélèvement des gamètes

La deuxième méthode, dite de " stripping", consiste à scarifier la gonade des animaux à

l'aide d'un scapel. Elle a pour avantage de supprimer la phase de stimulation de la ponte et celle

d'allente d'expulsion des gamètes, et qui perment d'obtenir des ovules parfaitement matures à un

stade d'évolution méïotique bien synchrone et avec l'assurance d'une absence totale de fécondations

incontrolées. Elle a pour inconvénient de sacrifier les géniteurs et donc d'en nécessiter un stock

important. Il faut noter que, d'autre part, celle technique est impossible à réaliser chez les espèces

larvipares comme Ostrea edulis.

3.4. -Induction de la triploïdie

3.4.1. -Principe

Un individu est triploïde lorsqu'il possède 3N chromosomes. Chez les mollusques, les

ovocytes sont bloqués en prophase ou métaphase de la première division méïotique. L'achèvement

de la méïose, qui se concrétise par l'expulsion de 2 globules polaires, ne peut être provoquée que par

la pénétration d'un spermatozoïde (planche photo Il).

10

PLANCHE PHOTO 1

1- Spermatozoïdes.

2- Ovules non fécondés à vésicule genninative (VG) centrale visible.

3- Expulsion d'un globule polaire (GP) après fécondation.

4- Formation du lobe polaire (début du stade 2 cellules).

5- Stade 2 cellules.

PLANCHE PHOTO II

1- Ovule non fécondé.

2- Ovule fécondé (présence d'un spermatozoïde SPZ).

3- Condensation du génome maternelle.

4- Expulsion du premier globule polaire (GPI)

ô génome paternel

ç génome maternelle

5- Expulsion du deuxième globule polaire (GP2), avant caryogamie.

6- Fonnation du lobe polaire (LP). Anaphase de la première division mitotique.

11

12

L'induction de la triploïdie est actuellement obtenue par rétention d'un des deux globules

polaires en soumettant les oeufs, quelques minutes après la fécondation, à des chocs physiques

(température, pression) ou à un traitement chimique (fig.2).

La technique d'induction chimique à la cytochalasine B, et plus récemment, au 6 DMAP

a été retenue (Desrosiers et al, soumis). L'efficacité dépend de la concentration, de la température,

de la durée et du moment d'application du traitement. Ces paramètres qui sont fonction de la biologie

et du développement embryonnaire doivent être déterminés pour chaque espèce (fig.3).

3.4.2. -Traitement à la cytochalasine B

Les cytochalasines résultent du métabolisme de certains chàmpignons. Elles modifient le

degré de polymérisation des molécules d'actine en empêchant leur addition aux filaments, sans

toutefois inhiber la mitose. Appliquées avant l'expulsion d'un des deux globules polaires, elles

désorganisent simultanément le réseau de filaments qui permet la migration des chromosomes et

l'anneau fibrillaire qui opère normalement une constriction du fragment cytoplasmique constituant le

globule polaire.

Le traitement appliqué est adapté de la méthode de Downing et Allen (1987). Il utilise la

cytochalasine B (CB), qui est un produit dangereux, cancérigène, tératogène et couteux (60000F/g). Il

comporte 2 étapes, l'immersion des oeufs dans une solution de CB puis un rinçage dans une solution

de DMSO (diméthylsulfoxyde). La CB, dissoute dans du DMSO à une concentration de 1 mg/l, est

mise en contact avec les oeufs pendant 15min, qui sont recueillis ensuite sur un tamis de 1IJm et

rinçés.Les oeufs sont placés dans un bain de DMSO de 0.1 % durant 20min afin de les débarasser de

la CB résiduelle, puis en incubation dans un bac de 30 litres.

3.4.3. -Traitement au 6-DMAP

Le 6-diméthylaminopurine (6-DMAP) ne perturbe pas la synthèse des protéines mais

seulement l'activité phosphorylatrice (Néant et Guerrier, 1988) des protéines kinases, entraînant ainsi

la décondensation de la chromatine; les chromosomes métaphasiques donnent alors des noyaux au

repos et le fusEjau 'est détruit par dépolymérisation de la tu bu Ii ne.

,1

OVOCYTE

Fig. : Induction de la triploïdie chez les mollusques bivalves

FECONDATION O::Pl..A.SION GP1 EXPV..s'ON GP2 CARYOQA.MIE

~H {:H)CuGJ8 DIPLOIDE

~H C:0cv~fj~) TRIPLOIDE PAR RETENTION DU GP1

G~)Czj TRIPLOIDE PAR RETENTION DU GP2

GPl : Premier globule polaire GP2: Second globule polaire

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13

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Crassostrea gigas Développement embryonnaire à 18"C

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o 10 20 3J 40 50 00 70 80 90 TEMPS POST-FECONDATION (min)

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TEMPS POST-FECONDATION (min)


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TEMPS POST-FECONDATION (min)

1 14

15

Le traitement est appliqué selon le protocole de Gérard (1991) avec une concentration

de 300 fJMII administrée 15min après la fécondation pendant 20min.

L'avantage de ce produit par rapport à la CB est qu'if pourait être moins dangereux, qu'if

coûte moins cher et que son effet est réversible: il suffit en effet de laver les oeufs avec de l'eau de

mer pour que les protéines se rephosphorylent, que les chromosomes se recondensent, et que les

microtubules se reforment.

3.5. -Contrôle et détermination de la ploïdie

Un des principaux problèmes de la méthode chimique d'induction de la triploïdie est le

résultat partiel de la polyploïdie. Une détermination de la ploïdie des individus ou du pourcentage de

triploïdes dans les lots obtenus après manipulation et élevage est donc nécessaire. Deux méthodes

existent, la première longue et ne pouvant être effectuée que sur des larves, a été remplacée

récemment par la deuxième plus rapide et adaptable à tous les stades de la vie de l'animal.

3.5.1. -Par caryologie

Les jeunes larves trocophores sont immergées 4h après la fécondation dans une solution

de colchicine (0.2g/1 d'eau de mer) pendant 2h afin de bloquer les chromosomes en métaphase. Un

choc hypotonique (eau de mer/eau douce: 1/3) de 20min induit un gonflement des cellules qui permet

de mieux distinguer les chromosomes. Les larves sont ensuite fixées dans 3 bains sucessifs de

Carnoy (éthanol/acide acétique: 3) à 4 'C. Les cellules embryonnaires sont dissociées par agitation

pendant 10min dans de l'acide acétique dilué à 50% et déposées sur une lame préchauffée à 45'C

environ. Enfin les lames sont colorées 10min par une solution de Giemsa (4%) à pH 7 (tampon

phosphate). L'observation microscopique permet de compter le nombril de chromosomes sur 50

métaphases prises au hasard.

3.5.2. -Par imagerie numérique

La technique d'analyse de la ploïdie chez les Mollusques bivalves par imagerie

numérique a été mise au point par Gérard et al. (1991). Deux protocoles existent en imagerie

16

numérique: l'un effectué sur des individus par l'intermédaire d'une empreinte branchiale (figA) et

l'autre sur des populations cellulaires (fig.5 et 6). Dans ce dernier cas, il est nécessaire d'avoir des

cellules bloquées au même stade de synthèse d'ADN. Pour qu'il en soit ainsi, on utilise un

antimitotique, l'aphidicoline, à une dose de 5Ilg/ml.

L'analyseur d'image, composé d'un microscope, d'une caméra et d'un micro-ordinateur

(fig.7) est un appareil de mesure photométrique qui permet de déterminer le degré de ploïdie suivant

la quantité d'ADN (Gérard et al. 1991/b). Les noyaux des cellules sont colorés par la réaction de

Feulgen Rosaniline. L'hydrolyse acide des ponts ribose-purine de l'ADN donne des résidus aldéhydes

qui, réagissant spécifiquement avec le réactif de Schiff, donnent une coloration rose. La densité

optique que mesure l'analyseur sera d'autant plus importante qu'il y aura d'ADN. L'analyseur donne le

rapport de la densité optique intégrée existant entre le témoin diploïde et le sujet étudié. Ce rapport

est de 1 si l'animal est diploïde de 0.5 s'il est haploïde et de 1.5 s'il est triploïde.

3.6. -Elevage larvaire

Les oeufs, environ 100 par ml, sont incubés à 25°C dans des bacs cylindro-coniques de

30 litres remplis d'eau de mer filtrée à 11lm et légèrement agitée par un bullage à la base. Au bout de

24h, les larves nageuses sont recueillies sur un tamis de 451lm et comptées afin:

• d'ajuster les lots à une concentration de10 larves par ml,

• de chiffrer le taux d'éclosion,

• de dénombrer éventiellement le taux de larves anormales (planche photo III).

Celte opération, répétée tous les 2 jours, s'accompagne d'un contrôle de croissance, et

de survie, jusqu'au transfert en nurserie. A chaque renouvellement d'eau, un antibiotique

(chloramphénicol) est ajouté, pour limiter le développement bactérien.

L'alimentation phytoplanctonique, généralement obtenue par mélange de 3 espèces, est

donnée quotidiennement à des concentrations de 20 celluleS/ill par espèces.

Figure 4- Contrôle de la ploïdie sur individus adultes. Individu diploïde en haut, tri.ploïde en bas.

17

Référence externe : ATD1 (1. 00)

Nombre de cellules 120

96

72

48

24

oL c 4c 6'c

Référence interne


40

30 .

20

10 .

oL~ , , 2c 4c 6c

Echantillon analysé A42 1 ATD1 (1.00)

Indice ADN (lA)

% de cellules 60

50

40

30

20

10

0 2c 4' c {;::---Tc--lô c

Nombre de cellules analysées

Degré de ploïdie (DP) Degré Q'hyperploïdie (DH) Indice de prolifération (IP)

56

100.0 % 0.0 % O. 0 % (NU 1)

L __ .. ____ . --'-- . ___ _

Référence externe : ATDl (1.00)


96

72

48

24

0L--Référence interne


40

30

20

10

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o , , , 2c 4c 6c

/

.. _.- .. _----,

Echantillon analysé

Indice ADN (lA)

A43 1 ATDl (1.00)

% de cellules 70

60

50

40

30

20

10

o l , 2c 4c bc

Nombre de cellules analysées:

Degré de ploïdie (DP) Degré d'hyperploïdie (DH) Indice de prolifération (IP):

45

-100.0 % 0.0 % 0.0 % (Nul)

! ,

l

Figure 5 Analyse d'une population cellulaire.

Référence externe : t2n (1.00)


40

30

20

10

o '" 2c 4'c

Référence interne


40

30

20

10

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6'c

6'c

Echantillon analysé

Indice ADN (lA)

~8

CB20' / t2n (1.00)

% de cellules 30

20

10

o 1 <s

c 4 c b c Nombre de cellules analysées:

Degré de ploïdie (DP) Degré d'hyperploïdie (DH) Indice de prolifération (IP):

186

-64.6 % 0.0 % o . 0 % (Nu 1)

___________ ~J

Figure 8 Décomposition en gaussiennes de la même population cellulaire.

1 Fré~~~e~c~ ~ (%)

40

30

20

10 2N 17%

3N 83%

01 ,D'1 ,YI\J ,I l,II 1 1,1'--;-., rr=l o 4000

"

8000 12000 16000 20000 24000 28000 D.O.I.

Fig . ..,: CONFIGURATION DU . SYSTEME SAMBA 2005

Camera

Microscope

Processeur de prétraitement

Moniteur

Processeur de

commande et de

gestion de l'acquisition

Moniteur

Processeur de

traitement et

d'analyse des données

Imprimante

'l' 1

. 1 1 i"

-19

mOLORd :!IR;)NV'ld

21

3.7. -Micronurserie

Après une période d'environ 20 jours d'élevage larvaire, la métamorphose intervient: les

larves cessent de nager et cherchent un support pour s'y fixer définitivement. Aprés filtration sur un

maillage de 250 ~m, elles sont placées dans des tamis de 100~m dont le fond est tapissé de brisure

de coquilles et les bords paraffinés afin d'éviter leur fixation sur ce support. Tant qu'il n'a pas atteint

une taille de quelques millimètres, le naissain doit être maintenu dans un environnement contrôlé,

l'eau doit être enrichie en nourriture, chauffée à 20"C, et renouvelée à un débit d'environ 300 à 400

litres/heure.

3.8. -Contrôle des performances biologiques en milieu naturel et en laboratoirre

Ce contrôle met à contribution plusieurs unités de recherche (fig.8).

Deux sites naturels ont été retenus: La Tremblade et Ouistreham. L'URRA et le

Laboratoire Régional d'Ouistreham assurent le suivi de l'élevage, le contrôle des différents

paramètres de croissance, la mortalité, la maturation et l'analyse des les constituants biochimiques.

Le contrôle de la ploïdie est assurée par l'URGE. Une étude histologique de la reproduction est

effectuée par l'Université de Bretagne Occidentale associée à l'URGE pour le contrôle de la ploïdie.

2.'2.

Fig. 9: CONTROLE DES PERFORMANCES DES POPULATIONS DIPLOIDES ET TRIPLOIDES DE Crassostrea glgas

Contrôle des performances Contrôle des performances

dans le milieu naturel: au laboratoire:

La Tremblade - Ouistreham La Tremblade

1 1 1 1 Biométrie, Biochimie 1 1 Reproduction 1 1 Physiologie 1

1 1 1 Contrôle de la ploïdle Contrôle de la ploidie Obtention de lots diploïdes • URGE-La Tremblade • URGE-La Tremblade et triploïdes purs par

1 1 biopsie et analyse d'Images

.URGE-La Tremblade Données blométrlques : Etude histologique

• URRA La Tremblade de la reproduction: 1 • Ouistreham • Université de

Bretagne Occidentale Bilan énergétique:

1 • UREA-La Tremblade

Analyses biochimiques:

1 • URRA La Tremblade ~ ... _--

'"

23

4. -DEROULEMENT DU PROGRAMME

Par simplification et du fait de l'impact économique de l'huitre creuse dans le bassin de

Marennes·Oléron, les résultats présentés porteront uniquement sur cette espèce.

4.1. -Résultats sur l'induction de la triploïdie

L'efficacité des techniques d'induction de la triploïdie est jugé essentiellement sur la base

du pourcentage de triploïdes obtenu, de la toxicité du traitement, et de son coût. D'importantes

améliorations ont été réalisées depuis 1990. La méthode à partir du 6-DMAP semble la mieux

convenir. Actuellement, une bonne manipulation doit donner 80 à 90% de triploïdes (fig.9 et 10).

Théoriquement, la triploïdie, jouant sur le développement sexuel, ne devrait pas apporter

des modifications dans la croissance larvaire. Les résultats obtenus expérimentalement confirment

cette hypothèse (fig. Il).

En revanche, le traitement d'induction, par ses effets toxiques, semble intervenir sur la

viabilité des larves (fig.12)

4.2. Résultats du contrôle de performance

Ce contrôle, débuté en Mars 91, est donc loin d'être terminé.

Sur le site de la Tremblade, l'élevage en claire a été retenu , afin d'accélérer les

processus de première maturation, qui doivent théoriquement entraîner des différences de

performances entre les lots diploïdes et triploïdes. Sur le site d'Ouistreham, l'élevage se fait sur

l'estran. La croissance étant moins rapide sur l'estran qu'en claire, les résultats présentés ici

concernent uniquement ceux obtenus à la Tremblade. Il faut signaler que de gros problèmes

d'infrastructures ont été rencontrés; une réfection des claires a été nécessaire en cours d'expérience,

obligeant à transférer provisoirement les huîtres dans un autre site. La dégration du milieu s'est

traduite par de très fortes mortalités dans les lots diploïdes et triploïdes, et par une distorsion dans les

performances biologiques enregistrées.

(f)

'" 01 <Il

100

C '" 50 2 :J o

CL

Fig. 9 : Taux d'éclosion et pourcentage de triploïdes 1 dose de 6-DMAP

oV~/~~/~/~(l:>.~(

(f)

'" 01 <Il

100

~ 50 2 :J o

CL

o

Téfroi, 150 ).JM;I 300 I-IMA 450 }JMJ1 600 IJM;1

Doses de 6-DMAP

Fig.10: Induction de la triploïdie par le 6-DMAP et la CytochaJasine B

Témo'n 6CMAP 6CMAP cs cs 150JJM/1 300).J~Vl O.5rrçA 1 rn;J11

/

2.4

lrn€s <rerrrdes

% trÇbïdes

25

Fig. 11 ~ Elevage larvaire CG3N9117 CROISSANCES COMPAREES

350T,----------------------------------,

(j) 300 z o a: ~ 250~·····

2: z w a: :J W

200 ... ····

:J 150~ .. " C) z o -'

100~" .

50 1 j Il! 1 1 j 1 i i 1 i III i 1 i 1 IIi III Iii II 1111

o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

JOURS

-+--

Témoin 2N

----3N 1 6DMAP-150

--..t.--

3N26DMAP-300

-e-

3N3 CS-0.5mg

----3N4 CS-1mg

Fig.12.: Elevage larvaire CG3N9117 MORTALITES RELATIVES f TEMOIN

"" o

z w w > a: :J (J)

100"'~

50~"

o! 1 i Iii i Iii i i Iii 1 Iii 1 i 1 1 1 Iii 1 i Iii 1 i 1

o 2 4 6 8 10121416182022 24 26 28 30 3234

JOURS

/

-A-

3N26DMAP-300

--El-

3N3 CS-0.5mg

---3N4 CS-1mg

26

4.2.1. Evolution des paramètres biomètriques

La croissance des huitres a été satisfaisante. D'un poids moyen d'environ 3.5g au mois

de février, elles ont aUeint 41g au mois de novembre pour le lot de diploïdes, et 53g pour le lot de

triploïdes. La différence entre les 2 lots n'est sensible qu'après la période estivale (fig.13).

L'évolution du poids sec de chair et de l'indice de condition (fig.14 et 15) renseigne un

peu mieux sur les différentes phases d'élevage. Les 2 premiers prélèvements, février et mars,

correspondent à la fin du prégrossissement dans l'écloserie de La Tremblade, l'indice de condition

juste avant le transfert en mer étant particulièrement élevé.

Du mois d'avril à la fin juin, les prélevements ont été realisés dans les claires. Le poids

sec de chair, qui n'évolue plus, et l'indice de condition, qui chute, sont de bons indicateurs d'un stress

nutritif. Une amorce de reprise de croissance est toutefois enregistrée à partir de la mi-juin.

C'est à partir de juillet que sont enregistrées les premières différences entre les lots

triploïdes et diploïdes. Entre juillet et novembre, l'indice de condition fluctue très peu chez les

triploïdes (entre 65 et 75). Pendant la même période, chez les diploïdes, 2 phases peuvent être

distinguées: une phase de maturation entre juillet et début août, pendant laquelle l'indice monte

jusqu'à 90, suivie d'une phase d'émission des gamètes entre le début et la mi-août durant laquelle

l'indice chute brutalement.

Les résultats histologiques de la reproduction, quand ils seront connus, permettront de

vérifier ces hypothèses, et également de voir si, chez les triploïdes, la faible augmentation de l'indice

de condition observée pendant la première quinzaine d'août, et sa diminution progressive entre

septembre et novembre, correspondent réellement à une maturation et à une vidange de produits

gamétiques, phénomène déjà signalé par Allen et Downing (1990).

4.2.2. Evolution des paramètres biochimiques

Les résultats obtenus, si l'on excepte la période de stress trophique, sont dans

l'ensemble conformes à ceux déjà connus.

Ol c Ql

Fig.13: POIDS TOTAL MOYEN 6OT,-------------------------------------------,

60"'

40"······ ................... .

U) 30"'" u o

CL 20"'"

10

o l , , , , , 1

Z1

-G-

Témoin 2N

-,ok

Triploïdes

Jan-91 Mar-91 Mai-91 Jul-91 Sep-91 Nov-91 Jan-92

Fév-91 Avr-91 Jun-91 Aoû-91 Oct-91 Déc-91

Fig.~+! POIDS SEC DE CHAIR 1.4, , 'r----------,

1.2"

Ol c 0.8"'" Ql U)

U ,) 0.6" CL

0.4

0.2"'" ...

o l , , , , , 1

-G

Témoin 2N

-,ok

Triploïdes

Jan-91 Mar-91 Mai-91 Jul-91 Sep-91 Nov-91 Jan-92

Fév-91 Avr-91 Jun-91 Aoû-91 Oct-91 Déc-91

"

2S3

Fig.15: INDICE DE CONDITION Psi (Pt-Pc) 100 1 1 ri ------,

90

BO

70~··

60~·

50

40

30 l , , , , , 1

---El-

Témoin 2N

-.0.

Triploïdes

Jan-91 Mar-91 Mai-91 Jul-91 Sep-91 Nov-91 Jan-92 Fév-91 Avr-91 Jun-91 Aoû-91 Oc\-91 Déc-91

Fig.16: TENEUR EN GLYCOGENE 200 1 il\ 1 ri ----

1 BO~··

160~··· .

140~··· Dl --- ............ ~ .. . Dl 120~······ E c 100~ ... (j)

U)

Ll o

D...

BO~

60~··· ..

40~·

20 .... ··

...• ~~ ••••••••••••.....

01 l ,,'t~, 1 1

-El-

Témoin 2N

...... -Triploïdes

Jan-91 Mar-91 Mai-91 Jul-91 Sep-91 Nov-91 Jan-92 Fév-91 Avr-91 Jun-91 Aoû-91 Oc\-91 Déc-91

/

29

On obtient un pic des teneurs en protéines pendant la gamétogénèse, aux mois de juin

et juillet. Le phénomène inverse est enregistré pendant le stress à la fin du printemps (fig.17).

Les teneurs en lipides (fig.18) ont un cycle plus normal. Les teneurs maximales, atteintes

en juillet pour les diploïdes, correspondent à la fin de la gamétogénèse, la ponte entrai na nt ensuite

une forte diminution. Les triploïdes présentent également un pic légèrement décalé au mois d'août.

les résultats de l'étude histologique devraient permettre de savoir si ce maximun doit être relié à une

activité gonadique.

Pour résister aux mauvaises conditions trophiques du printemps, les huîtres diploïdes

comme triploïdes, ont épuisé leurs réserves glucidiques (fig.16 et 19). Dès que les conditions se sont

améliorées, à partir de la mi-juin, la teneur en glycogène des huîtres triploïdes remonte rapidement

alors qu'elle reste proche du zéro pour les diploïdes pendant la phase de gamétogénèse. Ce résultat

très important confirme, qu'en absence de stress trophique, la réduction de la gonadogénèse chez

l'huître triploïde entraîne une amélioration de la qualité de la chair, qui se traduit par une teneur

élevée en glycogène. Après la ponte, les teneurs en glucides totaux et en glycogène chez les

diploïdes augmentent progressivement pour rejoindre au mois de novembre celles des triploïdes.

~ E c " ~ " "0 a.

Fig.17'; TENEUR EN PROTEINES 400 1 1 c, ----,

-G

Témoin~

-.0.

Trlplofdes

Jan-91 Mar-91 Ma/...gt Jul-91 Sep-91 NoV-9t Jan-92

Fév-91 Avr-flt Jun--91 AOÛ-91 QC[-91 OéC-91

Flg.18; TENEUR EN LIPIDES 1101 1 r'------,

100

-e

Témoin 2f\J

-.0.

Triploïdes

01 90 ... ·· ê1, E c " ~ " "0 a... 70 ... ··

(J) ~ (J)

E C

" ~ " "0 a.

/

Jan-91 Mar-gt MaHl1 Jul-91 Sep-9t NoV-9t Jan-92

Fév-91 Avr-gt Jun-91 Aoû...g1 OCt-91 OéC-91

Fig.1g; TENEUR EN GLUCIDES 250

2CO

150

100

o l, " 1

-B

Témoin 2'\j

-*Triploïdes

Jan-91 Mar-Q1 Mai-91 Jul-91 Sep-91 NoV-91 Jan-92

Fév-91 Avr-91 Jun-91 AOÛ-91 Oct-gt Déc-Ol

3l

31

5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Les résultats. présentés jusqu'à présent. sont l'aboutissement des recherches menées en

1989, 1990, et 1991. Les systèmes expérimentaux ont été mis en place. Des techniques de

triploïdisation ont été acquises, et des populations de triploïdes viables produites. Un contrôle de la

ploïdie a été mis au point. Le contrôle des performances biologiques a maintenant débuté.

Désormais, les recherches sont portées, essentiellement, sur l'amélioration des

techniques de triploïdisation. L'utilisation de nouveaux produits d'induction moins toxiques et plus

économiques, comme le 6-DMAP, donne déjà des résultats. Mais la mise au point de techniques de

tétraploïdisation semble la voie la plus prométeuse. En effet, l'obtention de géniteurs tétraploïdes

viables, croisés avec des géniteurs diploïdes, serait susceptible de fournir des populations à 100%

triploïde. Le contrôle de ploïdie, jusqu'à présent obligatoire, ne serait plus systématiquement

nécessaire.

L'induction de la tétraploïdie pourrait être obtenu par:

• la rétention des 2 globules polaires précédée d'une inactivation du stock

chromosomique du spermatozoïde (tétraploïdie gynogénétique),

• la suppression de la première division mitotique (tétraploïdie endomitotique).

Diverses techniques sont essayées, traitements chimiques, chocs de pression, chocs

thermiques, électrofusion ...

Aucun individu tétraploïde viable chez les mollusques bivalves n'a encore pu être

obtenu. Mais les réussites obtenues dans le domaine piscicole, laissent espérer et croire à de belles

perspectives pour l'appplication de cette nouvelle méthode à des souches conchylicoles.

32

BIBLIOGRAPHIE

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