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Ars Pharmaceutica, 45:3; 211-234, 2004

211ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LOS FACTORES DE POLIMERIZACIÓN EN LA FORMACIÓN DE NANOPARTÍCULAS...

Estudio de la influencia de los factoresde polimerización en la formación

de nanopartículas de polibutil-cianoacrilatoy la cinética de liberación de fármaco in vitro

Study of influence of polymerization factors on formation of poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles and in vitro drug release kinetics

HARIVARDHAN-REDDY L, MURTHY RSR*

Drug delivery research laboratory, Center of relevance and excellence in NDDS, Pharmacy Department, G.H.Patel building, M.S. University of Baroda, Vadodara-390002, Gujarat, India.*Autor de contacto: Teléfono: (0265) 2434187/2794051. Fax: (0265) 2418928

Correo electrónico: [email protected]

RESUMEN

Las nanopartículas de polibutil-cianoacrilato se sintetizaron mediante polimerización por dispersión y se caracteri-zaron mediante espectroscopía 1H-NMR, calorimetría diferencial de barrido y microscopía electrónica de transmi-sión. Se estudiaron propiedades de las partículas tales como el tamaño y el potencial zeta, y la influencia de laconcentración y el tipo de estabilizador en el tamaño de las partículas. También se estudió la influencia de factoresde polimerización tales como la concentración de monómero, la temperatura y el tiempo de polimerización en eltamaño y la distribución de las partículas, y su efecto en la eficacia de captura de las nanopartículas, utilizandoclorhidrato de doxorubicina (DH) como fármaco modelo. Las concentraciones elevadas de monómero dieron lugara la formación de partículas de mayor tamaño con distribución de tamaño bimodal y amplia y aumentaron lacaptura del fármaco. La polimerización a baja temperatura dio lugar a la formación de partículas más pequeñas,mientras que a temperatura elevada (60 °C) se produjo aglomeración y se redujo la captura del fármaco. Lostiempos de polimerización elevados no mostraron tener mucha influencia en el tamaño de las partículas, peroaumentaron la captura del fármaco. Se realizó la carga del fármaco en las nanopartículas mediante técnicas deincorporación y adsorción y se determinó la captura del fármaco. Las nanopartículas cargadas mediante técnicas deincorporación y adsorción mostraron una liberación rápida de fármaco en 0,001 N HCl. La liberación de fármacoen ambos tipos de nanopartículas siguió la ecuación de Higuchi. También se intentó establecer una correlación críticaentre las propiedades de las partículas y el comportamiento de la liberación de fármaco, así como subrayar suimportancia en diversas facetas de la administración de fármaco.PALABRAS CLAVE: Polibutil-cianoacrilato. Nanopartícula. Doxorubicina. Polimerización. Captura de fármaco. Libera-ción de fármaco.

ABSTRACT

Poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles were synthesized by dispersion polymerization and characterized by 1H-NMRspectroscopy, differential scanning calorimetry and transmission electron microscopy. Particle properties such as zetapotential and size, and the influence of concentration and type of stabilizer on particle size were studied. The influenceof polymerization factors such as monomer concentration, polymerization time and temperature on the particle size anddistribution, and their effect on entrapment efficiency of the nanoparticles was studied, using doxorubicin hydrochloride(DH) as a model drug. High monomer concentrations lead to the formation of larger particles with broad and bimodalsize distribution, and increased the drug entrapment. Polymerization at low temperatures resulted in smaller particles,and agglomeration was found at high temperature (60°C), with reduced drug entrapment. High polymerization times didnot show much influence on particle size, but increased the drug entrapment. Drug loading into nanoparticles was

TRABAJOS ORIGINALESORIGINAL WORKS

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HARIVARDHAN-REDDY L, MURTHY RSR.

carried out by incorporation and adsorption techniques, and drug entrapment was determined. The nanoparticles loadedby incorporation and adsorption techniques showed rapid drug release in 0.001N HCl. Drug release from both types ofnanoparticles followed Higuchi equation. An attempt was also made to critically correlate the particle properties anddrug release behavior and emphasize its importance in various facets of drug delivery.KEY WORDS: Poly(butyl cyanoacrylate). Nanoparticle. Doxorubicin. Polymerization. Drug entrapment. Drug release.

INTRODUCCIÓN

El desarrollo de sistemas de transporte coloi-dales no ha constituido un área de gran interésen el campo de la administración de fármacos.Las nanopartículas poliméricas son los sistemasde transporte que se han investigado en mayorprofundidad. Las nanopartículas de polialkil-cia-noacrilato han empezado a suscitar recientemen-te un creciente interés en el ámbito de la admi-nistración de fármacos dirigida debido a sufacilidad de síntesis, biodegradabilidad, capaci-dad para alterar la biodistribución de los fárma-cos y reducida toxicidad.1-5 La polimerizaciónaniónica de los monómeros de alkil cianoacrila-to en un medio acuoso acídico con un estabiliza-dor da lugar a la formación de nanopartículas deelevada porosidad y superficie lisa.1,6 Los pará-metros experimentales como el pH y la tempera-tura demostraron tener una mayor influencia enlas propiedades de las partículas sintetizadas.7

La polimerización con un pH bajo favorece laformación de nanopartículas, mientras que un pHsuperior a 3,5 acelera la síntesis de polímeros yda lugar a la formación de agregados de mayortamaño.7 La preparación de nanopartículas quecontienen un fármaco se puede realizar mediantela disolución del fármaco en un medio de poli-merización antes de la adición de monómero omediante la adsorción del fármaco en la superfi-cie de la nanopartícula previamente sintetizada.Se han publicado varios estudios sobre las nano-partículas de polialkil-cianoacrilato relacionadoscon la incorporación de diversos fármacos 5, 8-10,la estabilidad11, la toxicidad1 y la biodistribución.12

Sin embargo, se ha prestado poca atención alestudio de la influencia real de los factores depolimerización en las propiedades de las partí-culas y su efecto en la eficacia de captura de lasnanopartículas para la obtención de una formu-lación optimizada. Respecto a las posibilidadesde aplicación, las propiedades de las partículastales como el tamaño, la distribución de tamañoy las características de la superficie tienen unagran importancia, especialmente para la admi-nistración de fármacos dirigida, ya que influyenen la biodistribución de las nanopartículas.

INTRODUCTION

Development of colloidal carrier systems hasnow been an area of great interest in the field ofdrug delivery. Amongst these carriers, polyme-ric nanoparticles are the most extensively inves-tigated. Poly(alkyl cyanoacrylate) nanoparticleshave recently gained increasing interest in targe-ting and drug delivery, because of the ease ofsynthesis, biodegradability, ability to alter bio-distribution of drugs and lower toxicity.1-5 Anio-nic polymerization of alkyl cyanoacrylate mono-mers in aqueous acidic media containing astabilizer leads to the formation of nanoparticleswith high porosity and smooth surface.1,6 Theexperimental parameters such as pH and tempe-rature were reported to have greater influence onthe properties of particles formed.7 Polymeriza-tion at low pH favor nanoparticle formation, butpH > 3.5 leads to rapid polymer formation resul-ting in larger aggregates rather than nanoparti-cles.7 Drug containing nanoparticles can be pre-pared either by dissolving drug in polymerizationmedium prior to the monomer addition, or byadsorption of drug on the preformed nanoparti-cle surface. Several reports were published onpolyalkyl cyanoacrylate nanoparticles regardingincorporation of various drugs5, 8-10, stability11,toxicity1 and biodistribution.12 But a little atten-tion has been given to study clearly the influen-ce of polymerization factors on the particle pro-perties, and their effect on entrapment efficiencyof nanoparticles to obtain an optimized formula-tion. In view of applicability, the particle pro-perties such as size, size distribution and surfacecharacteristics have great importance especiallyfor targeted drug delivery13, as they influencethe biodistribution of nanoparticles.

Doxorubicin hydrochloride (DH) is an an-tineoplastic anthracycline antibiotic widely usedin the treatment of acute lymphoblastic leuke-mia, acute myeloblastic leukemia, malignant lym-phoma, hodgkin’s disease and breast carcinoma.The anthracycline ring is lipophilic, and themolecule is amphoteric having acidic functionsin the ring phenolic groups and a basic functionin the sugar amino group. DH causes cytotoxici-


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El clorhidrato de doxorubicina (DH) es unantibiótico de antraciclina antineoplástico amplia-mente utilizado en el tratamiento de la leucemialinfoblástica aguda, la leucemia mieloblásticaaguda, los linfomas malignos, la enfermedad deHodgkin y el carcinoma mamario. El anillo deantraciclina es lipofílico y la molécula es anfo-térica, con funciones acídicas en los grupos fe-nólicos del anillo y una función básica en el grupode aminoazúcares. El DH causa citotoxicidadmediante la intercalación específica del núcleode la antraciclina planar con la doble hélice delADN.14

Las nanopartículas de polibutil-cianoacrilato(PBC) que contienen doxorubicina pueden seruno de los posibles sistemas de transporte parala administración de fármacos, debido a su bio-degradabilidad y a las propiedades de su super-ficie (carga negativa). Estos sistemas se puedenutilizar eficazmente en la quimioterapia del cán-cer, especialmente en los casos de carcinomato-sis peritoneal y carcinomas linfáticos. Partiendode la considerable importancia de las propieda-des de las partículas en tales aplicaciones, eneste informe se presenta un estudio detallado delefecto de factores de polimerización tales comola concentración de monómero, el tiempo y latemperatura de polimerización en la distribucióny el tamaño de las partículas, y la influencia deestos parámetros en la eficacia de captura de lasnanopartículas. Se investigó el efecto del tipo deestabilizador y de su concentración en el tamañoy la distribución de las partículas. También seestudió la cinética de liberación de fármaco delas nanopartículas preparadas mediante incorpo-ración y adsorción de fármaco.

MATERIALES

el monómero de n-butil cianoacrilato fue pro-porcionado gratuitamente por Sun Pharmaceuti-cal Industries Limited (India), las muestras dedextran 40 (peso molecular 40.000) y dextran 70(peso molecular 70,000) fueron proporcionadastambién de forma gratuita por Claris life scien-ces limited (India). El sulfato de dextran se ob-tuvo de Hi-media (India). La muestra de clorhi-drato de doxorubicina fue proporcionadagratuitamente por RPG life sciences (India). Todoslos demás productos químicos y reactivos utili-zados en el estudio eran de grado analítico. El

ty by specific intercalation of planar anthracycli-ne nucleus with the DNA double helix.14

Poly(butyl cyanoacrylate) (PBC) nanopar-ticles containing doxorubicin could be one ofthe potential carriers for drug delivery, becauseof their biodegradability and surface properties(negative charge). These systems could be effec-tively used in the chemotherapy of cancer espe-cially in peritoneal carcinomatosis and lympha-tic carcinomas. The particle properties beingconsiderably important in such applications, thepresent communication reports a detailed studyof the effect of polymerization factors such asmonomer concentration, polymerization tempe-rature and time on particle size and distribution,and influence of these parameters on entrapmentefficiency of nanoparticles. The effect of stabi-lizer type and concentration on particle size anddistribution was investigated. Kinetics of drugrelease from nanoparticles prepared by incorpo-ration and adsorption of drug was also studied.

MATERIALS

n-butyl cyanoacrylate monomer was gifted bySun Pharmaceutical Industries Limited (India),Dextran 40 (molecular weight 40,000) and Dex-tran 70 (molecular weight 70,000) were gift sam-ples from Claris life sciences limited (India).Dextran sulfate was obtained from Hi-media (In-dia). Doxorubicin hydrochloride was a gift sam-ple from RPG life sciences (India). All otherchemicals and reagents used in the study were ofanalytical grade. Water used in the study wasdistilled and filtered through 0.22 µm filter (Pall,India) before use.

METHODS

Synthesis of poly(butyl cyanoacrylate) (PBC)nanoparticles:

Poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles wereprepared by dispersion polymerization by slightmodification of the previously reported method.11

Briefly, monomer was added drop-wise into theacidic medium (0.001N HCl) containing dextran70 under controlled stirring at 700 RPM. Po-lymerization was continued for 3h, after whichthe nanoparticle dispersion was neutralized to pH

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agua utilizada en el estudio era agua destilada yfiltrada a través de un filtro de 0,22 µ (Pall, India)antes de su uso.

MÉTODOS

Síntesis de nanopartículas de polibutil-cianoacrilato (PBC):

Las nanopartículas de polibutil-cianoacrilatose prepararon mediante polimerización por dis-persión con una ligera modificación respecto almétodo empleado anteriormente.11 En síntesis, elmonómero se añadió mediante goteo al medioacídico (0,001 N HCl) que contenía dextran 70removiendo de forma controlada a 700 rpm. Lapolimerización continuó durante 3 horas, trans-curridas las cuales se neutralizó la dispersión denanopartículas hasta un pH de 7,0 mediante untampón de fosfato (pH 7,4) con NaOH y se si-guió removiendo durante 1 hora para obtener unapolimerización completa.

Síntesis de nanopartículas de polibutil-cianoacrilato cargadas con doxorubicina (DPBC)

La preparación de las nanopartículas de DPBCfue similar a la de las nanopartículas de PBC. Sedisolvieron DH y dextran 70 en 0,001 N HCl yse añadió lentamente el monómero mediante goteoal medio de polimerización removiendo de for-ma constante a 700 rpm. Después de 3 horas depolimerización, la dispersión se neutralizó hastaun pH de 7,0 mediante un tampón de fosfato depH 7,4 y se siguió removiendo durante 1 horapara obtener una polimerización completa.

Estimación de doxorubicina en las nanopartículasde DPBC:

La dispersión de nanopartículas se centrifugóa 15.000 rpm durante 30 minutos en un centrifu-gador por enfriamiento (Remi C24, Remi instru-ments, India). Se decantó el sobrenadante y elsedimento se lavó tres veces con agua destiladapara separar el fármaco libre de las nanopartícu-las y se liofilizó. Las nanopartículas liofilizadasse pesaron y se disolvieron en metanol, y seanalizaron las soluciones en un espectrofotóme-

7.0 with 7.4 pH phosphate buffer containing NaOH(7.4 pH PB), and stirring was continued for 1hto allow complete polymerization.

Synthesis of doxorubicin loaded poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles (DPBC)

DPBC nanoparticles were prepared similar toPBC nanoparticles. DH and dextran 70 weredissolved in 0.001N HCl, and monomer was slo-wly added drop-wise into the polymerizationmedium, under continuous stirring at 700 RPM.After 3h of polymerization, the dispersion wasneutralized to pH 7.0 with 7.4 pH PB, and sti-rring was continued for 1h to allow completepolymerization.

Estimation of doxorubicin in DPBC nanoparticles:

The nanoparticulate dispersion was centrifu-ged at 15000 RPM for 30 min in a cooling cen-trifuge (Remi C24, Remi instruments, India). Thesupernatant was decanted and sediment waswashed thrice with distilled water to separate thefree drug from nanoparticles, and lyophilized.The lyophilized nanoparticles were weighed anddissolved in methanol, and the solutions wereanalyzed in UV-Visible spectrophotometer (Hi-tachi U 2000, Japan) at 495 nm.

Characterization of nanoparticles

1H-NMR spectroscopy

1H-NMR spectrum of PBC nanoparticles wasrecorded on FT-NMR Avance 400 MHz Fouriertransform nuclear magnetic resonance spectro-meter (Bruker-Biospin, AG, Switzerland). Thenanoparticles were dissolved in chloroform-d

1(Merck, Germany) and transferred to a 5 mm

NMR tube. The sample was spinned at 20 RPSat a power level of –4.0db, and pulse length of5 µs, with a delay time of 10 s. NMR tube con-taining sample was placed in 5 mm broad bandprobe head, and pulse programming was perfor-med at Zg (zero go) with sweep width of 18ppm. The spectrum of sample was recorded aftercarrying out 32 scans.



tro UV-Visible (Hitachi U 2000, Japón) a 495nm.

Caracterización de las nanopartículas

1Espectroscopía H-NMR

1El espectro H-NMR de las nanopartículas dePBC se registró en un espectrómetro de resonan-cia magnética nuclear FT-NMR Avance FourierTransform de 400 MHz (Bruker-Biospin, AG,Suiza). Las nanopartículas se disolvieron en clo-roformo-d1 (Merck, Alemania) y se transfirierona un tubo de RMN de 5 mm. La muestra secentrifugó a 20 rps a un nivel de potencia de –4,0 db, con una longitud de pulso de 5 µs y untiempo de demora de 10 s. El tubo de RMN quecontenía la muestra se colocó en una cabeza desonda de banda ancha de 5 mm y se realizó unaprogramación del pulso con paso por cero conun ancho de barrido de 18 ppm. El espectro dela muestra se registró después de 32 barridos.

Calorimetría diferencial de barrido (CDB)

Los análisis mediante CDB de las nanopartí-culas se realizaron en un calorímetro diferencialde barrido (Mettler Toledo, Suiza) con una velo-cidad de calentamiento de 10 °C por minuto enun rango comprendido entre 50 y 350 °C.

Microscopía electrónica de transmisión (MET)

Los estudios de MET se realizaron con elmicroscopio electrónico de transmisión PhilipsTechnai-20. Las nanopartículas se dispersaron enagua destilada desionizada y se colocó una gotade la dispersión diluida en una rejilla de cobrecon una película de carbono de 200 mesh. Seutilizó un 2% de uranil-acetato para teñir lasnanopartículas.

Medición del tamaño de las partículas

La medición del tamaño de las partículas serealizó por dispersión de luz dinámica utilizandoel analizador de tamaño de partículas MalvernHydro 2000 SM (Malvern instruments, RU). La

Differential scanning calorimetry (DSC)

DSC analysis of the nanoparticles was carriedout in Mettler Toledo differential scanning calo-rimeter (Mettler Toledo, Switzerland) at a hea-ting rate of 10°C per minute in the range of 50°Cto 350°C.

Transmission electron microscopy (TEM)

TEM studies were performed in Philips Te-chnai-20 transmission electron microscope. Na-noparticles were dispersed in de-ionized disti-lled water and one drop of the diluted dispersionwas placed on 200-mesh carbon coated coppergrid. 2% uranyl acetate was used as staining agentfor nanoparticles.

Particle size measurement

Particle size measurement was carried out bylaser scattering using Malvern Hydro 2000 SMparticle size analyzer (Malvern instruments, UK).Aqueous nanoparticulate dispersion was addedto the sample dispersion unit containing stirrerand stirred in order to minimize the inter particleinteractions, and laser obscuration range wasmaintained between 10-20%. The analysis wasperformed thrice and average values were taken.

The number of particles (Np) was calculatedby the following equation15,

Np = 6 Mo Xm / π ρ Dn3.

Where Dn is a number average diameter of thepolymer particles obtained from dynamic lightscattering, Xm is fractional conversion, Mo is amountof monomer charged in g/cm3 into the polymeri-zation medium, ρ is the density of the polymer ing/cm3 and Np is number of particles/cm3.

Zeta potential measurement

Zeta potential of nanoparticles was measuredin Malvern Zetasizer 3000 HSA (Malvern Instru-ments, UK). The aqueous nanoparticulate dis-persion was diluted in various media such as0.001 N HCl, 0.9% saline, 7.4 pH phosphate bufferand 8.0 pH tris buffer, and the zeta potential wasmeasured.

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dispersión acuosa de nanopartículas se añadió ala unidad de dispersión de la muestra que conte-nía un agitador y se removió para minimizar lasinteracciones entre las partículas, manteniendoun intervalo de oscurecimiento de láser compren-dido entre el 10 y el 20%. El análisis se realizótres veces y se consideraron los valores medios.

El número de partículas (Np) se calculó me-diante la siguiente ecuación15:

Np = 6 M

o X

m / π ρ D

n3.

Donde Dn es el valor medio del diámetro delas partículas de polímero obtenido mediantedispersión de luz dinámica, Xm es una conver-sión fraccional, Mo es la cantidad de monómerocargada en el medio de polimerización medidaen g/cm3, ρ es la densidad del polímero en g/cm3

y Np es el número de nanopartículas por cm3.

Medición del potencial zeta

La determinación del potencial zeta de lasnanopartículas se realizó con un equipo MalvernZetasizer 3000 HSA (Malvern Instruments, RU).La dispersión acuosa de nanopartículas se diluyóen varios medios (0,001 N HCl, solución salinaal 0,9 %, tampón de fosfato de pH 7,4 y tampóntris de pH 8,0) y se midió el potencial zeta.

Adsorción de fármaco en las nanopartículas dePBC

Se estudió la adsorción de DH en las nano-partículas de PBC a varios pH (3,0, 5,0, 7,0 y8,0). Se sintetizaron las nanopartículas de PBC yse ajustó el pH de las dispersiones con una so-lución de 0,1 N NaOH. A continuación, la solu-ción acuosa de DH se añadió a las dispersionesremoviendo simultáneamente y se incubó a unatemperatura de 37 ± 2 °C durante intervalos detiempo predeterminados. Una vez finalizado elperíodo de incubación, se centrifugaron las dis-persiones y se decantó el sobrenadante. El sedi-mento se volvió a dispersar en agua destilada yse liofilizó. El liofilizado se pesó y se disolvióen metanol, y se calculó el contenido de fármacode las soluciones en un espectrofotómetro UV-Visible (Hitachi U 2000, Japón) a 495 nm.

Drug adsorption to PBC nanoparticles

Adsorption of DH to PBC nanoparticles wasstudied at various pH such as 3.0, 5.0, 7.0 and8.0. PBC nanoparticles were synthesized, and thedispersions were adjusted to different pH with0.1N NaOH solution. Aqueous solution of DHwas then added to the dispersions under stirring,and incubated at 37 ± 2°C for predeterminedtime intervals. After incubation period, the dis-persions were centrifuged and supernatant wasdecanted. The sediment was re-dispersed in dis-tilled water and lyophilized. The lyophilizate wasweighed and dissolved in methanol, and solutio-ns were analyzed for drug content in UV-Visiblespectrophotometer (Hitachi U 2000, Japan) at 495nm.

Drug release from DPBC nanoparticles

Release of DH from DPBC nanoparticles wasperformed in 0.001N HCl and 0.9% saline. Dialysisbag technique was used for the release study asreported by Marchal-Heussler et al.8 The aqueousnanoparticulate dispersion was placed in cellulo-se dialysis bag (Hi-Media, cutoff 5000) and issealed at both ends. The dialysis bag was dippedin the receptor compartment containing dissolu-tion medium, which was stirred continuously at100 rpm maintained at 37 ± 2°C. The receptorcompartment was closed to prevent evaporationof dissolution medium. Samples were withdrawnat regular time intervals and the same volumewas replaced by fresh dissolution medium. Thesamples were analyzed in UV-Visible spectro-photometer at 495 nm. All experiments wererepeated thrice and the average values were taken.

RESULTS AND DISCUSSION

Synthesis and mechanism of formation of PBCnanoparticles:

PBC nanoparticles were synthesized by dis-persion polymerization of n-butyl cyanoacrylateby slow and drop-wise addition of monomer intothe polymerization medium containing stabilizer.The mechanistic events involved in the polyme-rization are discussed here. Controlled concen-tration of hydroxyl ions present in the medium,



Liberación de fármaco de las nanopartículas deDPBC

La liberación de DH de las nanopartículas deDPBC se realizó en 0,001 N HCl y solución salinaal 0,9%. Para el estudio de la liberación se uti-lizó la técnica de la bolsa de diálisis referida porMarchal-Heussler et al.8 La dispersión acuosa denanopartículas se colocó en una bolsa de diálisisde celulosa (Hi-Media, máximo 5000) y se sellópor ambos lados. La bolsa de diálisis se introdu-jo en un compartimento receptor que conteníaun medio de disolución, que se removió conti-nuamente a 100 rpm y se mantuvo a una tempe-ratura de 37 ± 2 °C. El compartimento receptorse cerró para evitar la evaporación del medio dedisolución. Las muestras se fueron retirando aintervalos de tiempo regulares y el volumen re-tirado se sustituyó por un medio de disoluciónfresco. Las muestras se analizaron en el espec-trofotómetro UV-Visible a 495 nm. Todos losexperimentos se repitieron tres veces y se consi-deraron los valores medios.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Síntesis y mecanismo de formación de lasnanopartículas de PBC:

Las nanopartículas de PBC se sintetizaronmediante polimerización por dispersión de n-butilcianoacrilato añadiendo lentamente monómeromediante goteo al medio de polimerización quecontenía el estabilizador. En esta sección se tra-tarán los aspectos mecanicistas implicados en elproceso de la polimerización. La concentracióncontrolada de los iones hidróxilos presentes enel medio hace que las unidades monoméricasempiecen a formar oligómeros. Estos oligóme-ros se van propagando y la longitud de sus cade-nas aumenta hasta alcanzar un nivel crítico apartir del cual se produce una reducción de lasolubilidad de los oligómeros y éstos salen de lafase acuosa para formar partículas primarias (pro-ceso de nucleación homogénea). Las gotitas dis-persas de monómero migran a las partículas pri-marias dando lugar a la formación de estructurashinchadas. El monómero de las partículas pri-marias hinchadas continúa su proceso de poli-merización mediante la entrada y propagaciónde iones que produce un crecimiento de la par-

initiate monomeric units to form oligomers. Theseoligomers further propagate, increase in chainlength and experience reduced solubility in theaqueous phase after attaining a critical chain length,then precipitate out from aqueous phase to formprimary particles (termed as homogeneous nu-cleation). The monomer diffuses from disperseddroplets into the primary particles leading to theformation of swollen structures. Monomer in theswollen primary particles further gets polymeri-zed by ion entry and its propagation resulting inparticle growth, which continues till all themonomer droplets are utilized. At this stage, thestabilizer covers particle surface and causes sta-bilization by steric repulsion mechanism.

Characterization of nanoparticles

PBC nanoparticles were characterized by 1H-NMR spectroscopy [Figure 1]. The results obtai-ned were tabulated (Table 1) indicating the peakposition, peak multiplicity and number of pro-tons. The spectrum confirms the presence of allfunctional groups of polymer and its completeformation.

Figure 2 shows DSC thermograms of bothPBC and DPBC nanoparticles. PBC nanoparti-cles showed glass transition temperature (Tg) at192.9°C, and a ∆H value of 1230 mJ. DPBCnanoparticles showed Tg at 189.7°C and ∆H valueof 1546 mJ.

Table 2 shows the zeta potential of PBC andDPBC nanoparticles in four different media suchas 0.001N HCl, 0.9% saline, 7.4 pH phosphatebuffer and 8.0 pH tris buffer. Zeta potential ofboth PBC and DPBC nanoparticles increased withincrease in pH, being high in 8.0 pH tris bufferand low in 0.001N HCl. The results obtainedwere in accordance with that reported by Mulleret al.16 for alkyl cyanoacrylates such as polyme-thyl, polyethyl, polyisobutyl and polyisohexylnanoparticles. This trend is due to increase indegree of dissociation of free acrylic acid groupsof polymer with increase in pH, being low atlow pH values. At the same time, the contribu-tion of dextran in observed high zeta potentialvalues of nanoparticles due to its dissociation inaqueous medium cannot be ruled out.

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tícula que continúa hasta que se han utilizadotodas las gotitas de monómero. En esta fase, elestabilizador cubre la superficie de la partícula ycausa una estabilización mediante un mecanis-mo de repulsión estérica.

Caracterización de las nanopartículas

Las nanopartículas de PBC se caracterizaronmediante espectroscopía H-NMR1 [Figura 1]. Losresultados obtenidos se tabularon (Tabla 1) indi-cando la posición máxima, la multiplicidad máximay el número de protones. El espectro confirma lapresencia de todos los grupos funcionales depolímero y su completa formación.

La Figura 2 muestra los termogramas de CDBde las nanopartículas de PBC y DPBC. Las na-nopartículas de PBC mostraron una temperaturade transición vítrea de 192,9 °C y un valor ∆Hde 1.230 mJ. Las nanopartículas de DPBC mos-traron una temperatura de transición vítrea de189,7°C y un valor ∆H de 1.546 mJ.

La Tabla 2 muestra el potencial zeta de lasnanopartículas de PBC y DPBC en cuatro me-dios diferentes: 0,001 N HCl, solución salina al0,9%, tampón de fosfato de pH 7,4 y tampón trisde pH 8,0. Tanto el potencial zeta de las nano-partículas de PBC como el de las nanopartículasde DPBC aumentó al incrementar el pH, con unresultado alto en el tampón tris de pH 8,0 y bajoen 0,001 N HCl. Los resultados coincidieron conlos obtenidos por Muller et al.16 para las nano-partículas de polialkil-cianoacrilatos como elpolimetil, polietil, polisobutil y polisohexil cia-noacrilato. Esta tendencia se debe a que el incre-mento de pH produce un aumento del grado dedisociación de los grupos de ácidos acrílicos li-bres del polímero, que disminuye al reducir elpH. Al mismo tiempo, no se puede descartar lacontribución del dextran en el incremento que seaprecia en los valores de potencial zeta de lasnanopartículas debido a su disociación en medioacuoso.



FIGURA 1. 1Espectro H-NMR de polibutil-cianoacrilato.FIGURE 1. 1H-NMR spectrum of Poly(butyl cyanoacrylate).

TABLA 1. Resultados del espectro 1H-NMR de las nanopartículas de PBC.

TABLE 1. Results of 1H-NMR spectrum of PBC nanoparticles.

Nºde muestra S.No.

Posición máxima (ppm) Peak position (ppm)

Multiplicidad Multiplicity

Nº de protones No. of protons

1 0,96 Multiplete 3

2 1,42 Multiplete 2

3 1,74 Multiplete 2

4 2,53 Multiplete 2

5 4,28 Triplete deformado 2

6 7,26 Singlete 2

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FIGURA 2. Termogramas de CDB de (a) nanopartículas de PBC y (b) nanopartículas de DPBC.FIGURE 2. DSC thermograms of (a) PBC nanoparticles and (b) DPBC nanoparticles.

TABLE 2. Zeta potential values of PBC and DPBC nanoparticles.

TABLA 2. Valores de potencial zeta de nanopartículas de PBC y DPBC.

PBC = polibutil-cianoacrilato, DPBC = politubtil-cianoacrilato cargado con doxorubicina, NP = nanopartículas.

PBC = Poly(butyl cyanoacrylate), DPBC = Doxorubicin loaded poly(butyl cyanoacrylate), NPs = nanoparticles.

La incorporación de DH a las nanopartículasprovocó una reducción del potencial zeta en to-dos los medios. Las nanopartículas de DPBCmostraron un potencial zeta positivo en 0,001 NHCl y una drástica reducción del potencial zetaen el tampón de fosfato de pH 7,4 y el tampóntris de pH 8,0 en comparación con las nanopar-tículas de PBC. Esto se debe probablemente a laadsorción del fármaco en la superficie de lananopartícula durante la polimerización, que dalugar a una ocultación de la carga polimérica.Hawley et al.17 observaron una reducción similardel potencial zeta de las nanosferas de poli(DL-láctido-co-glicólido) revestidas de poloxámero.

El potencial zeta de las nanopartículas tieneuna gran importancia para la administración defármacos a través de membranas biológicas. Larelevancia de esta propiedad es especialmentesignificativa en el caso de la administración defármacos a través de los vasos linfáticos, en la

Incorporation of DH into nanoparticles resul-ted in a reduction in zeta potential in all themedia. DPBC nanoparticles exhibited positive zetapotential in 0.001N HCl, and a drastic reductionin zeta potential in phosphate buffer pH 7.4 andtris buffer pH 8.0 in comparison to PBC nano-particles. This is probably due to drug adsorp-tion on nanoparticle surface during polymeriza-tion, leading to masking of polymeric charge.Similar reduction in zeta potential of poloxamercoated poly(DL-Lactide-co-glycolide) nanosphereswas reported by Hawley et al.17

Zeta potential of nanoparticles becomes in-creasingly important, when delivering drugsthrough biological membranes. This is especia-lly true in case of lymphatic delivery, where theinterstitium of lymphatic system being negative-ly charged, freely allows the anionic particles topenetrate18 aiding in high particle concentrationat required site. In such cases, poly(butyl cya-

Medio de dispersión Dispersion medium

NP de PBC PBC NPs

NP de DBPC DPBC NPs

0,001 N HCl -3,7 6,3

Solución salina 0,9% 0.9 % Saline

-11,9 -4,3

Tampón de fosfato pH 7,4 7.4 pH Phosphate buffer

-30,4 -6,7

Tampón tris pH 8,0 8.0 pH Tris buffer

-42,8 -16,4



que la carga negativa del intersticio del sistemalinfático permite una libre penetración de laspartículas aniónicas18 que contribuye al aumentode la concentración de partículas en el lugarnecesario. En estos casos, las nanopartículas depolibutil-cianoacrilato podrían constituir un sis-tema benéfico para la administración de fárma-cos.

Efecto de los factores de polimerización en eltamaño y la distribución de las partículas

Concentración de monómero

Para estudiar el tamaño y el patrón de distri-bución de las partículas, se midió el tamaño delas nanopartículas obtenidas con diferentes con-centraciones de monómero. Se seleccionaronconcentraciones de monómero comprendidas entre0,5% v/v y 4% v/v. El tamaño de las partículasobtenidas fue menor con concentraciones bajasde monómero y aumentó al incrementar la con-centración de monómero, con un tamaño máxi-mo a 4% v/v. No obstante, en estos casos elpatrón de distribución de las partículas es másimportante que su tamaño medio. La Figura 3muestra la representación compilada de las cur-vas de tamaño de las nanopartículas con diferen-tes concentraciones de monómero. Los resulta-dos fueron diferentes de los obtenidos por Douglaset al.19, que mostraban un patrón indefinido detamaño de partículas con concentraciones demonómero superiores al 1% v/v. En la figura seaprecia un claro desplazamiento de las curvas detamaño hacia valores de diámetro mayores alaumentar las concentraciones de monómero.También se realizó otra observación importantecon relación a la curva de distribución. Las cur-vas se abrieron al utilizar concentraciones altasde monómero mostrando una clara distribuciónbimodal con concentraciones superiores al 3,5%v/v, mientras que el efecto apenas fue apreciablea 3% v/v. La apertura de las curvas conducentea una distribución bimodal a concentraciones altasde monómero se puede explicar por el mecanis-mo de la coagulación. Con concentraciones ba-jas de monómero (0,5% v/v), la cantidad demonómero que se puede polimerizar es baja y sedistribuye uniformemente por las partículas pri-marias dando lugar al crecimiento controlado delas partículas y a su coagulación. Además, a

noacrylate) nanoparticles could be a beneficialsystem for drug delivery.

Effect of polymerization factors on particle sizeand distribution

Monomer concentration

Particle size measurements were done fornanoparticles obtained with various monomerconcentrations to study the particle size and dis-tribution pattern. Monomer concentrations wereselected in the range of 0.5% v/v to 4% v/v.Smaller particles were obtained at low monomerconcentration, and the particle size increased withmonomer concentration, showing a maximum sizeat 4% v/v. However, it is the particle distribu-tion pattern, which is more important than theaverage particle size in such cases. Figure 3 showsthe compiled graph of size curves of nanoparti-cles at various monomer concentrations. The resultsobtained were different from those reported byDouglas et al.19, who showed an indefinite pat-tern of particle size at monomer concentrationsabove 1% v/v. From the figure it is evident thatthe size curves shift towards larger particle dia-meter at increasing monomer concentrations. Atthe same time, another important observation wasmade regarding the curve distribution. The cur-ves showed broadening at high monomer con-centrations, exhibiting a clear bimodal distribu-tion above 3.5% v/v, and the effect was veryslight at 3% v/v. Broadening of curves leadingto bimodal distribution at high monomer con-centrations can be explained on the basis ofcoagulation mechanism. At low monomer con-centration (0.5% v/v), the amount of monomerto be polymerized is low, which diffuses unifor-mly into the primary particles, resulting in con-trolled particle growth and coagulation. Also,because of less particle concentration, the stabi-lizer effectively covers the particle surface, pre-venting agglomeration and resulting in smallerparticle size. At high monomer concentrations,the primary particles undergo saturation with moremonomer, and further polymerization at thiscondition leads to formation of larger particles.Also, the effective concentration of stabilizerreduces due to increase in particle concentration,resulting in improper surface coverage (Figure4). This leads to particle coagulation and increa-

222



FIGURE 3. Particle size distribution curves of PBC nanoparticles synthesized with various monomer concentrations.( ) 0.5 % v/v, ( ) 1 % v/v, ( ) 1.5 % v/v, ( ) 2 % v/v, ( ) 2.5 % v/v, ( ) 3 % v/v, ( ) 3.5 % v/v,

( ) 4 % v/v.

FIGURA 3. Curvas de distribución de tamaño de partículas de nanopartículas de PBC sintetizadas con diferentesconcentraciones de monómero. ( ) 0,5% v/v, ( ) 1% v/v, ( ) 1,5% v/v, ( ) 2% v/v, ( ) 2,5% v/v,

( ) 3% v/v, ( ) 3,5% v/v, ( ) 4% v/v.

consecuencia de la menor concentración de par-tículas, el estabilizador cubre eficazmente lasuperficie de las partículas, lo que evita la aglo-meración y favorece la formación de partículasde menor tamaño. Con concentraciones altas demonómero, se produce una saturación de laspartículas primarias y la polimerización que seproduce en estas condiciones da lugar a la for-mación de partículas de mayor tamaño. Además,la concentración efectiva del estabilizador sereduce al aumentar la concentración de partícu-las impidiendo una cobertura adecuada de lasuperficie (Figura 4). Esto da lugar a la coagu-lación y el aumento de tamaño de las partículas.El efecto del estabilizador se ha confirmado alrealizar una polimerización con una concentra-ción mayor de estabilizador (dextran 70 al 0,2%w/v), en la que se observó una reducción deltamaño medio de las partículas. El valor de Np

(número de partículas) calculado a partir de losdatos de medición del tamaño de las partículasfue disminuyendo al aumentar la concentraciónde monómero hasta producirse la coagulación delas partículas al 3% v/v. Sin embargo, con con-centraciones de monómero superiores al 3% v/v,el valor de Np aumentó debido a la reducción delvalor D

n como consecuencia de la distribución

bimodal de las partículas. Después de esta fase,la correlación entre la concentración de monó-mero y el valor N

p puede no ser apropiada.

se in size. The effect of stabilizer has been con-firmed by performing polymerization at increa-sed stabilizer concentration (0.2% w/v dextran70), which showed a reduction in average parti-cle size. The N

p (number of particles) calculated

from particle size measurement data, decreasedwith increased monomer concentration upto 3 %v/v, indicating coagulation of particles. Howe-ver, above 3 % v/v monomer the Np increaseddue to reduction in D

n as a result of bimodal

particle distribution. Hence after this stage, co-rrelation of monomer concentration with Np maynot be appropriate.



FIGURA 4. Mecanismo propuesto de formación de partículas con (a) concentraciones bajas de monómero y (b)concentraciones altas de monómero.

FIGURE 4. Proposed mechanism of particle formation at (a) low monomer concentration, and (b) high monomerconcentration.

224



Temperatura de polimerización

La polimerización del n-butil cianoacrilato serealizó a varias temperaturas (10 °C, 37 °C y 60°C) en matraces de polimerización a temperatu-ra controlada. La Figura 5 muestra las curvas detamaño de nanopartículas preparadas a tres tem-peraturas diferentes. El tamaño medio de laspartículas se fue incrementando al aumentar latemperatura hasta alcanzar un tamaño máximode 342 nm a 60 °C. En la figura se aprecia unclaro desplazamiento de las curvas de tamañohacia valores de diámetro mayores al aumentarla temperatura. Los resultados fueron diferentesde los obtenidos por Behan et al.7, que manifes-taron que el aumento de temperatura parecía tenerun efecto benéfico en el proceso de formaciónde partículas. Sin embargo, las fotografías demicroscopía electrónica de barrido (MEB) delinforme revelaron una aglomeración de partícu-las en forma de bultos a 65 °C con pH 2,0 y 3,0.Los datos de tamaño de las partículas y las mi-crografías electrónicas de transmisión del pre-sente estudio (Figura 6) también muestran unaaglomeración de partículas en las nanopartículassintetizadas a 60 °C. Se observa un aumento delnúmero de partículas (N

p) calculado a partir de

los datos de medición del tamaño de las partícu-las en las nanopartículas preparadas a 10 °C yuna disminución del valor Np a 60 °C. Estos datosrevelan una clara aglomeración de partículas atemperatura elevada, que se puede atribuir alincremento de la energía cinética del sistema yal choque entre las partículas, así como la redu-cida eficacia del estabilizador para estabilizar laspartículas a esta temperatura. Por tanto, las tem-peraturas de polimerización elevadas no ofrecenninguna ventaja significativa para el proceso deformación de nanopartículas en comparación contemperaturas más bajas.

Polymerization temperature

Polymerization of n-butyl cyanoacrylate wasperformed at various temperatures such as 10°C,37°C and 60°C in temperature controlled polyme-rization flasks. Figure 5 shows the size curves ofnanoparticles prepared at three different tempe-ratures. The average particle size was found toincrease with increase in temperature, exhibitinga maximum particle size (342 nm) at 60°C. Aclear shift in size curves towards the larger par-ticle diameter is evident from the figure. Theresults obtained were different from those repor-ted by Behan et al.7, who stated that higher tem-peratures appear to have a beneficial effect onparticle formation process. But, the SEM photo-graphs shown in the report reveal particle agglo-meration in the form of lumps at 65°C at pH 2.0and 3.0. Our particle size data and transmissionelectron micrographs (Figure 6) also support theparticle agglomeration in nanoparticles synthesi-zed at 60°C. The number of particles (N

p) calcu-

lated from particle size measurement data showhigh Np in nanoparticles prepared at 10°C, and alow N

p at 60°C. This strongly suggests the par-

ticle agglomeration at high temperature, whichcan be attributed to increased kinetic energy ofthe system and inter-collision of particles, andalso the reduced efficacy of stabilizer to stabili-ze the particles at this temperature. Hence highpolymerization temperature does not offer anysignificant advantage in nanoparticle formationcompared to lower temperature.



FIGURA 6. Micrografías electrónicas de transmisión de nanopartículas de PBC sintetizadas a diferentes temperaturas(a) 37 °C y (b) 60 °C.

FIGURE 6. Transmission electron micrographs of PBC nanoparticles synthesized at different temperatures (a) 37°C,(b) 60°C.

FIGURE 5. Particle size distribution curves of PBC nanoparticles synthesized at different temperatures. ( ) 10°C,( ) 37°C, ( ) 60°C.

FIGURA 5. Curvas de distribución de tamaño de partículas de nanopartículas de PBC sintetizadas a diferentes tempe-raturas. ( ) 10 °C, ( ) 37 °C, ( ) 60 °C.

Tiempo de polimerización

El aumento del tiempo de polimerización nosupuso una diferencia significativa en el tamañode las partículas ni en su distribución, lo queindica la posibilidad de una completa formacióny estabilización de las partículas dentro del tiemponormal de polimerización empleado en el estu-dio (3 horas).

Polymerization time

High polymerization times did not show muchdifference in particle size and distribution, indi-cating the complete particle formation and sta-bilization within the normal polymerization time(3 h) used in the study.

226



Concentración y tipo de estabilizador

Se utilizaron cuatro estabilizadores diferentes(dextran 40, dextran 70, sulfato de dextran ypolietileno glicol-6000) con diferentes concen-traciones para la síntesis de las nanopartículas yse estudió su efecto en el tamaño de las partícu-las (Figura 7). Se observó una reducción deltamaño de las partículas al aumentar la concen-tración de estabilizador con todos los estabiliza-dores. Las concentraciones elevadas de estabili-zador hicieron posible una estabilización eficazde las partículas mediante la adecuada coberturade su superficie y evitaron la aglomeración, dan-do lugar a la formación de partículas de menortamaño. En la Figura 8 se aprecia un claro des-plazamiento de las curvas de tamaño de partícu-las hacia valores de tamaño menores y un estre-chamiento de la distribución de tamaño al aumentarla concentración de estabilizador. El tamaño másreducido se obtuvo en las nanopartículas quecontenían dextran 40, lo que indica un mayorefecto estabilizador en comparación con otrosestabilizadores de dextran utilizados en el estu-dio. De estos datos se deduce que es posibleobtener nanopartículas de diferente tamaño me-diante la incorporación de distintos tipos de es-tabilizadores de dextran a diversas concentracio-nes. Las nanopartículas sintetizadas con grandescantidades de dextran y, por tanto, de reducidotamaño, podrían servir como depósitos de fár-maco circulantes por el sistema sanguíneo. Secree que las cadenas estéricas de moléculas dedextran reducen la opsonización y aumentan eltiempo de permanencia en la sangre de los sis-temas de partículas.20 Las nanopartículas sinteti-zadas con polietileno glicol-6000 como estabili-zador también podrían reducir la opsonizacióndebido a su propiedad de estabilización estérica.Estos sistemas serían útiles para la administra-ción de fármacos dirigida al tratamiento de tu-mores, ya que una permanencia prolongada delas nanopartículas en la sangre posibilita una mejorpenetración en los tejidos tumorales debido a sunaturaleza porosa y elevada permeabilidad vas-cular (efecto EPR)21.

Stabilizer type and concentration

Four different stabilizers, dextran 40, dextran70, dextran sulfate and polyethylene glycol-6000were used at various concentrations in the syn-thesis of nanoparticles, and their effect on parti-cle size was studied (Fig. 7). A reduction in particlesize was observed with increase in stabilizerconcentration with all stabilizers. High concen-trations of stabilizer effectively stabilize theparticles by proper surface coverage and preventagglomeration, resulting in smaller particle size.A clear shift of particle size curves towards thesmaller size and narrowing of the size distribu-tion with increased stabilizer concentration isevident from Figure 8. Nanoparticles containingdextran 40 exhibited lowest particle size, indica-ting better stabilizing effect compared to otherdextrans used in the study. Thus it is evidentthat, nanoparticles of different size could beobtained by incorporating different types of dex-trans as stabilizer at varied concentrations. Na-noparticles synthesized with high amounts ofdextrans coupled with the resultant low particlesize could be advantageous as long circulatingdrug reservoir in blood. The steric chains of dextranmolecules are believed to reduce opsonization,and increase the blood residence time of theparticulate systems.20 The nanoparticles synthe-sized with polyethylene glycol-6000 as stabili-zer also could reduce opsonization because of itssteric stabilization property. Such systems wouldbe useful in targeted drug delivery to tumors, asprolonged blood residence of nanoparticles leadto enhanced uptake by tumors because of theirleaky nature and high vascular permeability (EPReffect)21.



(a)

0

5

10

15

20

0.01 0.1 1 10

Particle s ize (µm )

Vo

lum

e (

%)

Efecto de los factores de polimerización en laeficacia de captura de las nanopartículas

Se estudió el efecto de variables de formula-ción tales como la concentración de monómero,la temperatura y el tiempo de polimerización conobjeto de optimizar estos parámetros para obte-ner nanopartículas con una mayor eficacia decaptura. El aumento de la concentración demonómero produce una mayor eficacia de captu-ra de las nanopartículas (Tabla 3). Se observóuna eficacia de captura superior en las nanopar-tículas preparadas con monómero al 2% v/v(74,35%) que en las nanopartículas preparadascon una concentración de monómero del 1% v/v (63,62 %). La utilización de concentracioneselevadas de monómero da lugar a la formaciónde grandes cantidades de polímeros, que se tra-duce en la incorporación de una mayor cantidadde fármaco y en el consiguiente aumento de laeficacia de captura.

Effect of polymerization factors on entrapmentefficiency of nanoparticles

The effect of formulation variables such asmonomer concentration, polymerization time andtemperature were studied to optimize these para-meters to obtain nanoparticles with better entra-pment efficiency. Increase in monomer concen-tration lead to increased entrapment efficiencyof nanoparticles (Table 3). The entrapment effi-ciency was found comparatively higher in nano-particles prepared with 2 % v/v monomer (74.35%), than with 1% v/v (63.62 %). High monomerfeed results in the formation of large amount ofpolymer, and hence incorporate more amount ofdrug, resulting in high entrapment efficiency.

FIGURE 7. Particle size distribution curves of PBC nanoparticles synthesized using different stabilizers at variedconcentrations (a) Dextran 40 ( 0.1 % w/v, 0.3 % w/v, 0.5 % w/v), (b) Dextran 70 ( 0.1 % w/v,

0.3 % w/v, 0.5 % w/v), (c) Dextran sulfate ( 0.1 % w/v, 0.3 % w/v, 0.5 % w/v), (d) Polyethyleneglycol-6000 ( 0.1 % w/v, 0.3 % w/v, 0.5 % w/v).

FIGURA 7. Curvas de distribución de tamaño de partículas de nanopartículas de PBC sintetizadas con diferentesestabilizadores a diversas concentraciones (a) Dextran 40 ( 0,1% w/v, 0,3% w/v, 0,5% w/v), (b) Dextran 70( 0,1% w/v, 0,3% w/v, 0,5% w/v), (c) Sulfato de dextran ( 0,1% w/v, 0,3% w/v, 0,5% w/v), (d)

Polietileno glicol-6000 ( 0,1% w/v, 0,3% w/v, 0,5% w/v).

228



Al aplicar una temperatura de polimerizaciónelevada (60 °C), se observó una reducción de laeficacia de captura de las nanopartículas, posi-blemente debida al aumento del nivel de filtra-ción del fármaco. El fármaco demostró ser esta-ble a 60 °C durante 3 meses.22 Se puede descartar,por tanto, el aspecto de la degradación del fár-maco en estas condiciones de polimerización.

La utilización de tiempos de polimerizaciónelevados aumentó la eficacia de captura de lasnanopartículas (Tabla 4). Esto se puede atribuiral mayor nivel de conversión de monómero apolímero que se observa al aumentar el tiempode polimerización y que se traduce en una ma-yor eficacia de captura del fármaco.

High polymerization temperature (60°C) re-duced the entrapment efficiency of nanoparticles,which may be due to the increased drug lea-ching. The drug was reported to be stable at 60°Cfor 3 months.22 Hence the aspect of drug degra-dation at these polymerization conditions can beruled out.

High polymerization times increased the en-trapment efficiency of the nanoparticles (Table4). This may be attributed to the high monomerto polymer conversion with time resulting inincreased drug entrapment.

TABLA 3. Influencia de la concentración de monómero en la eficacia de captura de las nanopartículasde polibutil-cianoacrilato cargadas con doxorubicina.

TABLE 3. Influence of monomer concentration on entrapment efficiency of poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticlesloaded with doxorubicin.

TABLA 4. Influencia del tiempo de polimerización en la eficacia de captura de las nanopartículas de polibutil-cianoacrilato cargadas con doxorubicina.

TABLE 4. Influence of polymerization time on entrapment efficiency of poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles loadedwith doxorubicin.

Concentración de monómero añadida (mg) Monomer concentration added (mg)

Eficacia de captura (%) Entrapment efficiency (%)

100

66,69

125

67,47

150

69,14

175

70,7

200

76,93

Tiempo de polimerización (h) Polymerization time (h)


4

66,69

8

66,91

12

67,66

24

68,16



Drug containing nanoparticles were pre-pared by loading various concentrations of DHby incorporation method to study the effect ofdrug concentration on entrapment efficiency ofnanoparticles Increase in added concentration ofdoxorubicin showed an increased entrapmentefficiency of nanoparticles upto 7 mg DH con-centration, and a decline afterwards (Table 5).This may be due to saturation of nanoparticleswith DH, and hence further drug addition didnot increase the entrapment efficiency.

La preparación de nanopartículas con fár-maco se realizó mediante la carga de diversasconcentraciones de DH por el método de incor-poración para estudiar el efecto de la concentra-ción de fármaco en la eficacia de captura de lasnanopartículas. Al aumentar la concentración dedoxorubicina se produjo un incremento de laeficacia de captura de las nanopartículas quealcanzó su nivel máximo con una concentraciónde DH de 7 mg, a partir de la cual se observóuna disminución de la eficacia de captura (Tabla5). Esta reducción de la eficacia de captura sepuede deber a una saturación de DH en las na-nopartículas que imposibilita el aumento de laeficacia de captura al añadir más fármaco.

TABLA 5. Influencia de la cantidad de doxorubicina cargada en la eficacia de captura de las nanopartículas depolibutil-cianoacrilato.

TABLE 5. Influence of the amount of doxorubicin loaded on entrapment efficiency of poly(butyl cyanoacrylate)nanoparticles.

Estudios de adsorción de DH en las nanopartículasde PBC

Illum et al.23 estudiaron la adsorción de dife-rentes concentraciones de doxorubicina en nano-partículas preparadas con dextran 70 y poloxá-mero 338 como estabilizadores. Sin embargo, estosautores no estudiaron el efecto del pH ni la in-fluencia del método de carga en la liberación defármaco de las nanopartículas. Se utilizaron di-ferentes valores de pH para estudiar la adsorciónde DH en las nanopartículas de PBC a fin dedeterminar la eficacia de fijación del fármaco yel efecto del pH en dicha fijación. Las condicio-nes de pH seleccionadas fueron 3,0, 5,0, 7,0 y8,0. El estudio no se realizó con valores de pHsuperiores a 8,0, debido a que el DH tiene pro-piedades de indicador y su color pasa de naran-ja-rojo a azul-violeta en condiciones alcalinas aun pH aproximado de 9,0.22

Adsorption studies of DH to PBC nanoparticles

Illum et al.23 studied adsorption of doxorubi-cin at various concentrations to nanoparticlesprepared by using dextran 70 and poloxamer 338as stabilizers. However, the authors did not re-port the effect of pH and influence of loadingmethod on drug release from the nanoparticles.Adsorption of DH to PBC nanoparticles wasperformed at various pH in order to determinethe binding efficiency, and also the effect of pHon drug binding. The pH conditions selected were3.0, 5.0, 7.0 and 8.0. The study was not perfor-med above pH 8.0, because DH shows indicatorlike properties, turning orange-red to blue-violetin alkaline conditions at about pH 9.0.22

Increase in pH beyond 3.0 showed an impro-ved drug adsorption onto PBC nanoparticles, withhigher binding at pH 8.0. The increased extentof adsorption of drug with pH is due to increase

Cantidad de doxorubicina cargada en las nanopartículas(mg)

Amount of doxorubicin loaded into

nanoparticles(mg)


2,2

56,88

5,0

63,72

7,0

65,98

10,0

35,73

230



Al ir aumentando el pH a partir de 3,0 seobservó una mejor adsorción del fármaco en lasnanopartículas de PBC, con una mayor fijaciónen la condición de pH superior (8,0). El aumentodel grado de adsorción del fármaco con valoresde pH más elevados se debe al aumento del gra-do de ionización del fármaco (pKa = 8,22) y a lamenor afinidad con el medio acuoso. La curvalineal (R2 = 0,994) del gráfico de eficacia defijación registrada a diferentes pH (Figura 8) indicala existencia de una relación lineal entre los pHdel medio de dispersión en la adsorción de fár-maco en las nanopartículas.

in ionization of drug (pKa = 8.22), and alsodecreased affinity towards the aqueous medium.A plot of log binding efficiency versus pH (Fi-gure 8), gave a linear curve (R2 = 0.994), indi-cating a linear relationship between pH of dis-persion medium on drug adsorption tonanoparticles.

FIGURA 8. Influencia del pH sobre la eficacia de fijación del fármaco de las nanopartículas de PBC (R2 = 0,994,calculado a partir de la ecuación de regresión).

FIGURE 8. Influence of pH on drug binding efficiency of PBC nanoparticles (R2 = 0.994, calculated from theregression equation).

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

0 2 4 6 8 10

pH

Lo

g b

ind

ing

eff

icie

nc

y

Se realizaron estudios de adsorción de DH ennanopartículas de PBC a un pH de 7,0 (pH fisio-lógico) mediante la incubación de las dispersio-nes a 37 ± 2 °C durante períodos de tiempo di-ferentes hasta alcanzar un máximo de 12 horas.Sin embargo, no se produjo un aumento signifi-cativo en la cantidad de fármaco adsorbida des-pués de una hora, lo que indica una rápida ad-sorción.

Liberación de fármaco in vitro de nanopartículasde DPBC

Se realizaron estudios sobre la liberación defármaco in vitro de nanopartículas de DPBC

Time-dependant adsorption studies of DH toPBC nanoparticles at pH 7.0 (physiological pH),were conducted by incubating the dispersions at37 ± 2°C for different time periods upto 12 h.However, there was no much increase in theamount of drug adsorbed beyond one hour, indi-cating rapid adsorption.

In vitro drug release from DPBC nanoparticles

Studies on in vitro drug release from DPBCnanoparticles prepared by incorporation (DPBC-incorporated) and adsorption (DPBC-adsorbed)of drug were carried out in two different mediasuch as 0.001N HCl and 0.9 % saline (Figure 9)



in order to evaluate the release in both acidicand media with physiological salt concentration.DPBC nanoparticles prepared by incorporationand adsorption showed rapid and high drug re-lease in 0.001N HCl. This is due to the greateraffinity of drug towards dissolution medium dueto low ionization at the pH of medium. Suchrelease pattern of DH from PBC nanoparticlescould be advantageous in intracellular drug de-livery. From the in vitro release data it could beexpected that after parenteral administration, thenanoparticles exhibit slow drug release in extra-cellular space (due to physiological pH). Afterentry into cells, rapid drug release is possible atendosomal acidic pH resulting in high intrace-llular concentration, similar to that of pH sensi-tive liposomes reported by Horwitz et al.24 Na-noparticles prepared by drug incorporation showedrapid release of DH than that of drug adsorbednanoparticles. The t

25 (time for 25 % drug relea-

se) values calculated from release plots were highfor drug adsorbed nanoparticles (3.2 h in 0.001NHCl and 8.8 h in 0.9 % saline) than for drugincorporated nanoparticles (1.4 h in 0.001N HCland 5.6 h in 0.9 % saline). This further suggestsstrong binding of DH to nanoparticle surface,which otherwise should result in faster desorp-tion and release.

mediante incorporación (DPBC incorporado) yadsorción (DPBC adsorbido) de fármaco en dosmedios diferentes, 0,001 N HCl y solución sali-na al 0,9% (Figura 9) a fin de evaluar el gradode liberación en el medio acídico y en el mediocon concentración de sal fisiológica. Las nano-partículas de DPBC preparadas mediante incor-poración y adsorción mostraron una liberaciónrápida y elevada de fármaco en 0,001 N HCl.Esto se debe a la mayor afinidad del fármacocon el medio de disolución a consecuencia delbajo grado de ionización al pH del medio. Estepatrón de liberación de DH de las nanopartículasde PBC podrían resultar ventajoso para la admi-nistración intracelular de fármaco. A partir delestudio de los datos de liberación in vitro, cabríaesperar que tras la administración parenteral seprodujera una disminución de la velocidad deliberación de fármaco de las nanopartículas enespacio extracelular (debido al pH fisiológico).Después de la penetración celular, se puede pro-ducir una rápida liberación del fármaco al pHacídico endosomal que se traducirá en una ma-yor concentración intracelular, semejante a la delos liposomas sensibles al pH descritos por Horwitzet al.24 En las nanopartículas preparadas median-te incorporación de fármaco, se observó una li-beración de DH más rápida que la de las nano-partículas adsorbidas. Los valores t25 (tiemponecesario para la liberación de un 25% de fár-maco) calculados a partir de las curvas de libe-ración de las nanopartículas con fármaco adsor-bido fueron superiores (3,2 h en 0,001 N HCl y8,8 h en solución salina al 0,9%) que los de lasnanopartículas con fármaco incorporado (1,4 hen 0, 001 N HCl y 5,6 h en solución salina al0,9%). Estos datos sugieren un mayor grado defijación del DH en la superfice de las nanopar-tículas que, de no ser tal, se traduciría en unamayor velocidad de desorción y liberación.

232



Los análisis cinéticos se realizaron medianteuna representación de M

t/M∞

frente a t1/2 (ecua-

ción de Higuchi). El patrón de liberación de fár-maco siguió la ecuación de Higuchi para las na-nopartículas preparadas mediante incorporación yadsorción de fármaco en ambos medios (0,001 NHCl y solución salina al 0,9%), lo que indica unaliberación de los sistemas matriciales. Esto se puedeatribuir a una difusión del fármaco por las nano-partículas tras la adsorción debido a su estructuraporosa con unas características de liberación se-mejantes a las de los sistemas matriciales.

CONCLUSIONES

Algunas variables experimentales, como laconcentración de monómero y la temperatura depolimerización, demostraron tener un importan-te influencia en el tamaño y la distribución delas partículas. Las concentraciones de monóme-ro elevadas dieron lugar a la formación de par-tículas de mayor tamaño con una distribución detamaño más amplia y una mayor eficacia de capturade las nanopartículas. La distribución y el tama-

The kinetic analysis was performed by plot-ting M

t/M∞

versus t1/2 (Higuchi equation). The drug

release pattern followed Higuchi equation fornanoparticles prepared by incorporation and ad-sorption of drug in both 0.001N HCl and 0.9 %saline indicating release from the matrix syste-ms. This can be attributed to the diffusion ofdrug into nanoparticles upon adsorption due totheir porous structure and simulating the releasecharacteristics of matrix systems.

CONCLUSIONS

Experimental variables such as monomer con-centration and polymerization temperature showeda profound effect on the particle size and distri-bution. High monomer concentrations resultedin larger particles with broader size distributionand high entrapment efficiency of the nanoparti-cles. The particle size and distribution are im-portant in drug delivery, as they influence thebiodistribution of nanoparticles in vivo. Highpolymerization temperature showed particle agglo-meration and broad size distribution, and hence

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Time (hours)

Cu

mula

tiv

e r

ele

as

e (

%)

FIGURE 9. Release profiles of Doxorubicin hydrochloride from Poly butyl cyanoacrylate nanoparticles in differentmedia ( ) DPBC-incorporated (0.9 % saline), ( ) DPBC-incorporated (0.001N HCl), ( ) DPBC-adsorbed

(0.001N HCl), ( ) DPBC-adsorbed (0.9 % saline).

FIGURA 9. Perfiles de liberación de clorhidrato de doxorubicina de nanopartículas de polibutil-cianocrilato en mediosdiferentes ( ) DPBC incorporado (solución salina al 0,9%), ( ) DPBC incorporado (0,001 N HCl), ( ) DPBC

adsorbido (0,001 N HCl), ( ) DPBC adsorbido (solución salina al 0,9%).



ño de las partículas son factores importantes parala administración de fármacos, ya que influyenen la biodistribución de las nanopartículas in vivo.Al aumentar la temperatura de polimerización,se observó una mayor distribución de tamaño yuna aglomeración de partículas. El aumento detemperatura no supone, por tanto, ninguna ven-taja en la formación de nanopartículas. La con-centración y el tipo de estabilizador demostrarontener una gran influencia en el tamaño de lasnanopartículas, permitiendo la obtención de na-nopartículas de diferente tamaño y distribuciónmediante la variación del tipo de estabilizador yde la concentración del mismo. Las nanopartícu-las preparadas con concentraciones elevadas delos estabilizadores dextran y PEG-6000 podríanreducir la opsonización de las partículas en elsistema sanguíneo y prolongar el tiempo de cir-culación. La lenta liberación de DH de las nano-partículas en solución salina al 0,9% (condiciónfisiológica) tiene una gran utilidad en la quimio-terapia del cáncer y en la prevención de la me-tástasis, ya que una liberación prolongada defármaco en el lugar de destino ofrece la ventajade permitir una continua exposición celular alfármaco, que se traduce en una muerte efectivade las células tumorales.

AGRADECIMIENTOS

Los autores del presente estudio manifiestansu agradecimiento a la University Grants Com-mission (UGC) de la India por la financiación deeste trabajo de investigación.

did not offer any advantage in nanoparticle for-mation. Nanoparticle size was greatly influencedby stabilizer type and concentration offering achoice to obtain nanoparticles of diverse size anddistributions by varying the type and concentra-tion of stabilizer. The nanoparticles prepared usinghigher concentrations of dextran and PEG-6000as stabilizers could reduce the opsonization ofparticles in blood and may result in prolongedcirculation time. Slow release of DH from nano-particles in 0.9 % saline (physiological condi-tion) indicates its usefulness in chemotherapy ofcancers and prevention of metastasis, as prolon-ged drug release at the target site offers advan-tage of continuous cell exposure to drug, resul-ting in effective cell kill.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank University Grants Com-mission (UGC) India for funding this researchwork.

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