Espectroscopía básica

(Apuntes de fuentes diversas: Howe, Elster, Lenkinski, Schnall, Castillo, Arbeláez, etc.)

Aníbal J. Morillo, MD La serie APUNTES de PONDO ® es una compilación de índole educativa, con la que se pretende divulgar información relacionada o no con la radiología y ciencias afines o disímiles. Se basa en referencias bibliográficas, conferencias, esquemas y experiencia (que no siempre es sinónimo de vejez). Cualquier laxitud en las normas de autoría se basa en la intención docente y sin ánimo de lucro de esta información. Sin embargo, se han hecho ingentes esfuerzos para dar un adecuado reconocimiento a las fuentes utilizadas, plagiadas o modificadas. Aunque los APUNTES de PONDO® son de uso y divulgación libre, se recomienda abstenerse de utilizar las fotografías, figuras, esquemas y tablas con fines diferentes a los de la formación personal, ilustración o diversión, para evitar la propagación de violaciones flagrantes a los derechos de autor. La ciencia está en permanente evolución. La lectura de la serie APUNTES de PONDO® debe ser crítica y complementada con otras fuentes de información. El autor no se hace responsable por el contenido o veracidad de esta información o por las consecuencias derivadas de conductas o decisiones tomadas con base en los APUNTES de PONDO ®.

En las imágenes por resonancia magnética (IRM) se obtienen señales de los tejidos que

dependen de la estructura molecular en la que participan los átomos de hidrógeno o

protones (H+); estas señales representan un mapa de frecuencias que son transformadas

en una escala de grises. En esta representación, la frecuencia de las señales está dada

por la posición espacial de la muestra analizada. En la espectroscopia por resonancia

magnética (ERM), la frecuencia está dada por el contenido químico de la muestra

examinada.

De hecho, la primera aplicación de la resonancia magnética nuclear fue en química

analítica, pues mediante la obtención de “mapas” o espectros de frecuencias (es decir,

ERM), se puede estudiar la estructura química de diversas sustancias.

En los compuestos químicos se encuentran nubes de electrones alrededor de los

protones (H+) que “protegen” al protón del la exposición al campo magnético externo y

producen distorsión de dicho campo. Los efectos de esta “protección” dependen de la

configuración molecular de cada compuesto químico. Así, los H+ en diferentes grupos

químicos experimentan diferente campo magnético por el efecto de “escudo” que les

proveen sus nubes de electrones. Cada compuesto químico tendrá entonces un espectro

de picos característicos, que representan resonancias a lo largo de un eje de frecuencias.

La frecuencia de codificación se normaliza con incompuesto de referencia, para lograr

que el eje sea independiente de la intensidad del campo magnético utilizado. Esta es la

escala de partes por millón (ppm), que se calcula como:

{(frecuencia de interés – frecuencia de referencia) / frecuencia de referencia}x 106

La frecuencia se mide en millones de ciclos por segundo o megahercios (MHz). Para la

señal de referencia en ERM se utilizan compuestos inertes, como el tetrametilsilano

[TMS o ((CH3)4Si)], o el trimetilsilipropionato (C6H13NaO2Si), los cuales se ajustan a

0.0 ppm, pues sus picos residen en una región que no interfiere con los demás picos. De

esta manera, se calibra el pico de resonancia del H2O a 4.7ppm.

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Al normalizar el eje de frecuencias mediante el uso de la escala de partes por millón,

cada compuesto emitirá un grupo de picos característicos que siempre estará localizado

en el mismo lugar de la escala, sin importar la intensidad del campo magnético

utilizado. La intensidad del campo es importante, pues a mayor Tesla (T), se obtiene,

además de una mejor relación señal/ruido, una mayor amplitud del rango de

frecuencias, es decir, una mejor separación de los picos. Esto hace deseable realizar

ERM a campos altos.

A diferencia de la IRM, en la que los gradientes que se utilizan para codificar la fase

suprimen la información química, en ERM, los gradientes se aprovechan para codificar

tanto la fase como la información química. Las posiciones de los picos sobre la escala

de frecuencias de desplazamiento químico (se conoce como desplazamiento químico

porque la distribución espacial del contenido molecular se representa como “picos” que

se “desplazan” o “aparecen” a lo largo de una escala de frecuencias) produce una

“huella” o “firma” con la que se puede identificar de manera confiable a cada

compuesto. Los espectros se grafican como una serie de “ondas” que pueden recordar a

las de un electroencefalograma, sobre una escala horizontal que corresponde al

desplazamiento químico en ppm. Esta técnica no sólo permite detectar diferentes grupos

químicos funcionales sino que puede cuantificar su concentración.

Por ejemplo, la molécula de etanol que contiene protones en tres lugares diferentes,

dados por los componentes –OH, -CH2- y –CH3 muestra tres

picos característicamente localizados a lo largo de la escala de

ppm. La posición de los picos corresponde a su localización

espacial dentro de la molécula de etanol. La amplitud de los

picos ( área bajo la curva) corresponde a su concentración. Las

diferencias entre los ambientes químicos locales en una muestra

compleja determinan sutiles desplazamientos químicos

(denominados por la letra griega delta - δ) en su frecuencia absoluta (Hz) o

relativa (ppm).

C - C - O - HH - H

H - HH - C - C - O - H

H - H

H - HH -

Las técnicas de ERM utilizan diferentes tipos de secuencias que permiten la evaluación

de un volumen (single voxel, usualmente de unos 4 a 8 cc) o de varios volúmenes

(multivoxel, de 1 cc cada uno) para localizar la señal espectroscópica. Algunos ejemplos

son las secuencias conocidas, como en IRM, por siglas “sonoras” o que evocan nombres

de objetos o acciones comunes, como la STEAM ( STimulated Echo Acquisition

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Method) o la PRESS (Point RESolved Spectroscopy), que ¡no debe confundirse con

DRESS (Depth RESolved Spectroscopy)!

El agua tiene concentraciones mucho más altas que la de otros metabolitos en el

cerebro. La resonancia de H2O a 4.7 ppm es masiva, de unas cincuenta mil veces la de

otros metabolitos; para que esta gran cantidad de moléculas de agua no interfiera con la

medición de protones en otros metabolitos, se utiliza una técnica de saturación, que se

conoce como CHESS (CHEemical Shift Selective), la cual, en forma análoga a la

común técnica de saturación grasa en IRM, mejora la visualización de las señales de

otras moléculas.

Una ERM típica, con técnica de supresión de agua, en un cerebro normal, muestra una

serie de picos característicos. Lo que se identifica como un pico único puede ser en

realidad una serie de picos múltiples, que pueden estar muy cercanos unos de otros (con

poco desplazamiento químico relativo entre ellos) y que requieren de técnicas más

sensibles para discernirlos. Algunos de los picos se presentan en parejas o en tripletas.

La señal depende, entre otros factores, de la movilidad de las moléculas, y se extingue

con el tiempo. El SE TE debe optimizar de caurdo al grupo de metabolitos que se va a

evaluar.

La escala de ppm se lee de derecha a izquierda, con el

valor 0ppm al extremo derecho de la gráfica. Si se

observa desde el extremo derecho (0ppm) hasta

2.0ppm, se encuentran picos irregulares de baja

intensidad, que corresponden a lípidos móviles y

triglicéridos. Son de alta concentración (60M) en

tejidos adiposos y en la médula ósea, y de baja

concentración (3.5M) en los músculos.

En enfermedades neuromusculares se puede elevar esta última concentración hasta en

6 veces.

Entre 1.3 y 1.5 ppm se encuentran el lactato – Lac (1.35ppm) y la alanina – Ala

(1.46ppm). El lactato se encuentra a concentraciones < 0.5 mM en el cerebro normal, y

hasta 25 mM en un músculo ejercitado al máximo. El lactato es el producto final de la

glicólisis anaerobia. Su elevación puede ser el resultado de metabolismo glicolítico,

como ocurre en la isquemia y en algunos tumores.

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Las concentraciones normales de lactato son tan bajas, que normalmente no se detecta

este metabolito. Se puede encontrar un pico de lactato elevado en patologías diversas,

como infarto, hipoxia/anoxia y en algunas neoplasias.

Por su cercanía en la escala de ppm, la alanina puede ser difícil de diferenciar del

lactato. Se ha reportado su elevación en algunos meningiomas ( NO en todos).

2.0ppm.

El primer metabolito de importancia encontrado sobre la escala de ppm es el

N-acetilaspartato (NAA), que produce el más alto de los picos de los metabolitos que se

estudian mediante ERM de H+. Se encuentra a concentraciones de 5 a 10 mM en el

cerebro adulto normal. Se le conoce como “marcador neuronal”, y refleja

contribuciones de otros

compuestos con residuos n-

acetilados, como el n-

acetilaspartilglutamato

(NAAG). La molécula de

NAA tiene protones en cuatro

grupos diferentes, CH3, NH,

CH y CH2.El pico más alto

corresponde al CH3, presenta a

2.0ppm, utilizando la referencia de TMS a 0.0ppm. Los del grupo CH2 resuenan a 2.8

ppm, y los H+ del grupo CH a 2.7 ppm. Estas diferencias sutiles pueden hacerlo

aparecer como un solo pico, o como un pico “ancho”, irregular, por las contribuciones

de sus cuatro grupos dentro de la misma molécula. Los protones del grupo NH no

presentan resonancia, dado su rápido intercambio con el H2O. La contribución del

NAAG ocurre a 2.05ppm.

Entre 2.1 y 2.5 ppm, se encuentran el glutamato (Glu), la glutamina (Gln) y el ácido

gama aminobutírico (GABA), Estos son protones fuertemente acoplados que producen

picos de patrones complejos, que varían de acuerdo al TE utilizado. El Glu es un

neurotransmisor excitatorio, mientras que la Gln es el producto de la reacción entre Glu

y amoníaco. La Gln es una molécula reguladora y detoxificadora de la Glu. Por su muy

difícil diferenciación, los picos de resonancia combinados de Gln y Glu se conocen

como Glx.

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3.0 ppm. Creatinas. La creatina (Cr) y la fosfocreatina (PCr) producen picos que pueden

denominarse en conjunto como creatinas totales (tCr), bastante constante en el cerebro,

a una concentración de 10mM. Este metabolito se puede usar como valor de referencia

de concentraciones. Las creatinas son una fuente de fósforo para la conversión de ADP

a ATP. Corresponden al segundo pico en importancia (por concentración) en ERM.

3.2 ppm. Colinas (tCho). El pico más prominente corresponde a suma de la colina,

fosforilcolina y glicerofosforilcolina, con probable contribuciónde la taurina (Tau), que

resuena entre 3.26 y 3.4ppm. La colina se almacena en el cerebro en forma de

acetilcolina, fosfocolina y probablemente fosfatidilcolina. El metabolito Scylloinositol

se ha descrito a 3.35 ppm, elevado en casos de enfermedad de Leigh.

3.43 y 3.8 ppm. Glucosa (Gluc). Es la obvia fuente de energía para el metabolismo

cerebral. Por sus diferentes regiones, sus picos se pueden confundir con los de Tau y

Glu.

3.58 ppm. Mio-inositol(Myo). Este pico distintivo se observa a TE corto, con

contribución de la Glicina (Gly) y los monofosfatos de inositol. El mioinositol puede ser

la forma de almacenamiento del mensajero hormonal inositol difosfato.

3.7 – 3.9 ppm. tGlx (Gln y Glx).

3.95 ppm tCr.

7-8 ppm Carnosina. Se encuentra en el músculo esquelético, y presenta un

desplazamiento químico que depende del pH loc

80 ppm. Histidina. El proton N-δ de la histidina proximal de la desoxihemoglobina se

ha utilizado como marcador de músculo esquelético. Su desplazamiento químico

exagerado se debe a efectos paramagnéticos del vecino componente heme.

El metabolismo celular incluye una serie de reacciones bioquímicas que sirven para

mantener el aporte energético celular y su viabilidad. La energía se obtiene de la

transferencia de ADP a ATP. Las vías metabólicas principales son la cadena reductora

mitocondrial, la fosforilación oxidativa mitocondrial y el ciclo del ácido cítrico (Krebs),

además de las reacciones reductoras citoplásmicas de la glicólisis aeróbica. Cuando

existe metabolismo anaerobio aumentado, se detecta un pico doble de lactato a 1.33

ppm.

El NAA se encuentra en oligodendrocitos primitivos y en neuronas del cerebro en

desarrollo. Una disminución en NAA es indicativa de una lesión axonal reversible o de

una pérdida neuronal. La recuperación del pico a 2.0ppm puede indicar recuperación.

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La vaina de mielina es una membrana doble lipídica. Normalmente, los lípidos se

encuentran fuertemente ligados entre sí, produciendo baja señal. Los procesos de

desmielinización alteran y destruyen las capas lipídicas; a medida que son dañados y

digeridos por macrófagos, los lípidos se hacen más móviles, con su representación en

aumento de señal en IRM. La caracterización de lípidos de manera no invasiva (ERM)

se hace con TE cortos (< 50ms) pues su señal se extingue antes que otros metabolitos.

No se conoce claramente el papel del NAA en el tejido cerebral, pero, como se anotó, a

este metabolito se le considera como “marcador neuronal”. El NAA no se encuentra en

las células gliales maduras; esto puede ser útil para evaluar las enfermedades

desmielinizantes del tipo de le esclerosis múltiple. La tasa de NAA / tCr puede

disminuir en esta enfermedad, aún antes de la aparición de alteraciones en la señal en

IRM convencional. Un pico alto de NAA se reconoce como indicador de viabilidad

neuronal. La mayoría de las enfermedades disminuyen sus niveles (neoplasias, infartos,

esclerosis múltiple, HIV,algunas formas de epilepsia y diabetes mellitus, pero también

en esquizofrenia y demencia) La única cusa reconocida de elevación de este pico de

NAA es la enfermedad de Canavan.

Las creatinas son el residuo del metabolismo energético: la fosfocreatina (PCr)

reacciona con el ADP para formar ATP. La fosforilcolina es una molécula precursora

incorporada al grupo polar de la fosfatidilcolina y la esfingomielina. Estos fosfolípidos

se incorporan a la membrana celular y a la mielina en el SNC. La relación entre Cho y

tCr puede mostrar elevación de Cho en neoplasias y diabetes mellitas, con disminución

en Cho enenfermedades crónica como la encefalopatía hepática y la hiponatriemia

crónica.

La elevación de Cho se ha fundamentado en productos que contienen Cho como

metabolitos de degradación de la mielina. Los niveles de Cr se pueden disminuir en

neoplasias y en isquemia.

La elevación del mioinositol se ha descrito en la enfermedad de Alzheimer, en la

demencia del síndrome de Down y en diabetes mellitus.

Como puede verse, el análisis de las señales de ERM puede mostrar anormalidades en la

concentración de diferentes metabolitos y puede orientar hacia factores pronósticos, o

hacia patologías generales o específicas.

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Algunas Referencias Bibliográficas

• Brateman L: Chemical shift imaging: A review. AJR 1986; 146: 971-980. • Elster AD: Questions and answers in magnetic resonance imaging. Mosby, St.

Louis, 1994. • Howe FA, Maxwell RJ, Saunders DE, Brown MM, Griffiths JR. Proton

spectroscopy in vivo. Mag Res Q 1993; 9(1): 31-59. • Jackson EF, Meyers CA: Introduction to hippocampal spectroscopy. Neuroimag

Clin North Am 1997; 7(1): 143-154. • Rand SD, Prost R, Li S-J: Proton MR spectroscopy of the brain. Neuroimag Clin

North Am 1999; 9(2): 379-395. • Lenkinski RE. Magnetic resonance spectroscopy: basic principles. MRI

Decisions 1989; Sep-Oct: 23-29.

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Addendum: Un poco más de física, para los curiosos: Tres parámetros característicos definen el espectro de resonancia magnética:

• Posición (frecuencia)

• Ancho (a altura media)

• Amplitud.

La posición esta dada por la frecuencia de resonancia. La frecuencia de resonancia de

un núcleo depende de su entorno o medio ambiente químico, por eso se llama

desplazamiento químico. El ancho de la señal a la mitad de su altura se relaciona con el

tiempo de relajación transversal (T2):

∆ω½=1/(πT2)

Donde ∆ω½ es igual al ancho de la señal a la mitad de la altura de la resonancia en Hz.

El área bajo la curva se obtiene de la amplitud y ancho directamente.

El espectro de resonancia del metanol contiene átomos de hidrógeno en dos medios

químicos diferentes, produce dos picos definidos. La proporción entre sus áreas es 3:1,

compatible con el hecho de que hay tres protones en el grupo metilo CH3 y uno en el

grupo hidroxilo OH. La resonancia del hidroxilo ocurre a una frecuencia mayor que la

del metilo porque los electrones asociados con las uniones carbono-hidrógeno en el

grupo metilo «aislan» a los hidrógenos del metilo del campo magnético externo, B0.

Esto implica que el campo magnético que es experimentado por estos grupos es

levemente menor que el campo aplicado. Por otra parte, el elemento electronegativo

oxígeno induce un «desaislamiento» del hidrógeno del hidroxilo, al concentrar un

mayor número de los electrones de unión alrededor de su propio núcleo. Por esta razón,

el hidrógeno del grupo hidroxilo experimenta un campo magnético neto mayor que los

hidrógenos asociados al grupo metilo.

El entorno químico particular de los átomos de hidrógeno asociados a diferentes

moléculas o partes de una molécula hace que sus relaciones giromagnéticas γ sean

diferentes, aún tratándose de un mismo elemento, H. Para demostrar las diferencias

entre sus frecuencias de Larmor, es conveniente expresarlas con referencia a un

hidrógeno estándar cuya relación giromagnética es γS. Las diferencias entre las

frecuencias de resonancia de los hidrógenos se expresan en términos de un parámetro

de tamizaje, σ. Se resumen estas relaciones en tres ecuaciones:

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ωCH3 = γCH3 (B0) ωOH = γOH (B0) ωS = γS (B0) (1- σ)

ωCH3 , ωOH y ωS corresponden a las frecuencias Larmor de los hidrógenos metilo,

hidroxilo y de referencia, respectivamente. γCH3 , γOH y γS son sus respectivas

relaciones giromagnéticas. Los valores del parámetro de tamizaje para el hidrógeno en

diferente medio ambiente se encuentra en el rango de partes por millón de B0. La

diferencia en la frecuencia de Largor entre agua y grasa es de unos 215Hz a 1.5T. Estas

diferencias se expresan en términos de un parámetro sin dimensión, independiente del

campo magnético, δ definido como

δ compuesto = ([ω compuesto – ωS ]/ ωS) (106)

donde ω se refiere a la frecuencia Largor y la unidad de δ es ppm de B0. El agua

entonces resuena a 4.7 ppm, y la grasa a unos 1.3 ppm en esta escala., la cual es

independiente de la intensidad del campo magnético aplicado. Lo más importante es que

el valor δ puede ser característico del medio ambiente químico del núcleo estudiado. De

esta manera, la química analítica permite utilizar la información de desplazamiento

químico junto con otros parámetros de resonancia nuclear para deducir la estructura de

compuestos desconocidos. El desplazamiento químico identifica los compuestos

presentes en una molécula, el área bajo las curvas o picos da un estimado de sus

concentraciones relativas.

Los átomos de hidrógeno son mucho más sensibles al

fenómeno de resonancia magnética nuclear que otros

núcleos con número impar de electrones. Sin embargo, es

posible hacer espectroscopía de fósforo, con la que

podemos identificar, en tres picos independientes, los tres

átomos del ATP, la energía que utilizamos para todas las

actividades celulares.