Erwin. Band Shift
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Gel de retardamiento(mobility shift assay)
Dr. en C. Erwin ChiqueteMedicina InternaBiología Molecular en [email protected]
Ensayo del cambio en la movilidadelectroforética del ADN
Sinonimia
•Gel shift assay•Gel retardation assay•Band shift assay•Mobility electrophoresis•Gel-electrophoresis DNA-bindingassay
Aspectos históricos
Esta técnica fue desarrollada en 1981 por Fried y Crothers; y Garner y Revzin, de manera independiente. Ambos grupos publicaron sus trabajos en la mismarevista: Nucleic Acids Research.
Objetivos de la técnica
Identificación de proteínas que se unen al ADN:
•Factores de transcripción.
•Proteínas que intervienen en lareparación del ADN.
•Proteínas que intervienen en el empaquetamiento del ADN.
Fundamentos
El principio en el que se basa elprocedimiento es que los complejosde ADN y proteínas tienen diferentemobilidad, con respecto al ADN queno está acomplejado con proteínas,durante la electroforesis en gel depoliacrilamida.
Procedimiento
El ensayo se divide en varias partes:
1. Preparación de una sonda de ADN. Una secuencia conocida de nucleótidos obtenidos por la digestión con enzimasde restricción de un fragmento clonadoen un plásmido (de 50-300 pb) o un fragmento sintético (de 20-50 pb) esmarcado radiactivamente.
Procedimiento
2. Preparación del gel. Un gel de poliacrilamida al 4-6% bajo en fuerzas iónicas es “precorrido” verticalmente durante 2 h a 150 V.
Procedimiento
3. Realización de la reacción de unión (fijación). Un extracto de proteínas totales o nucleares de células generalmente cultivadas son incubadas con la sondade ADN marcado. Este ADN tiene la secuencia a la que presumiblemente se unirá alguna proteína del extracto.
Procedimiento
4. Electroforesis en gel y autorradiografía. Los complejos de ADN y proteínas son separados del ADN libre mediante electroforesis en gel de poliacrilamidano desnaturalizante. Posteriormente se realiza una autorradiografía del gel y se analizan los resultados.
Procedimiento
A C
BB
Procedimiento(análisis estequiométrico)
Resultados
(B) DNA-binding activity of purified PRB. Gel retardation experiments were carried out as pre-viously described (31). Recombinant PRB was preincubated with the control buffer (lane 1), 10 27 M progesterone (P, lane 2), or R5020 (R,lane 3) for 15 min at 25°C. Labeled double-stranded PRE oligonu-cleotides were then added and the reaction mixture was incubated foran additional 15 min. Samples were analyzed on a nondenaturing 5% polyacrylamide gel.
Resultados
Variaciones: Competencia
CA B
A CB
Otras variaciones
•Super-shifting (uso de anticuerposdirigidos contra proteínas conocidas).
•Uso de marcas de fluoróforo en sustitución a las radiactivas.
Desventajas
•No es posible caracterizar la secuencia específica de la sonda que se une a laproteína (ésta debe conocerse con antelación).
•Puede haber más de una proteína quese unen formando un complejo de uniónal ADN.
•Lo que ocurre in vitro no necesariamentees una menifestación de lo que sucede in vivo.
Inmunoprecipitación
Antecedentes
Esta técnica de análisis in vitro de la interacción de un Ag con su Ac específico fuedesarrollada por Michael Heidelberger en1937.
En 1946 Oudin describió un sistema dedifusión para reacciones antígeno-anticuerpoen tubos llenos de agarosa.
Posteriormente Ouchterlony hace su clásicadescripción de la “doble difusión” en placas deagar.
Fundamento
Se basa en el principio de reacciónantígeno anticuerpo, que en un fluidoo soporte semisólido forma un precipitado.
Fundamento
Se usa un anticuerpo que va dirigido contra un antígeno protéico en una mezcla de proteínas para aislar el péptido que posee dicho antígeno.
Fundamento
Las técnicas que se basan en laprecipitación de complejos inmunes(inmunoprecipitación) son variadas.Pueden realizarse en un tubo de ensayoo en placas de agar (técnica conocidacomo inmunodifusión).
Fundamento
Fundamento
La reacción de precipitación esdependiente del pH, temperaturay concentración iónica; pero sobretodode las concentraciones relativas deAg y Ac.
Fundamento
Zona deequivalencia
Zona deexceso deanticuerpo
Zona deexceso deantígeno
INM
UN
OP
REC
IPIT
AD
O F
OR
MA
DO
CONCENTRACIÓN CRECIENTE DE ANTÍGENO
Inmunodifusión doble
REACCIÓN DEIDENTIDAD
REACCIÓN DENO IDENTIDAD
REACCIÓN DEIDENTIDAD PARCIAL
Inmunodifusión doble(semicuantitativa)
Ac
Ag X
Ag X/8
Ag X/32
Ag X/16 Ag X/4
Ag X/2
Inmunodifusión radial
Ag/4
Ag/2
Ag
Ag/8
Aplicaciones•Aislar un Ag específico (a menudo unaproteína).
•Cuantificar un determinado Ag.
•Identificación de virtualmente cualquier péptido de un extracto, generalmente en estado soluble (v.g. enzimas, factores de transcripción, receptores, etc.).
*A menudo, después de purificar una proteína, ésta es posteriormente analizada mendiante un gel de poliacrilamida y SDS.
Gracias