MULTI-DESARROLLO-HPTLC MÉTODO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE LA HIOSCIAMINA,

ESCOPOLAMINA Y SUS PRECURSORES BIOSINTÉTICOS EN SELECCIONADAS PLANTAS SOLANÁCEAS

CULTIVADAS EN CONDICIONES NATURALES Y COMO CULTIVOS IN VITRO

Equipo:Aguilar Magaña Diana

Canto Rodríguez YuselinePérez Muñoz Sharon

Tropano alcaloides

Son importantes productos farmacéuticos obtenidos a partir de plantas solanáceas, principalmente de Atropa, Datura, Hyoscyamus y

especies Duboisia

Debido a su actividad anticolinérgica son ampliamente utilizados en medicina como antiespasmódicos en la reducción

de la tensión de los músculos lisos digestivo y de las vías urinarias

Intentos de síntesis química han resultado económicamente inviable

debido a su estereoquímica

Se han intentado desarrollar métodos para producir tropano alcaloides en

plantas en cultivos in vitro, independientemente de la temporada y

las condiciones climáticas

Como midriáticos en el examen oftalmoscópico y

para prevenir la enfermedad del movimiento

◦ El objetivo de esta investigación fue desarrollar las condiciones para el TLC, separación y cuantificación de hiosciamina , escopolamina, Littorine, anisodamina y cuscohigrina encontrado en los extractos de las plantas intactas y/ o in-vitro biomasas deHyoscyamus niger, Atropa baetica , Atropa belladona y Datura stramonium.

No hay informes en la literatura acerca de la separación por TLC

de anisodamina yLittorine , importantes

precursores en la biosíntesis de tropano alcaloides.

Se han realizado investigaciones sin embargo la mayoría de ellas

se refieren sólo a los compuestos que son

importantes por uso medicinal , es decir, hiosciamina y

escopolamina o su degradación ( tropina, ácido trópico o

apoatropine)

Productos químicos y normas experimentales

Disolventes y reactivos fueron de analíticagrado, comprado a Poch. La hiosciamina se obtuvo de Extrasynthese, escopolamina de Sigma- Aldrich y anisodamina de laboratorios LKT•Littorine y cuscohigrina fueron aisladas de raíces peludas Atropa Bética

Se aplicaron extractos de la concentración, de la planta (400 ml) en placas de sílice PLC y se

desarrollo dos veces con cloroformo: metanol: acetona: 25 % de amoniaco y corrió a distancias de 10,0 y 7,5 cm

respectivamente

• Antes de cada desarrollo se preacondicionaron las placas con los vapores de fase móvil para 5 min en un paso gemela cámara cromatográfica

Dos bandas principales se obtuvieron de 20 placas y el

gel de sílice se eluyó tres veces

con metanol: 25 % de amoniaco

Los extractos combinados de cada banda se evaporaron a

sequedad, produciendo cuscohigrina y Littorine

Las estructuras se confirmaron mediante correlación de enlace

multiple heteronuclear, la coherencia cuántica de un solo heteronucleo y correlación de

espectroscopia y se comparo los datos con los valores de la

literatura apropiados.

Espectros de una y dos dimensiones de RMN de muestras se registraron a 500 y 125 MHz, respectivamente, utilizando un espectrómetro Varian Unity Plus

Material vegetal

Platas intactas deHyoscyamus niger L. , Datura strammonium

L. y Atropa belladonna L. se obtuvieron del Jardín de Plantas Medicinales de la Universidad

Médica de Gdansk, Polonia

Los análisis cromatográficos se realizaron sobre extractos de alcaloides obtenidos de las

hojas y raíces de H. niger , D. y A. strammonium belladona

crecido en condiciones naturales.

Las muestras seleccionadas de plantas solanáceas in vitro

también fueron examinados para el contenido de alcaloides:

1. Microtallos de H. niger cultivado en sólido de

Murashige y Skoog suplementado con 3,4 mg /L de

6- bencilaminopurina2. Microtallos de Atropa baetica cultivadas en medio sólido MS

suplementado con 3,4 mg /L de BAP

3. Raíces adventicias de H. niger cultivaron en MS líquido

suplementado con 1.0 mg /L de indol- 3- butírico

4. Raíces peludas del H. niger cultivado en medio líquido MS

sin fitohormonas

5. Raíces peludas de Atropa baetica se cultivaron en medio

MS líquido sin fitohormonas

Preparación de la muestra

La muestra se liofilizó y finamente se molió (en un mortero) se sometieron a ultrasonidos las muestras del suelo de biomasa vegetal (aprox. 100 mg) en temperatura ambiente, 3 X 15 min) en tubos de ensayo de polipropileno con un disolvente de extracción de cloroformo: metanol: 25% de amoníaco (15:15:01, v / v / v) (20 mL). 

Después de la filtración y la evaporación de los disolventes a presión reducida a 40 °C, el residuo se repartió entre cloroformo (10 mL) y 0,5M H2SO4 (10 mL). La capa ácida se hizo alcalina con 25% de amoníaco (pH = 9,0) y se extrajo con cloroformo (3 X 20 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida a 40 °C.

Los residuos se reconstituyeron en metanol (1 mL) y se almacenó a 4 °C hasta el análisis.

Para el medio líquido (todo volumen recogido después de 30 días de cultivo aprox. 15 mL) se hizo alcalina (pH = 9,0) con 25% de amoníaco y luego se extrajo con cloroformo (320 mL). 

Las capas orgánicas recogidas se secaron sobre sulfato de sodio anhídro y se evaporaron a presión reducida (40 °C). Las muestras se reconstituyeron en metanol (1 mL) y se almacenaron a 4 °C hasta el análisis.

Cromatografía

La cromatografía planar se realizó en 5cm X 20 cm Si60 F 254 TLC y placas de HPTLC de Merck. Las fases móviles dedicadas para alcaloides tropano TLC

separación de la literatura se utilizaron en los experimentos preliminares.

Los estándares de alcaloides primarios, como soluciones metanólico (1 mg / mL), de tanto aislada y comerciales compuestos se diluyeron hasta una

concentración final: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 y 3 mg/10mL. 

Todas las muestras y estándares se aplicaron manualmente a la placas por medio de una jeringa Hamilton TLC (Reno, NV, EE.UU.) como 5 mm.Las

bandas y el volumen de aplicación fue de 10 a 30 mL para las muestras y 10 mL para los estándares. Para el análisis cualitativo y cuantitativo, todas las muestras y los estándares fueron separados en placas de HPTLC (5 CMA 20 cm Si60 F 254, Merck, Darmstadt, Alemania) con una fase móvil que consiste

en cloroformo: metanol: acetona: 25% amoníaco (75:15:10:1.6).

Primera etapa

En la primera etapa (placa preacondicionamiento) de la primera

etapa de desarrollo, la fase móvil (aprox. 25 mL) se vertió en una cubeta de la

cámara de TLC y la placa cromatográfica con las muestras cargadas se puso en el

segundo, comedero seco y acondicionado durante 5 min.

Después de la fase de preacondicionamiento

procedimiento, por la inclinación de la cámara, la fase móvil (aprox. 10

mL) se transfirió a la artesa seco en el que se colocó la placa y fue

desarrollada a una distancia de 4 cm y se secó (5 min, en una

corriente tibia de aire).

Segunda etapa

 En la segunda etapa de desarrollo el procedimiento de

preacondicionamiento fue repetido y luego la placa de cromatografía

fue desarrollada a una distancia de 3 cm.

Después de la segunda etapa de desarrollo, las placas se secaron

durante 5 min en una corriente de aire caliente se escanearon en λ = 190 nm

para análisis de anisodamina utilizando un densitómetro (Desaga

CD60). 

Las placas de TLC cargadas se desarrollaron utilizando una de dos etapas multi-desarrollo (MD) , con cada etapa que comprende dos pasos. 

Los otros compuestos fueron examinados en λ = 520 nm después de la pulverización y derivatización con Reactivo de Dragendorff siguiendo una modificación. Los cromatogramas fueron documentados fotográficamente. Las exploraciones lineales se obtuvieron con hendidura dimensiones de 0,02 mm X 10 mm.

Validación del método

Las curvas de calibración (área de pico frente importe por carril) para hiosciamina, Littorine, cuscohigrina y escopolamina fueron lineales en el rango de 1000-3000 ng / carril, y para anisodamina en el intervalo de 500-3000 ng / carril. 

Los límites de detección (LD) y cuantificación (LOQ) para los análisis de HPTLC se calcularon a partir de una ecuación de calibración ya que los importes por los que la relación señal-ruido (S / N) fueron ≥ 3:01 y ≥ 10:01, respectivamente, con el uso de una muestra en blanco. Ellos son expresado como la cantidad (ng) de alcaloide examinado por carril.

Se midieron la precisión del instrumento (repetibilidad) y la precisión intermedia, se calcularon utilizando zonas de puntos medidos para 2000 ng de anisodamina, cuscohigrina, hiosciamina, escopolamina y Littorine por carril. Para la medición de la repetibilidad, la misma muestra fue analizada de forma independiente seis veces en cada placa HPTLC. La precisión Intermedio se midió mediante un análisis de seis muestras, preparado con la mismo procedimiento de preparación de muestras y se analizaron en las mismas condiciones cromatográficas (en la misma placa) en un solo día (precisión intradía) y en tres días diferentes (entre días de precisión)

Para la recuperación se midió para las soluciones patrón añadido, en tres concentraciones, a 100 mg de A. Bética raíces peludas de conocida composición. Después, la muestra se extrajo de acuerdo con el procedimiento descrito.

Medición de contenido

El contenido de alcaloides de una muestra de la planta se informó como la media de los tres extractos independientes de que la muestra y expreso como mg / g de material

vegetal seco. Cada extracto se cargó y se analizó por triplicado en la misma placa. Para cada medición, curvas de calibración de anisodamina, hiosciamina, escopolamina, Littorine y cuscohigrina se construyeron de forma independiente, utilizando seis diferentes patrones

de calibración.

Resultados y discusiones

Hay un potencial de efectos adversos relacionados con la matriz en el logro de

separación cromatográfica de los analitos a partir de biomasa de la planta. Por lo tanto, el trabajo de desarrollo en

la separación de hiociaminaa y la escopolamina, sus respectivos precurors Littorine y anisodamina, y el producto de

una ruta biosintética paralela cuscohigrina ), se llevó a cabo usando el

extracto alcaloide de Atropa Bética raíces peludas que previamente

se ha demostrado que produce una fracción alcaloide compleja.

Después muchas iteraciones en la concentración de

constituyentes de la fase móvil (Amoniaco, metanol,

acetona, cloroformo) el mejor método de análisis

implicó el uso de placas de HPTLC Si60 desarrollados con cloroformo: metanol:

acetona: 25% de amoniaco (75:15:10:1.8 v / v / v / v).

La fracción alcaloide de A. baetica raíces peludas

se separó con 12 componentes de reaccionar

con el reactivo de Dragendorff. Después co-

cromatografía con los estándares, cinco de los

alcaloides fueron identificados como anisodamina,

cuscohigrina, hiosciamina, Littorine y escopolamina

respectivamente.

La separación de los alcaloides fue suficiente para los análisis cualitativos. Sin embargo, los ensayos de densitométricos revelaron

que la evaluación cuantitativa de Littorine y escopolamina

todavía no era viable debido a la mala intensidad de las bandas que representan a

estos alcaloides. Para evitar esto y para mejorar la

separación de alcaloide, se utilizó la técnica de multi-

desarrollo. 

Esta estrategia proporciona la mejor

separación de anisodamina, cuscohigrina,

hiosciamina, Littorine y escopolamina, con

factores de resolución en la mayoría de los casos mayor que 1 (Rs> 1).

Para proporcionar una mejor reproducibilidad de

las separaciones se empleó la cámara de

doble canal Camag. Los dos canales separados en

el dispositivo permitir tanto la saturación

simultánea de la cámara con los vapores de la fase

móvil, y el precondicionamiento de

las placas cromatográficas.

El procedimiento

de desarrollo se puede iniciar sin

necesidad de abrir la cámara,

simplemente inclinándolo, de ésta manera, el

ambiente de saturación

apropiada se puede

mantener

Sin embargo, anisodamina y cuscohigrina,

incluso después de que el

procedimiento de desarrollo y

preacondicionamiento, aun tenían

valores de Rf muy similares. Por lo

tanto, con el fin de determinar el contenido de

anisodamina, era necesario aplicar

grandes cantidades de extractos de plantas sobre la

placa cromatográfica.

Se realizó un barrido

densitométrico con UV

(L=190nm) sin rociar con el reactivo de

Dragendorff. Dada la ausencia de

grupos cromóforos en la estructura de cuscohigrina,

el análisis cuantitativo de anisodamina

podía llevarse a cabo bajo éstas

condiciones.

Los parámetros validados fueron

precisión, repetibilidad y la

recuperación de las condiciones de

separación. Por lo tanto las condiciones desarrolladas fueron

utilizadas en los análisis cuantitativos de diversas matrices

analíticas , incluyendo plantas

de biomasa, cultivos in vitro, campo de

cultivo y medios de cultivo recogidos

después de la cosecha de los

cultivos in vitro.

La selección de matrices de análisis hizo

posible evaluar la utilidad de las condiciones

desarrolladas para los análisis de

TLC- proyección de anisodamina,

cuscohigrina, hiosciamina, escopolamina

littorine y en los materiales

vegetales de diferentes fuentes.

La anisodamina se detectó en la mayoría de las muestras de plantas, pero sólo en pequeñas cantidades, con la mayor concentración registrada en las raíces adventicias H. niger.

La Hyoscyaamine estaa presente en todas las muestras analizadas, a excepción de los dos microtallos Hniger y hojas de plantas intactas. Las cantidades más altas de éste se registraron dentro del cuadro –grown A.

Las cantidades más altas de la escopolamina estuvieron presentes en INH. Raíces nigerhairy de cultivos in vitro, que era 5 veces mayor que las cantidades registradas en las raíces de planta intacta. La demanda de escopolamina es mayor que para otros alcaliodes de tropano y para uso médico.

Los alcaloides de tropano en la mayoría de las plantas solanáceas son producidos en las raíces, y las partes aéreas son sólo un lugar para la acumulación de producto final.

Este hecho, puede explicar menores cantidades de alcaliodes de tropano y la falta de sus precursores en las hojas de las plantas intactas ensayados en los experimentos en comparación con las matrices de raíz.

La ausencia de alcaloides en microtallos niger H. que no mostraron la formación de raíces también fue causado por el metaolismo organoespecifico de alcaloides tropano.

Las altas cantidades de alcaloides particularmente en medios de crecimiento que se colectaron después del cultivo in vitro de las biomasas sugiere enfoques alternativos y mayor facilidad de obtención de los alcaloides de sistema de cultivo.

Los resultados obtenidos sugieren que condiciones MD-HPTLC se pueden utilizar con éxito para el cribado de ensayos de hiosciamina, escopolamina y sus precursores en diversos materiaes de plantas, incluyendo cultivos in vitro, el crecimiento de medios de comunicación y las plantas cultivadas en el campo.

REFERENCIAS◦ Jaremicz, Z., Luczkiewicz, M., Kisiel, M., Zárate, R., Jaber-Vazdekis, N., Migas, P.

Multi-development-HPTLC Method for Quantitation of Hyoscyamine, Scopolamine and their Biosynthetic Precursors in Selected Solanaceae Plants Grown in Natural Conditions and as In Vitro Cultures. Phytochemical Analysis. 2013