University of Applied Science Hamburg

Department Life Sciences

Entwicklung einer Methode zur Bestimmung bromierter Flammschutzmittel in Schweinswalen (Phocoena

phocoena) mit Hilfe der Gaschromatographie-Massenspektrometrie

Master Thesis

im Studiengang Environmental Engineering

vorgelegt von

Nicolas Fitz

Hamburg-Bergedorf

Am 15. Januar 2010

Gutachter: Prof. Dr. Olaf Elsholz (HAW Hamburg) Prof. Dr. Andreas Prange (GKSS-Forschungszentrum Geesthacht GmbH)

Die Master Thesis wurde betreut und erstellt im

GKSS-Forschungszentrum Geesthacht GmbH

Institut für Küstenforschung

Abteilung Marine Bioanalytische Chemie

Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Thesis selbstständig und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten und nicht veröffentlichten Schriften entnommen sind, sind als solche kenntlich gemacht. Die Arbeit ist in gleicher oder ähnlicher Form nicht als Prüfungsarbeit eingereicht worden.

Nicolas Fitz

Diese Master Thesis wurde im GKSS-Forschungszentrum Geesthacht GmbH im Institut für Küstenforschung in der Abteilung Marine Bioanalytische Chemie angefertigt. Ich möchte meinem Abteilungsleiter und Betreuer am GKSS-Forschungszentrum Geesthacht Herrn Prof. Dr. Andreas Prange für die Bereitstellung dieses Themas und für die Ermöglichung der Durchführung dieser Arbeit danken. Besonderer Dank geht an Herrn Dr. Jürgen Gandraß. Durch seinen Rat und Unterstützung habe ich tiefe Einblicke in die Spurenanalytik erlangen können. Ich danke Herrn Prof. Dr. Olaf Elsholz von der Hochschule für Angewandte Wissenschaften in Hamburg für die Betreuung während meines Hauptpraktikums, meiner Diplomarbeit und nun der Master Thesis. Ich danke dem Forschungs- und Technologiezentrum Westküste in Büsum (FTZ) für die Bereitstellung der Schweinswalproben.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung............................................................................................................................................1 1.1 Bromierte Flammschutzmittel in der marinen Umwelt .......................................................................1 1.2 Aufgabenstellung...............................................................................................................................2 2 Stand des Wissens ............................................................................................................................3 2.1 Der Schweinswal (Phocoena phocoena)...........................................................................................3 2.2 Halogenierter Flammschutzmittel in der Umwelt ...............................................................................4 2.2.1 Polybromierte Diphenylether (PBDE) 5 2.2.2 Polybromierte Biphenyle (PBB) 8 2.3 Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS).....................................................................10 2.3.1 GC/MS Hintergrund 10 2.3.2 Instrumentierung 12 2.4 Probenaufarbeitung .........................................................................................................................13 3 Methodenentwicklung .....................................................................................................................17 3.1 Bestehende GC/MS-Methode für PBDE..........................................................................................17 3.2 Erweiterung der GC/MS-Methode ...................................................................................................17 3.2.1 GC-Bedingungen 17 3.2.2 MS-Bedingungen 19 3.3 Probenaufarbeitung .........................................................................................................................23 3.3.1 Homogenisierung 23 3.3.2 Extraktion und Bestimmung des Fettgehaltes 25 3.3.3 Probenaufreinigung 27 3.3.4 Schwefelsäure-Cleanup 27 3.3.5 Fraktionierung mit PYE-HPLC 29 3.4 Validierung der Methode..................................................................................................................32 3.4.1 Kalibrierung 32 3.4.2 Reproduzierbarkeit 33 3.4.3 Aufstockung und Wiederfindungsraten 35 3.4.4 Nachweis und Bestimmungsgrenzen (NG, BG) 36 4 Realproben .......................................................................................................................................40 4.1 Ergebnisse.......................................................................................................................................40 4.1.1 PBDE-Konzentrationen 41 4.1.2 PBB-Konzentrationen 42 5 Diskussion........................................................................................................................................43 6 Schlussfolgerungen und Ausblick.................................................................................................46 7 Zusammenfassung ..........................................................................................................................47 Anhang.....................................................................................................................................................48 IUPAC-Nomenklatur bizyklischer Verbindungen ......................................................................................48 SOP_01: Homogenisierung von Fettgewebe mariner Säuger (Ultra-Turrax®).........................................52 SOP_02: Soxhlet-Extraktion, Probeneinengung.......................................................................................53

SOP_03: Bestimmung des Fettgehaltes in Extrakten...............................................................................55 SOP_04: Schwefelsäure-Cleanup von fetthaltigen Extrakten...................................................................56 SOP_05: PYE-HPLC Fraktionierung und finale Einengung des Extraktes...............................................57 SOP_06: GC/MS-Methode zur Bestimmung von PBDE und PBB............................................................59 SOP_07: Reinigung von Glasgeräten, Werkzeugen und Zubehör ...........................................................63 8 Literaturverzeichnis.........................................................................................................................65

Abkürzungsverzeichnis ASE® Automatisiertes Extraktionsverfahren (engl. ‘Accelerated Solvent

Extraction‘, Handelsname der Fa. Dionex für eine PFE)

BDE Substanzklasse: Bromierte Diphenylether, auch: PBDE

BG Bestimmungsgrenze

CI Ionisierungstechnik: chemische Ionisierung mittels Reaktantgas, mögliche Modi: „Positiv-Ionen“ (PCI), „Negativ-Ionen“ (NCI)

CS-1 - 5 ’calibration solutions’, Kalibrierlösungen der jeweiligen Substanzklasse

DDT Chloriertes Insektizid: Dichlordiphenyltrichlorethan

EI Ionisierungstechnik: Elektronenstoß-Ionisierung (engl. ‘electron impact ionization‘)

eV Elektronenvolt, physikalische Einheit für kinetische Energie (1 eV = 1,602·10-19

J)

FSM Flammschutzmittel

GC Gaschromatographie, Gaschromatograph

GC/MS Analysengeräte-Kopplung aus Gaschromatograph (GC) / Massenspektrometer (MS)

GPC chromatographisches Trennverfahren: „Gel Permeations Chromatographie“ oder auch Größenausschluss-Chromatographie

InjS Interner Standard zur volumetrischen Korrektur, ’injection internal stock solution‘

IUPAC Internationale Union für reine und angewandte Chemie, ‘International Union of Pure and Applied Chemistry‘

IVA Isotopenverdünnungsanalyse: Verwendung von isotopenmarkierten Analyt-Homologe als Interner Standard, steigert die Präzision

lw Bezugsgröße für Konzentrationsangaben: Fettgewicht (engl. ‚lipid weight’)

MAE Extraktionsmethode: Mikrowellen Aufschluss, (engl. ‘Microwave-assisted extraction’)

MS Analysegerät für Elementbestimmung/Molekülanalytik, Massenspektrometer

MSD Detektortyp: massenselektiver Detekor, Massenspektrometer

m/z Größe in der Massenspektrometrie, Verhältnis Masse zu Ladung von Ionen

NatS Standardlösung nichtmarkierter BDE, ’native stock solution‘

NCI Ionisierungstechnik: siehe CI

ng Gewichtseinheit: Nanogramm, 1 ng = 10-9 g

NG Nachweisgrenze

NIST The National Institute of Standards and Technology (NIST)

Pa Druckeinheit Pascal [N/m2] 1 Pa = 10-5 bar

PBB Substanzklasse: polybromierte Biphenyle

PBDE Substanzklasse: polybromierte Diphenylether, auch: BDE

PCB Substanzklasse: Polychlorierte Biphenyle

PCDE Polychlorierte Diphenylether

PCI Ionisierungstechnik: siehe CI

PFE Automatisiertes Extraktionsverfahren (engl. ‘Pressurized Fluid Extraktion)

pg Gewichtseinheit: Picogramm, 1 pg = 10-12 g

POP Sammelbegriff für persistente organische Schadstoffe (engl. ‚persistent organic pollutants‘)

PTFE Werkstoff: Polytetrafluorethylen, bekannter unter dem Handelsnamen Teflon®

PTV Injektionstechnik in der GC, engl. ‘Programmed Temperature Vaporizer’

PU Polyurethan, (DIN-Kurzzeichen PUR), Kunststoffe oder Kunstharze

RT Retentionszeit, Verweildauer der Analyte auf der Säule, ‘retention time‘ s/n Maß für die Signalintensität in Chromatogrammen: Signal/Rausch-Verhältnis

(engl. ‘signal-to-noise ratio‘) SIM Datenerfassungsmodus der Massenspektrometrie, ‘selected ion monitoring‘

SOP Standardarbeitsanweisung, ’standard operation procedure’

SurrS Interner Standard 13C-isotopenmarkierte BDE, ’surrogate stock solution’ TIC Chromatogramm in welchem alle m/z –Signale aufsummiert sind: Total-

Ionenstrom-Chromatogramm

WFR Wiederfindungsrate dotierter Substanzen in Aufstockungs-Experimenten

ww Bezugsgröße für Konzentrationsangaben: Nassgewicht (engl. ‚wet weight‘)

Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Gewöhnlicher Schweinswal (Phocoena phocoen) ............................................................................. 3 

Abb. 2: PBDE-Struktur mit 10 Substitutionsstellen ......................................................................................... 5 

Abb. 3: PBB-Struktur mit 10 Substitutionsstellen............................................................................................ 8 

Abb. 4: Schematischer Aufbau eines Quadrupol-Massenspektrometer (Quelle: selbst erstellte Zeichnung).......................................................................................................................................................... 10 

Abb. 5: Finales Temperaturprogramm mit resultierender Trennung der PBDE- und PBB-Kongenere........ 18 

Abb. 6: NCI-Full Scan des Hexa-PBB-155. Aus den drei signalintensivsten Fragmenten erfolgt die Auswahl der SIM-Massen. .............................................................................................................................. 19 

Abb. 7: Vorzerkleinerung einer Gewebeprobe.............................................................................................. 24 

Abb. 8: Dispergieren mit dem ULTRA -TURRAX® T 25 digital .................................................................... 24 

Abb. 9: Homogenisierte Probe im Supelco®-Vial ......................................................................................... 24 

Abb. 10: Schema Soxhlet-Extraktor :(1) Kolben mit Extraktionsmittel (2) Extraktor mit Hülse, (3) Dimrothkühler. .................................................................................................................................. 25 

Abb. 11: Rotationsverdampfer R-134 der Fa. Büchi..................................................................................... 26 

Abb. 12: Mit Schwefelsäure versetzte Probe vor (links) und nach dem Zentrifugieren (rechts)................. 27 

Abb. 13: Relative Signalintensität der acht PBDE-Kongenere in Abhängigkeit der Aufenthaltszeit im Ultraschall......................................................................................................................................... 26 

Abb. 14: Relative Signalintensität der sieben PBB-Kongenere in Abhängigkeit der Aufenthaltszeit im Ultraschall......................................................................................................................................... 26 

Abb. 15: Extrahiertes Ionen-Chromatogramm (NCI-Modus) der 13C12-PBDE Quantifier-Massen einer Fischölprobe (5 g, dreifacher Säure-Cleanup, eingeengt auf 300 µL, Injektionsvolumen: 1 µL, Zielkonzentration der Dotierung: 100 ng/mL.................................................................................... 29 

Abb. 16: TIC EI-Modus ‚full scan‘ der Fischölprobe. Der aus säureresistenten Substanzen bestehende breite Peak überdeckt den Retentionsbereich der Tri- bis Penta bromierten BDE-Kongenere....... 29 

Abb. 17: Prinzip der Pyren-Phasen-Trennung: die Analyte werden durch π – π-Wechselwirkungen (gelbe Doppelpfeile) mit den Ringen der stationären Phase zurückgehalten............................................. 30 

Abb. 18: PYE-HPLC Chromatogramm (DAD-λ: 230,2 nm) der dotierten Fischölprobe (Injekt.-Vol.: 20 µL), geschnitten in 2 Fraktionen .............................................................................................................. 30 

Abb. 19: Extrahiertes Ionenchromatogramm (Quantifier) vom NatS-dotierten Fischöl (1 ng/mL) nach der PYE-HPLC-Fraktionierung. .............................................................................................................. 31 

Abb. 20: PYE-HPLC Chromatogramm (DAD-λ: 230,2 nm) von 13C12-PBDE dotierten Schweinswalprobe, geschnitten in 3 Fraktionen. Injektions-Volumen: 100 µL ................................................................ 31 

Abb. 21: Prozentuales Σ7-PBDE-Muster der 9 Proben. Anteile bezogen auf die Summe............................ 41 

Abb. 22: PBDE-Profil normiert auf BDE-47 und Standardabweichung ........................................................ 40 

Abb. 23: Prozentuales Σ7-PBB-Muster der 9 Proben. Anteile bezogen auf die Summe. ............................. 42 

Abb. 24: PBB-Profil normiert auf PBB-49 und Standardabweichung ........................................................... 41 

Abb. 25: Überlagerung der Quantifier Massenspuren BDE-28: Realprobe (schwarz), CS-3 (blau) und CS-4 (rot) ................................................................................................................................................... 43 

Tabellenverzeichnis Tab. 1: Prozentuale Zusammensetzung und übliche Handelsnamen der BDE-Mischungen (de Boer, Allchin

et al. 2001). ........................................................................................................................................... 6

Tab. 2: Stoffeigenschaften ausgewählter PBDE-Kongenere.......................................................................... 6

Tab. 3: Auswahl an PBDE-Befunden in Biota des marinen Nahrungsnetzes, Angaben in [ng/g lw] (lipid weight) .................................................................................................................................................. 7

Tab. 4: Prozentuale Zusammensetzung und übliche Handelsnamen der technischen PBB-Mischungen .... 8

Tab. 5: PBB-Konzentrationen (Hexa-Kongenere) in verschiedenen Biota, Angaben in [ng/g lw] (lipid weight).............................................................................................................................................................. 9

Tab. 7: Übersicht der SIM-Massen für native und isotopenmarkierte PBDE sowie der Substanzen des InjS............................................................................................................................................................ 20

Tab. 8: Übersicht der SIM-Massen für native PBB ....................................................................................... 21

Tab. 9: Übersicht der SIM-Gruppen.............................................................................................................. 22

Tab. 10: Literaturangaben von PBDE-Minimalkonzentrationen in marinen Säugern in [ng/g lw]................. 23

Tab. 11: Kenndaten der PBDE-Kalibrierung (A-C, Arbeitsbereich 1 - 500 pg/µL)........................................ 32

Tab. 12: Kenndaten der PBDE-Kalibrierung (C-E, Arbeitsbereich 1 - 500 pg/µL)........................................ 33

Tab. 13: Kenndaten der PBB-Kalibrierung (A-C, Arbeitsbereich 5 - 500 pg/µL) .......................................... 33

Tab. 14: Kenndaten der PBB-Kalibrierung (C-E, Arbeitsbereich 5 - 500 pg/µL) .......................................... 33

Tab. 15: Reproduzierbarkeit als Wiederhol-Präzision der Flächencounts der nativen BDE (Quantifier) ..... 33

Tab. 16: Reproduzierbarkeit als Wiederhol-Präzision der Flächencounts der PBB-Kalibrierung (Quantifier)............................................................................................................................................................ 34

Tab. 19: Wiederfindungsraten (n = 6) dotierter 13C12-PBDE in Schweinswalproben.................................... 35

Tab. 20: Wiederfindungsraten (n=3) der PBB-Aufstockung (ca. Faktor 3 über nativer PBB-Belastung) im Schweinswal ....................................................................................................................................... 36

Tab. 21: PBDE Signal- zu Rauschverhältnis (s/n) ermittelt auf Grundlage des BDE-CS-1(1 pg/µL)........... 37

Tab. 22: PBB Signal- zu Rauschverhältnis (s/n) ermittelt auf Grundlage des PBB-CS-0 (1 pg/µL) und CS-1 (5 pg/µL).............................................................................................................................................. 38

Tab. 23: Aus „instrumentellen“ Werten abgeschätzte PBDE-NGM und BGM für das Gesamtverfahren....... 38

Tab. 24: Aus „instrumentellen“ Werten abgeschätzte PBB-NGM und BGM für das Gesamtverfahren ......... 38

Tab. 25: PBDE-Minimalkonzentrationen in Schweinswalen (Literatur) ........................................................ 38

Tab. 26: Übersicht der Grunddaten der analysierten Schweinswalproben. ................................................. 40

Tab. 27: Übersicht prozentualer Fettgehalte der Einwaagen, PBDE- und PBB-Gesamtbelastung als Summen.............................................................................................................................................. 40

Tab. 28: PBDE Konzentrationen in den 9 Proben, alle Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung [ng/g lw]........................................................................................................................................................ 41

Tab. 29: PBB Konzentrationen in den 9 Proben, alle Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung [ng/g lw]............................................................................................................................................ 42

Einleitung und Aufgabenstellung

1

1 Einleitung Der Mensch erzeugte im Laufe der Industrialisierung eine Vielzahl an synthetischen, chemischen Substanzen, die über ein breites Anwendungsspektrum tief mit den Konsumkreisläufen verflochten sind. Dabei war und ist es unvermeidbar, dass diese Stoffe teilweise während der Produkt-Lebenszeit in die Umwelt entlassen werden. Durch ihre Eigenschaften, wie z.B. deren Langlebigkeit (Persistenz), sind sie in der Lage sich weiträumig in der Natur auszubreiten. Dadurch sind diese Substanzen bereits in den entlegensten Regionen, fernab von menschlichen Ballungsräumen anzutreffen. Einige dieser Substanzen stellen für die Natur zum Teil hochgradig toxische Schadstoffe dar und richten erheblichen Schaden in den empfindlichen Ökosystemen an.

Aufgrund der Tatsache, dass unsere Zivilisation enorme Mengen an Abwässern aus nahezu allen Bereichen produziert, findet ein Großteil des Eintrages naturfremder Substanzen über die Wasserwege statt. Dies hat zur Folge, dass die aquatischen und marinen Ökosysteme relativ direkt von dieser Form der menschlichen Einflüsse auf die Umwelt betroffen sind. Da der Mensch das Meer zu Versorgungszwecken wirtschaftlich nutzt, ist auch er von der Belastung zu einem nicht unerheblichen Maße betroffen.

Durch die Gewahrwerdung der potenziellen Gefahr von künstlichen, anthropogenen Substanzen in der (marinen) Umwelt, wurde eine Vielzahl von Regularien der EU erlassen (z.B. die Europäische Wasserrahmenrichtlinie) sowie Regularien der „Helsinki-Commission“, „Stockholm-Convention“ und der „OSPAR-Commission“. Der Inhalt dieser Regularien soll den Eintrag und die Ausbreitung solcher Stoffe unterbinden und kontrollieren (überwachen). Auch wenn die Produktion und Vermarktung von einigen Stoffen und Verbindungen aufgrund ihres schädlichen Einflusses auf die Umwelt eingestellt wurde, ist anzunehmen, dass diese sich aufgrund ihrer Persistenz noch lange Zeit in der Umwelt befinden werden.

1.1 Bromierte Flammschutzmittel in der marinen Umwelt In der Vergangenheit wurden die Belastungen mit persistenten organischen Verbindungen (POP) in marinen Säugern vornehmlich von chlorierten Verbindungen (und deren Metaboliten), wie polychlorierten Biphenylen (PCB), Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT), Hexachlorocyclohexan (HCH), etc. dominiert (Tuerk, Kucklick et al. 2005). Seit einigen Jahren jedoch werden bromierte Flammschutzmittel ebenfalls in marinen Säugern festgestellt, und dies in scheinbar rasant ansteigenden Konzentrationen (Stapleton 2006), wodurch die Aufmerksamkeit verstärkt auf diese bromierten Substanzen gerichtet wird. Aus diesem Grund werden sie auch als so genannte ’emerging compounds’ bezeichnet.

Bromierte Flammschutzmittel (FSM) werden zu Brandschutzzwecken Kunststoffen zugesetzt und sind den persistenten organischen Verbindungen (POP) zu zuordnen. Ihre weiteren physiko-chemischen Eigenschaften führen zu einer Anreicherung in Biota (Bioakkumulation) und es gibt zahlreiche Hinweise, dass einige Kongenere dieser Substanzgruppen negative Auswirkungen auf die Entwicklung und die Gesundheit von Lebewesen haben, insbesondere den höheren Säugetieren.

Aufgrund ihrer Persistenz sind sie in der Lage sich über große Distanzen hinweg auszubreiten. Durch den erbrachten Nachweis, dass diese Substanzen bereits in der Arktis anwesend sind (de Wit, Alaee et al. 2006), kann geschlussfolgert werden, dass der Großteil des marinen Lebensraumes davon belastet zu sein scheint.

Aus diesen Gründen ist es wichtig und notwendig, den Verlauf des Eintrages, der Ausbreitung und des Verbleibes dieser (und anderer) Schadstoffe zu untersuchen und zu beobachten. Nur durch solche Beobachtungen können Aussagen darüber gemacht werden, ob Maßnahmen wie der Verzicht bzw. das Vermarktungs-Verbot der Substanzen einen mittel- bis langfristigen Effekt auf die Umwelt haben.

Im Zusammenhang mit der Europäischen Wasserrahmenrichtlinie (2000/60/EG) ist mit solchen Beobachtungen ebenfalls festzustellen, ob und in weit sich die geforderte Verbesserung der Gewässergüte einstellt. Darüber hinaus wurden einige Kongenere von bromierten FSM (polybromierten Diphenylether, PBDE) in die Liste der prioritär gefährlichen Stoffe als Ergänzung zur EU-Wasserrahmenrichtlinie aufgenommen (2455/2001/EG 2001).

Einleitung und Aufgabenstellung

2

Das Stockholmer Übereinkommen zu persistenten organischen Schadstoffen vom Mai 2001 („Stockholm Convention“, Teil des ‘United Nations Environmental Program‘ (UNEP)) stellt ein globales Abkommen dar, welches Mensch und Umwelt vor persistenten organischen Schadstoffen schützen soll. Die zwölf soweit definierten Schadstoffe (so genanntes „dreckiges Dutzend) wurden im Mai 2009 durch weitere chlorierte, bromierte und fluorierte Verbindungen ergänzt, unter anderem mit Hexabrombiphenylen, (SC-4/13), tetra-, penta- (SC-4/18), hexa- und hepta-bromierten Diphenylethern (SC-4/14). Diese Erweiterung des Schadstoffumfanges tritt im August 2010 in Kraft (UNEP-C.N.524.2009 2009).

Die OSPAR-Kommission zum Schutz und Erhalt des Nord-Ostatlantiks ist ein Zusammenschluss von 15 europäischen Regierungen, die zusammen mit der Europäischen Gemeinschaft daran arbeiten, die Verschmutzung des Nord-Ostatlantiks zu reduzieren und vorbeugende Maßnahmen zur nachhaltigen Bewirtschaftung einzuführen. Ein wichtiges Werkzeug zur Bewertung der Umweltbelastung ist deren ‘Co-ordinated Environmental Monitoring Program‘ (CEMP). Die Hauptkongenere der PBDE (IUPAC-Nr.: -28, -47, -66, -85, -99, -100, -153, -154,-183 und -209) als Vertreter der bromierten Flammschutzmittel (FSM), sind verbindlicher Teil der zu untersuchenden Substanzen innerhalb der CEMP-Richtlinien (OSPAR 2008).

1.2 Aufgabenstellung Die Aufgabe der vorliegenden Master Thesis bestand in der Entwicklung und exemplarischen Anwendung einer Methode, mit der Hauptkongenere der PBDE und PBB, als ausgewählte Vertreter der bromierten FSM, im Fettgewebe mariner Säuger bestimmt werden können. Als Analysegerät stand ein GC/MS (Quadrupol-MS der Fa. Agilent) zur Verfügung. Aufbauend auf die von mir verfasste Diplomarbeit (siehe Fitz 2007) sollte die dort optimierte Methode um die Substanzklasse der PBB erweitert werden. Entsprechende Extraktions- und Aufreinigungsschritte sollten etabliert und als Teil der Probenaufarbeitung der Methode mit validiert werden. Die Validierung und die exemplarische Anwendung fanden anhand von Fettgewebeproben von Schweinswalen (Phocoena phocoena) aus der Nord-, Ostsee und der Elbe statt. Die Proben wurden vom Forschungs- und Technologiezentrum Westküste in Büsum (FTZ) zur Verfügung gestellt.

Stand des Wissens

3

2 Stand des Wissens

2.1 Der Schweinswal (Phocoena phocoena) Der Schweinswal zählt zu den Vertretern der Zahnwale (Odontoceti) und bewohnt die Gewässer der gemäßigten Zonen in der nördlichen Hemisphäre. Seine englische Bezeichnung ‘harbor

porpoise‘ stammt von dem lateinischen Wort für Schwein (porcus), die auch die deutsche Namensgebung, neben Aussehen und Größe, bestimmt haben könnte. Schweinswale besitzen einen gedrungenen und stämmigen Körperbau, der in Verbindung mit ihrer charakteristischen dicken Fettschicht den Wärmeverlust in

den kalten Gewässern minimiert und als Anpassung an die klimatischen Bedingungen gesehen wird (W. F. Perrin 2002).

Weibliche Tiere erreichen im Durchschnitt eine Länge von 160 cm bei einem Gewicht von ca. 60 Kg. Die männlichen Tiere sind etwas kleiner, sie werden ca. 145 cm lang bei einem Gewicht von ca. 50 kg. Das größte bekannte Tier dieser Spezies war ein Weibchen mit einer Länge von 200 cm und einem Gewicht von 70 kg. Neugeborene Kälber sind zwischen 70-75 cm lang bei einem Gewicht von ca. 5 kg und besitzen proportional zu ausgewachsenen Tieren eine noch dickere Fettschicht. Durchschnittlich erreichen die Tiere ein Alter von 8 bis 10 Jahren (W. F. Perrin 2002).

Schweinswale besitzen eine dunkelgraue Färbung entlang des Rückens sowie auf den Oberseiten der vorderen Flossen. Das Kinn, die Unterseite der Flossen und der Bauch sind im Kontrast dazu von einer weißen Färbung. Charakteristisch ist die dreieckige Rückenflosse, die als gutes Erkennungszeichen auf See gilt (W. F. Perrin 2002).

Schweinswale werden oft in kleinen Gruppen von zwei bis drei Tieren angetroffen, wobei häufig ein Paar aus Mutter und Kalb besteht. Auch Gruppen von sechs bis acht Tieren sind nicht ungewöhnlich, größere Ansammlungen der Tiere sind jedoch nur selten zu beobachten (W. F. Perrin 2002).

Hauptsächlich ernähren sich die kleinen Zahnwale von Fischen und Tintenfischen (Kalmare, lat. Cephalopoda), wobei sich ihr Jagdrevier in meeresgrundnahen Zonen bis zu einer Tiefe von 200 Metern erschließt. Zu ihrer bevorzugten Beute gehören auf dem Meeresgrund lebende Fische, sowie Schwarmfische im Freiwasser mit hohem Fettgehalt wie z.B. Heringe, Sprotten und Sardellen (W. F. Perrin 2002).

Es ist bekannt, dass sich Schweinswale normalerweise für längere Zeit in einem Gebiet aufhalten, dennoch wurden Onshore/Offshore-Migrationen, sowie Wanderungen entlang von Küstenlinien beobachtet. Diesem Verhalten liegen das oft saisonal schwankende Nahrungsangebot aber auch saisonale Umweltveränderungen wie z.B. Eisbildung etc. zu Grunde (W. F. Perrin 2002).

Aufgrund ihres Lebensraumes in küstennahen Gewässern stehen Schweinswale unter direktem Einfluss menschlicher Aktivitäten. Schadstoffbelastung, Lärm, Schiffsverkehr und Überfischung ihrer Beutespezies sind nur einige vom Menschen verursachte Problematiken, mit denen die Tiere konfrontiert werden. Auch wenn der Schweinswal fast weltweit unter Schutz steht und die Bejagung durch den Mensch für Fleisch und Tran der Vergangenheit angehört, sind abnehmende Zahlen der Populationen zu beobachten. Es existiert kein effektiver Schutz gegen die „Beifang-Problematik“ oder die Belastung mit gesundheitsschädlichen Schadstoffen. Die Schweinswale sind seit einigen Jahren auf der so genannte „Roten Liste“ verzeichnet, und gelten in einigen Regionen (z.B. im Ostseeraum) als stark gefährdete Spezies (IUCN 2008).

Abb. 1: Gewöhnlicher Schweinswal (Phocoena phocoena) Quelle: Wikipedia.de

Flammschutzmittel in der Umwelt

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2.2 Halogenierter Flammschutzmittel in der Umwelt Die auf Erdöl basierenden Materialien wie Kunststoffe, Schäume, Textilien und deren Untergruppen finden in unserer Gesellschaft in nahezu allen Lebensbereichen ein breites Anwendungsspektrum. Nachteil dieser Werkstoffe ist die relativ leichte Entzündbarkeit, die, wie es die Vergangenheit häufig zeigte, im Brandfalle eine lebensgefährliche Bedrohung darstellen kann. Aus diesem Grund werden diese Werkstoffe mit Flammschutzmitteln versehen, die die Brennbarkeit der Materialien herabsetzen und das Sicherheitsrisiko erheblich abschwächen.

Hinter dem Begriff Flammschutzmittel verbergen sich verschiedene chemischen Verbindungen, die auf unterschiedliche Weise die Entzündbarkeit, bzw. die Brennbarkeit von deren Trägermaterialien herabsetzen. Folglich bezeichnet der Begriff Flammschutzmittel eine Wirkung und keine chemische Substanzklasse (Breitung 2003). Neben einer Vielzahl an anorganischen und organisch-phosphorhaltigen Substanzen haben sich vor allem halogenierte organische Verbindungen als FSM bewährt. Insbesondere Brom, zum Teil auch Chlor, stellte sich als Halogen in aliphatischen und aromatischen Verbindungen als sehr effektiv dar (EFRA 2000). Prinzipiell kommen auch andere Halogene für FSM in Frage, doch besitzt gerade Brom eine für diesen Einsatz ideale Bindungsenergie (Jod würde schon bei relativ niedrigen Temperaturen reagieren, Fluor wäre zu stabil).

Ein Hauptgrund für diese Effektivität liegt in der Wirkungsweise halogenierter FSM, die sich in der Gasphase vollzieht. Wird das mit FSM versehende Material erhöhten Temperaturen ausgesetzt, werden schwach-aktive und leicht flüchtige Halogenradikale gebildet. Diese Radikale, vornehmlich Brom, reagieren mit Edukten (Wassersoff- und Hydroxylradikalen) des Radikalkettenmechanismus der Flamme zu Halogenwasserstoff und energieärmeren Radikalen. Diese entstandenen Produkte haben zusätzlich einen Verdünnungseffekt auf die brennbaren Gase. Dies hat zur Folge, dass die Radikalkettenreaktion des Verbrennungsprozesses gehemmt bzw. deren Teilreaktionen unterbrochen werden, da Edukte abgefangen und der Reaktion entzogen werden. Der Halogenwasserstoff reagiert weiter mit neuen Wasserstoff- oder Hydroxylradikalen zu elementarem Wasserstoff oder Wasser ab, wobei das Halogenradikal wieder aus dieser Reaktion hervorgeht und den Kreislauf von neuem beginnen kann (Ausführliche Beschreibung der Reaktion siehe Fitz 2007).

Durch die Wirkung in der Gasphase sind halogenierte organische FSM universell einsetzbar, da sie nicht essentiell auf das Trägermaterial angewiesen sind, wie es bei anderen FSM und deren Wirkmechanismen der Fall ist (z.B. „Carbonisierung“ etc.). Ein weiterer Vorzug der Gasphasenreaktion ist, dass nur relativ geringe Mengen des FSM benötigt werden (EFRA 2000).

Die halogenierten organischen FSM werden den Trägermaterialien, vornehmlich Thermoplasten, bereits während der Polymerisierung (Rohpolymer) „additiv“ beigemischt, wobei sie im Gegensatz zu „reaktiven“ FSM nicht kovalent mit der Matrix verbunden sind. Dadurch können sie in der Gebrauchs- und Nachgebrauchsphase leichter als reaktiv gebundene FSM aus der Matrix durch Diffusionsprozesse freigesetzt werden. Hierin liegt unter Umweltgesichtspunkten ein systematischer Nachteil der additiven FSM (Ahrens, Böhm et al. 2003).

Eine der bedeutendsten Quellen für den Eintrag in die Umwelt stellen bereits die FSM-produzierenden und verarbeitenden Industrien dar. Frisch gefertigte Kunststofferzeugnisse wie Gehäuse für elektrische oder elektronische Geräte und andere Formbauteile müssen ausdampfen, gegebenenfalls gewaschen werden. Gleiches gilt für die mit FSM behandelten Textilien für die Möbel- und Autoindustrie. Insbesondere durch die Waschvorgänge gelangen große Lasten der persistenten Verbindungen in die Abwassersysteme und schließlich über die Vorfluter in die Umwelt (Watanabe und Sakai 2003). Signifikat erhöhte Konzentrationen von FSM wurden nach Einleitungsstellen der genannten Industrien im Wasser und im Sediment nachgewiesen (Sellström, et al. 1998). Somit gelangen also schon vor der eigentlichen Gebrauchsphase FSM aufgrund der additiven Natur ihrer Verarbeitung in die Umwelt.

Auch während der Gebrauchsphase migrieren additive FSM aus den elektrischen und elektronischen Produkten in ihre Umgebung und gelangen adsorbiert an Stäuben und Partikeln (Tamade Y. 2002) zunächst in die Raumluft. Mit den üblichen Reinigungen von Büros und privaten Haushalten finden sich die FSM in den Abwassersystemen und schlussendlich in den kommunalen Kläranlagen wieder. Da die dort ablaufenden Prozesse bzw. die Biologie diese persistenten Stoffe

Stand des Wissens

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Abb. 2: PBDE-Struktur mit 10 Substitutionsstellen

nicht abbauen können, verbleiben die FSM in den Klärschlämmen (Oberg, Warman et al. 2002), oder gelangen über die Vorfluter in die Umwelt. Eine weitere Problematik im Zusammenhang mit dem belasteten Klärschlamm tut sich auf, wenn dieser als mineralischer Dünger in der Landwirtschaft verwendet wird, da damit enorme diffuse Quellen erzeugt werden (Clarke, Porter et al. 2008).

Eine weitere diffuse Quelle für den Eintrag bromierter FSM in die Umwelt stellen Deponien dar, in denen noch, vor der Erlassung entsprechender Gesetze, ausgediente elektrische und elektronische Geräte eingelagert wurden. Somit ist das Problem in der Nachgebrauchsphase noch immer präsent. Auch hier migrieren FSM über Diffusionsprozesse aus ihrer Polymer-Matrix in ihre Umgebung und gelangen adsorbiert an Partikel über die Wasserwege in die Umwelt (Watanabe und Sakai 2003). Alte Deponien stellen folglich ein noch lang anhaltendes Emissionspotential an Gruppen von FSM dar, die schon besseren Wissens nicht mehr Stand der Technik sind, jedoch für noch andauernde Funde in der Umwelt sorgen können.

Auf diese Weisen in die Umwelt eingetragen, gelangen die Schadstoffe über die Flüsse letztendlich in die Weltmeere, wo sie aufgrund ihrer Eigenschaften in die Nahrungsnetze aufgenommen werden.

Im Folgenden werden zwei für die vorliegende Master Thesis relevante Gruppen bromierter FSM betrachtet und genauer auf deren Verwendung, physikalisch-chemischen Eigenschaften und deren daraus resultierendes Verhalten in der Umwelt eingegangen.

2.2.1 Polybromierte Diphenylether (PBDE) Struktur: Die Grundstruktur der PBDE bilden zwei Benzolringe, die über ein Sauerstoffatom verbunden sind (der C-O-C Bindungswinkel beträgt ca. 120°) und damit einen Ether darstellen. Es existieren 10 Substitutionsstellen wo ein Bromatom ein Wasserstoffatom ersetzen kann, was zu

unterschiedlichen Bromierungsgraden der Moleküle führt. Der Bromierungsgrad wird als lateinisches Zahlwort als Vorsilbe kenntlich gemacht. Abhängig von Art und Umfang der Substitution kommt es zu einer verdrillten Anordnung der Benzolringe, die der jeweiligen Struktur zum Teil unterschiedliche Eigenschaften verleiht.

Nomenklatur: Jeder Bromierungsgrad kann (abgesehen vom Deka-BDE) eine bestimmte

Anzahl von Isomeren bilden, welche mit stets gleicher Anzahl an Bromatomen die Benzolringe an unterschiedlichen Stellen besetzt. Analog zu strukturähnlichen Verbindungen, wie z.B. PCB und PCDE, sind theoretisch 209 Kongenere möglich. Aufgrund dieser Analogie bot es sich an, für die Isomere und Kongenere die Nomenklatur nach K. Ballschmiter zu verwenden, welche er ursprünglich zur Bezeichnung der PCB entwickelt hatte (Ballschmiter und Zell 1980; Ballschmiter, Mennel et al. 1993). Die Systematik der Nomenklatur besteht darin, jedes Substitutionsmuster in aufsteigender Reihenfolge der Bromierungsgrade mit einer fortlaufenden Nummer von 1 bis 209 zu versehen. Diese Nomenklatur wurde von der „Internationalen Union für reine und angewandte Chemie“ (IUPAC) übernommen. Eine Liste der Substitutionsmuster und den korrespondierenden Nummern befindet sich im Anhang auf Seite 48.

Anwendung: Höherbromierte PBDE wurden und werden als additive Flammschutzmittel in einer Vielzahl von Kunststoffen verwendet. Die Vermarktung erfolgte nicht in Form von Reinsubstanzen, sondern stellte sich in Form von Mischungen dar, die sich aus verschiedenen Kongeneren zusammensetzten, da es sich um ein Syntheseprodukt handelt. Die drei erhältlichen Mischungen waren der Penta-, Okta- und Deka-BDE-Mix. Durch die Namensgebung wird deutlich, auf welchen

Polybromierte Dipehnylether (PBDE)

6

1.) Berechnet aus Standard-Atom Gewichten nach NIST 2.) (Braekevelt, Tittlemier et al. 2003) 3.) (Öberg 2002), experimentelle Werte bei 285 °K, k.A.= keine Angaben d. Autors

Bromierungsgrad die Synthese abzielte (de Boer, Allchin et al. 2001). Eine Übersicht ist in Tab. 1 gegeben. Tab. 1: Prozentuale Zusammensetzung und übliche Handelsnamen der BDE-Mischungen (de Boer, Allchin et al. 2001).

Tetra‐BDE Penta‐BDE Hexa‐BDE Hepta‐BDE Octa‐BDE Nona‐BDE Deka‐BDE Handelsnamen

Penta‐Mix 33,7% 54,6% 11,7% DE‐71, Daytex 115Okta‐Mix 5,5% 42,0% 36,0% 11,3% 2,1% DE‐79, Saytex 111Deka‐Mix 3,0% 97,0% DE‐83, DE‐83R, Saytex 102E

Verwendet wurden PBDE vor allem in folgenden Erzeugnissen, wobei sie mengenmäßig nicht im Spurenberich zugesetzt wurden, sondern 5-30 Gewichts-% des eigentlichen Trägermaterials ausmachen können (Esch 1994):

Gehäuse elektronischer Geräte (Butadien-Styrene) Platinen, Ummantelungen von Leitungen (Epoxide) Schäume, Isolierungen (Polyurethane, -ethylene) Textilien, Beschichtungen (KFZ, Möbel, Sicherheitsbekleidung)

Aufgrund der weiter unten beschrieben Befunde wurde die Verwendung von zwei PBDE-Mischungen wieder verboten. Mit dem Erlass der EU-Richtlinie 2002/95/EC vom August 2002 durfte der Penta-Mix nicht mehr als FSM verwendet werden, ab 2006 durfte diese Mischung auch kein Bestandteil mehr der sich im Umlauf befindenden Produkte sein (was auch die Einfuhr entsprechender Güter betraf) (Prevedouros, Jones et al. 2004). Mit der Richtlinie 2003/11/EG vom Februar 2003 wurde der Erlass quasi auf den Okta-BDE Mix ausgedehnt, der seither auch nicht mehr verwendet werden darf (2003/11/EG 2003).

Einzig der Deka-Mix darf noch ersatzweise verwendet werden, auch wenn eine in der Diskussion stehende mögliche Debromierung unter Umweltbedingungen zu niederen Kongeneren noch nicht ausreichend geklärt wurde (Law 2006).

Eigenschaften: PBDE gelten als persistente Verbindungen, da sie resistent gegenüber Säuren und Basen, sowie Reduktions- und Oxidationsmitteln sind. Auch gegenüber einem gewisses Maß an Licht (UV) und Wärme (bis ca. 50 °C bis die Zersetzung beginnt, was aber in der Natur quasi nicht vorkommt (Rahman, Langford et al. 2001)) weisen sie ein relativ stabiles Verhalten auf (Allchin, Law et al. 1999). Es wurde eine hohe Bindungsaffinität zu Partikeln beobachtet, die mit steigendem Bromierungsgrad zunimmt (Law 2006). Eine weitere wichtige Eigenschaft ist ihre hohe Lipophilie, welche insbesondere für das Verhalten in der Umwelt (Bioakkumulation) von Bedeutung ist. Tab. 2: Stoffeigenschaften ausgewählter PBDE-Kongenere

Kongener # Masse 1.) [g/mol] log K ow2.) Dampfdruck3.) [log Pa]

Tri-BDE-28 406,90 5.94 ± 0.15 ‐1,69Tetra-BDE-47 485,79 6.81 ± 0.08 ‐2,19Penta-BDE-99 564,69 7.32 ± 0.14 ‐2,87Penta-BDE-100 564,69 7.24 ± 0.16 ‐2,66Hexa-BDE-153 643,58 7.90 ± 0.14 ‐3,46Hexa-BDE-154 643,58 7.82 ± 0.16 ‐3,19Hepta-BDE-183 722,48 8.27 ± 0.26 k.ADeka-BDE-209 959,17 k.A. ‐5,80

Die log KOW-Werte (logarithmierte Verteilungskoeffizienten zwischen Oktanol und Wasser) in Tab. 2 stellen ein Maß für die Lipophilie da, welche ebenfalls mit steigendem Bromierungsgrad zunimmt, wohingegen die Wasserlöslichkeit aber auch der Dampfdruck mit steigender Bromierung abnehmen (Boon, Lewis et al. 2002).

Stand des Wissens

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1.) (Boon, Lewis et al. 2002), 2.) (Fangstrom, Athanasiadou et al. 2005), 3.) (Haglund, Zook et al. 1997), 4.) (Kalantzi, Hall et al. 2005) 5.) (Vetter, von der Recke et al. 2007), k.A.= keine Angaben d. Authors, * = Angaben in ng Kg ww (wet weight)

Durch ihre Strukturähnlichkeit zu den PCB nimmt man für die PBDE einen ähnlichen Werdegang und ähnliches Verhalten in der Umwelt an. Generell gilt dabei, das höherbromierte Kongenere, also die, die vornehmlich als technischen Mischungen verwendet wurden, über eine geringere Mobilität in der Umwelt verfügen als niederbromierte Kongenere. Mögliche Gründe dafür sind die geringere Flüchtigkeit, die stärkere Bindungsaffinität zu Partikeln und die schlechtere Wasserlöslichkeit. Trotz der im Verhältnis geringeren Lipophilie neigen die geringer bromierten Kongenere eher zur Bioakkumulation, was wahrscheinlich mit der Größe der Moleküle zusammenhängt, da anzunehmen ist, dass sie aus sterischen Gründen besser resorbierbar sind (Watanabe und Sakai 2003).

Aus den oben beschriebenen Eigenschaften ergibt sich, dass sich PBDE über die Nahrung in den Lebewesen der aquatischen und marinen Ökosysteme anreichern, vorwiegend in fetthaltigeren Geweben (Bioakkumulation). So wurden PBDE bereits in einer Vielzahl verschiedener Biota festgestellt (siehe Tab. 3), woraus eine gewisse „Allgegenwärtigkeit“ der Schadstoffe zu erkennen ist (Allchin, Law et al. 1999). Tab. 3: Auswahl an PBDE-Befunden in Biota des marinen Nahrungsnetzes, Angaben in [ng/g lw] (lipid weight)

Spezies Ort BDE-28 BDE-47 BDE-99 BDE-100 BDE-153 BDE-154

Eissturmvogel (Fulmarus glacialis ) 2.) Faroe Inseln k.A. 8,4 3 2,3 1,2 4Miesmuschl (Mytilus edulis )* 5.) Trondheim Fjord k.A. 140 82 k.A. k.A. k.A.Seestern (Asterias rubens ) 1.) Nordsee 0,6 22 9 23 3 9

Einsiedler Krebs (Pagurus bernhardus ) 1.) Nordsee 1,4 38 16 15 3,1 10Schrimp 1.) Nordsee 2,6 37 5,1 6,9 0 3,9Herring 1.) Nordsee 1,9 37 12 9,2 0,9 1,5

Dorsch (Gadus morhua ) 1.) Nordsee 2,7 43 6,3 13 0 3,9Schweinswal (Phocoena phocoena ) 1.) Nordsee 22 864 406 242 149 178

Seehund (Phoca vitulina ) 1.) Nordsee 9,7 1236 396 82 98 21Kegelrobbe (Halichoerus grypus ) 4.) Nordsee 1,9 210 16 21 11 8

Ringelrobbe (Phoca hispida botnica ) 3.) Ostsee k.A. 256 33 61 9,5 k.A.

Ein weiteres Phänomen ist die Anreicherung der PBDE (und anderer Schadstoffe) über die Trophiestufen der Nahrungsnetze der marinen Umwelt. Dies führt zu erheblichen Steigerungen der Schadstofflasten bei den höheren Säugetieren die am Ende der „Nahrungskette“ stehen (Biomagnifikation), was auch aus den Konzentrationen aus Tab. 3. hervorgeht.

Die gefundenen Muster entsprechen nicht derer, die man aufgrund der verwendeten kommerziellen Gemische vermuten würde, was vermutlich an der relativ schlechten Bioverfügbarkeit der höher bromierten Kongenere liegt (Allchin, Law et al. 1999). Des Weiteren könnte dies auf einen möglichen metabolischen Abbau von einigen Organismen im Nahrungsnetz hindeuten, die in der Lage sind, höhere Kongenere zu debromieren (Biotransformation), wobei es ebenso zu einer Verschiebung des Musters führen würde (Rahman, Langford et al. 2001).

Die relativen Konzentrationen der gefundenen Hauptkomponenten nimmt generell in folgender Reihenfolge ab: BDE-47 > BDE-99, BDE-100 > BDE-153, BDE-154 > BDE-28. BDE-47 ist in Biota häufig das abundanteste Kongener mit über 50% der Gesamtsumme (Weijs, Dirtu et al. 2009). Auch wenn die PBDE als nicht akut toxisch gelten, stehen sie unter Verdacht endokrin wirksame Substanzen (Disruptoren) zu sein, womit sie das Hormonsystem höherer Lebewesen empfindlich stören können. Das pharmakologische Verhalten von PBDE kann dahingehend zusammengefasst werden, das mit Zunahme der Bromatome pro Molekül eine geringere Resorption, eine kürzere Halbwertzeit und eine abnehmende potentielle Bioakkumulation einhergeht (Hardy 2002).

Polybromierte Biphenyle (PBB)

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1.) (Hardy 2002) 2.) (WHO 1994)

2.2.2 Polybromierte Biphenyle (PBB) Struktur: Das Grundgerüst der PBB ist analog zu den PCB durch zwei kovalent mit einander verbundenen Benzolringen gegeben, die wiederum zehn Substitutionsstellen für Wasserstoff- oder

Bromatome aufweisen (siehe Abb. 3). Im Gegensatz zu den PBDE, wo die Benzolringe über ein Sauerstoffatom verbunden sind, können hier die Benzolringe in eine planare Stellung gehen, wenn die Substitutionsstellen 2 und 6, bzw 2‘ und 6‘ entsprechend substituiert sind. Analog zu den PCB, PBDE etc. existieren hier verschiedene Bromierungsgrade und deren Isomere, was zu den 209 Kongeneren führt.

Abb. 3: PBB-Struktur mit 10 Substitutionsstellen

Nomenklatur: Auch die 209 PBB-Kongenere werden nach der IUPAC-Nomenklatur benannt, eine Liste mit allen Substitutionsmustern und korrespondierender Nummer ist im Anhang auf Seite 48 gegeben. Der Bromierungsgrad wird auch hier mit dem lateinischen Zahlwort als Vorsilbe kenntlich gemacht. Anwendung: PBB wurden seit den 1970er Jahren als additives FSM in einer Vielzahl an Kunststoffen und Textilien eingesetzt (Berger, Vetter et al. 2002). Ähnlich der PBDE wurden PBB in drei kommerziellen Gemischen vertrieben, der Hexabrombiphenyl (HexaBB)-Mischung, der Okta- und DekaBB-Mischung, die hauptsächlich in Thermoplasten verarbeitet wurden. In den USA machte die HexaBB-Mischung ca. 83% der verwendeten PBB-Produkte aus (Hardy 2002). Bei den Mischungen handelt es sich ebenfalls um Syntheseprodukte, wodurch verschiedene Bromierungsgrade und Isomere in den Umlauf kamen. Im Laufe der Produktionszeit konnte durch verschiedene Untersuchungen gezeigt werden, dass sich das Muster der prozentualen Zusammensetzung der Isomere in den technischen Gemischen verändert hatte (WHO 1994). Tab. 4: Prozentuale Zusammensetzung und übliche Handelsnamen der technischen PBB-Mischungen

Die Produktionsvolumina der Okta- und DekaBB-Mischungen machte jedoch nur einen kleinen Teil vom Gesamtvolumen an PBB aus, in den USA betrug dieser ca. 13% (Hardy 2002). Im Jahre 1973 ereignete sich bei Michigan, USA, ein dramatischer Umweltunfall, als ca. eine halbe Tonne reine HexaBB-Mischung versehentlich Tierfutter beigesetzt wurde. Die Folgen waren eine großflächige Kontamination von Nutztieren und deren Produkte, bis hin zu den Menschen in der Region. In notgeschlachteten Tieren wurde eine Belastung von bis zu 1 mg/g (lw) festgestellt (Di Carlo, Seifter et al. 1978; WHO 1994).

Wenige Jahre nach diesem Zwischenfall wurde die PBB-Produktion in den USA von Seiten der Hersteller freiwillig eingestellt. Einige Jahre nach dem Produktionsstopp in den USA wurde auch die Herstellung in Europa weitgehend heruntergefahren. Der DekaBB-Mix wurde noch bis zum Jahr 2000 in Frankreich hergestellt (Hardy 2002). Mit der Direktive 2002/95/EG wurde dann im Januar 2003 ein totales Verwendungsverbot von PPB erlassen, welches auch die in die EU eingeführte Produkte mit einschloss (2002/95/EG 2003).

Eigenschaften: Die Untersuchungen zu den physiko-chemischen Eigenschaften von PBB sind im Gegensatz zu PBDE, PCB, etc. wesentlich unvollständiger oder schwerer zugänglich. Häufig sind nur Eigenschaften der Mischungen zu finden.

PBB weisen generell die nach der Stockholm-Konvention definierten Kriterien von POP auf (de Wit, Alaee et al. 2006). Die Vier Hauptkriterien beinhalten:

Stabilität über einen langen Zeitraum (in der Umwelt) Weiträumige geographische Ausbreitung durch Wind- und Wasserbewegung

Tetra-BB Penta-BB Hexa-BB Hepta-BB Octa-BB Nona-BB Deka-BB Handelsnamen

HexaBB-Mix 1.) 4% 63% 33% Firemaster BP-6, Firemaster FF-1OktaBB-Mix 2.) 1% 27% 72% Bromkal 80, FR 250 14ADekaBB-Mix 2.) 0,30% 2,90% 96,80% Flammex-B, Adine 0102

Stand des Wissens

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1.)(Braune, Mallory et al. 2007), 2.) (Vetter, von der Recke et al. 2008), Werte als Median, 3.)(von der Recke and Vetter 2008), 4.) (de Boer, Wester et al. 1998)

Spezies Ort BB-153 BB-154 BB-155

Elfenbeinmöwe (Pagophila eburnea ) 1.) Kanad. Arktis 9.6Ei, Seeadler (Haliaeetus albicilla ) 2.) Norwegen 6.1 3.2 3.6Ei, Goldadler (Aquila chrysaetos ) 2.) Norwegen 1.0 0.4 0.0Ei, Wanderfalke (Falco peregrinus ) 2.) Norwegen 3.9 1.1 7.6Ei, Zwergfalke (Falco columbarius ) 2.) Norwegen 0.8 0.1 0.4

Ei, Hühnerhabicht (Accipiter gentilis ) 2.) Norwegen 0.7 0.3 0.5Seehund (Phoca vitulina ) 3.) NordseeSeehund (Phoca vitulina ) 4.) Nordsee 13 - 16

∑HexaBB: 76 bis 100

Anreicherung im Fettgewebe lebender Organismen Toxische Wirkung auf Menschen und Tiere (UNEP 2001)

Zu PBB-Gehalten in Umweltproben existieren im Gegensatz zu den besser untersuchten Schadstoffen wie PBDE oder PCB nur relativ wenige aktuelle Informationen. Oft beziehen sich die Untersuchungen auf nur wenige Kongenere. Dennoch wurde und wird diese Substanzgruppe weltweit in vielen verschiedenen Biota festgestellt, u.a. in der Arktis (de Wit, Alaee et al. 2006; Braune, Mallory et al. 2007), siehe Tab. 5. Tab. 5: PBB-Konzentrationen (Hexa-Kongenere) in verschiedenen Biota, Angaben in [ng/g lw] (lipid weight)

Dies zeigt deutlich, das PBB in der Umwelt über einen langen Zeitraum stabil sind und einige Kongenere über weite Strecken transportiert werden können. Ein weiteres Indiz für ihre Langlebigkeit ist die Tatsache, dass die Befunde in Umweltproben von den HexaBB-Kongeneren dominiert werden (von der Recke und Vetter 2008), obwohl die technischen HexaBB-Gemische schon seit über 30 Jahren nicht mehr hergestellt werden. Der Verdacht von der Fähigkeit der Bioakkumulation von PBB in fetthaltigen Geweben von Lebewesen bestätigt sich ebenfalls mit den Befunden in den Umweltproben (siehe Tab. 5).

Nach dem Michigan-Zwischenfall wurden die PBB-Mischungen in toxikologischer Hinsicht etwas umfassender untersucht: Analog zu den PCB sind auch bei den PBB die planaren Kongenere von toxikologischer Relevanz, da sie mit dieser sterischen Konfiguration an den AH-Rezeptor binden und damit zelluläre Prozesse empfindlich stören könnten (WHO 1994).

PBB interagieren auch mit dem endokrinen System, da sich im Tierversuch zeigte, dass sich Gehalte von Steroidhormonen veränderten, wenn Versuchstiere PBB ausgesetzt waren. Bei höhere Dosen über längere Zeit zeigte sich ein vermehrtes Aufkommen von Leberkarzinomen und es wurden Beeinträchtigungen der Fortpflanzungsfähigkeit festgestellt (Darnerud 2003).

Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS)

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2.3 Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS)

2.3.1 GC/MS Hintergrund Gaschromatographen gekoppelt mit Massenspektrometern (GC/MS) sind in den meisten Fällen die Analysengeräte der Wahl in diesem Bereich der Schadstoffanalytik. Im Folgenden werden kurz die diesen Instrumenten zugrundeliegenden Prinzipien zusammengefasst. Für eine detaillierte Beschreibung der Vorgänge und Funktionen siehe (Fitz 2007).

Wie alle chromatographischen Methoden wird die GC zur Trennung der Analyte eingesetzt, die darauf beruht, dass das Stoffgemisch, transportiert durch die gasförmige mobile Phase, mit der stationären Phase der Säule in Wechselwirkung tritt. Da die stationäre Phase hier eine Flüssigkeit ist, stellt sich über einen Diffusionsprozess ein Verteilungsgleichgewicht der Analyte zwischen mobiler und stationärer Phase ein, worauf auch der Begriff der „Verteilungschromatographie“ beruht. Durch die Lösung der Substanzen in der stationären Phase sind sie dem Einfluss des Trägergases nicht mehr ausgesetzt, sie verweilen substanzspezifisch lange in der flüssigen Phase, bevor sie zurück ins Gas diffundieren, worauf der Effekt der Trennung beruht. Die Retentionszeit der Analyte ist im Wesentlichen von deren physikalischen Eigenschaften wie z.B. Dampfdruck und Polarität abhängig. Mit zunehmender Ähnlichkeit der Analyte zur Natur der stationären Phase nimmt die Retentionszeit zu.

Je nach Anwendung existieren verschiedene Säulentypen, die sich im Wesentlichen durch die Art der Zusammensetzung (funktionelle Gruppen) bzw. der daraus resultierenden Polarität der stationären Phase unterscheiden. Weitere Parameter sind: Schichtdicke der stationären Phase, Innendurchmesser und Länge der Säule. Diese Parameter müssen auf die Analyte abgestimmt werden.

Wurden die Analyte chromatographisch durch den GC getrennt und eluieren zeitlich versetzt von der Säule, muss ein Detektor diese Elutionen in elektrische Signale umwandeln, mit Hilfe derer es dann möglich ist, qualitative und quantitative Aussagen über die Substanzen machen zu können. In der Gaschromatographie sind eine Reihe von Detektoren in der Lage ausschlaggebende Zusatzinformationen der Analyte zu liefern, wozu auch das Massenspektrometer (MS) zu zählen ist.

Allgemein ist die Massenspektrometrie ein physikalisches Verfahren, das Ionen, die im Vakuum hinreichend stabil sind, nach ihrem Verhältnis von Masse zur Ionenladung (m/z) trennt. Da im Falle der hier betriebenen Analytik meistens eine einfache Ionenladung vorliegt (z = 1), wird häufig auch nur von Massen gesprochen. Sowohl zur Elementbestimmung als auch zur Molekülanalytik stellt die Massenspektrometrie eine leistungsstarke Technik dar. Der massenselektive Detektor (MSD) gehört zu den „destruktiven“ Detektoren, da die Substanzen ionisiert werden müssen um ein elektrisches Signal zu erzeugen, und diese dann nicht unbeschadet aus dem Detektor wieder hervorgehen, wie es z.B. beim Fotometer der Fall ist.

Abb. 4: Schematischer Aufbau eines Quadrupol-Massenspektrometer (Quelle: selbst erstellte Zeichnung)

Der prinzipielle Aufbau besteht aus einem Einlasssystem, einer Ionisierungseinheit (Ionenquelle), dem Trennsystem (Massenfilter) und der Detektionseinheit. Diese Komponenten werden im Folgenden kurz erläutert, da einige für den Abschnitt 3 (Methodenentwicklung) relevant sind.

Stand des Wissens

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Durch das separat zu beheizende Einlasssystem (Interface) gelangen die Analyte vom GC gemäß ihrer Trennung in das Vakuum des Massenspektrometers und zwar direkt in die Ionenquelle. Hier werden die Substanzen je nach verwendeter Technik in positive (EI, PCI) oder negative (NCI) Ionen überführt. Die Techniken haben gemein, dass von einem Filament Elektronen emittiert und mittels eines elektrischen Feldes beschleunigt werden, welche dann direkt (EI) oder über Weiterreaktionen (CI) mit den Analyte reagieren.

Im Falle der so genannten Elektronenstoß Ionisierung (engl. ‘elektron impact ionization‘, EI) schießen die beschleunigten Elektronen ein moleküleigenes Elektron aus deren Orbital, wodurch ein positiv geladenes Molekülion entsteht. Bei diesem direkten Beschuss kommt es auch zu Bindungsbrüchen am Molekül, da der Energieüberschuss in Form von Schwingungen umgesetzt wird. Das Molekül zerbricht sehr gut reproduzierbar in ionisierte substanzspezifische Fragmente. Diese Zusatzinformationen macht man sich bei der Substanzidentifikation zu nutze.

Nicht ganz so gut reproduzierbar, doch von großer Bedeutung ist die so genannte chemische Ionisierung (engl. ‘chemical ionization‘ CI). Diese chemische Ionisierung der Analyte läuft auf einem wesentlich geringeren Energieniveau ab als bei der EI, wodurch das Maß der Fragmentierung ebenfalls niedriger ist und es zu einer höheren Abundanz des ionisierten Muttermoleküles kommt. Hier kommt ein so genanntes Reaktantgas zum Einsatz, welches über einen Ringspalt am Interface in die Ionenquelle eingeleitet wird und im Verhältnis zu den Analyten in sehr hoher Konzentration in der Quelle vorliegt. Am verbreitetesten für die CI ist Methan als Reaktantgas, alternativ werden iso-Butan, Ammoniak und Kohlendioxid eingesetzt. Unterschieden wird hier zwischen negativer und positiver CI, wonach sich die Spannungspotentiale der anderen MS-Komponenten richten. Da für die Master Thesis im Wesentlichen die NCI von Relevanz ist, soll auf den PCI-Modus nicht weiter eingegangen werden.

Gegenüber der EI und PCI bietet die NCI eine empfindlichere Ionisierung der betrachteten Analyte. Ein Grund für die höhere Empfindlichkeit in diesem Modus ist die vorwiegende Ionisierung von Molekülen mit einer hohen Elektronenaffinität. Diese Affinität besitzen vornehmlich Moleküle mit elektronegativen Substituenten, wie z.B. Halogenen, die durch eingefangene Elektronen (Elektronen-Einfang-Reaktion) in Anionen überführt werden. Bei der CI kommt es zunächst zu Reaktionen zwischen emittierten Elektronen und dem Reaktantgas (Methan), bei welcher sich ein Gleichgewicht einstellt. Analog zum EI-Modus werden in der NCI den Gas-Molekülen Elektronen herausgeschossen (siehe Gleichung (I)) unter Bildung von so genannten thermischen Elektronen. Die eigentliche Ionisierung der Analyte findet dann durch eine Weiterreaktion mit den thermischen Elektronen statt.

(I) CH4 + e- (200 eV) CH4

+ + 2e-thermisch

(II) MX + e- thermisch MX-

Der Primärmechanismus der NCI wird von der Elektronen-Einfangreaktion (engl. ‘electron capture reaction‘) dargestellt. Die thermischen Elektronen aus Gleichung (I) werden von den Analyten eingefangen, wodurch es zur Bildung eines Molekül-Anions kommt (siehe Gleichung (II)). Doch auch in der NCI kommt es zu Fragmentierungen der Analyte, die sich im Wesentlichen durch die Abspaltung von Halogenatomen auszeichnet (nach der Dissoziative-Elektronen-Einfangreaktion und Ionenpaar-Bildung, siehe Fitz 2007).

Die so gebildeten Ionen werden anschließend mit einem der Ionenladung entsprechenden elektrischen Feld in die gewünschte Flugrichtung beschleunigt. Eine so genannte Ionenoptik (‘ion focus‘, ‘entrance lens’, siehe Abb. 4) fokussiert den Ionenstrahl auf den Eintrittsspalt des Massenseparationssystems. Im diesem Massenfilter werden die ionisierten Analyte und deren Fragmente nach ihrem m/z-Verhältnis getrennt. Eines der am häufigsten verwendeten Massenfilter ist der so genannte Quadrupol-Massenfilter, welcher im Vakuum (bis 10-4 Pa) bzw. im Ultrahochvakuum (<10-5 Pa) arbeitet. Der Quadrupol ist aus vier konzentrisch parallel zueinander angeordneten Stabelektroden aufgebaut die gegenüberliegend paarweise an eine variable, jeweils entgegengesetzt gepolte Gleichspannung angeschlossen sind. Zusätzlich wird eine modulierbare Hochspannungsfrequenz überlagert, sodass nur Ionen gleicher m/z (Filtereffekt) auf stabilen Wellenbahnen den Filter passieren (Cammann 2001).

Schließlich gelangen die den Filter passierenden Analyt-Ionen in die Detektionseinheit, wo sie einen schwachen Stromfluss erzeugen (bewegte Ladungen). Dieser Stromfluss wird mittels eines

Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS)

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Elektronenvervielfachers (Dynode) über eine Elektronenkaskade verstärkt und trifft am Ende auf eine Kollektorelektrode, wo er dann als elektronisches Signal weiter verarbeitet werden kann.

2.3.2 Instrumentierung Für die Untersuchungen von bromierten FSM findet man in der Literatur sehr häufig den Einsatz von Single-Quadrupol-Massenspektrometern (diese sind den ‘low resolution mass spectrometry‘, LRMS zu zuordnen), betrieben sowohl im NCI- als auch im EI-Modus, (Herzke, Kallenborn et al. 2002; Bayen, Lee et al. 2004; Bethune, Julshamn et al. 2005; Stapleton 2006; Fair, Mitchum et al. 2007; Luo, Wong et al. 2007).

Wie oben beschrieben stellt sich der NCI-Modus im Gegensatz zur EI für die Untersuchung halogenierter Verbindungen als die empfindlichere Option für Single-Quadrupol-MS dar. Insbesondere bei bromierten FSM macht man sich das zu Nutze, da Bromatome im NCI ein sehr intensives Signal erzeugen. Sehr häufig werden die beiden stabilen Bromisotope 79Br und 81Br (m/z = 79 bzw. 81) im SIM-Modus (engl. ‘selected ion monitoring‘) zur Quantifizierung herangezogen, wobei Bestimmungsgrenzen, je nach Kongener, im Bereich von 0,1 bis 1,0 ng/g lw (lw = lipid weight) erreicht werden (Boon, Lewis et al. 2002; Fangstrom, Athanasiadou et al. 2005; Stapleton, Dodder et al. 2006; Wolkers, Hammill et al. 2006). Nachteile dieser Wahl der SIM-Massen liegt im Wesentlichen darin begründet, dass durch die Vielzahl von bromierten Verbindungen in Umweltproben (Vetter, von der Recke et al. 2007) Bromatome nicht sehr spezifisch sind. Auftretende Koelutionen können nicht unterschieden werden, wodurch es leicht zu einer Verfälschung von Ergebnissen kommen kann. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Anwendung der präzisionssteigernden Isotopenverdünnungsanalyse (IVA) nicht möglich ist, da bei dieser (im Falle der PBDE und PBB) standardmäßig mit 13C-Isotopen gearbeitet wird, und keine weiteren stabilen Bromisotope existieren.

Ein Ansatz, der diesen Missständen Abhilfe verschafft, ist das Messen im NCI auf den Massenspuren der höheren Analyt-Fragmente, welche unter Standardbedingungen nur 0,1 – 15 % der Br- -Intensitäten ausmachen. Unter für diese Fragmentmassen optimierten NCI-Bedingungen ist die Möglichkeit einer spezifischeren Erfassung gegeben, die auch die IVA mit einschließt und das Problem der Koelutionen löst (Ackerman, Wilson et al. 2005; Fitz 2007).

Alternativ zu den Single-Quadrupol-MS werden auch empfindlichere Geräte mit höherer Auflösung verwendet, die eine exaktere Bestimmung der Masse ermöglichen und damit eine höhere Selektivität erreichen (‘high resolution mass spectrometry‘, HRMS). Mit hochauflösenden Massenspektrometern werden im Falle von PBDE Nachweisgrenzen im Bereich von 0,0001-0,01 ng/g ww (ww = wet weight) erreicht, womit diese deutlich unter denen der LRMS liegen. (Haglund, Zook et al. 1997; Ikonomou, Rayne et al. 2002; Christensen, MacDuffee et al. 2005; Fernandez, Araque et al. 2007). Ein Vorteil dieser Geräte ist, dass sich durch die höhere Empfindlichkeit der EI-Modus verwenden lässt, der mehr Informationen über die Struktur der Analyte liefert als die NCI, was aber auch nur im Scanmodus von Bedeutung ist. Abgesehen von den höheren Anschaffungs- und Instandhaltungskosten, gelten HRMS-Methoden als aufwendiger zu entwickeln und weniger robust im Vergleich zu LRMS (van Leeuwen und de Boer 2008). Eine weitere Alternative stellen so genannte Tandem MS, bzw. MSn-Geräte , wie z.B. ’ion trap’ dar, die auch in der Analytik von POP benutzt werden (Allchin, Law et al. 1999; Johnson-Restrepo, Kannan et al. 2005; Luo, Wong et al. 2007) (Luross, Alaee et al. 2002). Bei dieser Variante sind mindestens zwei MS hintereinander geschaltet, um durch weitere Fragmentierungen (induziert durch ein Stossgas in einer den MS zwischengelagerten Kollisionszelle) und Filterung der gewünschten Ionen eine höhere Selektivitäten zu erreichen. Doch auch die Robustheit von MSn-Methoden wird eher unter der von LRMS-Methoden angeordnet (van Leeuwen und de Boer 2008).

Weitere kritische Größen der Instrumentierung in der Analytik bromierter FSM sind die Injektionstechnik und die Wahl der analytischen Säule der GC-Trennung, die der MS-Detektion vorgeschaltet sind. Gängige Injektions-Varianten sind der so genannte Verdampfungsinjektor (auch Split-splitless-Injektor genannt), der PTV (Programmed Temperature Vaporizer) und die so genannte On-Column Injektion.

Bei den ersten beiden Varianten wird die Probe in flüssiger Form in den gläsernen Liner überführt, der sich entweder konstant auf hoher Temperatur befindet, sodass das Lösungsmittel der eingebrachten Probe unmittelbar verdampft wird, oder im Falle des PTV ein Temperaturprogram

Stand des Wissens

13

gefahren werden kann, welches erst das Verdampfen des Lösungsmittels, dann das der Analyte ermöglicht. Ist die Konzentration der Analyte zu hoch für die analytische Säule (Überladung) kann die Probe geteilt werden (engl. ‘split-mode‘), womit nur ein Bruchteil der Probe auf die Säule gelangt. Die On-Column Injektion bringt die flüssige Probe direkt auf die analytische Säule, von wo diese erst mit dem Temperaturprogramm des GC in die Gasphase gebracht und getrennt wird. Bei der Verwendung der On-Column Injektion ist eine hohe Reinheit der Probe erforderlich, da andernfalls die Säule durch Verschmutzung drastisch an Trennleistung verlieren kann.

Problematisch bei der Untersuchung der bromierten FSM ist weiter, dass die Analyte zur Anlagerungen an Oberflächen neigen. Durch die bauliche Beschaffenheit des Verdampfungs- bzw. des PTV-Injektors sind vor allem durch den Liner große Oberflächen gegeben, an denen es zur Anlagerung und damit zu Verlusten der Analyte kommt (Diskriminierung). Die On-Column Injektion stellt hier die verlustfreiere Variante dar, da hier den Analyten keine großen Oberflächen zur Anlagerung geboten wird (van Leeuwen und de Boer 2008). Mit der Verwendung einer Vorsäule können auch Proben aufgegeben werden, die noch Matrixbestandteile enthalten, da diese hier abgelagert nicht die analytische Säule erreichen. Auch bei den Vorsäulen gibt es Unterschiede in Material und Beschaffenheit, was näher in Fitz (2007) betrachtet wurde.

Die am häufigsten verwendete Kapillarsäulenart, die im Zusammenhang mit der Untersuchung bromierter FSM in der Literatur genannt wird, ist die, deren unpolare stationäre Phase zu 95% aus methylierten Polysiloxanen besteht, und zu 5% ein Phenolrest als weitere organische Komponente in die Vernetzung eingearbeitet wurde (Herzke, Kallenborn et al. 2002; Bayen, Lee et al. 2004; Stapleton, Dodder et al. 2006; Fernandez, Araque et al. 2007). Da es sich bei den betrachteten Analyten um zyklische Verbindungen handelt, ist durch den phenolischen Rest eine hinreichende Ähnlichkeit zu diesen gegeben, sodass die Diffusionsprozesse bzw. die sich einstellenden Gleichgewichte zu einer zweckmäßigen Trennung führen. Die Säulenart wird von verschiedenen Herstellern mit unterschiedlichen Bezeichnungen und z.T. Modifikationen vertrieben: DB5-MS, DB5-HT (Fa. J&W Scientific), RTX-5 (Fa. Restek GmbH), HP-5TA, DB-5 (Fa. Agilent Technologies).

FSM sind konzipiert, um bei sich erhöhenden Temperaturen ihre Wirkung zu entfalten, welche mit dem Zerfall (Abspaltung von Bromatomen vom Molekül) einhergeht. Dieser Temperaturempfindlichkeit muss bei der Säulenlänge Rechnung getragen werden, da im Wesentlichen diese Länge für die Aufenthaltszeit bzw. dem Ausgesetztsein höherer Temperaturen entscheidend ist. Werden die Analyte thermisch zersetzt kommt es zu erheblichen Signalverlusten, da die Edukte für die Zielfragmente bei der Ionisierung nicht mehr im vollen Umfang zur Verfügung stehen. Ein weiteres Kriterium ist die Filmdicke der stationären Phase, da sie bestimmt wie tief die Analyte in sie hinein diffundieren, was sich ebenfalls proportional zur Zeit vollzieht. Gewöhnlich werden 30 - 60 m Säulen (mit 0,25 mm Innendurchmesser und einer Filmdicke von 25 µm) für die Trennung der Kongenere niederen bis mittleren Bromierungsgrades eingesetzt (Korytar, Covaci et al. 2005). Für höherbromierte Kongenere werden allerdings kürzere Säulen (6 – 16 m) mit einer geringeren Filmdicke (0,1 µm) verwendet, da sich zeigte, dass die so reduzierte Aufenthaltszeit die Peakflächen vervielfachen kann, im Vergleich zu Säulen mit einer Länge von über 30 m (Kierkegaard, Sellström et al. 2009).

2.4 Probenaufarbeitung Da POP stark lipophile Substanzen sind, reichern sie sich vornehmlich in den Fettdepots von Organismen an. Sind diese Depots nicht vorhanden, findet die Anreicherung in Zellmembranen (Phospholipiden) statt. Die Targetanalytik von persistenten organischen Schadstoffen beginnt (nach der Probenahme) meist mit dem Homogenisieren der Probe (Biota), gefolgt von einer Extraktion, in welcher die Analyte von dem Großteil der Matrix abgetrennt werden. Nachgeschaltete Aufreinigungsschritte (Cleanup) sind unumgänglich für die weitere Analytik.

Die Extraktion ist eine Art Schlüsselelement der Probenaufarbeitung, da der damit produzierte Extrakt die Analyte erst zugänglich macht. Die Effizienz der Extraktion wird durch Parameter bestimmt wie der Wahl des Extraktionsmittels (Lösungsmittel), Dauer und Temperatur der

Extraktion, ggf. auch der Druck der Extraktionskammer und dem Maß, wie umfassend das Extraktionsmittel die Probe durchdringen kann. Für eine möglichst vollständige Extraktion der

Probenaufarbeitung

14

Analyte aus der Probenmatrix sollten diese Parameter optimiert werden (van Leeuwen und de Boer 2008).

Das Homogenisieren stellt sich häufig aus dem einfachen feinen Zerschneiden der Gewebeprobe dar (z.B. mittels Skalpell) mit anschließender Vermahlung (Mörser) mit getrocknetem und gereinigtem Na2SO4 (Ikonomou, Rayne et al. 2002; Bayen, Lee et al. 2004; Christensen, MacDuffee et al. 2005). Das Na2SO4 hat dabei zum Einen eine trocknende Wirkung (hygroskopisch) zum Anderen dient es als „Mahlhilfe“. In manchen Fällen werden auch Gewebeproben zusammen mit Na2SO4 in einem elektrischen „Labormixer“ homogenisiert (Haglund, Zook et al. 1997; Herzke, Kallenborn et al. 2002). Das Na2SO4 sorgt darüber hinaus im folgenden Extraktionsschritt für eine bessere Durchlässigkeit der Probe für das Extraktionsmittel, da es sich ja um einen oberflächenabhängigen Verteilungsprozess handelt.

Als gut erprobte und robuste Extraktionsmethode gilt die Extraktion nach Soxhlet. Sie wird im Kontext mit POP für eine große Bandbreite an Biota-Matrices eingesetzt, wie z.B. verschiedene Fett-, Muskel- und Lebergewebe von Säugern, Muscheln, Fisch, etc. Hierbei wurden sehr gute Wiederfindungsraten erreicht (Galceran, Santos et al. 1993; de Boer, Allchin et al. 2001; Hall, Kalantzi et al. 2003; Christensen, MacDuffee et al. 2005; Johnson-Restrepo, Kannan et al. 2005; Fernandez, Araque et al. 2007; Luo, Wong et al. 2007). Klare Vorteile dieser Methode sind deren Einfachheit, da keine komplizierten oder technisierten (teuren) Komponenten notwendig sind (nur ein gläserner Aufbau mit Heizpilz) sowie die relativ einfache Durchführung, auch im Routinebetrieb mehrerer parallel arbeitenden Extraktoren. Die Extraktionszeit ist relativ lang (6 bis 24 Stunden), doch könnte das, wenn über Nacht extrahiert wird, ein Stück weit kompensiert werden. Für unpolare lipophile Analyte würde ein unpolares Lösungsmittel (n-Hexan oder n-Pentan) ausreichen, bei welchen vor allem Triglyceride mit extrahiert werden und es zu einem fetthaltigen Extrakt kommt. Für leicht bis mittelpolare Analyte (z.B. niedrigbromierte PBDE) ist eine leichte Polarität (auch Semipolarität genannt) des Extraktionsmittels notwendig, was durch eine Mischung verschiedener Lösungsmittel erreicht werden kann. Damit gelangen auch die Phospholipide in den Extrakt. Verschiedene Untersuchungen (de Boer, Allchin et al. 2001) mit gemischten Extraktionsmitteln führten zu dem Ergebnis, dass eine Mischung aus n-Hexan : Aceton 1:1 (v/v) sich als am besten für eine quantitative Extraktion von PBDE eignen würde.

Eine Alternative zur Soxhlet-Extraktion stellt die „Pressurized Fluid Extraction“ (PFE) oder auch „Accelerated Solvent Extraction“ (ASE®, Handelsname der Fa. Dionex) dar (Herzke, Kallenborn et al. 2002; Kucklick, Struntz et al. 2002; Bethune, Julshamn et al. 2005; Stapleton 2006; Fair, Mitchum et al. 2007). Bei dieser Methode werden Probeneinwaagen zwischen 1 bis 5 g, homogenisiert mit dem 3 bis 5-fachen an Na2SO4, in so genannte Kartuschen gefüllt, die unter hohen Drücken (zwischen 8 bis ca. 14 MPa) und Temperaturen (50 – 110 °C) mit semipolaren Lösungsmittelgemischen mehrfach beaufschlagt werden. Vorteil dieser Technik sind vor allem die Automatisierbarkeit und der damit verbundene Probendurchsatz, da die Geräte mit bis zu 24 Proben parallel bestückt werden können, und die Dauer der Extraktion meistens unterhalb einer Stunde beträgt. Nachteile sind die hohen Anschaffungskosten und die gründliche Reinigung der Kartuschen, da sich Kontaminationen von einer Probe zur nächsten zeigten. Außerdem ergaben sich für niedrig bromierten Kongenere niedrige Wiederfindungsraten (< 60%) (van Leeuwen und de Boer 2008).

Eine weitere und technisiertere Extraktionsmethode, welche jedoch nicht allzu verbreitet zu sein scheint, ist der Mikrowellen Aufschluss (engl. ‘Microwave-assisted extraction‘, MAE). Bei dieser Methode wird Probenhomogenat (zwischen 2 bis 4 g) und Na2SO4 (ca. das 5-fache der Einwaage) in speziellen Druckgefäßen Mikrowellenstrahlung ausgesetzt. Durch erhöhten Druck und Temperatur (z.B 115 °C) findet ähnlich der PFE eine beschleunigte Extraktion statt. Je nach Gerät können 6 oder mehr Proben parallel extrahiert werden. Extraktionszeiten werden mit unter 30 Minuten angegeben (Bayen, Lee et al. 2004). Vorteilhaft erscheint neben den kurzen Extraktionszeiten der geringe Lösungsmittelverbrauch von 8 bis 25 mL einer semipolaren Lösungsmittelmischung. Mit dieser Methode wurden gute Wiederfindungsraten und Methoden-Präzisionen erzielt für BDE-47, BDE-99 und BDE-100 von 89 ± 8% bis 95 ± 14% (Vetter 2001; Bayen, Lee et al. 2004). Nachteilig sind die hohen Investitionskosten, welche sich jedoch im Routinebetrieb über den hohen Probendurchsatz und den geringen Mengen an Extraktionsmittel wieder wettmachen ließen.

Stand des Wissens

15

Neben diesen drei Hauptmethoden der Extraktion existieren noch weitere, die jedoch als weniger bedeutend eingeschätzt werden. Noch zu erwähnen ist die einfache Säulenextraktion, bei der die mit Na2SO4 homogenisierte Probe (mit Einwaagen zwischen 0,5 und 25 g (ww)) in eine Extraktionssäule (eine Glassäule mit Nutsche und Hahn) gegeben wird, in der sich um die 300 mL eines semipolaren Extraktionsmittels oder eine ähnliche Mischung befindet. In manchen Fällen wird auch mit Extraktionsmitteln leicht verschiedener Polaritäten mehrfach extrahiert, wobei sich die Extraktionsmittel-Volumina um ca. 300 mL bewegen. Anschließend werden die Volumina vereinigt und für das Cleanup eingeengt (Haglund, Zook et al. 1997; Ikonomou, Rayne et al. 2002; Luross, Alaee et al. 2002). Eine Extraktionsvariante, die einen ersten Cleanup mit einschließt ist die Matrix-Festphase-Dispersion (engl. ‘Matrix Solid Phase Dispersion‘, MSPD). Hier werden zwischen 5 bis 10 g Probe mit Na2SO4 und säurebehandelten Kieselgel vermahlen, und dann in einer entsprechenden Säule mit 400 mL semipolaren Lösungsmittels extrahiert. Bei dieser Methode werden schon während der eigentlichen Extraktion Lipide zerstört, die dann als Polare Verbindung am Kieselgel verbleibend, vom Extrakt abgetrennt wurden (Gómara, García-Ruiz et al. 2006).

Der durch die Extraktion gewonnene Rohextrakt wird üblicherweise um ein vielfaches eingeengt, in der Regel mittels Rotationsverdampfer oder ähnliche Apparaturen. Die Probenaufreinigung (Cleanup) der stark fetthaltigen Extrakte von Biota bedarf einer besonders weitreichenden Fettentfernung. Schon geringe Mengen an Fett reichen aus um die choromatographische Trennung und die Ionisierung empfindlich zu stören. So ist das Maß der Fettabtrennung zentraler Punkt bei dem Cleanup, bei welchem man zwischen „destruktiven“ und „nicht-destruktiven“ Methoden unterscheidet.

In der Literatur findet man häufig als ersten Schritt des Cleanup Variationen der Größenausschlusschromatographie (nicht-destruktive Methode), die sich die Größenunterschiede zwischen den mit extrahierten Triglyceriden und den Analyten zu Nutze macht (de Boer, Allchin et al. 2001; Herzke, Kallenborn et al. 2002; Kucklick, Struntz et al. 2002; Luross, Alaee et al. 2002; Christensen, MacDuffee et al. 2005; Fair, Mitchum et al. 2007). Hier wird ein poröses hochvernetztes Material in Form von kleinen Kugeln bzw. Granulat verwendet, und aus Polymeren oder Silikat (Kieselgel) besteht (Durchmesser der Kugeln beträgt ca. 5 – 15 µm). In Verbindug mit auf Polymeren basierten Packungsmaterialien und unpolaren bis mittelpolaren mobilen Phasen wird häufig auch der Begriff der GPC („Gel-Permeations-Chromatographie“) verwendet. Das Gel ist in Säulen gepackt, die oft in einem halb präparativen Maßstab von 25 x 600 mm verwendet und mit entsprechenden Pumpen gekoppelt werden können. Die Poren in dem Material besitzen eine Größe von 50 bis 100 Ǻ (1 Ǻ = 10-10 m). Das Trennprinzip beruht darauf, dass beim Durchströmen der Probe die relativ kleinen Analyte in die Poren diffundieren, und so eine längere Aufenthaltszeit bzw. eine kleinere axiale Fließgeschwindigkeit besitzen. Alle größeren Moleküle, die nicht in die Poren diffundieren können, fließen ungehindert durch die Säule und verlassen diese als erste. Durch Fraktionierung sind so störende Matrixbestandteile abzutrennen. Bedingt durch die relativ großen Extraktvolumina an dieser Stelle des Analysenganges ist auch das notwendige Injetkionsvolumen von entspechendem Umfang. Dies hat zur Folge, dass die benötigten Säulen um diese Volumina aufzunehmen von einem halb präparative Aufbau sind und relativ große Flüsse benötigen (zwischen 5 und 10 mL/min) (Kucklick, Struntz et al. 2002; Fair, Mitchum et al. 2007). Diese Flüsse sind oft nicht von einfachen HPLC-Pumpen zu leisten, wodurch extra Investitionen erforderlich sind.

Da die Gel-Permeations-Chromatographie nicht in der Lage ist alle Fette (Triglyceride, Phospholipide, Fettsäuren, etc.) mit einem Lauf vollständig abzutrennen, folgen dieser erneut GPC-Fraktionierungen (Haglund, Zook et al. 1997; Bayen, Lee et al. 2004) oder weitere „nicht-destruktive“ und „destruktive“ Cleanup-Methoden. Diese weiteren Cleanup-Schritte gehören häufig in den Bereich der „Adsorptions-Chromatographie“ und bestehen aus der Anwendung selbst- oder vorgepackter Säulen, in denen sich verschieden Lagen Florisil® (Magnesiumsilikat) oder unterschiedlich behandelte Silikate (deaktiviert mittels Wärme, Imprägnierungen mit Säure- oder Base) befinden. Häufig werden diese auch in Kombinationen mit Aluminiumoxyd verwendet, was eine stark fettbindende Wirkung hat. Im Falle von säuremodifizierten Kieselgelen handelt es sich um „destruktive“ Methoden, da hier die Restfette zerstört bzw. in polare Verbindungen überführt werden und an der polaren stationären Phase verbleiben (Covaci, Voorspoels et al. 2007). Eluiert werden die Analyte mit unpolaren bis semipolaren Lösungsmitteln wie n-Hexan, iso-Oktan,

Probenaufarbeitung

16

Dichlormethan, Diethylether, etc. und Mischungen daraus und werden anschließend unter Stickstoff weiter auf konzentriert. In einigen Fällen werden diese Kombinationen aus Adsorptions-Chromatographie und destruktiver Säure-Kieselgel Säule und deren Variationen auch als erster Cleanup-Schritt nach der Extraktion verwendet (Hall, Kalantzi et al. 2003; Bayen, Lee et al. 2004; Fernandez, Araque et al. 2007) und das z.T. auch ohne weitere Cleanup-Schritte. Johnson-Restrepo und Kannan et al. (2005) erzielten bei dem Cleanup von fetthaltigen Extrakten mit einem mehr-lagigen Säulen-Cleanup, ohne Folgeschritte Wiederfindungsraten zwischen 61 und 94% (dotierte interne Standards). Im Falle von selbstgepackten Säulen mit modifizierten Kieselgelen wird der Aufwand der Vorbereitung als hoch eingeschätzt, da das Ausheizen (Deaktivierung), die Konditionierung mit Säure oder Base und das Packen und Einschlämmen des Materials in Glassäulen viele Stunden betragen kann. Damit verbunden ist der Verbrauch an Kieselgel, da, je nach Fettgehalt des Extraktes, die Reinigung als nicht praktikabel erscheint.

Ein weiterer und einfacher destruktiver Cleanup stellt das schlichte Beaufschlagen des eingeengten Extraktes mit konzentrierter Schwefelsäure (H2SO4) dar. Das zerstörte Lipid-Gemisch wird dann mit n-Hexan zum Teil mehrfach gewaschsen/ausgeschüttelt, wobei mehrere Zentrifugier-Schritte für die Phasentrennung nötig sind. Der so von der Hauptlast der Fette befreite Extrakt kann mittels Kieselgel-Säulen-Cleanup oder GPC weiter aufgearbeitet werden (Haglund, Zook et al. 1997; Bethune, Julshamn et al. 2005; Luo, Wong et al. 2007). Dieser Ansatz wird als simpel aber effizient bewertet, auch wenn das Zentrifugieren sowie das Überführen/Waschen der organischen Phase mit einem gewissen Zeit- und Arbeitsaufwand verbunden ist (Kierkegaard, Sellström et al. 2009).

Methodenentwicklung

17

3 Methodenentwicklung Im Folgenden wird die Entwicklung der Analysemethode beschrieben, welche ausgewählte Hauptkongenere zweier Substanzgruppen bromierter FSM im Fettgewebe mariner Säuger messen kann. Aufbauend auf die in meiner Diplomarbeit (Fitz 2007) entwickelten GC/MS-Methode werden unter Erweiterung der Substanzgruppe der PBB, Extraktions- und Aufreinigunsschritte zusammen mit der GC/MS-Analyse validiert.

3.1 Bestehende GC/MS-Methode für PBDE Die Ausgangssituation dieser Master Thesis waren die Ergebnisse meiner Diplomarbeit, welche 2007 ebenfalls in der Abteilung für Marine Bioanalytische Chemie im Institut für Küstenforschung am GKSS angefertigt wurde. Es wurde eine GC/MS-Methode entwickelt, die, als Basis einer Analysemethode die 8 Hauptkongenere von PBDE (IUPAC-Nr.: -28, -47, -99, -100, -153, -154, -183 und -209) in fetthaltigen Extrakten mariner Säugetiere qualifizieren und quantifizieren soll. Des Weiteren wurde ein Cleanup-Schritt mit konzentrierter Schwefelsäure für kommerzielles Fischöl als Testmatrix erprobt, der zeigte, dass damit eine recht weitreichende Fettabtrennung erreicht werden kann. Die Wiederfindungsraten des Schwefelsäure-Cleanup für dotiertes Fischöl (8 Hauptkongenere) betrugen 63 – 106 %. Im Folgenden wird kurz auf die Kernpunkte der entwickelten GC/MS-Methode eingegangen.

Injiziert wird mittels On-Column-Injektion auf eine Siltek®-deaktivierte Vorsäule (Fa. Restek), gefolgt von der Trennung auf einer 15 m DB5-MS Dünnfilmsäule. Bei Injektionen unter Einsatz des PTV-Injektors wurden Signalverluste durch thermische Zersetzungsprozesse beobachtet, die bei der On-column-Injektion vermieden werden konnten. Die Siltek®-deaktivierte Vorsäule führte zu einer weiteren Steigerung der Signalintensität, was bei herkömmlicher deaktivierter Silica-Vorsäule nicht der Fall war. Durch den Einsatz der kurzen DB5-MS Dünnfilmsäule konnten die in der Literatur beschriebenen Probleme der thermischen Zersetzung, die mit dem PTV-Injektor und einer langen Säule ebenfalls beobachtet wurden, weitgehend vermieden werden.

Die Methan-CI im Negativ-Ionen-Modus (NCI) wurde für die Detektion auf Massen charakteristischer PBDE-Fragmente optimiert (optimierte Parameter: Reaktantgasstrom, Bechleunigungsspannung und Filamentstrom). Damit konnte zum Einen eine höhere Spezifität erreicht werden, was bei der in der Literatur häufig zu findenden Detektion auf den unspezifischen 79Br und 81Br-Ionen nicht der Fall ist. Zum Anderen kann nun von der Isotopenverdünnungsanalyse (IVA) Gebrauch gemacht werden, wodurch die Präzision und Richtigkeit (= Messunsicherheit) erheblich verbessert wird. Ein Weiterer Vorteil ist, dass nun auch Koelutionen von unterschiedlichen bromierten Verbindungen (z.B. PBDE und PBB) quantifiziert und qualifiziert werden können.

3.2 Erweiterung der GC/MS-Methode Für die Erweiterung der GC/MS-Methode um die neue Substanzklasse der PBB mussten die Bedingungen der gaschromatischen Trennung sowie der massenspektrometrischen Detektion entsprechend angepasst werden.

3.2.1 GC-Bedingungen Das Temperaturprogramm aus der Diplomarbeit wurde für die Trennung von 8 PBDE-Hauptkomponenten optimiert und bedurfte nun einer Modifikation, um die Hauptkongenere der PBB zu berücksichtigen, da die Messung der Vertreter beider Substanzklassen in einem Lauf stattfinden sollte. Durch die leichteren Massen der PBB, bedingt durch den fehlenden Sauerstoff, sind niedrigere Siedepunkte und damit kleinere Retentionszeiten als bei den PBDE zu erwarten. Das Hauptaugenmerk der Modifizierung lag somit auf der ersten Hälfte des Temperaturprogrammes.

Für die PBB wurden acht Einzelsubstanzen angeschafft: PBB -26, -38, -52, -49, -80, -153, -155 und -169, die mit einer Konzentration von 100 µg/ml in n-Hexan vorlagen (Einzelheiten zu den PBB-Standards siehe SOP_06). Die Hexa-Kongenere PBB-153, -154 und -169 waren Bestandteil der kommerziell erhältlichen HexaBB-Mischungen und machte den Hauptbestandteil der in Umweltproben gefundenen Gehalte aus (von der Recke und Vetter 2007; Vetter, von der Recke et

Temperaturprogramm

18

PBDE- und PBB Kongenere (Extrahierte Ionenspur: 79Br) (Alle Kongenere mit 500 ng/mL in n -Nonan)

0.0E+00

5.0E+04

1.0E+05

1.5E+05

2.0E+05

0 7 9 11 14 16 18 21 23 25 28 30 32 34 37 Min

Counts

0

50

100

150

200

250

300

350

T [°C]

3)

10)

9)

8)

6)7)

5)4)

2)1)

11)

12) 13) 14)

al. 2008). Auch wenn PBB-169 einen eher kleineren Anteil von z.B. der Mischung FireMaster® ausmachte, so stellte es sich doch als das Kongener mit der höchsten Toxizität dieses Gemisches heraus (WHO 1994). Zu Untersuchungen von tri- und tetrabromierten Kongeneren sind kaum Informationen verfügbar. PBB-26, -49, -52 und -80 wurden nachweislich in Biota festgestellt (Luross, Alaee et al. 2002; Fernandez, Araque et al. 2007).

Die Elutionsreihenfolge der acht Kongenere wurde anhand der Retentionszeiten mittels Einzelinjektionen im NCI ‚full scan‘-Modus ermittel und stellt sich, beginnend mit der kleinsten Retentionszeit, wie folgt dar: PBB-26, -38, -49, -52, -80, 155, -153, -169.

Die ersten Testläufe unter Verwendung des PBDE-Temperaturprogrames (Fitz 2007) zeigten, dass die PBB-Kongenere durch die schnelle anfängliche Heizrate von 40 °C/min in einem sehr gestauchten Block innerhalb relativ kurzer Zeit eluierten. Für eine zeitlich besser aufgelöste Trennung wurden die Temperatur-Steigungen auf über die Hälfte reduziert, sodass die Peaks mit mehr Abstand von einander eluieren. Für eine bessere Übersicht bei der Trennung von PBB und PBDE wurde ein Mischstandard hergestellt, der alle nativen PBB- und PBDE-Kongenere mit einer Konzentration von 500 ng/mL in n-Nonan enthielt. Vermessen wurde im NCI-Full Scan. Ein gutes Ergebnis wurde erzielt, mit einer kleinen Steigung von 15 °C/min bis 200°C, gefolgt von einem noch sanfteren Temperaturanstieg von 4°C/min die bis zu einer Endtemperatur von 300 °C anhält. Dieser leichte Anstieg bis zur Endtemperatur wurde dem Ausgangstemperaturprogramm nachempfunden, damit die höherbromierten Kongenere der PBDE ähnlich übersichtlich von der Säule eluieren, veranschaulicht in Abb.5.

Abb. 5: Finales Temperaturprogramm mit resultierender Trennung der PBDE- und PBB-Kongenere.

Durch die langsameren Heizraten wird folglich auch die Endtemperatur später erreicht, die chromatographische Trennung nimmt mehr Zeit in Anspruch. Um die Analysenzeit nicht unnötig zu verlängern, wurden die vorder- und endständigen Haltezeiten verkürzt. Auch wenn das Deka-BDE-209 bei ca. 33.7 Dezimalminuten eluiert, wird eine Haltezeit der Endtemperatur für ca. 5 Minuten für sinnvoll erachtet, da sie, ins Besondere im Falle von Realproben, eine reinigende Wirkung auf das chromatographische System hat (Ausheizen).

Elutionsreihenfolge PBDE, PBB:1) PBB‐26 8) PBB‐1552) BDE‐28 9) BDE‐1003) PBB‐38 10) BDE‐994) PBB‐49 11) PBB‐153, BDE‐1545) PBB‐52 12) BDE‐1536) BDE‐47 13) PBB‐169, BDE‐1837) PBB‐80 14) BDE‐209

Methodenentwicklung

19

Die Dauer des neuen Temperaturprogramms (siehe Tab. 6) beträgt nun 39 Minuten, womit es neun Minuten länger ist als das der Diplomarbeit, was aber aufgrund der doppelten Menge an zu trennenden Substanz immer noch als zügig bewertet werden kann. Wie auch in der Diplomarbeit folgt die Temperatur des On-Column-Injektors der des GC-Ofens im Abstand von 3 °C.

In Abb. 5 ist weiter zu erkennen, dass es zwischen einigen PBDE- und PBB-Kongeneren zu Koelutionen, bzw. zu Elutionen kommt, bei denen die Peaks der Substanzen stark ineinander schultern, sodass diese mehr als die halbe Peakhöhe „verschmolzen“ sind. Eine weitere Trennung ist aufgrund der Ähnlichkeit der Substanzen zueinander auf dieser Säule nicht möglich. Da es sich bei Abb. 6 um ein extrahiertes Ionen-Chromatogramm auf der Masse des 79Br handelt, wird deutlich wie es z.B im Falle des Peak Nr. 11 zu einer Fehlaussage kommen kann, da hier zwei Kongenere unterschiedlicher Substanzklassen (PBDE-154 und PBB-153) simultan eluieren, die so nicht weiter unterschieden werden können. Gleiches gilt für Peak Nr. 6, 7, 8, 9 und 13. Dieses Problem kann nur dadurch gelöst werden, wenn man sich von den unspezifischen Massen des Broms abwendet und für die Detektion auf Massen der höheren Fragment-Ionen zugreift. Die Auswahl geeigneter Massen wird im folgenden Abschnitt besprochen.

3.2.2 MS-Bedingungen Zur Steigerung der Empfindlichkeit bei der massenspektrometrischen Detektion von Substanzen wird das so genannte ‚selected ion monitoring‘ (SIM) verwendet. Hier wird nur auf einer Auswahl von Massen gemessen, das Spektrometer muss nicht den ganzen Massenbereich „abfahren“, wie es beim Scan-Modus der Fall ist. So wird wertvolle Messzeit gewonnen, die auf den ausgewählten Massen verbracht werden kann, wodurch auch mehr Signal der Massen erfasst wird, was wiederum zu mehr Intensität führt. Alle von den Ziel-Ionen verschiedenen Massen werden quasi

ausgeblendet.

Die Auswahl geeigneter SIM-Massen erfolgt nach dem Kompromiss zwischen der Signalintensität und der Spezifität. Im Falle der bromierten FSM erzeugt Brom im NCI die intensivsten Signale, welche aber, wie oben mehrfach beschrieben, zu unspezifisch sind für eine eindeutige Detektion. Die nächst intensiveren Signale bilden die höheren Fragment-Ionen der Substanzen, welche sich meistens aus den [M-]. oder [M-Br]- und [M-Br2]

- -Massen ergeben (siehe Abb. 6). Nun ist

es üblich neben den intensivsten Signalen zur Quantifizierung (engl. ‘quantifier‘) noch weitere Massen auszuwählen, die ebenfalls nur in Anwesenheit der ausgewählten Substanz auftreten, und zum Absichern des tatsächlichen Vorhandenseins der Zielsubstanz dienen (engl. ‘qualifier‘).

In der Diplomarbeit wurden die Parameter der NCI (Beschleunigungsspannung, Emissionsstrom des Filaments und der Reaktanagasstrom) für die Bildung dieser höheren Fragment-Ionen der

Tab. 6: Übersicht der GC-Temperaturprogramme: Ausgangssituation (Fitz 2007) modifiziert (für PBDE, PBB)

Abb. 6: NCI-Full Scan des Hexa-PBB-155. Aus den drei signalintensivsten Fragmenten erfolgt die Auswahl der SIM-Massen.

Diplomarbeit (PBDE) Master‐Thesis (PBDE & PBB)

61 [°C]  2 min Haltezeit 64 [°C]  1 min Haltezeit40 [°C/min] 200 [°C]  15 [°C/min] 200 [°C] 10 [°C/min] 280 [°C]  4 [°C/min] 300 [°C]  4 min Haltezeit2 [°C/min] 300 [°C]  8 min Haltezeit

Laufzeit: 30,00 [dez. min] Laufzeit: 39,07 [dez. min]

MS-Bedingungen

20

∑Br SIM-Gruppe Quant [m/z ] Qual I [m/z ] Qual II [m/z ] Qual III [m/z ]

native BDE*28 3 2 327,0 325,0 329,0 247,047 4 4 325,0 327,0 404,9 406,8100 5 5 402,7 404,7 483,7 481,799 5 5 402,7 404,7 483,7 481,7154 6 6 483,7 563,6 403,7 643,5153 6 6 483,7 563,6 403,7 643,5183 7 7 563,6 561,6 483,6 481,6209 10 8 486,6 484,6 482,6 -

13C12-BDE*28 3 2 339,0 337,0 341,0 257,047 4 4 337,0 339,0 417,0 419,0100 5 5 416,8 414,8 412,8 336,999 5 5 416,8 414,8 412,8 336,9154 6 6 495,7 493,8 575,5 414,6153 6 6 495,7 493,8 575,5 414,6183 7 7 573,7 575,7 495,7 493,7209 10 8 494,6 496,6 498,5 -

InjS13C12-BDE 139* 6 3 495,7 493,8 575,5 414,613C12-PCB 138* 6 6 371,9 373,8 339,9 337,9

* = Kongener-Nummer nach IUPAC-Nomenklatur.

PBDE optimiert. Geeignete Massen für Quantifier-Ionen wurden für die nativen und die 13C12-Isotopen-markierten PBDE ausgewählt und validiert (instrumentell). Diese Massen wurden für diese Arbeit übernommen und zusätzlich um je drei Qualifier-Massen erweitert.

Die NCI-Parameter werden als Kompromiss für die PBB ohne weitere Optimierung verwendet, unter der Annahme, dass diese Bedingungen ähnlich effektiv höhere Fragment-Ionen produzieren (Übersicht der NCI-Parameter siehe SOP_06). Für die Auswahl geeigneter Quantifier- und Qualifier-Massen für die PBB wurden die Standards im NCI-Full Scan vermessen. Anhand der Spektren wurden geeignete Quantifier und je drei Qualifier-Massen aus den größten Fragmenten ausgewählt (siehe Abb. 6). Im Fall des Deka-BDE-209 entsteht unter NCI-Bedingungen, neben den intensiven Signalen des Broms, nur ein weiteres hochabundantes Fragment: [C6Br5O]-. Durch die an diesem Fragment verbleibenden sechs C-Atomen ist der Massenunterschied zum isotopenmarkierten Analogon durchschnittlich um 6 m/z kleiner geworden, da 13C12-BDE 209 strukturell das gleiche Fragment bildet. Es kommt zu einer leichten Überlappung der Fragment-Massen. Aus diesem Grunde werden neben dem Quantifier nur zwei Qualifier aus dem Fragment-Cluster gewählt, die sich von der Überlappung möglichst weit entfernt sind. Analog wurden die Massen des markierten Kongeners gewählt. 13C12-markierte PBB-Kongenere wurden nicht angeschafft, da sie zum Einen nicht in vollem Umfang erhältlich und zum Anderen sehr teuer waren, was für einen Routinebetrieb nicht im Verhältnis steht. Die Quantifizierung der PBB findet deshalb nur anhand der Quantifier gegen eine externe Kalibrierung statt. Für eine Volumenkorrektur wird ein Injektionsstandard (InjS) verwendet. Der InjS besteht aus einer Mischung von 13C12-PCB-138 und 13C12-BDE 139. Auch für diese Substanzen wurden nach oben beschriebenem Vorgehen geeignete Quantifier- und Qualifier-Ionen ermittelt. Eine Übersicht der SIM-Massen ist in Tab. 7 und Tab. 8 gegeben. Tab. 7: Übersicht der SIM-Massen für native und isotopenmarkierte PBDE sowie der Substanzen des InjS

Methodenentwicklung

21

native PBB* ∑Br SIM-Gruppe Quant [m/z ] Qual I [m/z ] Qual II [m/z ] Qual III [m/z ]

26 3 1 311,0 308,9 312,9 230,549 4 3 388,8 390,8 310,8 230,852 4 3 390,8 388,8 310,8 230,880 5 4 469,7 471,7 309,8 310,9155 6 5 627,6 625,6 549,6 469,7153 6 6 627,6 625,6 549,6 469,7169 6 7 627,6 625,6 549,6 469,7

* = Kongener-Nummer nach IUPAC-Nomenklatur.

Tab. 8: Übersicht der SIM-Massen für native PBB

Beim PBB-38 hat sich ergeben, dass die mittels eines höher konzentrierten Standards (500 ng/mL) ermittelten SIM-Massen von geringer Intensität waren. In den Verdünnungen der angefertigten Kalibrierstandards (CS) waren die Signale dieser Fragmente zu schwach, als das eine ausreichende Quantifizierung möglich war. Aus diesem Grund wird PBB-38 bei allen weiteren Untersuchungen weggelassen, und ist nicht mehr Bestandteil der Methode.

Durch die Natur der GC-Trennung nehmen die Retentionszeiten der Substanzen mit steigenden Massen und Siedepunkten zu. Aus diesem Grund sind Substanzen geringerer Masse im vorderen Teil des Chromatogrammes zu erwarten, schwerer siedende Verbindungen später. Damit ist es unnötig alle SIM-Massen über das gesamte Chromatogramm hinweg zu messen, stattdessen werden zeitlich versetzte SIM-Gruppen definiert, in denen ausschließlich die Massen der erwarteten Substanzen beobachtet werden. Dieses Vorgehen spart wertvolle „Abtastzeit“ ein und steigert die Intensität, da mehr Zeit zus Signalerfassung für die jeweilige m/z zur Verfügung steht. Zwei Zeitbegriffe, die im Zusammenhang mit dem Mechanismus der massenspektrometrischen Detektion stehen sind die so genannte ‘Dwell-Time‘ (engl. für Haltezeit auf der SIM-Masse) und die ‘Cycle-Time‘ (engl. für Messzyklus-Zeit).

Die Dwell-Time beschreibt die Zeit in Millisekunden, die der Massenfilter die ausgewählten Massen durchlässt damit diese an der Dynode ein Signal erzeugen. Für jede SIM-Masse ist eine solche Dwell-Time festzulegen. Mit größerer Dwell-Time nimmt die Intensität zu, da mehr Signal erfasst wird. Die Cycle-Time ergibt sich als Summe der Dwell-Time einer jeden Masse in der SIM-Gruppe und der Zeit, die der Massenfilter benötigt, um zwischen den Massen zu wechseln. Die Cycle-Time bestimmt nun, mit wie vielen Messpunkten ein Peak erfasst wird, bzw. wie genau seine Form abgebildet werden kann. Nach einer Faustregel sollte ein Peak von mindestens 15 Messpunkten beschrieben werden um verlässlich ausgewertet zu werden. Aus diesem Grunde macht es keinen Sinn, die Dwell-Time auf den Massen beliebig hoch zu setzen, oder besonders viele Massen einer SIM-Gruppe zu zuordnen. Bei sehr schmalen bzw. kleinen Peaks sollte darauf geachtet werden, dass ausreichend Messpunkte über dem Peak vorhanden sind. Ist dies nicht der Fall sollten Dwell-Time oder Umfang der SIM-Gruppen verringert werden.

Die nach diesen Gesichtspunkten erstellten acht SIM-Gruppen weisen nicht mehr als 12 verschiedene Massen auf. Die jeweiligen Startzeiten der Gruppen sind so gesetzt, das auch bei einer geringfügigen Verschiebung der Retentionszeiten, was insbesondere bei der Vermessung von Realproben beobachtet wurde, diese immer noch sicher innerhalb der SIM-Gruppe liegen. Die Dwell-Time für die Quantifier-Massen beträgt 30 Millisekunden, die der Qualifier-Ionen 10 Millisekunden. Für den Wechsel von einer SIM-Masse zur nächsten, braucht das MS durchschnittlich ca. 15 Millisekunden (errechneter Wert). Die resultierende Zyklen-Zeit beträgt zwischen 2,8 bis 7 Cycl/s (Messzyklen pro Sekunde). Für das Vorhandensein von mindestens 15 Datenpunkten über jeden Peak ist eine Mindestbreite von ca. 5,75 Sekunden, bzw. 0,095 Dezimalminuten erforderlich. Eine Übersicht der SIM-Gruppen ist in Tab. 9 gegeben.

MS-Bedingungen

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SIM-Gruppen Nr. Startzeit [min] Zyklus [cyc/s] PBDE *,** PBB* 13C12 BDE*, PCB*

Tri-PBB 1 00:00 7 26BDE28 2 09:80 2,8 28

TetraBB InjS 3 10:40 4,2 49, 52 13C12 -PCB 138PBB-80 BDE-47 4 11:50 2,8 47 80

hexaPBB pentBDE 5 13:00 2,8 99, 100 155hexBB hexBDE 6 15:50 2,8 154, 153 153 13C12 -BDE 139heptBDE hexBB 7 19:00 2,8 183 169

deka-BDE 8 24:00 5,3 209* = Kongener-Nummer nach IUPAC-Nomenklatur.** = native und 13C12-Kongenere

Tab. 9: Übersicht der SIM-Gruppen

Methodenentwicklung

23

3.3 Probenaufarbeitung Die hier entwickelte Analysemethode ist fokussiert auf ausgewählte Kongenere zweier Substanzklassen bromierter persistenter organischer Verbindungen, PBDE und PBB. Die hier entwickelte Probenaufarbeitung verfolgt jedoch ein umfassenderen Ansatz und richtet sich nach der relativ großen Schnittmenge der physiko-chemischen Eigenschaften vieler POP. So sollen für eine spätere Weiterentwicklung der Methode weitere POP durch die hier angewendeten Techniken zugänglich gemacht werden, da diese sich häufig ohnehin zusammen mit den bromierten Substanzen in der Umwelt befinden und anreichern. Tab. 10: Literaturangaben von PBDE-Minimalkonzentrationen in marinen Säugern in [ng/g lw]

Die in Fitz (2007) theoretisch ermittelten Bestimmungsgrenzen ergaben sich, im Zusammenhang mit den dort zugrunde gelegten Annahmen (unter Anderem eine Einwaage von 2 g Probe), in dem Bereich von 0,06 bis 0,44 ng/g lw für die Kongenere BDE-28, bis -183. Verglichen mit den Minimalkonzentrationen in Tab. 10 würden diese ausreichen, um die minimalen Gehalte sicher zu quantifizieren. Es wird angenommen, dass diese Grenzen sich durch die angepassten MS-Bedingungen nur leicht ändern werden.

Die Gehalte von PBB machen ca. 1 – 10 % der PBDE-Belastung in Biota und anderen Umweltproben aus (Herzke, Berger et al. 2005). Da sich darüber hinaus in Vorversuchen und bei der Ermittlung geeigneter PBB-SIM-Massen (siehe Abschnitt 3.2.2) bereits gezeigt hat, dass die Fragmente der PBB von geringerer Intensität sind als die der PBDE bei gleicher Konzentration, werden sich die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen dieser Substanzklasse ebenfalls als höher darstellen. Aus diesem Grund wird die angenommene Einwaage aus meiner Diplomarbeit um den Faktor 2,5 auf resultierende 5 g erhöht um auf die Gegebenheiten der PBB einzugehen.

Durch das Nichtvorhandensein von 13C12-PBB-Kongeneren können WFR geringer 100% bei der Probenaufarbeitung neben den erwarteten niedrigen Gehalten auch noch erschwerend für die Detektion hinzukommen. Von daher befindet man sich mit der Vergrößerung der Einwaage auf der sicheren Seite.

Für alle verwendeten Glasgeräte und Werkzeuge sind entsprechende Reinigungsprozeduren etabliert worden. Einweg-Glasgefäße (Proben- und Autosamplervials) werden über Nacht mit organischen Lösungsmitteln eingelegt, Werkzeuge und stark verschmutze Glasgeräte werden vorgereinigt und in der Laborspülmaschine gewaschen, die u.a. vollentsalztes Wasser verwendet. Nicht spülmaschinentaugliche und graduierte Glasgeräte werden in einem alkalischen Reinigungsbad (5% RBS® 50-Lösung) eingeweicht und mit vollentsalztem Wasser gespült. Glasgeräte (nicht graduiert) und Werkzeuge (Skalpell, Spatel und Pinzetten) werden für 10 Stunden bei 250 °C ausgeheizt. Alle Reinigungsprozeduren sind im Detail in SOP_07 beschrieben.

3.3.1 Homogenisierung Die Schweinswalproben werden in einem PE-Kunststoffbeutel bei ca. -18 °C im Laborgefrierschrank aufbewahrt. Der erste Schritt der Probenaufarbeitung ist das Homogenisieren der Gewebeprobe, wozu verschiedene Varianten von mechanischer Zerkleinerung angewendet werden (siehe Abschnitt 2.4). Bei der hier angewendeten Homogenisierung wird vor Einsatz des Dispergier-Werkzeuges die Gewebeprobe durch einfaches Zerschneiden vorzerkleinert. Durch das Dispergieren des Fettgewebes entsteht eine breiige, zähflüssige Masse. Bei dem Dispergier-Werkzeug handelt es sich um einen ULTRA -TURRAX® T 25 digital, der Firma Ika, der vereinzelt in der Literatur als Werkzeug zum Homogenisieren verwendet wird (de Boer, Allchin et al. 2001). Im Folgenden wird der Arbeitsablauf der Homogenisierung beschrieben.

BDE 28 BDE 47 BDE 100 BDE 99 BDE 154  BDE 153

Law et al. 2002, Schweinswal (n = 59) [ng/g lw] ‐ 57.72 5.328 5.994 ‐ 5.217Boon et al. 2002, Schweinswal (n =3) [ng/g lw] 7.6 245 47 43 12 5.6Boon et al. 2002, Seehund (n =3) [ng/g lw] 1.1 57 6.2 11 2.4 3.4

Homogenisierung

24

Abb. 7: Vorzerkleinerung einer Gewebeprobe

Abb. 8: Dispergieren mit dem ULTRA -TURRAX® T 25 digital

Die Homogenisierung wird unter laufendem Abzug durchgeführt. Die noch gefrorene Gewebeprobe wird mittels Skalpell und Pinzette (Edelstahl) auf einem PTFE-Schneidebrett zerkleinert (Würfel einer Kantenlänge von ca. 2 mm) und von Nichtfettgeweben (z.B. obere Schwarte, Muskelfleisch der Unterhaut, Blutgefäße, etc.) befreit. Diese Nichtfettgewebe stellten sich als sehr hinderlich beim Dispergieren heraus. Durch den hohen Fettgehalt des Gewebes tritt das Fett beim Zerschneiden in Form von einer Art Öl heraus. Das so bearbeitete Gewebe wird zusammen mit dem Öl mit Hilfe eines breiten Spatels von dem Schneidebrett in ein Gefäß überführt. Wird eine größere Menge

(>10 g) an Probe homogenisiert erfolgt die Überführung in ein Becherglas (siehe Abb. 8). Bei geringeren Probenmengen erfolgt die Überführung und das anschließende Dispergieren in einem gewogenem 22 mL Supelco® Schraubdeckel-Vial.

Das Dispergier-Werkzeug arbeitet mit einem runden Rotor, welcher in einem perforierten stählernen Rohr (Stator) rotiert. Ein beim Betrieb entstehender Sog führt das Material zu den Scherkanten im Ringspalt. Die Gewebewürfel werden in kleinste Bestandteile zerschert und liegen nach einer Zeit von ca. 20 min in Form einer zähflüssigen und optisch dichten Masse vor. Für das Dispergieren ist ein gewisser Füllstand notwendig, damit das Probenmaterial durch den Rotor zirkulieren kann. Fällt die Probenmenge zu gering aus um den Füllstand zu erreichen, wird das Homogenat mit einem notierten Volumen an n-Hexan aufgestockt. Der Dispergier-Prozess erwärmt die Probe je nach Laufzeit und Drehzahl entsprechend stark. Da es sich bei den Analyten um wärmeempfindliche Verbindungen handelt, muss das Dispergieren regelmäßig unterbrochen werden damit die Probe abkühlen kann. Durch verbleibende Bestandteile anderer Gewebearten bilden sich während der Homogenisierung Fasern, die den Rotor zu setzen und den Prozess behindern. Diese müssen mittels Pinzette von dem Werkzeug entfernt werden. Es bietet sich an dieses während der Abkühlphase durchzuführen.

Wurde in einem Becherglas dispergiert, wird die Probe in Aliquoten ebenfalls in

gewogene 22 mL Supelco® Schraubdeckel-Vials verfüllt. Diese Probenvials sind mit allen Daten wie Datum, Probenkennung, Nettogewicht von Vial und Deckel deutlich zu kennzeichnen. In diesen Vials können Proben bei -18 °C im Laborgefrierschrank vor der Analyse oder als Rückstellprobe gut verwahrt werden (siehe Abb. 9).

Das Dispergier-Werkzeug wird nach der Homogenisierung gründlich von Geweberesten befreit und in Aceton und n-Hexan im laufenden Betrieb gewaschen um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Auch die Reinigung des PTFE-Schneidebrettes sowie das Auswechseln von Pinzette und Skalpell sind vor dem Bearbeiten einer neuen Probe selbstverständlich.

Da es sich um biologisches Material handelt und sich die Aufarbeitung um eine nicht gerichtete Tätigkeit handelt (im Sinne der Biologischen Arbeitsstoff-Verordnung), werden mit Papiertüchern aufgenommenes Fett, Gewebeabschnitte sowie Einweg-Klingen vor der Entsorgung autoklaviert. Die Verfahrenschritte finden sich detailliert zusammengefasst in SOP_01.

Abb. 9: Homogenisierte Probe im Supelco®-Vial

Methodenentwicklung

25

3.3.2 Extraktion und Bestimmung des Fettgehaltes Zur Extraktion wird das Verfahren nach Soxhlet verwendet (genereller Aufbau, siehe Abb.10), da es bekannt für seine Robustheit, gute Ausbeute und simple Handhabung ist (siehe Abschnitt 2.4). Um die Methode auch für geringer belastete Matrizes einsetzbar zu machen, wurde der Extraktor mit einem Volumen von 150 mL dimensioniert. Die Extraktionshülse, gefertigt aus Glasfasern mit anorganischen Bindemitteln, fasst ca. 80 mL. Die hier angesetzte Probeneinwaage von 5 g (siehe Abschnitt 3.3) wird mit dem fünffachen Zusatz an Na2SO4 beaufschlagt. Diese Mischung nimmt ca. ein Volumen von 15 mL ein (überschlagen mit der Angabe des Herstellers: ρ(Na2SO4) = 2,70 g/cm3 und näherungsweise für das Homogenat mit ρ(Olivenöl) = 0,91 g/cm3). Damit kann die

Einwaage um den Faktor fünf vergrößert werden, was bei gering belasteten Umweltproben nötig sein könnte.

Der Kolben für die Extraktionsmittel-Vorlage hat ein Volumen von 250 mL und wird mit einem Heizpilz temperiert. Kondensiert wird der Extraktionsmittel-Dampf mittels eines Dimroth-Kühlers, der das Kondensat in die Extraktionshülse tropfen lässt. Zur Kühlung wird auf 10 °C konstant temperiertes Leitungswasser in einem geschlossenen Kreislauf verwendet. Dieses gelangt über Gewebeschläuche mit GL-14-Anschlüssen durch die Kühler, wobei vier Kühler in Reihe verbunden sind (im Gegenstrom zum Dampf). Kolben, Extraktor und Kühler sind mit Schliffverbindungen (NS 29/32, bzw. NS 45/40) zusammen gesteckt, die mit entsprechenden PTFE-Schliffmanschetten abgedichtet werden. Schlifffett zum Abdichten ist aufgrund der Lipophilie der Analyte keinesfalls zu verwenden, da es zu Analytverlusten und Kreuzkontaminationen führen könnte. Die Extraktion wird unter laufendem Abzug durchgeführt.

Dieser Soxhlet-Aufbau wird vor jeder Probenextraktion mit Aceton vorgereinigt, um letzte Organik-Reste von den Wandungen und ggf. aus der Hülse zu waschen. Nach der vierstündigen Reinigung wird das Aceton verworfen. Die Hülse wird unter N2 vom restlichen Aceton getrocknet, da sich zeigte, dass sich beim Ausdampfenlassen an der Luft die Hülse mit Eiskristallen überzieht, welche als Feuchtigkeit in dem Hülsenmaterial verbleibt.

Als Extraktionsmittel wird 250 mL einer Mischung aus n-Hexan : Aceton im Verhältnis 1:1 (v/v) verwendet, wie sie häufig in der Literatur bei Soxhlet-Extraktionen für ähnliche Aufgabenstellungen eingesetzt wird (siehe Abschnitt 2.4). Von dem homogenisierten Probenmaterial wird nach einer kurzen Auftauzeit ca. 5 g (genauer Wert wird im Probenprotokoll notiert) in ein (tariertes) 25 mL Becherglas überführt. Hierzu wird eine Pasteurpipette verwendet, bei welcher die Spitze eingekürzt wurde um den Querschnitt der Spitze zu vergrößern, damit das viskose Probenmaterial besser portioniert werden kann.

Das so überführte Probenmaterial wird dann mit den internen Standards dotiert. Im Falle der 13C12-PBDE (SurrS mit c = 1 µg/mL) werden 30 µL mit einem Transferpettor zur Probe gegeben. Damit wird im finalen Extrakt vor der GC/MS-Bestimmung eine Konzentration von 100 ng/mL angestrebt, die dem Gehalt der 13C12-Kongenere in den BDE-Kalibrierstandards entspricht. Durch leichtes Schwenken des

Becherglases wird der interne Standard mit der Probe vermischt und anschließend mit der fünffachen Menge an Na2SO4 zu einer homogenen Mischung vermengt. Diese Mischung wird in die vorgereinigte Extraktionshülse überführt. Der verwendete Spatel und das 25 mL Becherglas werden für eine möglichst quantitative Überführung des Fettes und der Analyte mit ca. 2 mL n-Hexan gespült, welches mit in die Hülse gegeben wird. Für den Verfahrens-Blindwert, der mit jedem Extraktionsgang mitläuft, werden nur ca. 25 g Na2SO4 in die Hülse gefüllt.

Abb.10: Schema Soxhlet-Extraktor: (1) Kolben mit Extraktionsmittel (2) Extraktor mit Hülse, (3) Dimrothkühler.Quelle:(Cammann 2001)

Extraktion und Bestimmung des Fettgehaltes

26

Sind die Extraktoren mit Proben beladen worden, erfolgt die sechsstündige Extraktion, welche gut an einem Arbeitstag durchgeführt werden kann. Nach der Extraktionszeit wird das Ende eines Zyklus abgewartet, d.h. wenn das Extraktionsmittel aus dem Extraktor zurück in den Kolben fließt, wird der Vorgang gestoppt. Das Extraktionsmittel in dem 250 mL Rundkolben ist nun beladen mit den Analyten und dem Fett, wodurch es zu einer leichten Trübung und Farbänderung ins gelbliche kommen kann. Der Kolben wird mit einem Schliffstopfen und der verbleibenden PTFE-Manschette verschlossen über Nacht gelagert (optional, da auch direkt weiter gearbeitet werden könnte).

Im Weiteren Verlauf der Analyse wird das Extraktvolumen genau bestimmt (Messzylinder, Wert wird notiert). An dieser Stelle wird ein Aliquot von 7 mL zur Fettgehaltsbestimmung nach SOP_03 in ein ausgeheiztes und gewogenes 7 mL Supelco®-Vial überführt. Dieses Aliquot wird unter Stickstoff so lange eingeengt, bis die Blindwertprobe trocken ist, bzw. das Volumen des fettigen Rückstandes sich nicht mehr ändert. Das beim Einengen gebildete Kondensat sowie eventuell noch in der Probe verbliebenes Wasser, wird durch das Ausheizen der Vials auf 105 °C entfernt. Die Dauer wurde auf 30 Minuten festgesetzt, da sich bei Ausheiz-Zeiten oberhalb der 30 Minuten eine Gewichtszunahme zeigte, welche vermutlich durch die Oxidation der Fette zustande kam, die Bestimmung des Fettgehaltes jedoch verfälschen könnte. Nach dem Ausheizen werden die Vials in einem Exsikkator zum Abkühlen deponiert.

Das Gewicht des verbleibenden Fettrückstandes wird dann über Wägung und Differenzbildung mit dem Ausgangsgewicht des Vials ermittelt, und auf das Extraktvolumen zurückgerechnet. Bei der Methodenvalidierung konnten Standardabweichungen von ± 0,84 % (n = 6) erzielt werden.

Für den Weiteren Analysegang wird die Probe von dem Extraktionsmittel befreit. Hierzu wird der Extrakt in einen 250 mL Spitzkolben umgefüllt, zusammen mit Lösungsmittelmengen (n-Hexan) mit

welchen der Rundkolben, und das für die Fettgehaltsbestimmung verwendeten Glasgerät mehrfach gespült wurden. Zum Abtrennen des Extraktionsmittels wird ein Rotationsverdampfer mit Vakuumpumpe verwendet (siehe Abb. 11), der vor jeder Probe mit 150 mL Aceton vorgereinigt wird. Der Spitzkolben rotiert (40 min-1) in einem Wasserbad (40 °C), wodurch die Wandungen des Kolbens stetig benetzt werden. Über diese große durch die Benetzung entstandene Oberfläche kann das Extraktionsmittel im Niederdruck (500 mbar) effektiv verdunsten, wodurch es von dem übrigen Extrakt abgetrennt wird. Das abgetrennte Lösungsmittel kondensiert im Kühler des Rotationsverdampfers und sammelt sich in einem Glaskolben zur Entsorgung. Das Zielvolumen der Einengung des Probenextraktes liegt bei ca. 20 mL (beim Blindwert ca.10 mL). Je nach Beschaffenheit der Probe werden diese

Volumina nach ca. 30 bis 50 Minuten erreicht. Der so vom Extraktionsmittel befreite Extrakt wird mittels Pasteurpipette in 22 mL Supelco® Vials überführt. Blindwertproben kommen in ein Vial, Proben werden auf zwei Vials aufgeteilt. An dieser Stelle ist der Analysegang gut zu unterbrechen, da so aufbereitete Proben vor der weiteren Aufreinigung lange gelagert werden können.

Abb. 11: Rotationsverdampfer R-134 der Fa. Büchi

Methodenentwicklung

27

3.3.3 Probenaufreinigung Die Probenaufreinigung sieht hier im Wesentlichen die Abtrennung von mitextrahierten Fetten und anderen Matrixbestandteilen des Rohextraktes von den Analyten vor. Der Schwefelsäure-Cleanup als „destruktive Methode“ (siehe Abschnitt 2.4) wurde in meiner Diplomarbeit (Fitz 2007) mit handelsüblichem Fischöl (Oleum Jacoris A) getestet. Mit Einwaagen von 0,5 g des Fischöls und zweimal 4 mL konzentrierter Schwefelsäure (also ein resultierendes Verhältnis von 16 mL H2SO4 pro Gramm Fischöl) konnte eine hinreichende Abtrennung der verbleibenden Matrixbestandteile erreicht werden, die, nach entsprechender Einengung, eine direkte Injektion in den GC zuließ (Fitz 2007).

3.3.4 Schwefelsäure-Cleanup Die in dieser Arbeit verwendeten Probeneinwaagen sind mit 5 g festgesetzt, womit sie um einen Faktor 10 größer sind als die bei den Cleanup-Untersuchungen in der Diplomarbeit. Vorversuche mit Realproben (mit ebenfalls 5 g Einwaage) zeigten, dass das Verhältnis von Säure zu Fett auf 3 mL H2SO4 pro Gramm Probe verringert werden konnte, wenn mit drei nacheinander erfolgenden Beaufschlagungen gearbeitet wurde. Hierzu wurde dem nahezu extraktionsmittelfreien Rohextrakt in einem 22 mL-Vial 5 mL H2SO4 zugeführt, sowie n-Hexan als verbleibende unpolare Phase. Durch energisches Schütteln von Hand (für ca. 1 Minute) wurden die Phasen vermischt, wobei die Säure das Fett zerstörte und in polare Verbindungen überführte. Der bei dieser Reaktion entstehenden Hitze, die ja aufgrund der wärmeempfindlichen Analyte vermieden werden muss, wird mit einem Wasserbad nach dem Schütteln entgegen gewirkt.

Um die Phasentrennung der Mischung aus Probe, Säure und Lösungsmittel zu beschleunigen, wurde anstatt der Anwendung von Ultraschall (siehe Abschnitt 3.3.4.2) das Zentrifugieren eingesetzt. Da durch die unterschiedliche Beschaffenheit der Proben die Zeit der Phasentrennung variieren kann, wurde das Zentrifugieren für eine Dauer von 12 Minuten (bei 2000 min-1) betrieben. Diese Zeit hat sich im Laufe der Arbeit mit allen Proben als ausreichend herausgestellt.

Die nun oberständige Phase wird mittels sauberer Pasteurpipette und entsprechenden Spülschritten (n-Hexan) in ein sauberes 22 mL Vial überführt. In diesem kann nun, wie oben beschrieben die Beschickung mit konzentrierter Schwefelsäure noch zweimal erfolgen. Um die Zeit des Aufreinigungsprozesses zu verkürzen wurde die erste Beschickung mit Säure auf eine parallele Durchführung umgestellt. Wie am Ende von Abschnitt 3.3.2 beschrieben wird der Probenextrakt auf zwei Vials aufgeteilt. Die Aliquote können nun gleichzeitig mit Schwefelsäure versetzt und zentrifugiert werden. Die oberständigen unpolaren Phasen werden dann in einem weiteren Vial vereinigt, und nochmals aufgereinigt. Der Cleanup mit Schwefelsäure ist detailliert in SOP_04 zusammengefasst. Der so von fettigen Bestandeilen befreite Extrakt ist nun für die weitere Analyse aufgereinigt.

3.3.4.1 Säureresistenz von PBDE und PBB Um den möglichen Einfluss von konzentrierter Schwefelsäure auf die Analyte zu untersuchen wurden gezielte Experimente durchgeführt. Dazu wurde in 5 mL Supelco®-Vails 2 mL von der Säure vorgelegt, sowie 500 µL eines Standards, der die Analyte in einer Konzentration von 100 ng/mL in n-Hexan enthielt (entsprechend der Bedingungen einer Aufreinigung). Für die PBDE und PBB wurden je vier so vorbereitete Vials waagerecht auf dem Schüttler positioniert, der mit 110 Schwingungen pro Minute die Phasen vermischte. Nach je 15, 45, 75 und 120 Minuten wurde je ein Vial vom Schüttler genommen, ein Aliquot der unpolaren Phase in ein 300 µL Insert-Vial überführt und mit dem GC/MS gegen den Ausgangsstandard vermessen.

Für die PBDE und PBB konnten keine Verluste durch die starke Säure festgestellt werden, was ihren persistenten Charakter bestätigte. Damit gilt es als unwahrscheinlich, dass Verluste der Analyte durch den Säure-Cleanup entstehen werden, selbst, wenn diese der Säure über zwei Stunden ausgesetzt sind.

Abb. 12: Mit Schwefelsäure versetzte Probe vor (links) und nach dem Zentrifugieren (rechts)

Schwefelsäure-Cleanup

28

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

-5.00 5.00 15.00 25.00 35.00

[%]

[min]

Zeitlicher Ultraschalleinfluss auf PBB KonzentrationPBB-Standard mit 100 ng/mL in n-Hexan in konz. Schwefelsäure

PBB 26

PBB 49

PBB 52

PBB 80

PBB 155

PBB 153

PBB 169

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

-5.00 5.00 15.00 25.00 35.00

[%]

[min]

Zeitlicher Ultraschalleinfluss auf PBDE KonzentrationPBDE-Standard mit 100 ng/mL in n-Hexan in konz. Schwefelsäure

BDE 28BDE 47BDE 100BDE 99BDE 154BDE 153BDE 183BDE 209

3.3.4.2 Ultraschall In der Diplomarbeit wurde bei der Erprobung des Säure-Cleanups zur Phasentrennung ein Ultraschalbad verwendet. Mit den dort benutzten Einwaagen von 0,5 g Fischöl und 4 mL Säure wurde die Mischung pro Cleanup-Stufe für insgesamt 8 Minuten dem Ultraschall ausgesetzt. Mit den in der Master Thesis zugrunde gelegten Einwaagen von 5 g Probe würde sich auch die Zeit die zur Phasentrennung benötigt wird entsprechend verlängern. Um auch hier den möglichen Einfluss auf die Analyte abzuschätzen wurden Experimente durchgeführt.

3.3.4.3 Beständigkeit von PBDE und PBB Gleich dem in Abschnitt 3.3.4.1 beschriebenen Vorgehen wurden in 5 mL Vials 2 mL Säure vorgelegt, zusammen mit 0,5 mL Standard (Analyt-Konzentration von 100 ng/mL). Die so präparierten Vials wurden bis zu 30 Minuten in ein laufendes Ultraschallbad gestellt. Alle 10 Minuten wurde ein Vial entnommen und ein Aliquot der n-Hexan-Phase in ein 300 µL Insert-Autosamplervial überführt und im GC/MS gegen den Ausgangsstandard vermessen.

Für beide FSM-Gruppen ergaben sich mit der Aufenthaltszeit im Ultraschall abnehmende Intensitäten der Signale um ca. 30 %, bezogen auf den Ausgangsstandard (siehe Abb. 13 und Abb. 14).

Im Falle von Realproben könnten nun Kongenere, die in geringen Konzentrationen vorliegen so weit zersetzt werden, dass sie bis unter die Nachweisgrenze der Methode ab gereichert werden.

Auch wenn tatsächliche Aufenthaltszeiten, die für die Phasentrennung von Probeneinwaagen um 5 g nicht untersucht wurden, reicht der Befund aus um von der Anwendung des Ultraschalls abzusehen.

Es ist anzunehmen, dass das diesen Schritt ersetzende Zentrifugieren mit der Dauer von 12 Minuten keine wesentliche Verlängerung der Analysezeit bedeutet, dafür aber die Phasentrennung ohne Verluste der Analyte von statten gehen kann.

Abb. 13: Relative Signalintensität der acht PBDE-Kongenere in Abhängigkeit der Aufenthaltszeit im Ultraschall

Abb. 14: Relative Signalintensität der sieben PBB-Kongenere in Abhängigkeit der Aufenthaltszeit im Ultraschall

Methodenentwicklung

29

3.3.5 Fraktionierung mit PYE-HPLC Vorversuche mit 5 g 13C12-dotiertem Fischöl zeigten nach der 3-fachen Schwefelsäure-Aufreinigung, im wesentlichen nach Abschnitt 3.3.4, und finaler Einengung auf 300 µL bei der Injektion von 1 µL zur Vermessung im GC/MS unbefriedigende Resultate (siehe Abb. 15). Die Peaks extrahierter Ionenspuren der niederbromierten 13C12-Kongenere wiesen niedrige Intensitäten auf, waren unförmig und wirkten insgesamt unscharf. Darüber hinaus wiesen die Massenspuren ein hohes Untergrundrauschen auf, was ein Hinweis auf die Anwesenheit von

eventuellen Begleitsubstanzen sein könnte.

Durch die erhöhte Menge an Matrix ist es vorstellbar, dass

eventuelle säureresistente

Begleitstoffe das Cleanup überstehen und mit injiziert werden, welche bei Untersuchungen mit geringeren Einwaagen nicht aufgefallen waren. Sind Matrixbestandteile in großer Menge vorhanden, wirken diese störend auf die Ionisierung und könnten so zu den beobachteten

geringen Intensitäten führen. Um zu überprüfen, ob unbekannte Substanzen in dem Bereich der niederbromierten Kongenere eluieren, wurde dieselbe Probe im EI-Modus vermessen, da dieser Modus ähnlich einem FID (engl. ‘flame ionizaton detector‘) organische Substanzen recht umfassend detektieren kann.

In Abb. 16 ist das EI-TIC (‘full scan‘-Modus) der Fischölprobe dargestellt. Deutlich erkennt man im Retentionsbereich der Tri-, Tetra- und Penta-Kongenere (4,5 bis 10 Dezimalminuten), dass eine beachtliche Menge an Fremdsubstanzen eluiert, die äußerst störend die Detektion der Analyte zu beeinträchtigen scheint. Diese Fremdsubstanzen werden von den m/z = 366,4 und m/z = 253,2, sowie den diesen umgebenden Custern dominiert. Auch

erste Untersuchungen mit Schweinswalproben führten zu einem ähnlichen Ergebnis, in den extrahierten Ionen-Chromatogrammen waren im vorderen Bereich viele Peaks fremder Substanzen anwesend. Dieses hohe Aufkommen von Begleitsubstanzen macht deutlich, dass die

Abb. 15: Extrahiertes Ionen-Chromatogramm (NCI-Modus) der 13C12-PBDE Quantifier-Massen einer Fischölprobe (5 g, dreifacher Säure-Cleanup, eingeengt auf 300 µL, Injektionsvolumen: 1 µL, Zielkonzentration der Dotierung: 100 ng/mL) *= Kongenere des SurrS

Abb. 16: TIC EI-Modus ‚full scan‘ der Fischölprobe. Säureresistente Substanzen überdeckt den Retentionsbereich der tri- bis pentabromierten BDE-Kongenere.

Fraktionierung mit PYE-HPLC

30

Probenaufreinigung noch erweitert werden muss, um eine ungestörtere Detektion der Analyte zu gewährleisten.

In der Literatur findet man als weitere Probenaufreinigung nach einem Schwefelsäure-Cleanup den Einsatz von säulenchromatographischen Methoden wie der GPC oder gepackte Kieselgelsäulen (siehe Abschnitt 2.4). Da die beobachteten Fremdsubstanzen Massen in der Größenordnung der Analyte und darunter haben, wird von einem auf Größenausschluss basierenden Verfahren abgesehen.

Weiter findet sich in der Literatur ein HPLC-basierendes Verfahren (Umkehrphasen HPLC), welches aufgrund der Beschaffenheit der stationären Phase sehr selektiv gegenüber aromatischen Verbindungen wie PBDE, PBB, PCB etc. ist. Verwendet wird das Verfahren für die Trennung, bzw. Fraktionierung von Mischungen der genannten Substanzfamilien (Ramos, Hernandez et al. 1998; Kannan, Sang Hee Hong et al. 2005; Gómara, García-Ruiz et al. 2006). Da sich das Maß der Trennung nach der „Planarität“ der Moleküle richtet (Haglund, Asplund et al. 1990), gelingt unter speziellen Bedingungen auch die Abtrennung der toxikologisch interessanten co-planaren Kongenere (siehe Abschnitt 2.2.2).

Die stationäre Phase dieser HPLC-Säule besteht aus Kieselgel mit über Spacer gebundene Pyren-Gruppen als organische Seitenketten (2-(1-Pyrenyl)ethyl-Gruppen). Die Pyren-Gruppen weisen durch die Ring-Strukturen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu den Analyten auf, worauf auch das Trennprinzip dieser Säule beruht. Die Analyte werden im Wesentlichen über π – π-Wechselwirkungen zwischen ihren Benzolringen und den Pyren-Ringen zurückgehalten (siehe Abb. 17), womit sich

die hohe Selektivität dieser LC-Phase ergibt. Alle sich in Lösung befindenden Bestandteile, die keine Ringstrukturen aufweisen, bzw. nicht mit den π-Elektronen wechselwirken, können so weitgehend abgetrennt werden, da sie ungehindert mit der mobilen Phase die Säule passieren. Diese LC-PYE-Fraktionierung erschien damit geeignet, um den Extrakt von störenden Bestandteilen weiter zu reinigen.

Für diesen Zweck wurde eine entsprechende Phase mit Vorsäule angeschafft, die „COSMOSIL 5-PYE Packed Column“ (250 × 4.6 mm i.d., Particle size 5 μm) von der Firma Nacalai Tesque. Des

Weiteren stand eine HPLC-Anlage der Firma Agilent Technologies zu Verfügung, ausgestattet mit einem Autosampler, Säulenofen, einem Dioden-Array-Detektor (DAD) und einem gekühlten Fraktionssammler (im Detail ist die Anlage in SOP_05 beschrieben). Die Betriebsparameter wurden an denen aus der Literatur angelehnt: mobile Phase: n-Hexan mit einem Fluss von 1 mL/min, Säulenofentemperatur auf 40 °C, Wellenlängen (DAD-λ) 220,8 nm, 230,2 nm und 280,2 nm.

Bei der Injektion eines NatS-dotierten Fischölextraktes (1 ng/µL) in die HPLC eluierte als erstes ein sehr großer Peak, gefolgt von mehreren kleinen, die als die Analyte identifiziert werden konnten (siehe Abb. 18). Durch den Fraktionssammler war es möglich, diesen großen Peak gezielt aus der Probe zu

Abb. 17: Prinzip der Pyren-Phasen-Trennung: die Analyte werden durch π – π-Wechselwirkungen (gelbe Doppelpfeile) mit den Ringen der stationären Phase zurückgehalten

Abb. 18: PYE-HPLC Chromatogramm (DAD-λ: 230,2 nm) der dotierten Fischölprobe (Injekt.-Vol.: 20 µL), geschnitten in 2 Fraktionen

Methodenentwicklung

31

entfernen. Nach der Vereinigung und der Einengung der Fraktionen wurde 1 µL in den GC injiziert. Das extrahierte Ionenchromatogramm (Quantifier) zeigte eine stark verbesserte Darstellung der Peaks (Abb. 19), weitgehend befreit von störenden Begleitsubstanzen. Dieses Ergebnis kann als Erfolg für die weitergehende Aufreinigung von Realproben gewertet werden.

Im Weiteren wurde die bisher erste Fraktion erweitert, um auszuschliessen, dass matrixbedingte Verschiebungen der Retentionszeit zu Verlusten der Analyte führen könnten. Wegen des nicht ausreichnenden Volumens der Fraktionssammlervials wurde die Fraktionierung auf drei Fraktionen (F1, F2, F3, siehe Abb. 20) umgestellt, Bei Schweinswalproben stellt sich die Situation ähnlich wie bei dem Fischöl dar. Hier eluierte ebenfalls zu Beginn ein intensiver breiter Peak, der als Summe der nicht chromatographierbaren Substanzen durch die Fraktionierung abgetrennt wurde (siehe Abb. 20).

Bei Betrachtungen von nicht fraktionierten Schweinswalproben mit GC/MS zeigte sich eine relativ hohe Belastungen an anderen organischen Schadstoffen, welche durch einen NCI-full scan unter Anderem als PCB identifiziert werden konnten. Diese dominierten nun auch im Chromatogramm der PYE-HPLC.

Aus zeitlichen Gründen wurde von einer weiteren Optimierung der PYE-HPLC-Methode, die z.B. einige PCB von bromierten Schadstoffen separieren könnte, abgesehen. Im Fokus stand hier die weitere Reinigung des Extraktes von Matrixbestandteilen, die mit der Anwendung der Pyren-Phase erreicht werden konnte.

Der vom Säure-Cleanup kommende Extrakt wird auf ein Volumen von 300 µL (N2 auf ca. 30 °C) eingeengt. Es werden zwei Aliquote von 100 µL mit der PYE-HPLC fraktioniert, die verbleibenden 100 µL werden als Rückstellprobe aufbewahrt. Die Fraktionen beider Aliqoute werden vereinigt und auf 200 µL unter Zugabe des InjS eingeengt (N2), wonach sie nun mittels GC/MS vermessen werden können.

Die Belastung der Schweinswale mit PCB führte bei der Detektion mittels GC/MS zu Interferenzen, wodurch es weiterhin zu Signalüberlagerungen kam. PBDE-28 konnte aus diesen Gründen nicht ausgewertet werden, und war damit nicht Teil der Methodenvalidierung (siehe Abschnitt 3.4). Der Frage, warum es trotz der Auswahl an spezifischen Fragment-Massen zu einer Überlagerung durch PCB kam wird in Abschnitt 5 diskutiert.

Abb. 19: Extrahiertes Ionenchromatogramm (Quantifier) vom NatS-dotierten Fischöl (1 ng/mL) nach der PYE-HPLC-Fraktionierung.

Abb. 20: PYE-HPLC Chromatogramm (DAD-λ: 230,2 nm) von 13C12-PBDE dotierten Schweinswalprobe, geschnitten in 3 Fraktionen. Injektions-Volumen: 100 µL

Validierung der Methdode

32

Basierend auf den gemittelten Einzelwerten (n =3)

BDE 28 47 100 99 154 153 183 209

r 2 0,999998 0,999995 0,999997 0,999974 0,999996 0,999981 0,999990 0,999997Steigung 320,06 189,30 641,30 214,44 427,01 300,26 508,65 2178,57

3.4 Validierung der Methode Ziel einer Methodenvalidierung ist die Überprüfung, ob ein gewähltes Analyseverfahren geeignet ist, eine vorgegebene spezifische Aufgabe zu erfüllen. Im Rahmen einer Validierung werden Leistungsmerkmale in Bezug auf den Anwendungsbereich, die Matrix und die Qualitätsanforderungen der für einen bestimmten Anwendungszweck entwickelten Verfahren festgestellt. Jedes Verfahren (oder Verfahrensvariante) muss als vorläufig eingestuft werden, solange nicht die nötige Validierungsarbeit geleistet wurde (UBA 2005).

Die validierten Schritte der Analysemethode sind in den Arbeitsvorschriften im Anhang aufgeführt. Bestandteil dieser Arbeitsvorschriften sind ebenfalls alle verwendeten Geräte und Chemikalien, die für die jeweiligen Schritte verwendet wurden (siehe SOP_01 - SOP_07).

Alle verwendeten Glasgeräte, die im Zusammenhang mit der Validierung oder damit verbundenen Untersuchungen verwendet wurden, wurden ebenfalls nach einer Arbeitsvorschrift gereinigt (SOP_07). Mittels Blindwert-Messungen wurde bestätigt, dass keine Kontaminationen durch verbleibende Analytmengen aus vorheriger Benutzung der Glasgeräte durch unvollständige Reinigung auftraten.

Für die im Folgenden beschriebene Validierung wurden sechs Aliquote eine Realprobe (Schweinswal) nach im Abschnitt 3.3 beschriebenem Vorgehen aufgearbeitet und zweckmäßig aufgestockt. Diese sechs Proben wurden zusammen mit Verfahrensblindwerten und Kalibrier-Standards in einer Probensequenz vermessen. Alle Messwerte, die für die einzelnen Leistungsmerkmale und Kenngrößen der Validierung zugrunde gelegt wurden, stammen aus dieser Messsequenz, die ein möglichst reales Bild unter angewandten Bedingungen wiedergeben sollte.

3.4.1 Kalibrierung Die Kalibrierung der PBDE und PBB wurde mit je vier Konzentrationsstufen durchgeführt. Im Falle der PBDE konnten fertige und kommerziell erhältliche Standards (Calibration Standards, CS) verwendet werden (Fa. Cambridge Isotope Laboratories). Diese Standards enthielten die nativen 8 PBDE-Hauptkongenere (siehe Abschnitt 3.1) in den Konzentrationen CS-1 bis CS-4: 1, 5, 50 und 500 ng/mL und lagen in n-Nonan vor. Des Weiteren waren die 13C12-markierten BDE-Kongenere in der konstanten Konzentration von 100 ng/mL in jedem Standard enthalten, sowie die Substanzen des InjS (siehe Abschnitt 3.2.1). Im Falle der PBB wurde aus den Einzelsubstanzen (siehe Abschnitt 3.2.1) eine Stammlösung angesetzt, in der jedes Kongener mit einer Konzentration von 2 µg/mL in n-Nonan vorlag. Aus dieser Stammlösung wurden dann vier Verdünnungen für die Kalibrierstufen in den Konzentrationen PBB-CS-1 bis CS-4: 5, 10, 50, 500 ng/mL hergestellt.

Die Kalibrierungen wurden dann nach SOP_06 fünfmal (A-E) im Rahmen einer Messsequenz mit den Realproben zusammen vermessen. Durch die relativ langen Messzeiten kann es zu einer Gerätedrift kommen, bei der sich das Konzentrations-Signal-Verhältnis ändert. Aus diesem Grund werden Blindwerte, Realproben und Kalibrierungen in der Messsequenz so arrangiert, dass immer vier dreifach vermessene Proben von drei Kalibrierungen „eingerahmt“ werden (engl. ‘bracketing‘). Die Messwerte der Quantifier aus den Kalibrierstandards wurden gemittelt und bildeten über eine gewichtete lineare Regression, übernommen aus der Diplomarbeit, die Grundlage der Quantifizierung. Die in

Tab. 11 und Tab. 12 für die PBDE wiedergegebenen quadratischen Korrelationskoeffizienten betragen zwischen 0,999965 und 1 (gerundet auf sechs Nachkommastellen) und können als sehr gut bewertet werden, da die Messwerte über einen Zeitraum von über 45 Stunden (Dauer der Messsequenz) aquiriert wurden. Tab. 11: Kenndaten der PBDE-Kalibrierung (A-C, Arbeitsbereich 1 - 500 pg/µL)

Methodenentwicklung

33

Basierend auf den gemittelten Einzelwerten (n =3)

BDE 28 47 100 99 154 153 183 209

r 2 0,999994 0,999994 0,999999 1,000000 0,999990 0,999976 0,999965 0,999999Steigung 347,62 205,22 707,15 236,94 468,53 325,34 552,66 2361,58

Basierend auf den gemittelten Einzelwerten (n =3)

PBB 26 49 52 80 155 153 169

r 2 0,999940 0,999977 0,999967 0,999970 0,999951 0,999992 0,999911Steigung 534,57 892,40 271,49 1423,84 1434,80 1020,66 2569,61

Basierend auf den gemittelten Einzelwerten (n =3)

PBB 26 49 52 80 155 153 169

r 2 0,999963 0,999981 0,999984 0,999977 0,999934 0,999989 0,999902Steigung 551,42 929,41 283,11 1501,96 1589,08 1122,96 2801,23

Mit n= 5 über eine Messdauer von ca. 45 Stunden

BDE 28 47 100 99 154 153 183 209

BDE-CS1 9,18% 9,18% 11,60% 10,17% 3,95% 8,79% 8,47% 6,94%BDE-CS2 7,88% 13,85% 7,81% 5,64% 6,99% 6,19% 8,31% 6,00%BDE-CS3 5,41% 6,57% 6,81% 8,52% 6,31% 5,80% 5,18% 4,84%BDE-CS4 6,13% 6,30% 7,55% 7,13% 7,05% 6,25% 6,46% 6,08%

Dargestellt ist die Standardabweichung der Flächencounts zum Mittelwert (n= 5) des Kongeners in der jeweiligen Konzentration (CS1-4).

Tab. 12: Kenndaten der PBDE-Kalibrierung (C-E, Arbeitsbereich 1 - 500 pg/µL)

Die Steigungen ändern sich ein wenig, was mit der Gerätedrift erklärt werden kann. Diese Abweichungen machen deutlich, dass drei Kalibrierungen innerhalb von 24 Stunden eine sinnvolle und notwendige Anzahl darstellt.

Bei der Kalibrierung der PBB stellen sich die quadratischen Korrelationskoeffizienten ein wenig schlechter dar (siehe Tab. 13 und Tab. 14), sie bewegen sich zwischen 0,999934 und 0,999992, was aber auch noch als gut bewertet werden kann. Mögliche Ursachen für die geringfügig schlechtere Korrelation könnten kleine Volumenfehler bei der manuellen Herstellung der Verdünnungen sein. Auch hier macht sich die Gerätedrift in Form der sich ändernden Steigung bemerkbar. Tab. 13: Kenndaten der PBB-Kalibrierung (A-C, Arbeitsbereich 5 - 500 pg/µL)

Tab. 14: Kenndaten der PBB-Kalibrierung (C-E, Arbeitsbereich 5 - 500 pg/µL)

3.4.2 Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit, auch bekannt unter dem Begriff Wiederholpräzision, gibt an, wie stark die Analysewerte aufgrund zufälliger Fehler streuen. Statistisch wird die Reproduzierbarkeit durch die Standardabweichung bzw. dem Vertrauensbereich beschrieben (UBA 2005).

Als quasi instrumentelle Reproduzierbarkeit wurden die Standardabweichungen der Qantifier-Flächen der PBDE- und PBB-Kalibrierungen, bezogen auf ihren arithmetischen Mittelwert herangezogen. Diese Streuung beträgt bei den PBDE-Kalibrierungen zwischen 3,95 % und 13,85 %, im Mittel 7,29 % (siehe

Tab. 15). Tab. 15: Reproduzierbarkeit als Wiederhol-Präzision der Flächencounts der nativen BDE (Quantifier)

Die Standardabweichungen der PBB-Kalibrierstandards fielen im Gegensatz zu denen der PBDE auch ein wenig größer aus. Sie betragen zwischen 2,24 % und 15,14 % und im Mittel 7,37 % (siehe

Validierung der Methdode

34

Mit n = 6 über eine Messdauer von ca. 45 Stunden

BDE 28 47 100 99 154 153 183 209

B-01 [ng/g lw] n.a. 33,16 13,16 2,54 6,67 2,25 0,06 n.n.C-01 [ng/g lw] n.a. 30,38 13,03 2,47 6,52 2,13 0,07 n.n.D-01 [ng/g lw] n.a. 29,30 13,23 2,38 6,43 2,24 0,05 n.n.

B-02 [ng/g lw] n.a. 30,99 12,83 2,49 6,36 2,02 0,05 n.n.C-02 [ng/g lw] n.a. 30,60 13,15 2,38 6,32 2,10 0,05 n.n.D-02 [ng/g lw] n.a. 30,98 13,06 2,30 6,41 2,22 0,06 n.n.

StabwMeth [ng/g lw] n.a. 1,27 0,14 0,09 0,12 0,09 0,01 n.n.StabwMeth [%] n.a. 4,11% 1,08% 3,66% 1,93% 4,16% 12,79% n.n.n.a.= nicht auswertbarn.n.= nicht nachweisbar

Mit n=5 über eine Messdauer von ca. 45 Stunden

PBB 26 49 52 80 155 153 169

PBB-CS1 14,46% 5,70% 8,61% 15,14% 7,08% 8,60% 4,09%PBB-CS2 13,74% 6,77% 6,11% 8,18% 8,52% 7,25% 3,69%PBB-CS3 5,16% 8,64% 7,56% 8,27% 9,32% 9,22% 7,11%PBB-CS4 3,69% 2,24% 4,34% 4,47% 5,99% 6,49% 5,85%

Standardabweichung der Flächencounts zum Mittelwert (n= 5) des Kongeners in der jew. Konzentration (CS-1 - 4)

Tab. 15).

Damit waren die mittleren Streuungen der beiden FSM-Gruppen relativ nahe bei einander, auch wenn die Minimal-Maximal-Streuung im Falle der PBB größer war. Bei beiden Substanzklassen traten die größeren Abweichungen vor allem in den kleineren Konzentrationen (CS-1 und CS-2) auf. Tab. 16: Reproduzierbarkeit als Wiederhol-Präzision der Flächencounts der PBB-Kalibrierung (Quantifier)

Da die Messwerte aus der Probensequenz stammen, die über 45 Stunden andauerte, ist die Gerätedrift als zufälliger Fehler hier mit inbegriffen. Wären die Standards einzeln direkt fünfmal hintereinander vermessen worden, wäre die Streuung bei solchem Vorgehen zwar kleiner, jedoch würde das keinen realen Bedingungen entsprechen.

Für die Ermittlung der Reproduzierbarkeit der gesamten Methode (Methoden-Präzision) wurde ein Probenhomogenat (Fettgewebe vom Schweinswal) nach dem in Abschnitt 3.3 entwickelten Vorgehen in sechs parallelen Ansätzen aufgearbeitet. Die sechs Ansätze wurden in zwei Blöcke (01 und 02) jeweils à drei Proben und einem Verfahrens-Blindwert (A bis D) aufgeteilt. Alle sechs Ansätze wurden mit den 13C12-PBDE-Kongeneren (als Mischstandard im SurrS) dotiert um die Quantifizierung der natürlichen Gehalte mittels der IVA zu korrigieren. Die hier zu Grunde liegende Standardabweichung ist die der vorgefundenen Belastung der einzelnen Kongenere im Fettgewebe.

Die Ergebnisse der Methoden-Präzision für die PBDE sind in Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden. wiedergegeben. Zur Quantifizierung des Blockes 01 wurden die drei gemittelten Kalibrierungen (A-C), für den Block 02 die Kalibrierung (C-D) verwendet (siehe Abschnitt 3.4.1). Da hier alle Ergebnisse auf das Fettgewicht der Probe bezogen worden sind, fließen hier ebenso die zufälligen Fehler der Einwaagen, der Volumina der Dotierung und der gravimetrisch ermittelten Fettgehalte (siehe Abschnitt 3.3.2) mit ein.

Da hier „dasselbe Verfahren am identischen Untersuchungsobjekt im selben Labor durch den selben Bearbeiter mit derselben Geräteausrüstung in den kürzesten möglichen Zeitabständen“ (UBA 2005) durchgeführt wurde, handelt es sich hier um die Methodenpräzision im Sinne des Umweltbundesamtes.

Die ermittelten relativen Standardabweichungen der Belastungen lagen zwischen 1,08 % und 4,16 %, mit Ausnahme der des BDE-183, welche, bedingt durch die geringe Konzentration, bei 12,79 % lag. BDE-28 konnte nicht ausgewertet werden, da die Quantifier- und Qualifier-Massenspuren durch Störsubstanzen Überlagert waren. BDE-209 wurde nicht nachgewiesen, was sich mit den

Methodenentwicklung

35

Mit n = 3 über eine Messdauer von ca. 23 Stunden

PBB 26 49 52 80 155 153 169B-01 [ng/g lw] n.n. 6,93 7,47 0,00 3,55 0,61 n.n.C-01 [ng/g lw] n.n. 6,89 6,92 0,00 3,66 0,63 n.n.D-01 [ng/g lw] n.n. 6,68 7,14 0,00 3,57 0,59 n.n.

sMeth [ng/g lw] - 0,13 0,28 0,00 0,06 0,02 -sMeth [%] - 1,92% 3,89% 0,00% 1,55% 3,09% -

n.n.= nicht nachweisbar

Untersuchungen in der Literatur deckt, da BDE-209 sterisch zu groß ist um in höheren Säugetieren resorbiert zu werden. Mit diesen Ergebnissen kann die Methoden-Präzision für die PBDE als gut bewertet werden.

Von den sieben untersuchten PBB (siehe Tab. 17) konnten vier Kongenere in der Schweinswalprobe nachgewiesen werden: PBB-49, -52, -155, -153. PBB-26, -80 und -169 waren nicht nachweisbar. Die Standardabweichung der gefundenen Kongenere in drei Messungen (die jeweils dreifach vermessen wurden) beträgt hier zwischen 1,92 % und 3,89 % und kann damit ebenfalls als gut angesehen werden.

3.4.3 Aufstockung und Wiederfindungsraten Die Wiederfindung stellt die Ausbeute der gesamten Methode und damit einen zentralen Leistungsparameter der Methodenvalidierung dar. Mit diesem Parameter lässt sich gut abschätzen wie hoch die Analyt-Verluste durch die Probenaufarbeitung sind und wie gut die Korrekturen durch interne Standards diese wieder kompensieren.

Die zur IVA verwendeten acht 13C12-PBDE-Kongenere (SurrS) in den sechs Aliquoten hielten zur Ermittlung der Wiederfindungsraten (WFR) der PBDE her (siehe Tab. 18). Sie wurden unmittelbar vor der Probenaufarbeitung in definierter Menge zum Homogenat hinzugegeben, womit sie die Aufarbeitung komplett durchlaufen haben. Da sie nun wie eine reine Dotierung der Realproben betrachtet wurden, greift hier auch die Volumenkorrektur nach der finalen Einengung durch den InjS. Tab. 18: Wiederfindungsraten (n = 6) dotierter 13C12-PBDE in Schweinswalproben

BDE 28 47 100 99 154 153 183 209

A-01 (Blank) 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%B-01 80.7% 77.7% 75.5% 72.1% 75.1% 69.6% 84.6% 69.6%C-01 65.6% 69.2% 67.6% 65.2% 73.0% 68.4% 80.1% 60.2%D-01 58.3% 66.8% 63.7% 62.1% 68.8% 64.3% 75.3% 59.2%

A-02 (Blank) 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%B-02 66.7% 66.2% 65.7% 63.7% 66.0% 62.4% 85.4% 62.4%C-02 64.2% 60.6% 60.5% 58.6% 64.1% 60.4% 77.7% 55.4%D-02 68.0% 65.8% 68.6% 67.1% 74.7% 68.9% 81.0% 53.8%

Mittelwert 67.3% 67.7% 67.0% 64.8% 70.3% 65.7% 80.7% 60.1%Stabw 7.4% 5.6% 5.1% 4.6% 4.6% 3.8% 3.9% 5.6%

Sechsfache Aufstockung (jeweils B-D) mit 13C12-BDE Standart mit 2000 pg Abs. (SurrS). Gehalte wurden Korrigiert mittels InjS.Die Verfahrens-Blindwerte (A-01, -02) waren frei von 13C12-BDE Kongeneren. Die Zielkonzentration der 13C12-Dotierung sollte im finalen Extrakt-Volumen 100 ng/mL betragen, dieselbe Konzentration wie in den PBDE-Kalibrierstandards. Die mittels InjS korrigierten Wiederfindungsraten betrugen zwischen 64,8 % und 80,7 %, mit Ausnahme des Deka-BDE-209, welche bei 60,1 % lag. Im Mittel betrug die WFR aller Messungen 67,9 %. Diese Wiederfindungsraten können als befriedigend bewertet werden. Die Korrekturfaktoren des InjS waren alle kleiner 1, was bedeutet, dass das tatsächliche Volumen der finalen Einengung (siehe Ende Abschnitt 3.3.5) kleiner als das beabsichtigte Volumen war.

Tab. 17: PBB-Methoden-Präzision

Nachweis- und Bestimmungsgrenzen

36

Zur Ermittlung der PBB-Wiederfindung wurde der Block 02 der Validierungsproben mit nativen Kongeneren aufgestockt. Aus Vorversuchen mit demselben Probenmaterial (ein anderes Homogenat) waren die Kongenere und Konzentration der PBB-Belastung in diesem Tier in etwa bekannt. Es wurde ein PBB-Mischstandard hergestellt, der, orientiert an diesen Konzentrationen, die PBB-Belastung um ca. den Faktor 3 aufstocken sollte. Die Konzentration von nicht in den Proben vorhandenen PBB-Kongeneren wurde mit 20 bis 30 ng/mL Extrakt des Endvolumens angesetzt. Anstatt die Probenaliquote mit einem relativ hochkonzentrierten Standard aufzustocken, berücksichtigt dieses recht individuelle Vorgehen die Größenordnung der gegebenen Belastung. Der Mischstandard wurde ebenfalls unmittelbar vor der Probenaufarbeitung hinzugegeben und hat alle Schritte dieser durchlaufen. Die so produzierten Gehalte wurden mit Korrektur des InjS quantifiziert. Mit Hilfe des nicht PBB-dotierten Block 01 konnte die Differenz zwischen Aufstockung und Gehalten der ursprünglichen Belastung gebildet werden. Die Konzentrationen des PBB-Mischstandards wurden mittels Mehrfachmessung gegen die externe Kalibrierung quantifiziert und bildete so die Grundlage der prozentualen WFR in Tab. 19. Tab. 19: Wiederfindungsraten (n=3) der PBB-Aufstockung (ca. Faktor 3 über nativer PBB-Belastung) im Schweinswal

PBB 26 49 52 80 155 153 169

B‐02 72.9% 73.6% 58.0% 100.6% 86.2% 80.4% 80.1%C‐02 71.4% 70.7% 51.2% 100.6% 78.3% 75.0% 76.4%D‐02 85.0% 87.2% 64.5% 119.1% 100.4% 93.2% 86.7%

Mittel 76.5% 77.2% 57.9% 106.8% 88.3% 82.9% 81.0%Stdabw 7.5% 8.8% 6.7% 10.6% 11.2% 9.3% 5.2%

Die prozentualen WFR der PBB-Aufstockung betrugen zwischen 57,9 % und 106,8 %, womit sie größere Schwankungen aufweisen als die WFR der 13C12-PBDE in gleichbleibender Konzentration. Das Gleiche gilt für die Standardabweichungen der PBB-WFR, welche fast um einen Faktor 2 größer sind als die der PBDE. Im Mittel sind die WFR der PBB mit 81,5 % jedoch höher als die der PBDE, und können insgesamt als gut bewertet werden, abgesehen von PBB-52, bei welchem die WFR mit knapp 58 % als befriedigend eingestuft wird. Die etwas größeren Schwankungen der WFR und der Standardabweichung erklären sich vermutlich zum Einen mit der schwächeren MS-Response der PBB, zum Anderen, durch das niedrige Konzentrationisniveau, welches ca. um den Faktor 3 bis 5 unterhalb der PBDE liegt.

3.4.4 Nachweis und Bestimmungsgrenzen (NG, BG) Allgemein handelt es sich bei der Nachweis- und Bestimmungsgrenze um die kleinste Konzentration eines Analyten in einer Probe, welche noch qualitativ bzw. quantitativ bestimmt werden kann. Dabei stellt die Nachweisgrenze eine Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten dar. Die Bestimmungsgrenze ist diejenige Konzentration, von der ab die Messung eine vorgegebene Anforderung an die Präzision erfüllt (UBA 2005).

Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze existieren verschiedene Verfahren. Ein verbreitetes ist in Form der DIN 32645 für kalibrierfähige Verfahren gegeben. Hier bildet die Grundlage der Ermittlung dieser Grenzen eine Kalibrierung mit gewissen Anforderungen (Kalibrierung mit 10-Punkten, äquidistante Konzentrationen, Varianzhomogenität etc.). Die Ermittlung bei diesem Verfahren richtet sich nach einem Vertrauensband, welches die lineare Kalibirerfunktion umhüllt und sich aus statistischen Kenngrößen (Standardabweichungen, Quadratsummen, t-Test, etc.) errechnet lässt. Da sich schon in meiner Diplomarbeit zeigte, dass die Voraussetzung der Varianzhomogenität nicht erfüllt werden konnte und des Weiteren 10 äquidistant konzentrierte Standards nicht praktikabel in dem betrachteten Konzentrationsberiech sind, konnte das DIN-Verfahren nicht verwendet werden. Für eine gewichtete und nicht äquidistante Kalibrierung ist noch kein DIN-Verfahren zur Ermittlung der NG und BG vorhanden.

Ein anderes Vorgehen zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen, insbesondere bei chromatographischen Analysetechniken, basiert auf dem so genannten Signal- zu

Methodenentwicklung

37

Rauschverhältnis. Hier werden diese Grenzen als Vielfache des Untergrundrauschens (engl. ‘noise‘) definiert, die das Signal (engl. ‘signal‘) des Analyten erbringen muss. Eine weit verbreitet Definition setzt die Nachweisgrenze als dreifaches Untergrundrauschen (engl. ‘signal-to-noise‘: s/n = 3) fest, die Bestimmungsgrenze als s/n = 10.

3.4.4.1 Instrumentell Die instrumentellen Nachweis- und Bestimmungsgrenzen (NGi, BGi) wurden hier nach dem Signal- zu Rauschverhältnis ermittelt. Für Die PBDE wurde das s/n-Verhältnis des kleinsten Kalibrierstandards CS-1 (1 ng/mL) aus der Messsequenz (Kalibrierung A bis E) extrapoliert. Da sich diese Verhältnisse im Mittel zwischen 2,5 und 13,5 bewegten, konnte die Extrapolation auf s/n=3, bzw. s/n=10 als zulässig betrachtet werden (siehe Tab. 20). Die Signal- zu Rauschverhältnisse des Deka-BDE-209 waren aufgrund der zehnfachen Konzentration der Standards für eine Extrapolation zu hoch. Da dieses Kongener hier jedoch von untergeordneter Relevanz ist, wurde von weiteren Verdünnungen abgesehen. Die ermittelten NGI und BGI werden aus diesem Grund sicherheitshalber um 100 % erhöht und sind nur als eine Annäherung zu betrachten. Tab. 20: PBDE Signal- zu Rauschverhältnis (s/n) ermittelt auf Grundlage des BDE-CS-1(1 pg/µL)

"Pk‐pk S/N = Corrected signal/Pk‐pk noise"

BDE  28 47 100 99 154 153 183 209

Kalib. A 5.8 2.6 14.8 11.6 11.3 5.5 14.4 220.1Kalib. B 7.3 2.4 16.4 10.8 9.3 4.6 13.4 220.1Kalib. C 7.7 2.2 12.6 6.3 7.6 6.6 11.0 248.6Kalib. D 7.3 2.8 11.1 9.6 11.9 7.3 13.4 240.7Kalib. E 5.9 2.7 12.8 6.4 11.8 8.2 14.9 309.8

Mittel 6.8 2.5 13.5 8.9 10.4 6.4 13.4 247.9NGI [pg] 0.4 1.2 0.2 0.3 0.3 0.5 0.2 0.1

BGI [pg] 1.5 3.9 0.7 1.1 1.0 1.6 0.7 0.4

Definiert ist nach der Metode des Signal‐ zu Rauschverhältnis die NG mit s/n = 3:1, die BG mit s/n = 10:3

Die NG und BG des BDE 209 ist eine Annäherung durch zu grosses Interpolationsinterval Die so ermittelten instrumentellen Nachweisgrenzen für BDE-28 bis BDE-183 betragen zwischen 0,2 und 1,2 pg absolut. Die Bestimmungsgrenzen ergeben sich zwischen 0,7 und 3,9 pg absolut.

Im Falle der PBB zeigte sich, dass die s/n-Verhältnisse des CS-1 (5 pg/µL) von Kongener PBB-49, -80, -153, -155 und -169 (im Mittel s/n = 20 - 30) für eine Extrapolation zu groß waren. Aus diesem Grund wurde eine weitere Verdünnung hergestellt, der PPB-CS-0 mit einer Konzentration von 1 pg/µL. Der CS-0 und der CS-1 wurden je dreimal vermessen und auf dieser Grundlage (Zweipunkt-Kalibrierung) die NGi und BGi bestimmt (siehe Tab. 21).

Nachweis- und Bestimmungsgrenzen

38

Tab. 21: PBB Signal- zu Rauschverhältnis (s/n) ermittelt auf Grundlage des PBB-CS-0 (1 pg/µL) und CS-1 (5 pg/µL)

"Pk‐pk S/N = Corrected signal/Pk‐pk noise"

s/n 26 49 52 80 155 153 169

PBB‐CS0 1.5 2 0.8 3.3 4 3.4 2.3PBB‐CS0 3.5 7.4 2.7 6.3 6 5 10.6PBB‐CS0 3.1 7 1.5 7.9 8.4 5.4 7PBB‐CS1 5.9 22.5 5.6 16.9 27.9 25.5 22.9PBB‐CS1 7.1 19.4 10.2 14 30.6 25.5 24.9PBB‐CS1 7.7 21.8 6.1 19.6 30.6 21.4 22.9Mittel CS0 2.7 5.5 1.7 5.8 6.1 4.6 6.6Mittel CS1 6.9 21.2 7.3 16.8 29.7 24.1 23.6

NGI [pg] 2.9 0.8 2.1 1.1 0.5 0.6 0.7BGI [pg] 9.5 2.5 7.1 3.6 1.7 2.0 2.4

Definiert ist nach der Metode des Signal‐ zu Rauschverhältnis die NG mit s/n = 3:1, die BG mit s/n = 10:1

Die instrumentellen NGi und BGi der PBB betragen zwischen 0,5 und 2,9 bzw. zwischen 1,7 und 9,5 pg absolut, womit sie sich deutlich oberhalb der Grenzen der PBDE bewegen.

3.4.4.2 Gesamtverfahren Die Methoden-Nachweis- und Bestimmungsgrenzen (NGM und BGM) für das Gesamtverfahren wurden rechnerisch auf der Grundlage der instrumentellen Werte ermittelt, da keine unbelastete Matrix zur Verfügung stand. Die in Abschnitt 3.3 besprochenen und ausgewählten Rahmenbedingungen sehen u. a. eine Probeneinwaage von 5 g Fettgewebe vor, sowie die Einengung des Gesamtextraktes auf 300 µL (anschließend wird mit Aliquoten weitergearbeitet). In der für die Validierung verwendeten Realprobe wurde der Fettgehalt mit 96,06 % ± 0,84 % (n=6) bestimmt, womit der Bezug auf 5 g Fettgewicht eine hinreichend genaue Abschätzung ist. Verrechnet mit diesen Rahmenbedingungen ergeben sich die NGM und BGM für das Gesamtverfahren der PBDE in Tab. 22 und der PBB in Tab. 23. Tab. 22: Aus „instrumentellen“ Werten abgeschätzte PBDE-NGM und BGM für das Gesamtverfahren

BDE  28 47 100 99 154 153 183 209

NGM [ng/g lw] 0.03 0.07 0.01 0.02 0.02 0.03 0.01 0.01

BGM [ng/g lw] 0.09 0.24 0.04 0.07 0.06 0.09 0.04 0.02

Tab. 23: Aus „instrumentellen“ Werten abgeschätzte PBB-NGM und BGM für das Gesamtverfahren

PBB 26 49 52 80 155 153 169

NGM [ng/g lw] 0.17 0.05 0.13 0.07 0.03 0.04 0.04

BGM [ng/g lw] 0.57 0.15 0.43 0.22 0.10 0.12 0.14

Um die Brauchbarkeit der Methode anhand der ermittelten NGM und BGM abschätzen zu können sind zum direkten Vergleich in Tab. 24 gefundene PBDE-Minimalkonzentrationen (in ng/g lw) in Schweinswalen aus der Literatur gegeben. Anhand dieser Minimalkonzentrationen ist ersichtlich, dass die Bestimmungsgrenzen dieser Methode ausreichend niedrig wären, um selbst in Lebergewebe PBDE-Kongenere quantitativ zu detektieren. Tab. 24: PBDE-Minimalkonzentrationen in Schweinswalen (Literatur)

28 47 100 99 154 153 183 209

Schweinswal Fettgewebe (n =3) 1) 7.6 245.0 47.0 43.0 12.0 5.6 k.A. k.A.Schweinswal Lebergewebe (n =3) 1) 5.0 1.2 0.3 0.5 0.2 0.1 k.A. k.A.

BDE [ng/g lw]

1) (Boon, Lewis et al. 2002) k.A. = keine Angaben

Methodenentwicklung

39

Wie oben beschrieben handelt es sich bei den ermittelten Werten um Hochrechnungen, die auf Grundlage von Kalibrierstandards erfolgten. Im Falle von Realproben sind verbleibende Matrixbestandteile und andere organische Schadstoffe anwesend, die durch Signalüberlagerung und Erhöhung des Untergrundrauschens die Detektion erschweren können, was während Vorversuchen und der Validierung mit der Realprobe beobachtet wurde (siehe Abschnitt 5). Somit ist davon auszugehen, dass sich die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen, abhängig von der Beschaffenheit der jeweiligen Realprobe, noch geringfügig erhöhen können.

Realproben

40

Pp 2898 Pp 3024 Pp 3299 Pp 3195 Pp 3204 Pp 3338 Pp 3007 Pp 3070 Pp 3318FundortFettgehalt [%] 90.51% 89.06% 94.10% 90.08% 92.23% 92.97% 42.82%* 94.01% 87.83%Σ7‐PBDE [ng/g] (lw) 702.1 134.6 77.3 186.1 159.2 124.8 154.1 556.9 690.0

Σ7‐PBB [ng/g] (lw) 21.9 23.7 7.5 8.5 4.8 16.3 21.8 86.3 22.7

*= Fettgehalt bezogen auf den aufgefüllten Extrakt, siehe Probenprotokoll im Anhang

NordseeOstseeElbe

4 Realproben Die validierte Methode wurde exemplarisch auf einen Satz von 9 Schweinswalproben angewendet. Die Proben wurden in Plastiktüten (PE) vom Forschungs- und Technologiezentrum Westküste in Büsum (FTZ) zur Verfügung gestellt und im Labortiefkühlschrank bei -18 °C verwahrt. Bei diesen Proben handelt es sich überwiegend um Todfunde von verendeten Tieren, die zwischen 2004 und 2006 in der Nord- und Ostsee, sowie in der Elbe geborgen wurden. Eine Übersicht der Grunddaten ist in Tab. 25 gegeben. Tab. 25: Übersicht der Grunddaten der analysierten Schweinswalproben.

Gruppe Kennung Geschlecht Fundjahr Fundort Beifang Länge [cm] Gewicht [kg] Alter

Pp 2898 m 2005 Krautsand nein 98 14 jElbe Pp 3024 w 2005 Kolmar nein 154 47 a

Pp 3299 m 2006 Brookdorf nein 113 23 j

Pp 3195 m 2005 Kerteminde ‐ ‐ ‐ jOstsee Pp 3204 m 2006 Kerteminde ja 108 19 j

Pp 3338 m 2006 Kerteminde nein 118 32 j

Pp 3007 m 2005 Sylt nein 111 17 jNordsee Pp 3070 m 2004 Sylt nein 81 10 j, nn

Pp 3318 m 2006 Sylt nein 112 18 j

‐ = Keine Informationen vorhanden m/w = männlich/weiblich a / j / nn = adult / juvenil / neo natal Die Proben wurden nach SOP_01 bis SOP_06 aufgearbeitet und vermessen. Auffällig bei der Aufarbeitung der Proben war die unterschiedliche Farbe und Konsistenz der Gewebe. Leider geht aus den Grunddaten weder hervor, von welcher Stelle des Körpers die Proben genommen wurden, noch in welchem Zustand der Verwesung die Tiere bei den Probenahmen waren. Auch kann nicht angegeben werden, wann innerhalb des Fundjahres (ob z.B. im Januar oder im Dezember) das Tier geborgen wurde.

4.1 Ergebnisse Bei der Probe Pp 3007 war nur eine geringe Probenmenge vorhanden, dessen Volumen nicht zum Dispergieren ausreichte. Aus diesem Grunde musste die mittels Skalpell vorzerkleinerte Probe mit ca. 5 mL n-Hexan aufgefüllt werden um die Homogenisierung zu ermöglichen. Dadurch konnten leider keine Exakte Einwaage und der prozentuale Fettgehalt der Probe bestimmt werden. Bei allen andern Proben betrug der Fettgehalt bezogen auf die Einwaage zwischen 89,06% und 94,10% (siehe Probenprotokolle im Anhang).

Es zeigte sich, dass die PBDE-Gehalte der hochabundanten Kongenere (BDE-47 und -100) in einer so hohen Konzentration vorlagen, das diese außerhalb des Arbeitsbereiches der Kalibrierung waren. Dies traf für alle 9 Proben zu, weshalb diese im Verhältnis 1:10 oder 1:20 (mit n-Nonan) verdünnt werden mussten und nochmals vermessen wurden.

Wie bei der zur Methodenvalidierung herangezogenen Realprobe, konnte in den hier vermessenen neun Proben eine Vielzahl von nicht identifizierbaren Peaks beobachtet werden, die ihrem Anschein nach von PCB stammen, mit denen die Tiere scheinbar stark belastet sind. Des Weiteren kann aufgrund der betrachteten extrahierten Ionenspuren gemutmaßt werden, dass sowohl unbekannte PBDE als auch PBB in den Tieren vorhanden sind, die in den entsprechenden SIM-Gruppen ähnliche Fragmentierungsmuster erzeugten. Eine Übersicht der Ergebnisse ist in Tab. 26 gegeben. Tab. 26: Übersicht prozentualer Fettgehalte der Einwaagen, PBDE- und PBB-Gesamtbelastung als Summen

Realproben

41

Pp 2898 403 ± 2.2 159.45 ± 0.08 87.4 ± 0.69 38 ± 1.8 14.8 ± 0.9 0.21 ± 0.02 n.n. ± ‐

Pp 3024 35 ± 1.7 40.37 ± 0.29 14.6 ± 0.60 32 ± 1.1 11.7 ± 0.7 1.36 ± 0.15 n.n. ± ‐

Pp 3299 53.21 ± 0.37 13.34 ± 0.50 3.3 ± 0.10 5.6 ± 0.14 1.79 ± 0.08 0.04 ± 0.01 n.n. ± ‐

Pp 3195 103.3 ± 0.54 33.84 ± 0.32 30.0 ± 0.65 12.6 ± 0.5 6.2 ± 0.1 0.11 ± 0.01 n.n. ± ‐

Pp 3204 114 ± 1.4 19.39 ± 0.23 13.61 ± 0.02 7.9 ± 0.3 4.4 ± 0.1 0.01* ± 0.00 n.n. ± ‐

Pp 3338 54 ± 5.0 17.07 ± 0.12 24.7 ± 0.12 20.4 ± 0.2 8.8 ± 0.1 0.1 ± 0.00 n.n. ± ‐

Pp 3007 93.34 ± 0.39 30.47 ± 0.07 10.0 ± 0.22 15.7 ± 0.3 4.33 ± 0.09 0.28 ± 0.01 n.n. ± ‐

Pp 3070 142 ± 2.6 195 ± 6.3 93.3 ± 0.55 86 ± 3 39.06 ± 0.61 1.13 ± 0.07 n.n. ± ‐

Pp 3318 258 ± 7.4 194 ± 6 130 ± 4.2 71 ± 1 35.94 ± 1.38 0 ± 0.00 n.n. ± ‐

n.n. = nicht nachweisbar * = kleiner BG

BDE‐183 BDE‐209BDE‐47 BDE‐100 BDE‐99 BDE‐154 BDE‐153

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

BDE-47 BDE-100 BDE-99 BDE-154 BDE-153 BDE-183 BDE-209

BD

E-X

/BD

E-4

7 [%

]

BDE-Profil normiert auf BDE-47 (n=9)

4.1.1 PBDE-Konzentrationen Von den acht untersuchten PBDE-Hauptkongeneren konnten in fast jeder Probe sechs nachgewiesen werden. BDE-28 konnte auch hier aufgrund von sich überlagernden Signalen nicht ausgewertet werden, wie es schon bei den Proben zur Methodenvalidierung bereits der Fall war. Damit fällt BDE-28 aus den weiteren Betrachtungen heraus. BDE-209 wurde in keiner Probe nachgewiesen. In Tab. 27 sind die Konzentrationen bezogen auf das Fettgewicht der Probe wiedergegeben, sowie die Standardabweichungen. Tab. 27: PBDE Konzentrationen in den 9 Proben, alle Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung [ng/g lw]

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Pp 2898 Pp 3024 Pp 3299 Pp 3195 Pp 3204 Pp 3338 Pp 3007 Pp 3070 Pp 3318

Prozentuales ∑7‐PBDE‐Muster  

BDE‐209

BDE‐183

BDE‐153

BDE‐154

BDE‐99

BDE‐100

BDE‐47

Abb. 21: Prozentuales Σ7-PBDE-Muster der 9 Proben (Anteile bezogen auf die Summe).

Die prozentuale PBDE-Verteilung, basierend auf der Σ7-PBDE (BDE-47 bis BDE-183) ist in Abb. 21 dargestellt. Bis auf Probe Pp 3024 und Pp 3070 macht BDE-47 anteilig das häufigste Kongener aus (meist >50%), wie es auch in der Literatur häufig berichtet wird. Des Weiteren bilden BDE-100 und BDE-99 mit die größten Anteile der PBDE-Gesamtbelastung.

In Abb. 22 ist eine auf BDE-47 normierte Darstellung mit Standardabweichung des BDE-Profils gegeben. Abb. 22: PBDE-Profil normiert auf BDE-47 und Standardabweichungen

Realproben

42

Pp 2898 n.n. ± ‐ 7.7 ± 0.3 5.8 ± 0.10 n.n. ± ‐ 4.0 ± 0.2 4.4 ± 0.2 n.n. ± ‐

Pp 3024 n.n. ± ‐ 6.8 ± 0.4 3.20 ± 0.02 n.n. ± ‐ 10.4 ± 0.5 3.4 ± 0.2 n.n. ± ‐

Pp 3299 n.n. ± ‐ 4.3 ± 0.2 1.68 ± 0.04 n.n. ± ‐ 1.29 ± 0.03 0.17 ± 0.01 n.n. ± ‐

Pp 3195 n.n. ± ‐ 3.69 ± 0.02 3.4 ± 0.1 n.n. ± ‐ 1.14 ± 0.02 0.30 ± 0.01 n.n. ± ‐

Pp 3204 n.n. ± ‐ 1.7 ± 0.1 2.32 ± 0.04 n.n. ± ‐ 0.56 ± 0.01 0.18 ± 0.01 n.n. ± ‐

Pp 3338 n.n. ± ‐ 4.1 ± 0.2 3.0 ± 0.1 n.n. ± ‐ 8.32 ± 0.07 0.76 ± 0.01 n.n. ± ‐

Pp 3007 n.n. ± ‐ 11.7 ± 0.8 3.25 ± 0.03 n.n. ± ‐ 5.89 ± 0.11 0.95 ± 0.04 n.n. ± ‐

Pp 3070 n.n. ± ‐ 33 ± 2.3 7.9 ± 0.6 n.n. ± ‐ 33.9 ± 0.7 11.7 ± 0.2 n.n. ± ‐

Pp 3318 n.n. ± ‐ 10.0 ± 0.97 3.65 ± 0.02 n.n. ± ‐ 6.65 ± 0.2 2.39 ± 0.06 n.n. ± ‐

n.n. = nicht nachaweisbar

PBB‐169PBB‐49 PBB‐52 PBB‐80 PBB‐155 PBB‐153PBB‐26

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

PBB-26 PBB-49 PBB-52 PBB-80 PBB-155 PBB-153 PBB-169

PB

B-X

/PB

B-4

9 [%

]

PBB-Profil normiert auf PBB-49 (n=9)

4.1.2 PBB-Konzentrationen Von den sieben untersuchten PBB-Kongeneren konnten PBB-49, -52, -155 und 153 in allen Proben nachgewiesen werden, die Konzentrationen und deren Standardabweichungen sind in Tab. 28 gegeben. Tab. 28: PBB Konzentrationen in den 9 Proben, alle Angaben in Mittelwert ± Standardabweichung [ng/g lw]

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Pp 2898 Pp 3024 Pp 3299 Pp 3195 Pp 3204 Pp 3338 Pp 3007 Pp 3070 Pp 3318

Prozentuales ∑7‐PBB‐Muster  

PBB‐169

PBB‐153

PBB‐155

PBB‐80

PBB‐52

PBB‐49

PBB‐26

Abb. 23: Prozentuales Σ7-PBB-Muster der 9 Proben (Anteile bezogen auf die Summe).

Die in Abb. 23 dargestellte prozentuale Verteilung der vier gefundenen PBB-Kongenere wird in den meisten Proben von PBB-49 und PBB-52 dominiert.

In Abb. 24 findet sich eine auf PBB-49 normierte Darstellung des PBB-Profils mit Standardabweichungen.

Abb. 24: PBB-Profil normiert auf PBB-49 und Standardabweichungen

Diskussion

43

5 Diskussion Die in dieser Master Thesis entwickelte Analysemethode erlaubt die Bestimmung zweier Gruppen bromierter Flammschutzmittel (PBDE und PBB) im Fettgewebe mariner Säugetiere. Ausgehend von einer GC/MS-Methode für PBDE, die Gegenstand meiner Diplomarbeit war, wurde das Substanzspektrum der Methode auf ausgewählte Kongenere der PBB ausgeweitet. Des Weiteren wurden Methoden und Techniken der Extraktion und Probenaufreinigung etabliert, welche zusammen mit der weiter modifizierten GC/MS-Methode, die Analysemethode darstellt. Die Auswahl der Methoden wurde nach Gesichtspunkten der Robustheit und einfachen Handhabbarkeit hinsichtlich eines Routinebetriebes getroffen, bei einem ausgewogenen Aufwand-zu Nutzen-Verhältnis.

Die Probenaufarbeitung und GC/MS-Analyse stellt sich wie folgt dar. Eine Gewebeprobe wird mittels Skalpell von Hand vorzerkleinert und mit Hilfe eines Dispergier-Werkzeuges (ULTRA -TURRAX®) zu einer homogenen Phase gebracht. Das Homogenat wird mit internen Standards dotiert (IVA) und mit Natriumsulfat zu einer pastösen Masse gebracht. Die Extraktion der Probe findet nach dem Verfahren nach Soxhlet mit einem semipolaren Extraktionsmittel für sechs Stunden statt, wodurch ein fetthaltiger Extrakt entsteht. Nachdem dieser Extrakt von dem Großteil des Extraktionsmittels befreit wurde, wird das Fett recht umfassend mit einem Schwefelsäure-Cleanup entfernt. Verbleibende und säureresistente Matrixbestandteile werden mit einer LC-Fraktionierung (Umkehrphasen-HPLC) des Extraktes auf einer Pyrenphase entfernt. Die Fraktionen werden vereinigt, dotiert (InjS) und eingeengt, wonach sie bereit für die Injektion in den GC sind. Die Injektion findet über einen On-Column-Injektor auf eine Siltek®-deaktivierte Vorsäule statt, der eine 15 m lange DB5-MS Dünnfilmsäule nachgeschaltet ist. Die Ionisierung erfolgt im NCI, die Messung auf PBDE bzw. PBB-Fragmenten. Im Folgenden werden die wichtigsten Schritte z. T. bewertend dargestellt und diskutiert.

Die Vorzerkleinerung von Hand ist ein erster und unumgänglicher Schritt bei dem Großteil der unter Abschnitt 2.4 beschriebenen Varianten der Probenaufarbeitung. Insbesondere die Entfernung von Probenbestandteilen, die nicht dem Fettgewebe zu zuordnen sind, wie z.B. Schwarte oder Muskel ist Teil dieses Schrittes. Durch den Einsatz des ULTRA -TURRAX®, in Verbindung mit 22 mL- Supelco®-Vials können auch relativ kleine Probenmengen aufgearbeitet werden. Durch das Homogenisieren und anschließende Verwahren der Probe im selben Vial ist unnötiger Probenkontakt und die Gefahr der Kreuzkontamination mit weiteren Geräten und Gefäßen wie z.B. einen Mörser minimiert.

Die Soxhlet-Extraktion stellt eine wohlbekannte und robuste Methode dar, die sehr gute Ausbeuten erzielen kann. Die Handhabung ist übersichtlich und auch mehrere parallele Extraktionen lassen sich gut kontrollieren. Die einzelnen Glasgeräte lassen sich gut und gründlich reinigen. Die Extraktionszeit könnte hier, hinsichtlich eines Routinebetriebs, einen Nachteil darstellen, auch der Auf- und Abbau, sowie das Reinigen aller Komponenten ist mit recht viel Handarbeit verbunden. Des Weiteren zeigte sich die generelle Brauchbarkeit der gewählten Extraktionsparameter auch für andere POP, wie PCB-Kongenere, welche erfolgreich mit in den Extrakt überführt wurden konnten.

Das Befreien der hergestellten Extrakte von dem Extraktionsmittel mittels Rotationsverdampfer stellt quasi den zeitlichen Engpass der Methode dar. Durch die erforderlichen Waschschritte zwischen den Proben, trotz einer relativ geringen Menge eines leicht flüchtigen Lösungsmittels, nimmt dieser Vorgang bei einem Satz von vier Proben und einem Rotationsverdampfer, gut einen Arbeitstag in Anspruch. Im Fall der Routineanalytik wäre der parallele Betrieb von zwei Rotationsverdampfer empfehlenswert.

Durch den Cleanup mit konzentrierter Schwefelsäure konnte eine recht weitreichende Abtrennung des Fettes aus den Extrakten erzielt werden. Die Analyte werden aus der Fett-Säure-Emulsion mit n-Hexan heraus gewaschen, welches sich durch das Zentrifugieren oberständig absetzt. Das mehrfache Auswaschen und Zentrifugieren bedarf ebenfalls Zeit und einen gewissen Aufwand für die Durchführung, ist aber mit einfachen und soliden Mitteln umsetzbar. Um dieses Maß der Fettabtrennung zu erreichen, werden in der Literatur kosten- und materialintensive halbpräparative Methoden eingesetzt, die mit dem simplen Säurecleanup abzukürzen sind. Großer Vorteil von einigen dieser technisierten Methoden ist die Automatisierbarkeit, die Arbeitszeit und Personaleinsatz senkt und den Probendurchsatz steigert.

Diskussion

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Durch die PYE-HPLC konnte die Aufreinigung der Extrakte von säureresistenten Matrixbestandteilen erheblich verbessert werden.

Neben dem für die PBB angepassten Temperaturprogramm des GC wurde der Umfang der SIM-Massen um je drei Qualifier pro Kongener erweitert, um mehr Spezifität zu erreichen und eine besserer Identifikation in komplexen Matrices sicher zu stellen. Damit ist das Maß an simultaner Detektion in einem GC/MS-Lauf (bei maximal 12 Massen pro SIM-Gruppe) zu der das Massenspektrometer fähig ist quasi erschöpft, da bei der nötigen ‘cycle time‘ die Peaks im unteren Konzentrationsbereich gerad noch mit 10 bis 15 Messpunkten erfasst werden können. Die zum Teil bekannten Koelutionen von PBDE und PBB stellen aufgrund der SIM-Massen der höheren Fragmente kein Problem dar, wie es im Falle der Messung auf den unspezifischen Brom-Isotopen der Fall wäre.

Die im Rahmen der Methodenvalidierung ermittelten Parameter (WFR, NG, BG, Präzision, etc.) stellen eine Momentaufnahme der Leistungsfähigkeit dar und sollten im Routinebetrieb weiter überprüft werden. Insbesondere Aussagen über die Robustheit können nur im längeren Betrieb gemacht werden.

Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen sind auf der Grundlage von vermessenen Standards ermittelt worden, da keine unbelastete Matrix für diesen Zweck zur Verfügung stand. Aus diesen Gründen sind die NGM und BGM der Gesamtmethode insoweit theoretischer Natur, als in Realproben viele störende Signale durch Matrixbestandteile und anderen organische Schadstoffe vorhanden sind, die einen Nachweis oder eine quantitative Detektion in den ermittelten Grenz-Konzentrationen nicht zulassen. Dies hat sich in der Schweinswalprobe zur Validierung bei dem Kongener PBDE-28 gezeigt. Hier kam es auf der Quantifier-Massenspur des BDE-28 (m/z = 327,0) zu einer Überlagerung der Signale, sehr wahrscheinlich durch andere persistente organische Schadstoffe. In Abb. 25 sind die Massenspuren des BDE-28 einer Validierungsprobe (schwarz), des BDE-CS-3 (50 ng/mL) (blau) und des CS-4 (500 ng/mL) (rot) übereinandergelegt dargestellt. In der Probe ist deutlich das Tailing eines großen Peaks zu erkennen, welches über die Retentionszeit des dreifachbromierten BDE-Kongeners streicht. Anhand der darüber dargestellten Signale der Standards kann abgeschätzt werden, dass in dem Tailing ein Peak von ca. 100 pg Platz finden würde. Auf den Massenspuren der Qualifier des BDE-28 sieht die Situation ähnlich aus.

Um diese scheinbare Überlagerung genauer aufzuklären wurde eine Validierungsprobe im NCI ‘full scan‘-Modus vermessen, wobei der aufgezeichnete Massenbereich von 70 bis 900 m/z reichte. Durch die Betrachtung ausgewählter Massenspuren (extrahierte Ionen-Chromatogramme) der fünf- bis siebenfach chlorierten PCB-Massen (errechnet aus den IUPAC-Standard Atommassen), wurde ersichtlich, dass im Bereich der Retentionszeit des PBDE-28 sechsfach chlorierte

PCB in hoher Abundanz in der Probe anwesend waren. Ähnlich den PBDE und PBB werden hier die Hauptfragmente durch [M-]- oder [M-Cl]- gebildet. Im Falle eines HexaPCB ergeben sich damit die Massen m/z = 360,9, bzw. m/z = 325,4. Durch die Massenvariation der natürlichen Isotopenverteilung (35Cl:37Cl ≈76: 24) kommt es durch die hohe Abundanz des unbekannten PCB-Kongeners zu der beobachteten Überlagerung der Signale auf der Masse m/z = 327.

Mit Ausnahme des PBDE-28 sind die ermittelten NGM und BGM als sehr gut zu bewerten und hinreichend niedrig um die Gehalte von PBDE und PBB in Realproben zu erfassen. Die hier ermittelten Bestimmungsgrenzen für die PBDE liegen in dem Bereich von 0,04 - 0,24 ng/g lw und für die PBB-Kongenere zwischen 0,10 und 0,43 ng/g lw. In der Literatur werden für LRMS im NCI und der Detektion von PBDE auf den Brommassen Bestimmungsgrenzen von 0,1 bis 1,0 ng/g lw angegeben (Stapleton, Dodder et al. 2006; Wolkers, Hammill et al. 2006). Damit liegen die hier bestimmten Grenzen mit den optimierten Bedingungen noch unter den angegebenen Bereichen, bei deutlich höherer Spezifität. Im Vergleich zu mit HRMS und MSn ermittelten Grenzen, die sich

Abb. 25: Überlagerung der Quantifier-Massenspuren BDE-28: Realprobe (schwarz), CS-3 (blau) und CS-4 (rot)

Diskussion

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zwischen 0,0001 und 0,041 ng/g lw (für PBDE und PBB) belaufen (Christensen, MacDuffee et al. 2005; Fernandez, Araque et al. 2007), schließen die hier ermittelten Bestimmungsgrenzen für die PBDE direkt im oberen Bereich an.

Die unter der Anwendung der IVA ermittelte Methoden-Präzision beträgt für alle Kongenere mit denen die Realproben belastet waren zwischen 1,08 und 4,16%, mit Ausnahme des BDE-183 (12,79%), und kann damit als gut bewertet werden.

Um die Validierung der Methode zu komplettieren wären neben Vergleichsmessungen derselben Probe mit anderen Analysegeräten und Verfahren auch die Vermessung eines zertifizierten Referenzmaterials erforderlich oder die Teilnahme an einem Ringversuch. Diese Maßnahmen standen nicht ohne erheblichen Aufwand zur Verfügung und wären im Rahmen der Masterarbeit schwer zu leisten gewesen.

Durch die mehrfachen Vermessungen von Realproben durch die Validierung der Methode und den untersuchten neun Schweinswalen ergab sich eine Art Routinebetrieb, der nun erste Aussagen über die Robustheit der Methode zulässt, welche zur Zeit der Methodenvalidierung nicht gemacht werden konnten. Trotz der Verwendung einer Vorsäule, auf der quasi ein Online-Cleanup der Probe stattfindet, da höher siedende Matrixbestandteile dort zurückbleiben, zeigte sich, dass nach etwa 60 Injektionen von Realproben, die Ionenquelle des Massenspektrometers gereinigt werden musste. Die Verunreinigung der Ionenquelle stört die Ionisierung, wodurch die Bildung der erwarteten Fragmente abnimmt, was einen starken Signalverlust zur Folge hat.

Durch die im ersten Durchgang gefundenen und für den Arbeitsbereich der Kalibrierung zu hohen Gehalte an PBDE mussten die Proben nochmals in verdünnter Form (1:10 bzw. 1:20) vermessen werden, was für alle neun Proben zutraf. Durch diese Tatsache könnte über eine nicht ganz so weite Einengung der Extrakte nach der Fraktionierung nachgedacht werden, oder diese für nur ein Aliquot durchzuführen. Dies hätte weiter zur Folge, dass die eingetragenen Verunreinigungen damit reduziert werden, und die Anzahl der vermessenen Proben erhöht werden könnte, bis eine Reinigung der Ionenquelle erforderlich wäre.

Die neun exemplarisch vermessenen Schweinswalproben wurden bewusst nach ihren Fundorten ausgewählt, um bei der Analyse mit einem breiten Spektrum an möglichen ortsbedingten Variationen konfrontiert zu werden. Signifikante ortsbezogene Unterschiede in den Schadstoffmustern und Gehalten ließen sich nicht erkennen, wofür der Probenumfang auch nicht ausreichte. Die Gehalte der bromierten Schadstoffe schwanken in einem relativ großen Konzentrationsbereich und bewegten sich für Σ7-PBDE zwischen 77,3 ng/g lw und 689,9 ng/g lw, im Mittel 309,4 ng/g lw. Bemerkenswert war der Gehalt an Σ7-PBDE in Tier Pp3070 von 556,9 ng/g lw. Diese Belastung stellt die zweithöchste Konzentration in den neun Tieren dar, und das bei einem laut den Grunddaten sehr jungen, bzw. neugeborenen Tier. Das vorgefundene generelle Profil an BDE in den Schweinswalen ergibt sich nach den Gehalten mit BDE-47 > BDE-100 > BDE-99 > BDE-154 > BDE-153 > BDE-183 und ist damit vergleichbar zu Angaben die in der Literatur vorgefunden werden (Boon, Lewis et al. 2002; Weijs, Dirtu et al. 2009).

Die Gehalte an PBB waren ähnlich großen Schwankungen unterworfen und betrugen zwischen Σ7-PBB: 4,8 ng/g lw und 86,3 ng/g lw. im Mittel 23,7 ng/g lw. Damit macht die mittlere Σ7-PBB-Belastung ca. 8 % des mittleren Σ7-PBDE-Gehaltes aus, was sich gut mit den Angaben aus der Literatur deckt. Hier wird von Anteilen zwischen ein und 10 % berichtet (Herzke, Berger et al. 2005). Leider liegen keine ausführlichen Vergleichsdaten zu PBB-Kongeneren in Schweinswalen vor. Von der Recke et al. (2008) untersuchte ausführlich die Anwesenheit von hexabromierten Kongeneren in marinen Biota, mit dem Ergebnis, dass diese von PBB-155, -154 und -153 dominiert werden. PBB-155 und -153 konnte ebenfalls in allen Proben bestimmt werden.

In allen untersuchten Tieren wurde eine hohe Belastung an weiteren Schadstoffen festgestellt. Durch die Vermessung des zur Validierung verwendeten Tieres im NCI ‘full scan‘-Modus und Abgleich mit einer MS-Spektren Datenbank konnte ein Großteil dieser Substanzen als PCB-Kongenere identifiziert werden. Da sich die Chromatogramme der neun Tiere sehr ähnlich darstellten, wird ebenfalls von einer hohen PCB-Last ausgegangen.

Diskussion

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6 Schlussfolgerungen und Ausblick Das in dieser Master Thesis entwickelte Verfahren ermöglicht die routinemäßige Bestimmung von Hauptkongeneren zweier Substanzklassen von bromierten Flammschutzmitteln in Fettgewebe mariner Säugetiere. Die Anwendbarkeit konnte exemplarisch an Schweinswalproben (Phocoena phocohena) aus der Nord-, Ostsee und dem Elbeästuar gezeigt werden. Damit ist ein Beitrag geleistet worden zur Beobachtung von bromierten organischen Schadstoffen in marinen Biota.

Im Gegensatz zu vielen in der Literatur beschriebenen spezifischen und nachweisstarken Verfahren, zeichnet sich die in dieser Arbeit entwickelte Methode durch einen geringeren instrumentellen und dadurch kostengünstigen Aufwand aus, da hier keine hochauflösenden Massenspektrometer (HRMS) oder Tandem-MS (MS/MS) verwendet werden. Durch die optimierten Parameter der NCI konnte eine Spezifität erreicht werden, die einen sicheren Nachweis von PBDE und PBB in Biota gewährleistet. Des Weiteren macht die Optimierung Nachweis- und Bestimmungsgrenzen auf dem niedrigauflösenden Massenspektrometer (LRMS) möglich, die mit denen der unspezifischen aber sonst nachweisstarken Detektion auf den Bromisotopen vergleichbar sind.

Bei der Konzeptionierung der Methode wurden die Techniken und Parameter für eine Erweiterung auf andere persistente organische Schadstoffe ausgelegt. Damit ist die mögliche Erweiterung der Methode mit einem relativ geringen zusätzlichen Aufwand verbunden, um andere relevante Schadstoffklassen mit zu erfassen. Bei den Untersuchungen der Schweinswale zeigte sich die Anwesenheit von weiteren organischen Schadstoffen, insbesondere von PCB. Damit konnte bereits qualitativ gezeigt werden, dass die Art der Probenaufarbeitung (Extraktion, Säure-Cleanup, Fraktionierung, etc.) erfolgreich weitere organische Schadstoffe für eine mögliche Analyse zugänglich macht. Somit ließe sich, nach der Entwicklung geeigneter GC/MS-Methoden, die aufgearbeitete Probe für die Untersuchung weiterer Substanzklassen verwenden, womit ein gutes Entwicklungspotential erreicht wurde.

Da die PCB jedoch einen störenden Einfluss auf die Detektion von den niederbromierten PBDE-Kongeneren haben, wäre die Abtrennung der PCB aus dem Probenextrakt und deren getrennte GC/MS-Bestimmung vorteilhaft. Dies ließe sich eventuell mit der Weiterentwicklung des Fraktionierungsschrittes der PYE-HPLC erreichen. Insbesondere durch die Variation der Zusammensetzung der mobilen Phase könnte ein Großteil der PCB aus der Probe abgetrennt werden, wozu dieses Verfahren ebenfalls in der Literatur verwendet wird (Gómara, García-Ruiz et al. 2006).

Um den Probendurchsatz für den Routinebetrieb zu steigern, wären automatisierte Extraktionsverfahren weiterhin eine gute Option, die anzudenken und zu untersuchen wären. Die ASE stellt hier eine interessante Alternative dar, da durch die dort verwendeten relativ geringen Lösungsmittelmengen von um die 100 mL (Mehrfachextraktionen) auch der sich anschließende Aufwand bei der Einengung mit Hilfe des Rotationsverdampfers reduziert wäre.

Schlussfolgerung und Ausblicke

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7 Zusammenfassung Die vorliegende Master Thesis beinhaltet die Entwicklung einer Analysemethode, welche die Bestimmung zweier Gruppen von bromierten Flammschutzmitteln (polybromierte Diphenylether, PBDE und polybromierte Biphenyle, PBB) im Fettgewebe mariner Säuger mit Hilfe der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS) ermöglicht.

PBDE und PBB gelangten durch ihren Einsatz als Flammschutzmitteln in Kunststoffen in großen Mengen in die Umwelt. Diese Substanzen sind zu den persistenten organischen Schadstoffen zu zählen, welche sich weiträumig in der Umwelt ausbreiten und durch die Anreicherung in Biota ein Problem darstellen. Die acht PBDE (BDE-28, -47, -99, -100, -153, -154, -183 und -209) sind die am häufigsten in Biota und Umweltproben gefundenen Kongenere. Bei den PBB sind es vor allem die der hexabromierten Kongenere (PBB-153 und -155). Die Belastung mit bromierten Schadstoffen kann eine Gefährdung des Gesundheitszustandes darstellen, insbesondere für die Säugetiere die sich am Ende der marinen Nahrungskette befinden.

Die Probenaufarbeitung der Analysemethode umfasst die Homogenisierung der Fettgewebeprobe mit Hilfe eines Dispergier-Werkzeuges, gefolgt von einer sechsstündigen Soxhlet-Extraktion mit einer Mischung aus organischen Lösungsmitteln. Die Fettabtrennung in den stark lipidhaltigen Extrakten wird mit einem mehrstufigen Cleanup mit konzentrierter Schwefelsäure durchgeführt. Restliche säureresistente Matrixbestandteile werden großteils durch eine HPLC-Fraktionierung (Umkehrphasen HPLC) auf einer Pyrenphase von den Extrakten abgetrennt.

Qualifiziert und quantifiziert wird mit einer GC/MS-Methode im Negativ-Ionen-Modus (NCI). Der Grundstein dieser Methode wurde bereits in meiner Diplomarbeit entwickelt, in welcher optimierte NCI-Bedingungen geschaffen wurden, die die Detektion auf charakteristischen Fragmentionen der Analyte erlaubt, im Gegensatz zur Detektion auf den unspezifischen 79Br- und 81Br-Ionen, wie es häufig in der Literatur zu finden ist. Durch den Einsatz der On-Colum-Injektion und einer relativ kurzen DB5-MS Dünnfilmsäule konnten die bekannten Probleme der thermischen Zersetzung der Analyte weitgehend vermieden werden.

Diese Methode wurde in dieser Thesis um 7 PBB-Kongenere erweitert (PBB-49, -52, -80, -155, -153 und -169). Durch die Messung auf den höheren Fragmenten ist nicht nur die Anwendung der Isotopenverdünnungsanalyse (IVA) möglich, es können auch auftretende Koelutionen von Kongeneren beider Substanzklassen eindeutig unterschieden werden. Für die PBDE und PBB erfolgt die Quantifizierung über Mehrpunktkalibrierungen und gewichteter linearer Regression (Arbeitsbereich PBDE: 1 - 500 pg, PBB: 5 – 500 pg, mit r2 > 0,9999 für alle Kongenere beider Substanzklassen).

Die Validierung der Methode wurde mit Hilfe aufgestockter Realproben (Schweinswal) durchgeführt, deren Parameter sich wie folgt darstellen. Die Bestimmungsgrenzen (theoretische Hochrechnung basierend auf Standards), ermittelt auf der Basis eines zehnfachen Signal/Rauschverhältnisses, liegen für alle PBDE-Kongenere im Bereich von 0,04 - 0,24 ng/g lw und für die PBB-Kongenere zwischen 0,10 und 0,43 ng/g lw. Die Wiederfindungsraten (WFR) der PBDE (n = 6) betrugen zwischen 60,1 und 80,7 %, die der PBB (n = 3) zwischen 76,5 und 106,8 % mit Ausnahme von PBB-52 (57,6 %). Die Methodenpräzision des Gesamtverfahrens wurde aus Wiederholbestimmungen der nativen Gehalte von Schweinswalen ermittelt. Sie betrug für die PBDE (n = 6) für alle nachgewiesenen Kongenere zwischen 1,08 % und 4,16 %, mit Ausnahme des BDE-183 (12,79 %) und für die PBB (n = 3) zwischen 1,55 % und 3,89 %.

Exemplarisch wurden 9 Schweinswalproben nach der validierten Methode aufgearbeitet und vermessen. Die Proben stammen aus der Nord- und Ostsee, sowie der Elbe und wurden zwischen 2004 und 2006 geborgen. Dabei handelt es sich hauptsächlich um Fettgewebeproben von jungen männlichen Tieren. Die Gesamtbelastung der PBDE betrug als Σ7-PBDE zwischen 77,26 und 702,10 ng/g lw. Die Belastung mit PBB als Σ7-PBB war in dem Bereich von 4,77 bis 86,29 ng/g lw, bei Fettgehalten zwischen 87,8 % und 94,1 %.

Probenprotokolle

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Anhang

IUPAC-Nomenklatur bizyklischer Verbindungen

Kongener Nr. Kongener Nr. Kongener Nr. Kongener Nr.

2‐Mono‐ 1 2,2',6,6'‐Tetra‐ 54 2,3,3',4',5‐Penta‐ 107 2,3,3',4,5,6‐Hexa‐ 160

3‐Mono‐ 2 2,3,3',4'‐Tetra‐ 55 2,3,3',4,5'‐Penta‐ 108 2,3,3',4,5',6‐Hexa‐ 161

4‐Mono‐ 3 2,3,3',4'‐Tetra‐ 56 2,3,3',4,6‐Penta‐ 109 2,3,3',4',5,5'‐Hexa‐ 162

2,2'‐Di‐ 4 2,3,3',5‐Tetra‐ 57 2,3,3',4',6‐Penta‐ 110 2,3,3',4',5,6‐Hexa‐ 163

2,3‐Di‐ 5 2,3,3',5'‐Tetra‐ 58 2,3,3',5,5'‐Penta‐ 111 2,3,3',4',5',6‐Hexa‐ 164

2,3'‐Di‐ 6 2,3,3',6‐Tetra‐ 59 2,3,3',5,6‐Penta‐ 112 2,3,3',5,5',6‐Hexa‐ 165

2,4‐Di‐ 7 2,3,4,4'‐Tetra‐ 60 2,3,3',5',6‐Penta‐ 113 2,3,4,4',5,6‐Hexa‐ 166

2,4'‐Di‐ 8 2,3,4,5‐Tetra‐ 61 2,3,4,4',5‐Penta‐ 114 2,3',4,4',5,5'‐Hexa‐ 167

2,5‐Di‐ 9 2,3,4,6‐Tetra‐ 62 2,3,4,4',6‐Penta‐ 115 2,3',4,4',5',6‐Hexa‐ 168

2,6‐Di‐ 10 2,3,4',5‐Tetra‐ 63 2,3,4,5,6‐Penta‐ 116 3,3',4,4',5,5'‐Hexa‐ 169

3,3'‐Di‐ 11 2,3,4',6‐Tetra‐ 64 2,3,4',5,6‐Penta‐ 117 2,2',3,3',4,4',5‐Hepta‐ 170

3,4‐Di‐ 12 2,3,5,6‐Tetra‐ 65 2,3',4,4',5‐Penta‐ 118 2,2'3,3',4,4',6‐Hepta‐ 171

3,4'‐Di‐ 13 2,3',4,4'‐Tetra‐ 66 2,3',4,4',6‐Penta‐ 119 2,2',3,3',4,5,5'‐Hepta‐ 172

3,5‐Di‐ 14 2,3',4,5‐Tetra‐ 67 2,3',4,5,5'‐Penta‐ 120 2,2',3,3',4,5,6‐Hepta‐ 173

4,4'‐Di‐ 15 2,3',4,5'‐Tetra‐ 68 2,3',4,5,'6‐Penta‐ 121 2,2',3,3',4,5,6'‐Hepta‐ 174

2,2',3‐Tri‐ 16 2,3',4,6‐Tetra‐ 69 2',3,3',4,5‐Penta‐ 122 2,2',3,3',4,5',6‐Hepta‐ 175

2,2',4‐Tri‐ 17 2,3',4',5‐Tetra‐ 70 2',3,4,4',5‐Penta‐ 123 2,2',3,3',4,6,6'‐Hepta‐ 176

2,2',5‐Tri‐ 18 2,3',4',6‐Tetra‐ 71 2',3,4,5,5'‐Penta‐ 124 2,2',3,3',4',5,6‐Hepta‐ 177

2,2',6‐Tri‐ 19 2,3',5,5'‐Tetra‐ 72 2',3,4,5,6'‐Penta‐ 125 2,2',3,3',5,5',6‐Hepta‐ 178

2,3,3'‐Tri‐ 20 2,3',5',6‐Tetra‐ 73 3,3',4,4',5‐Penta‐ 126 2,2',3,3',5,6,6'‐Hepta‐ 179

2,3,4‐Tri‐ 21 2,4,4',5‐Tetra‐ 74 3,3',4,5,5'‐Penta‐ 127 2,2',3,4,4',5,5'‐Hepta‐ 180

2,3,4'‐Tri‐ 22 2,4,4',6‐Tetra‐ 75 2,2',3,3',4,4'‐Hexa‐ 128 2,2',3,4,4',5,6‐Hepta‐ 181

2,3,5‐Tri‐ 23 2',3,4,5‐Tetra‐ 76 2,2',3,3',4,5‐Hexa‐ 129 2,2',3,4,4',5,6'‐Hepta‐ 182

2,3,6‐Tri‐ 24 3,3',4,4'‐Tetra‐ 77 2,2',3,3',4,5'‐Hexa‐ 130 2,2',3,4,4',5',6‐Hepta‐ 183

2,3',4‐Tri‐ 25 3,3',4,5‐Tetra‐ 78 2,2',3,3',4,6‐Hexa‐ 131 2,2',3,4,4',6,6'‐Hepta‐ 184

2,3',5‐Tri‐ 26 3,3',4,5'‐Tetra‐ 79 2,2',3,3',4,6'‐Hexa‐ 132 2,2',3,4,5,5',6‐Hepta‐ 185

2,3',6‐Tri‐ 27 3,3',5,5'‐Tetra‐ 80 2,2',3,3',5,5'‐Hexa‐ 133 2,2',3,4,5,6,6'‐Hepta‐ 186

2,4,4'‐Tri‐ 28 3,4,4',5‐Tetra‐ 81 2,2',3,3',5,6‐Hexa‐ 134 2,2',3,4',5,5',6‐Hepta‐ 187

2,4,5‐Tri‐ 29 2,2',3,3',4‐Penta‐ 82 2,2',3,3',5,6'‐Hexa‐ 135 2,2',3,4',5,6,6'‐Hepta‐ 188

2,4,6‐Tri‐ 30 2,2',3,3',5‐Penta‐ 83 2,2',3,3',6,6'‐Hexa‐ 136 2,3,3',4,4',5,5'‐Hepta‐ 189

2,4',5‐Tri‐ 31 2,2',3,3',6‐Penta‐ 84 2,2',3,4,4',5‐Hexa‐ 137 2,3,3',4,4',5,6‐Hepta‐ 190

2,4',6‐Tri‐ 32 2,2',3,4,4'‐Penta‐ 85 2,2',3,4,4',5'‐Hexa‐ 138 2,3,3',4,4',5',6‐Hepta‐ 191

2',3,4‐Tri‐ 33 2,2',3,4,5‐Penta‐ 86 2,2',3,4,4',6‐Hexa‐ 139 2,3,3',4,5,5',6‐Hepta‐ 192

2',3,5‐Tri‐ 34 2,2',3,4,5'‐Penta‐ 87 2,2',3,4,4',6'‐Hexa‐ 140 2,3,3',4',5,5',6‐Hepta‐ 193

3,3',4‐Tri‐ 35 2,2',3,4,6‐Penta‐ 88 2,2',3,4,5,5'‐Hexa‐ 141 2,2',3,3',4,4',5,5'‐Octa‐ 194

3,3',5‐Tri‐ 36 2,2',3,4,6'‐Penta‐ 89 2,2',3,4,5,6‐Hexa‐ 142 2,2',3,3',4,4',5,6‐Octa‐ 195

3,4,4'‐Tri‐ 37 2,2',3,4',5‐Penta‐ 90 2,2',3,4,5,6'‐Hexa‐ 143 2,2',3,3',4,4',5,6'‐Octa‐ 196

3,4,5‐Tri‐ 38 2,2',3,4',6‐Penta‐ 91 2,2',3,4,5',6‐Hexa‐ 144 2,2',3,3',4,4',6,6'‐Octa‐ 197

3,4',5‐Tri‐ 39 2,2',3,5,5'‐Penta‐ 92 2,2',3,4,6,6'‐Hexa‐ 145 2,2',3,3',4,5,5',6‐Octa‐ 198

2,2',3,3'‐Tetra‐ 40 2,2',3,5,6‐Penta‐ 93 2,2',3,4',5,5'‐Hexa‐ 146 2,2',3,3',4,5,5',6'‐Octa‐ 199

2,2',3,4‐Tetra‐ 41 2,2',3,5,6'‐Penta‐ 94 2,2',3,4',5,6‐Hexa‐ 147 2,2',3,3',4,5,6,6'‐Octa‐ 200

2,2',3,4'‐Tetra‐ 42 2,2',3,5',6‐Penta‐ 95 2,2',3,4',5,6'‐Hexa‐ 148 2,2',3,3',4,5',6,6'‐Octa‐ 201

2,2',3,5‐Tetra‐ 43 2,2',3,6,6'‐Penta‐ 96 2,2',3,4',5',6‐Hexa‐ 149 2,2',3,3',5,5',6,6'‐Octa‐ 202

2,2',3,5'‐Tetra‐ 44 2,2',3',4,5‐Penta‐ 97 2,2',3,4',6,6'‐Hexa‐ 150 2,2',3,4,4',5,5',6‐Octa‐ 203

2,2',3,6‐Tetra‐ 45 2,2',3',4,6‐Penta‐ 98 2,2',3,5,5',6‐Hexa‐ 151 2,2',3,4,4',5,6,6'‐Octa‐ 204

2,2',3,6'‐Tetra‐ 46 2,2',4,4',5‐Penta‐ 99 2,2',3,5,6,6'‐Hexa‐ 152 2,3,3',4,4',5,5',6‐Octa‐ 205

2,2',4,4'‐Tetra‐ 47 2,2',4,4',6‐Penta‐ 100 2,2',4,4',5,5'‐Hexa‐ 153 2,2',3,3',4,4',5,5',6‐Nona‐ 206

2,2',4,5‐Tetra‐ 48 2,2',4,5,5'‐Penta‐ 101 2,2',4,4',5',6‐Hexa‐ 154 2,2',3,3',4,4',5,6,6'‐Nona‐ 207

2,2',4,5'‐Tetra‐ 49 2,2',4,5,6'‐Penta‐ 102 2,2',4,4',6,6'‐Hexa‐ 155 2,2',3,3',4,5,5',6,6'‐Nona‐ 208

2,2',4,6‐Tetra‐ 50 2,2',4,5,'6‐Penta‐ 103 2,3,3',4,4',5‐Hexa‐ 156 Deca‐ 209

2,2',4,6'‐Tetra‐ 51 2,2',4,6,6'‐Penta‐ 104 2,3,3',4,4',5'‐Hexa‐ 157

2,2',5,5'‐Tetra‐ 52 2,3,3',4,4'‐Penta‐ 105 2,3,3',4,4',6‐Hexa‐ 158

2,2',5,6'‐Tetra‐ 53 2,3,3',4,5‐Penta‐ 106 2,3,3',4,5,5'‐Hexa‐ 159

Anhang

49

Probenprotokoll Datum:

Probenkennzeichen: PP2898 (B), PP3024 (C), PP3299 (D)

X Fettgewebe

Datum:Homogenisieren: PP2898 PP3024 PP3299

Vial leer** [g]: 20.29 20.37 20.828Vial voll** [g]: 32.81 31.79 35.317n -Hexan [mL]: - - -Einwaage [g]: 12.52 11.42 14.489

X Einfrieren der Probe

Datum:Extraktion: A B C D

Blindwert: XVial Einwaage [g]: - 5.089 5.162 5.145Soxhlet X Na2SO4 [g]: 27.623 26.720 29.020 26.850

Dotierungen: BDE - 30 30 30- - - -- - - -

Dotierungen: PPB - - - -- - - -

Start [hh:mm]: 10:35 Extraktionszeit netto [h]: 6:00Ende [hh:mm]: 16:35

Datum:Fettgehalt: Extraktvolumen [mL]: 228 229 231 228

Aliquout [mL]: 7 7 7 7Vial leer [g]:** 9.4887 9.4679 9.4578 9.5139Vial voll [g]:*** 9.4842 9.6087 9.5973 9.6575Rückstand [g] -0.0045 0.1408 0.1395 0.1436Fettgehalt Extrakt [g]: -0.1475 4.6065 4.60218 4.67693Fettgehalt Probe [%]: #WERT! 90.52% 89.16% 90.91%

Datum:Cleanup:

I. Schritt H2SO4 [mL]: 5 5+5 5+5 5+5II. Schritt H2SO4 [mL]: 5 5 5 5III. Schritt H2SO4 [mL]: - - - -

Datum:Fraktionierung LC-PYE:

Volumen (nach Säure-Cleanup) [µL] 300 300 300 300Inj.Vol [µL] (Aliquot) 100 100 100 100∑ verinigter Aliquote 2 1 2 2

Datum:Probeneinengung: InjS* [µL]: - 20 20 20

Keeper (n -Nonan) [µL]: 200 100 200 200Endvolumen [µL]: 200 100 200 200

GC/MS-Messung am:

Bemerkungen: Nach der Fraktionierung ist Probe (B) verloren gegangen (gebrochenes Barkey © Einenggefäß). Die 100 µL Rückstellprobe wurde verwendet, womit diese aufgebraucht wurde.

*=Volumen abhängig vom finalen Endvolumen, Zielkonzentration wie in BDE-Kalibrier-Standards von 100 ng/mL

**= Das Gewicht des jeweils ausgeheizten Vials (inkl. Schraubdeckel) (siehe SOP 02).

***= Nach der N2-Einengung und dem Ausheizen

v1.6

09/13/09

Elbe-Gruppe

Organische Schadstoffe

Bemerkungen:

CleanupS* [µL]:

PBB-SurrS [µL]:PBB-NatS_8 [µL]:

08 - 09.10.2009

10/07/09

09/23/09

10/05/09

PP3024 kein Leergewicht d. Vails, 2. Aliquot: 12,34

06/24/09

BDE-NatS* [µL]:

PP2898 noch ein zweites Aliquot mit Vial leer: 20,27, Vial voll: 28,69 = 8,42g

06/24/09

09/22/09

BDE-SurrS* [µL]:

Probenprotokolle

50

Probenprotokoll Datum:

Probenkennzeichen: PP3007 (B), PP3070 (C), PP3318 (D)

X Fettgewebe

Datum:Homogenisieren: PP3007 PP3070 PP3318

Vial leer** [g]: 20.798 20.902Vial voll** [g]: 28.690 31.365 29.269n -Hexan [mL]: 5 - -Einwaage [g]: 28.690 10.567 8.367

X Einfrieren der Probe

Datum:Extraktion: A B C D

Blindwert: XVial Einwaage [g]: - 9.350 5.782 4.717Soxhlet X Na2SO4 [g]: 24.19 27.023 27.378 27.898

Dotierungen: BDE - 30 30 30- - - -- - - -

Dotierungen: PPB - - - -- - - -

Start [hh:mm]: 11:12 Extraktionszeit netto [h]: 6:03Ende [hh:mm]: 17:15

Datum:Fettgehalt: Extraktvolumen [mL]: 232 250 234 235

Aliquout [mL]: 7 7 7 7Vial leer [g]:** 9.5247 9.4711 9.4766 9.4826Vial voll [g]:*** 9.5251 9.5818 9.6392 9.6060Rückstand [g] 0.0004 0.1107 0.1626 0.1234Fettgehalt Extrakt [g]: 0.01326 3.9543 5.4355 4.1427Fettgehalt Probe [%]: #WERT! 42.29% 94.00% 87.82%

Datum:Cleanup:

I. Schritt H2SO4 [mL]: 5 5+5 5+5 5+5II. Schritt H2SO4 [mL]: 5 5 5 5III. Schritt H2SO4 [mL]: - - - -

Datum:Fraktionierung LC-PYE:

Volumen (nach Säure-Cleanup) [µL] 300 300 300 300Inj.Vol [µL] (Aliqout) 200 100 100 100∑ verinigter Aliqoute 2 2 2 2

Datum:Probeneinengung: InjS* [µL]: - 20 20 20

Keeper (n -Nonan) [µL]: 200 200 200 200Endvolumen [µL]: 200 200 200 200

GC/MS-Messung am:

Bemerkungen: Relativ grosses Extraktvolumen von Probe (B) durch die n -Hexan Zugabe bei der Homogenisierung.

*=Volumen abhängig vom finalen Endvolumen, Zielkonzentration wie in BDE-Kalibrier-Standards von 100 ng/mL

**= Das Gewicht des jeweils ausgeheizten Vials (inkl. Schraubdeckel) (siehe SOP 02).

***= Nach der N2-Einengung und dem Ausheizen

v1.6

Nordsee-Gruppe

Organische Schadstoffe

Bemerkungen:

CleanupS* [µL]:

PBB-SurrS [µL]:PBB-NatS_8 [µL]:

10/08/09

10/08/09

09/25/09

05 - 06/10/2009

06/26/09

BDE-NatS* [µL]:

(B) sehr geringe Menge, Einwaage nichtgenau zu bestimmen, Auffüllen mit n -Hexan nötig.

09/24/09

09/24/09

BDE-SurrS* [µL]:

Anhang

51

Probenprotokoll Datum:

Probenkennzeichen: PP3195 (B), PP3204 (C), PP3338 (D)

X Fettgewebe

Datum:Homogenisieren: PP3195 PP3204 PP3338

Vial leer** [g]: 20.846 20.32 20.954Vial voll** [g]: 32.67 29.59 35.352n -Hexan [mL]: - - -Einwaage [g]: 11.824 9.27 14.398

X Einfrieren der Probe

Datum:Extraktion: A B C D

Blindwert: XVial Einwaage [g]: - 5.594 5.056 5.246Soxhlet X Na2SO4 [g]: 24.39 30.220 27.565 25.810

Dotierungen: BDE - 30 30 30- - - -- - - -

Dotierungen: PPB - - - -- - - -

Start [hh:mm]: 10:25 Extraktionszeit netto [h]: 6:10Ende [hh:mm]: 16:35

Datum:Fettgehalt: Extraktvolumen [mL]: 220 228 232 231

Aliquout [mL]: 7 7 7 7Vial leer [g]:** 9.5003 9.4376 9.4902 9.4351Vial voll [g]:*** 9.4965 9.5923 9.6309 9.5829Rückstand [g] -0.0038 0.1547 0.1407 0.1478Fettgehalt Extrakt [g]: -0.1194 5.0388 4.6632 4.8774Fettgehalt Probe [%]: #WERT! 90.08% 92.23% 92.97%

Datum:Cleanup:

I. Schritt H2SO4 [mL]: 5 5+5 5+5 5+5II. Schritt H2SO4 [mL]: 5 5 5 5III. Schritt H2SO4 [mL]: - - - -

Datum:Fraktionierung LC-PYE:

Volumen (nach Säure-Cleanup) [µL] 300 300 300 300Inj.Vol [µL] (Aliqout) 100 100 100 100∑ verinigter Aliqoute 2 2 2 2

Datum:Probeneinengung: InjS* [µL]: - 20 20 20

Keeper (n -Nonan) [µL]: 200 200 200 200Endvolumen [µL]: 200 150 200 200

GC/MS-Messung am:

Bemerkungen: Bei Probe (B) ging bei Überführung in Soxhlethülse eine mandelgroße Portion daneben.Bei Probe (A) ist beim finalen Einengen ein Teil verloren gegangen, es konnten keine 200 µL in das Insertvial überführt werden.

*=Volumen abhängig vom finalen Endvolumen, Zielkonzentration wie in BDE-Kalibrier-Standards von 100 ng/mL

**= Das Gewicht des jeweils ausgeheizten Vials (inkl. Schraubdeckel) (siehe SOP 02).

***= Nach der N2-Einengung und dem Ausheizen

v1.6

PBB-SurrS [µL]:

BDE-NatS* [µL]:

PP3204 noch ein zweites Aliquout von ca. 9.06g, Vialleergew.20.29g

09/28/09

09/30/09

PBB-NatS_8 [µL]:

Organische Schadstoffe

Bemerkungen:

09/26/09

10/09/09

10/09/09

10/02/09

10/06/09

BDE-SurrS* [µL]:

CleanupS* [µL]:

Ostseegruppe

SOP

52

SOP_01: Homogenisierung von Fettgewebe mariner Säuger (Ultra-Turrax®) Verwendete Geräte und Chemikalien

Dispergier-Werkzeug: ULTRA -TURRAX® T 25 digital, Fa. IKA Laborwaage Sartorius R160 P Schneidebrett aus PTFE Skalpell-Griff: Mod. Nr.4 (Edelstahl), 160 mm, Fa. BAYHA ®, Best.-Nr.: 233-5202 Skalpell-Klingen: Mod. Nr. 23, Fa. BAYHA ®, Best.-Nr.: 233-5223 Löffelspatel 18/10 180 mm, Fa. VWR Best-Nr.: 231-0186 Spitzpinzette Proben-Vials 22 mL, Supelco® (27151), Schraubkappe mit PTFE-Dichtung (27152) n-Hexan Picograde ®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1244-B040 Aceton Picograde ®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1142-B040 Labor-Aluminiumfolie

Alle verwendeten Glasgeräte werden nach SOP_07 gereinigt

Vorbereitung

Alle Arbeitsschritte werden unter dem Abzug ausgeführt. Die Arbeitsfläche wird mit einem Bogen Aluminiumfolie unterlegt, um Kontaminationen zu

vermeiden und eine bessere Reinigung zu ermöglichen. Gleiches gilt für den Boden (Standfuss) des Ultra-Turrax®.

Schneidebrett, Skalpell, Spatel und Pinzette werden bereitgelegt (Je ein frisches Set pro neuer Probe)

Ein Proben-Vial wird gewogen (immer mit Deckel) und das Gewicht im Protokoll und später auf dem Vial selbst notiert.

Vor Benutzung des Ultra-Turrax® wird das Dispergier-Werkzeug je eine Minute in Aceton und n-Hexan bei niedriger Drehzahl vorgewaschen. Hierzu eignen sich die 22 mL Schraubdeckelvials.

Durchführung

Mittels Skalpell und Pinzette wird das Fettgewebe auf dem Schneidebrett von anderen Geweben freigelegt, der Kontakt mit Probe und Arbeitshandschuh soll vermieden werden (Kontaminationen anderer Geräte/Gegenständen).

Eine so bearbeitete Menge an Fettgewebe (ideal sind 15g) wird kleine Würfel zerteilt (Kantenlänge ca. 2 mm), und diese in das 22 mL Proben-Vail überführt. Mit der flachen Seite des Spatels kann das Fett auf dem Schneidebrett gut auf geschabt und mit in das Vial gegeben werden.

Mit dem Ultra-Turrax®, beginnend mit den unteren Drehzahlen, werden die Gewebestücke im Vail solange zerkleinert, bis eine optisch homogene Masse entsteht, die keine Würfel mehr aufweisen sollte. Insbesondere bei höheren Drehzahlen ist darauf zu achten, dass das Homogenat nicht zu warm wird, es kann zu einer leichten Schaumbildung kommen. In entsprechenden Zeitabständen muss kontrolliert werden, dass das Dispergier-Werkzeug nicht durch nicht-dispergierbare Bestandteile zugesetzt ist, diese sind mittels Pinzette zu entfernen.

Sollte die Probenmenge so gering sein, dass der erforderliche Füllstand im Vial für den Ultra-Turrax® nicht gegeben ist, muss dieser mit n-Hexan entsprechend aufgefüllt werden (Volumen der Zugabe im Protokoll notieren).

Nachbereitung

Das Schneidebrett ist nach Gebrauch in heißem Seifenwasser (Pril) ab zu schruppen, mit Reinstwasser zu spülen und nach der Trocknung mit Aceton und n-Hexan abzuwischen, bevor es für eine neue Probe verwendet wird.

Das Dispergier-Werkzeug ist nach dem Homogenisieren mit den zur Vorwäsche verwendeten Lösungsmitteln analog zur Vorreinigung zu waschen. Die Lösungsmittel werden dann verworfen und durch frische ersetzt. Verbleibende Reste am Werkzeug sind mit einer neuen Pinzette zu entfernen.

SOP

53

SOP_02: Soxhlet-Extraktion, Probeneinengung

Verwendete Geräte und Chemikalien

Soxhlet-Apparatur:

Heizpilz: EM0250, Fa. ThermoFischer scientific Extraktor 150 mL, Fa. Lenz Laborglas GmbH, Best.-Nr.: 5.3951.37 Rundkolben 250 mL, NS 29/32 Fa. Lenz Laborglas GmbH, Best.-Nr.:3.0029.49 Dimroth-Kühler mit GL18-Anschluss NS 45/40 Fa. Lenz GmbH, Best.-Nr.:5.2460.G6 Extraktionshülsen: 603G Glass Fibre Thimble 33 x 94mm Fa. Whatman Normschliff-PTFE-Manschette mit Griffbund NS 29/32, VWR 201-0043 Normschliff-PTFE-Manschette mit Griffbund NS 45/40, VWR 201-0046

Rotationsverdampfer:

Rotationsverdampfer R-134, Fa. Büchi Vakuum-Pumpe (Rotationsverdampfer): MZ 2C, Fa. Vacuubrand Spitzkolben, 250 mL, Duran ®, NS 29/32 Fa. Lenz Art.-Nr.: 3.0319.49

Messpipette Blaubrand ® 10 mL, Klasse AS, Fa. Brand, Best.-Nr.: 27843 Becherglas 25 mL Ilmabor I-330 Fa. Techn. Glaswerke Ilmenau TGI, Art.-Nr.: 33550103 Messzylinder Blaubrand ® Klasse A, 250 mL Fa Brand, Best.-Nr.:612-5020 Pasteurpipetten,2 mL, 230 mm, Fa.Brand, Best. Nr.: 7477 20 Gummihütchen (Pasteurpipetten), Fa. Brand, Best.: 124700 Mikroliterpipette Transferpettor Digital, KB, 10-50μl, Fa. Brand, Best.-Nr.: 701817 Mikrospatel, rund, Edelstahl, (140 mm x 2 mm), Fa. Roth Best.-Nr. : AT19.1 Proben-Vials 22 mL, Supelco® (27173), Schraubdeckel mit PTFE-Dichtung (27147-U) Laborwaage (Rm. 022): Sartorius AC 211 S (Labortisch) Laborwaage (Rm. 022): Sartorius R160 P (Abzug) SurrS: Method 1614 ’Labelled Surrogate Solution’,13C12-BDE (1,2 mL in Nonan, 1 μg/mL),CIL Na2SO4 , Für die Organische Spurenanalyse Fa. Merk, Best.-Nr.:1.06639.0500

o Alternativ Na2SO4 Fa. Promochem for Residue analysis Best.-Nr.: SC-1024-B005 n-Hexan Picograde ®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1244-B040 Aceton Picograde ®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1142-B040 Extraktonsmittel: n-Hexan:Aceton 1:1 (v/v)

Alle Arbeiten werden, wenn nicht anders erwähnt, unter laufenden Abzügen ausgeführt. Es wird in Batches von vier gearbeitet (1 Blank + 3 Proben). Alle verwendeten Glasgeräte werden nach SOP_07 gereinigt.

Vorbereitung Soxhletextraktion

Die Dimroth-Kühler werden an den Stativen befestigt (die GL-Gewinde zeigen nach hinten) und mit den Kühlwasserleitungen untereinander verbunden. Dabei ist zu beachten, dass die Kühlschnecken im Gegenstrom zu betreiben sind. Sind die Kühler angeschlossen ist der Kreislauf auf Dichtigkeit zu überprüfen (Kühlwasserpumpe anschalten, dann Vor- und Rücklauf langsam aufdrehen, bis die Luft aus dem System heraus ist.).

Ist der Kühlkreislauf dicht, werden die Extraktoren unter die Kühler gesetzt, zunächst zur rechten Seite versetzt um Schliffmanschette und Extraktionshülse hinzu zufügen.

Die Rundkolben sind mit 200 mL Aceton zu befüllen und mit Schliffmanschette und Glasstopfen zu versehen. Der Aufbau wird zusammengesetzt, die Stativklemmen sollen nur locker halten, der Aufbau braucht Spiel. Sind alle Schliffverbindungen gesteckt, können die Heizpilze auf Stufe 5 geschaltet werden, die Vorreinigung soll mindestens vier Stunden betragen.

SOP

54

Durchführung Soxhletextraktion

Die noch nassen Extraktionshülsen werden im Becherglas unter Stickstoff getrocknet. Das Aceton der Vorreinigung wird verworfen und durch 250 mL des Extraktionsmittels ersetzt.

Probe: In 25 mL Bechergläser werden ca. 5 g (Waage Abzug, Gewicht genau notieren) homogenisierte Probe eingewogen (gekürzte Pasteurpipette) und entsprechend mit 30 µL 13C12-Standards dotiert (Transferpettor) und leicht geschwenkt. Anschließend werden 25 g Na2SO4 hinzugefügt (Einwaage: Na2SO4 ca. 1:5, Waage Labortisch). Mit dem Mikrospatel wird die dotierte Probe mit dem Na2SO4 zu einer homogenen Mischung gebracht und in die Extraktionshülse überführt. Mit ca. 2 mL n-Hexan wird der Spatel und das Becherglas gespült und mit in die Hülse gefüllt. Der Aufbau wird zusammengesetzt und die Probe für sechs Stunden extrahiert (ThermoFischer Heizpilz: Stufe 5, ca. 2 Tropfen pro Sekunde).

Blank: wie Probe, jedoch ohne Probeneinwaage und 13C12-Standard.

Nach Ablauf der Extraktionszeit wird das Ende eines Zyklus abgewartet und der Glas-Aufbau vom Heizpilz getrennt. Der Kolben wird mit Manschette vom Extraktor genommen und mit dem Glasstopfen verschlossen. An dieser Stelle kann der Analysegang gut unterbrochen werden, die Rundkolben können problemlos über Nacht aufbewahrt werden.

Probeneinengung mittels Rotationsverdampfer:

Sicherstellen das der Kühlwasserstrom vorhanden und eingeschaltet ist.

Das Wasserbad des Rotationverdampfers wird auf 40°C aufgeheizt, das anliegende Vakuum auf ca. 450 mbar gesetzt, die Hysterese auf 5 mbar.

Reinigung (nach, bzw. vor jedem Einengungschritt): Das System wird mit 150 mL Aceton in einem separaten 250 mL Spitzkolben mit PTFE-Manschette vorgereinigt. Ist der Kolben auf den Kern des Dampfdurchführungs-Rohres gesteckt worden kann das Vakuum angelegt und die Rotation auf ca. 40 Umdrehungen pro Minute gestellt werden. Der Kolben wird zu gut 1/3 in das Wasserbad getaucht und bis kurz vor die Trockene gefahren. Zum beenden des Laufes wird erst der Kolben aus dem Wasserbad gehoben, die Rotation gestoppt und mit einer Hand unter dem Kolben belüftet.

Das Extraktvolumen im Rundkolben wird komplett in einen 250 mL Messzylinder gegeben und das exakte Volumen im Protokoll notiert. Von diesem Volumen wird ein 7 mL - Aliquot des Extraktes zur Fettgehaltsbestimmung nach SOP_03 entnommen (Messpipette), das verbliebene Volumen in einen 250 mL Spitzkolben gegeben. Je zwei n-Hexan Spülungen von Rundkolben und Messzylinder werden mit in den Spitzkolben gegeben.

Analog zur Vorreinigung wird mit dem Spitzkolben der Proben verfahren. Der Kolben wird jedoch so in das Wasserbad eingetaucht, das die Mitte der Spitze des Kolbens knapp untertaucht, da hier das Extraktionsmittel verhaltener abrotiert werden muss. Es wird auf ein Endvolumen von ca. 20 mL eingeengt. Einenggeschwindigkeit generell über die Eintauchtiefe des Kolbens im Wasserbad regulieren!

Ist der Extrakt so auf ca. 20 mL eingeengt worden, wird der restliche Extrakt mittels Pasteur-Pipette zu möglichst gleichen Teilen in zwei 22 mL Vial überführt (Erspart zusätzliche Austarierung beim Säure-Cleanup nach SOP_04) Analog wird mit den zwei 2 mL n-Hexan Spülschritten des Spitzkolbens verfahren.

Es Erfolgt das Schwefelsäure Cleanup nach SOP_04.

SOP

55

SOP_03: Bestimmung des Fettgehaltes in Extrakten Verwendete Geräte und Chemikalien

Messzylinder Blaubrand ®, 250 mL Messpipette Blaubrand ® 10 mL, Klasse AS, Fa. Brand, Best.-Nr.: 27843 Vakuumtrockenschrank: RVT 220, Fa. Hereaus Proben-Vials 7 mL, Supelco® (27151), Schraubdeckel mit PTFE-Dichtung (27152) Laborwaage (Rm. 023): Sartorius R160 P Exsikkator, 5L Silica Gel Orange, (2-5 mm, Indikator, Perlform), Fa. Roth Art.-Nr.:P077.1 (Exsikkator ) Stickstoff-Einengapparatur, 4-Port, einzeln dosierbar, Edelstahl (Eigenbau) Messpipette Blaubrand ® 10 mL, Klasse AS, Fa. Brand, Best.-Nr.: 27843

Alle verwendeten Glasgeräte werden nach SOP_07 gereinigt.

Vorbereitung

Je nach Analysenumfang sind eine entsprechende Anzahl an 7 mL Vials auszuheizen und im Exsikkator abzukühlen.

Diese Vials, inklusive den zugehörigen Deckeln, werden mit der Probenkennzeichnung beschriftet und gewogen (Eintrag ins Protokoll).

Durchführung

Nachdem das Extraktvolumen bestimmt wurde, wird mit einer Messpipette jeweils ein Aliquot von 7 mL pro Probe in ein wie oben vorbereitetes Vial überführt.

Unter Stickstoff wird das Extraktionsmittel der Aliquote abgeblasen, bis Blindwertproben trocken sind, bzw. sich das Volumen des Rückstandes der Proben nicht mehr ändert.

Um das beim Einengen entstandene Kondensat zu Entfernen werden die Vials im Ofen (ohne Deckel) bei 105 °C für 30 min ausgeheizt (bis zur Gewichtskonstanz).

Nach dem Ausheizen werden sie dem Ofen entnommen und mittels Pinzette in den Exsikkator zum Abkühlen gestellt, für etwa 15 Minuten.

Die abgekühlten Vials werden dem Exsikkator mit einer Pinzette entnommen, mit dem zugehörigen Deckel versehen und gewogen, das Gewicht wird im Protokoll notiert und damit der Restfettgehalt errechnet.

SOP

56

SOP_04: Schwefelsäure-Cleanup von fetthaltigen Extrakten

Verwendete Geräte und Chemikalien Pasteurpipette, 230 mm, (7477 20), Brand Gummihütchen (Pasteurpipetten), Fa. Brand, Best.: 124700 Messpipette Blaubrand ® 5 mL, Fa. Brand, Best.-Nr.: 612-1113 Proben-Vials 22 mL, Supelco® (27173), Schraubdeckel mit PTFE-Dichtung (27147-U) Becherglas 250 mL Ilmabor I-330 Fa. TGI, Art.-Nr.: 33550108 Insert-Vials 300 μL, Supelco® (27564U), Schraubdeckel PTFE-Septum (27327) Probenaufbereitungs-System, Barkey® flowtherm OptoControl 8 Eineng-Gefäße, Barkey® 0,5 mL (ca. 10 mL Gesamtvolumen) Zentrifuge: Contifuge 17S, Fa. Heraeus

Rotor: F-34-6-38 (Festwinkelrotor) Adapter für 50 mL Fallcon-Röhrchen, Best.-Nr.:5804775.007

n-Hexan Picograde ®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1244-B040 Schwefelsäure 96% Suprapur®, Merck, 1.00714.0250, CAS-Nr. 7664-93-9#

Alle verwendeten Glasgeräte werden nach SOP_07 gereinigt. Bis auf das Zentrifugieren werden alle Verfahrensschritte unter laufendem Abzug ausgeführt.

Durchführung

Der vom Extraktionsmittel befreite Extrakt befindet sich in einem (Blank), bzw. zwei (Proben) 22 mL Schraubdeckel-Vials (siehe SOP_02)

Schwefelsäure Cleanup:

o Im Vial befinden sich ca. 10 mL Extrakt. Mittels Messpipette 5 mL Schwefelsäure gegeben (an der Innenwand des Vials vorsichtig einlaufen lassen). Das verschlossene Vial wird für eine Minute von Hand geschüttelt, dann für mindestens eine Minute zum abkühlen in ein Wasserbad gestellt (250 mL Becherglas, Leitungswasser).

o Die abgekühlten Vials werden zentrifugiert (2000 rpm, 12 Minuten), wobei mit einer geraden Anzahl von Proben oder entsprechenden Gegengewichten gearbeitet wird.

o Die sich dann in den Vials eingestellte oberständige unpolare Phase ist mittels Pasteurpipette zu 4/5 in zu überführen. Mit ca. 1 mL n-Hexan wird die Wandung gespült und zusammen mit der restlichen Phase weitestgehend überführt. Dieser Schritt wird einmal wiederholt.

Ist ein weiterer Cleanup-Schritt erforderlich, findet die Überführung in ein 22 mL Vial statt, ansonsten in ein 0,5 mL Barkey®-Einenggefäß. Befindet sich der Extrakt, im Falle von sehr fetthaltigen Proben, in zwei separaten Vials, wird der aufgereinigte Inhalt jetzt bei der Überführung vereinigt.

Unter Verwendung des Barkey® Probenaufarbeitungs-System werden die Proben auf ein Endvolumen von 300 µL gebracht (N2-Vordruck: 1,5 Bar, N2-Temperatur: 80 °C). Die Wandungen des Einengefäßes werden kurz vor dem Erreichen des Endvolumens mit n-Hexan gespült.

Die 300 µL Probe werden mit frischer Pasteurpipette in ein beschriftetes 300 µL Insert-Vial überführt und sind bereit für die Fraktionierung, z.B nach SOP_5.

SOP

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SOP_05: PYE-HPLC Fraktionierung und finale Einengung des Extraktes Geräte und Chemikalien

Agilent HPLC-System HP 1100 Degasser G1379A Binary Pump G1312A (Spezielle Pumpendichtung: PE-Pump Seal, Agilent Technologies Part No.: 0905-1420 Automatic Liquid Sampler ALS G1329A Kühlung Autosampler ALSTherm G1330B Säulenofen Colcom G1316A Dioden Array Detector DAD G1315B Fraktionssammler Analyt-FC G1384C

Probenaufbereitungs-System, Barkey® flowtherm OptoControl 8 0,2 mL Barkey® Einenggefässe Ultraschallbad Bandelin Sonorex © Vorsäule: “Cosmosil 5-PYE” 4.6 x 10 mm, Nacalai Tesque™ 37903-11 Säule: “Cosmosil 5-PYE” 4.6 x 250 mm, Nacalai Tesque™ 37989-11 n-Hexan Picograde ®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1244-B040 n-Nonan, Picograde®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1271-B010 InjS, Injektionsstandard (13C12-PCB 138 und 13C12-Hexa-BDE 139 (jeweils 1000 ng/mL) Proben-Vials 4 mL, Supelco®, Braunglas (27001-U)

Parameter HPLC:

Mobile Phase: n-Hexan (Entgast, siehe Anmerkung)

Fluss: 1 mL/min

Injektionsvolumen: 100 µL

Säulenofentemp.: 40 ºC

Wellenlängen (DAD): 220.8 nm

230.2 nm

280.2 nm

Fraktionen zur Isolierung von PBDE und PBB:

Fraktion I: 04.00 – 07.40 min

Fraktion II: 07.41 – 10.51 min

Fraktion III: 15.00 – 18.00 min

Anmerkung:

Die HPLC wurde mit Pumpendichtungen ausgestattet, die speziell für organische Lösungsmittel geeignet sind (Pmax: 200 bar).

Das n-Hexan wird stets im Ultraschallbad für mindestens 15 Minuten (unter dem Abzug) entgast bevor es verwendet wird.

SOP

58

Durchführung:

Für jede Probe werden zwei Aliquoute (von je 100 µL) fraktioniert.

Der Barkey® flowtherm OptoControl 8 wird in Betrieb genommen (N2-Vordruck: 1,5 Bar, N2-Temperatur: 80 °C). Für jede neue Probe wird eine nach SOP_07 vorgereinigte Edelstahlspitze aufgeschraubt. Die Lichtschranke wird mit dem im finalen Schritt verwendeten Lösungsmittel auf das Zielvolumen justiert.

Die HPLC wird mit n-Hexan gespült, bis sich akzeptable Basislinien auf allen Wellenlängen eingestellt haben. Der Druck bei den oben genannten Parametern sollte ca. zwischen 38 - 40 bar liegen.

Die Probe befindet sich in einem 300 µL Autosamplervial (letzter Schritt des Schwefelsäure Cleanup, siehe SOP_04), und wird in den Autosampler gestellt. Im Probennamen (in der Chemstation Software der HPLC) wird vermerkt, ob es ich um den ersten oder den zweiten Lauf handelt.

Nach dem ersten Lauf werden die drei Fraktionen mittels sauberer Pasteurpipette in ein sauberes und gekennzeichnetes Barkey® Einenggefäss (0,2 mL) überführt. Es wird sofort begonnen das erste Aliquot der Probe einzuengen.

Der zweite Lauf wird analog zu dem ersten fraktioniert und mittels derselben Pasteurpipette in dasselbe Gefäß überführt. Abschließend wird mit n-Hexan jedes der drei Fraktionsgefäße mit ca. 0,5 mL gespült und mit in das Einenggefäß gegeben. Der verbleibende Rest von ca. 100 µL wird als Rückstellprobe im Autosamplervial mit neuem Deckel im Kühlschrank verwart.

Die so vereinigten Aliquote werden dann bis kurz vor das Zielvolumen eingeengt, wobei die Gefäßwandungen zweimal mit n-Hexan gespült werden. Dem folgt die Zugabe des Keeper (n-Nonan) und schlussendlich von 20 µL des InjS.

Wird das Endvolumen von 200 µL erreicht, wird der Extrakt in ein entsprechend gekennzeichnetes 300 µL Insert-Vial überführt und ist fertig für eine Vermessung via GC/MS nach SOP_05.

Tipp:

Im Fraktionssammler werden mindestens die ersten fünf Positionen mit 4 mL Supelco® -Vials bestückt, falls es zu einer Fehlfunktion des Fraktionssammlers kommt.

SOP

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SOP_06: GC/MS-Methode zur Bestimmung von PBDE und PBB Verwendete Geräte und Chemikalien

GC Agilent 6890 N (G1540N) mit On-Column-Injektor und Autosampler ALS 7683BMS Agilent 5975 XL (G3174A)

Software: MSD Chemstation E.01.00.237 Autosampler- Insert-Vials 300 μL, Supelco® (27564-U) Schraubdeckel PTFE Septum (27327) n-Nonan Picograde®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1271-B010 n-Hexan Picograde ®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1244-B040 Aceton Picograde ®, Fa. Promochem, Best.-Nr.: SO-1142-B040

PBDE-CS-1 – CS-4: Method 1614 ‘Calibration Solutions’ Cambridge Isotope Laboratory, CIL, EO-5279 (4 x 0,2 mL in n-Nonan),Enthält:

o BDE 28, 47, 99, 100, 153, 154, 183 (1, 5, 50 und 500 ng/mL), o BDE 209 in jeweils10 fach höherer Konzentration o Obige Komponenten als 13C12-BDE (100 ng/mL)

PBB-CS-1 - CS-4 (5, 10, 50, 500 ng/mL), Kalibrierlösungen in n-Nonan aus folgenden Einzelstandards hergestellt (Fa. ULTRA Schientific):

o PBB 26:2,3’,5-Tri-BB, in n-Hexan, 100 µg/mL Prod.-Nr.: RBF-086S o PBB 38:3,4,5-Tri-BB, in n-Hexan, 100 µg/mL Prod.-Nr.:RBF-098S o PBB 52:2,2’,5,5’-Tetra-BB, in n-Hexan, 100 µg/mL Prod.-Nr.:RBF-089S o PBB 49:2,2’,4,5’-Tetra-BB, in n-Hexan, 100 µg/mL Prod.-Nr.:RBF-088S o PBB 80: 3,3',5,5'-Tetra- BB, in n-Hexan, 100 µg/mL Prod.-Nr.:RBF-090S o PBB 153: 2,2',4,4',5,5'-Hexa- BB, in n-Hexan, 100 µg/mL Prod.-Nr.:RBF-094S o PBB 155: 2,2',4,4',6,6'-Hexa- BB, in n-Hexan, 100 µg/mL Prod.-Nr.:RBF-093S o PBB 169: 3,3',4,4',5,5'-Hexa- BB, in n-Hexan, 100 µg/mL Prod.-Nr.:RBF-095S

InjS, Injektions Standard (13C12-PCB 138 und 13C12-Hexa-BDE 139 (je 1µg/mL), n-Nonan)

Vorbereitung:

Mit Hilfe der Intensitäten der geräteinternen Kalibriersubstanz für NCI (PFDTD) wird qualitativ überprüft, ob ein Tuning erforderlich ist.

Gemessen wird mit den Parametern der optimierten Methode auf den drei Fragment-Massen: m/z=185,0, m/z=350,9 und m/z=448,9, die in einem ungefähren Verhältnis von 100 : 85 : 5 auftreten sollten. Ist dies der Fall wird das Ergebnis als pdf-Datei dokumentier. Weichen die Verhältnisse der Fragmente zu stark ab kann ein Autotuning erforderlich sein.

Zusätzlich wird über die Intensitäten der einzelnen Fragmente (auch vor und nach dem Tuning) eine Kontrollkarte zur Beobachtung geführt. (z.B. in Microsoft Excel).

Die Waschlösungen auf dem Magazin-Positionen A und B des ALS werden mit Aceton und n-Hexan gefüllt (die Gefäße bis zum Rand füllen). Bei längeren Mess-Sequenzen sind die Waschlösungen alle 24 Stunden auszuwechseln.

Anmerkung:

Wurde der MSD kürzlich geöffnet (Wartung) oder wird ein Luftleck vermutet, ist zu überprüfen, ob (noch) Luft und Wasser im System anwesend sind, da diese die Detektion beeinträchtigen.

Untergrundsüberprüfung im PCI-Modus: Die Intensität des m/z=19 sollte weniger als 5% von der des m/z=17 betragen. Die Intensität des m/z=32 sollte vernachlässigbar klein sein. Treffen diese Bedingungen nicht zu, deutet dies auf ein Luftleck im System hin, eine Lecksuche ist erforderlich.

Im PCI-Modus (Tunfile: pcich4.u) wird ein Autotune durchgeführt, dann auf den m/z = 17 (CH5

+), m/z = 19 (H3O+) und auf m/z=32 (O2+), wahlweise auch m/z=28 (N2

+) gemessen. Der NCI-Autotune mit dem PFDTD unter Standard-Bedingungen durchgeführt, der

Reaktantgasstrom wird auf 40% (entspricht 2 mL/min) eingestellt.

SOP

60

Im Anschluss daran werden in der Tune-Datei die für die PBDE-Methode optimierten Quellenparameter übernommen (Emissionsstrom und Beschleunigungsspannung, siehe Parameterliste unten) und gespeichert.

Es wird erneut eine Überprüfung der PFDTD-Fragmentionen vorgenommen ob sich Intensitäten und Verhältnisse verbessert haben. Ist dies der Fall werden die Werte in einer pdf-Datei hinterlegt und es kann mit der Durchführung fortgefahren werden.

Durchführung (Erstellung von Mess-Sequenzen)

Kalibriert wird für die PBB bzw. PBDE mit den je vier Standards (CS-1 bis CS-4). Vor und nach jeder Kalibrierung einer Substanzklasse wird ein Lösungsmittelblank injiziert (n-Nonan)

Durch das Vorgehen nach SOP_02 bis SOP_05 wird stets mit 4 Proben (= ein Probenset) parallel gearbeitet. Jede Probe wird dreimal vermessen (Ausreißer). Ist ein Probenset so vermessen worden, erfolgt erneut eine Kalibrierung (so genanntes Bracketing).

Aufgrund der anfallenden erforderlichen Messzeiten muss der Gerätedrift insofern Rechnung getragen werden, als daß pro Probenset die Mittelwerte aus drei Kalibrierungen zur Verfügung stehen. Je nach Anzahl der Probensets wird pro Substanzklasse in den Brackets einfach oder doppelt kalibriert.

Bsp.: Es sollen zwei Probensets vermessen werden. Zu Beginn der Sequenz wird pro Substanzklasse einmal, zwischen den Sets doppelt und am Ende wieder einmal Kalibriert. So wird jedes Probenset in Summe von drei Kalibrierungen „eingefasst“.

Auswertung der Daten (mittels Chemstation Software und MS Excel®)

In der Auswerteanwendung der Chemstation™ Software, „Enhanced Data Analysis“ wird zunächst eine Art Datenbank der betrachteten Substanzen angelegt, in welche die Grunddaten (Retentionszeiten, Massenspuren der Quantifier und allen Qualifiern) anhand einer geladenen Datei eines Standards eingetragen werden. Die Reihenfolge der Analyte ist festzulegen, die MS Excel®-Dokument müssen darauf angepasst werden. Dieser Datensatz wird als Teil der GCMS-Methode gespeichert. (Bei geladener Methode auf Calibrate -> Set up Quantitation). Im Zuge der Datenbankerstellung kann eine Datei mit Integrationsparametern eingebunden werden. Werden keine individuellen Informationen hinterlegt, bedient sich die Software der Standardparameter.

Ist die Datenbank erstellt kann ein Datensatz geladen werden (Standard, Blank oder Probe). Dieser Datensatz wird dann aufgrund der substanzspezifischen Informationen aus der Datenbank und ggf. der hinterlegten Integrationsparameter hin untersucht, und die identifizierten Peaks integriert. (-> Quantitate -> Calculate), ein Report der gefundenen und integrierten Quantifier wird als Liste (Textfile) ausgegeben)

Alle so behandelten Daten werden visuell kontrolliert ob die Identifikation und Integration aller Massenspuren seitens der Software zufriedenstellend ist ( ->View -> QEdit Quant Result ). Da in komplexen Matrices kleine und schulterbildende Peaks schwer zu erfassen sind, ist hier der Vergleich mit Retentionszeiten und Fragmentierungsverhältnissen der Substanzen aus den Kalibrierstandards unumgänglich. Wenn die Kontrollen und Korrekturen abgeschlossen sind wird zurück ins Hauptmenü gewechselt (-> View -> Return to Data Analysis). Die geänderten Daten werden nach Aufforderung gespeichert.

Ist mit allen Dateien der Messsequenz so verfahren worden, werden die Integrationsergebnisse in einem Report ausgegeben, der als MS Excel®-Datei abgespeichert werden kann (*.xls). Die Reihenfolge der Substanzen ist durch die Quantitationtable festgelegt. Die Reihenfolge der Parameter der Substanzen ist ebenfalls festzulegen (beispielhaft unten dargestellt) da die weiterverarbeitenden MS Excel®-Dateien auf eine konsistente Reihenfolge angepasst sind, um die Auswertungen zu vereinfachen.

Die Dreifachkalibrierung (PBDE und PBB) pro Probenset, sowie die Probendaten und Blanks sind in getrennten Reports auszugeben.

Für einen Report (-> Quantitate -> Custom Report) ist zunächst eine Datenbank zu erstellen

SOP

61

(Checkbox: Create New Database) zu erstellen, folgende Angaben sollen in dieser Reihenfolge enthalten sein:

o Header: Operator Acq. Method File

o All Compounds: Ret. Time (Target=Quantifier) Signal (m/z) Target Response (counts/sec) Q1 Signal Q1 Response Q2 Signal Q2 Response Q3 Signal Q3 Response

Ist der Inhalt so definiert, werden die Messdateien (Kalibrierung oder Messdaten) für den Report ausgewählt und als MS Excel®-Datei (.xls) in dem entsprechenden Verzeichnis gespeichert.

Die entsprechenden MS Excel®-Dateien für die jeweilige Kalibrierung und Ergebnisse werden mittels Verknüpfung auf die Reportdatei verwiesen (MS-Excel 2003: Bearbeiten -> Verknüpfung -> Quelle ändern). Dabei ist auf die richtige Reihenfolge zu achten, in welcher diese in der Datenbank hinterlegt wurden, diese sollte, einmal festgelegt, immer beibehalten werden um eine zeiteffiziente Auswertung zu ermöglichen.

Die Dreifachmessungen der Kalibrierungen und Proben werden als Mittelwert zusammengefasst. Die Kalibrierungen werden mittels gewichteter Regression (Wichtungsfaktoren=1/x) in eine MS-Excel®-Tabelle ausgewertet. Bei der Zusammenfassung von Kalibrierungen und Proben erfolgt eine Prüfung auf eine nicht akzeptabel Drift innerhalb des Bracketings. Bei Zweifach –Injektion (Anfang oder Ende des Bracketing) sind ggf. Einzelmesswerte bei zu starker Abweichung zu entfernen.

Als letzter Schritt werden die Daten der Fettbestimmung (siehe SOP_03) aus den Protokollen

mit der Ergebnisdatei verknüpft.

Konfiguration des GC (6890N) / MS (5975)

On-Column Injektion: Autosampler 7683B, Fa. AgilentSpritze: 5 μL On-Column RN, 5182-0836, Fa. AgilentVorsäule: 1,60 - 2,00 m Siltek®-deaktivierte Kapillare, Fa. RestekAnalytische Säule: DB5-MS (15 m x 250 μm x 0,1 μm) Fa. J&W ScientificSäulenverbinder: Siltek® ’Pressfit-connector’, Fa. RestekIonenquelle: CITrägergas: Helium 4,9, (konstanter Fluss auf 1,8 mL/min)Reaktantgas: Methan 5,5 Injektionsparameter Autosampler 7683B

Injektionsvolumen: 1 µLPumphübe mit Probe: 1Spülen mit Probe : 0Hubgeschwindigkeit: schnell (fast)Spülungen vor Injektion mit Waschlösung A: 3Spülungen vor Injektion mit Waschlösung B: 3Spülungen nach Injektion mit Waschlösung A: 5Spülungen nach Injektion mit Waschlösung B: 5Waschlösung A: Aceton, Waschlösung B: n -Hexan

SOP

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GC-Parameter Quellen-Parameter optimierte Methode

Trägergas-Fluss 1,8 mL/min (constant flow mode) Modus: Negativ-CITemperaturprogramm: Rate [°C/min] End-Temp.[°C] Haltezeit [min] Temperatur Quelle: 150 °CAnfangstemperatur: 64 °C 0 64 1 Temperatur Quadrupol: 150 °C

15 200 0 Emissionistrom (Filament): 225 µA4 300 4 Beschleunigungsspannung: 200 eV

Laufzeit: 39:07 min

Injektor-Temperatur: Oven track (entspricht der Ofentemperatur + 3 °C) Reaktantgasfluss (CH4): 40%

SIM-Massen PBDE und InjS (native und isotopenmarkierte Kongenere )∑Br SIM-Gruppe Quant [m/z ] Qual I [m/z ] Qual II [m/z ] Qual III [m/z ]

native BDE*28 3 2 327 325 329 24747 4 4 325 327 404.9 406.8100 5 5 402.7 404.7 483.7 481.799 5 5 402.7 404.7 483.7 481.7154 6 6 483.7 563.6 403.7 643.5153 6 6 483.7 563.6 403.7 643.5183 7 7 563.6 561.6 483.6 481.6209 10 8 486.6 484.6 482.6 -

13C12-BDE*28 3 2 339 337 341 25747 4 4 337 339 417 419100 5 5 416.8 414.8 412.8 336.999 5 5 416.8 414.8 412.8 336.9154 6 6 495.7 493.8 575.5 414.6153 6 6 495.7 493.8 575.5 414.6183 7 7 573.7 575.7 495.7 493.7209 10 8 494.6 496.6 498.5 -

InjS13C12-BDE 139* 6 3 495.7 493.8 575.5 414.613C12-PCB 138* 6 6 371.9 373.8 339.9 337.9

* = Kongener-Nummer nach IUPAC-Nomenklatur. SIM-Massen PBB

native PBB* ∑Br SIM-Gruppe Quant [m/z ] Qual I [m/z ] Qual II [m/z ] Qual III [m/z ]

26 3 1 311 308.9 312.9 230.549 4 3 388.8 390.8 310.8 230.852 4 3 390.8 388.8 310.8 230.880 5 4 469.7 471.7 309.8 310.9155 6 5 627.6 625.6 549.6 469.7153 6 6 627.6 625.6 549.6 469.7169 6 7 627.6 625.6 549.6 469.7

* = Kongener-Nummer nach IUPAC-Nomenklatur.

SIM-Gruppen Zeiten

SIM-Gruppen Nr. Startzeit [min] Zyklus [cyc/sec] PBDE *,** PBB* 13C12 BDE*, PCB*

Tri-PBB 1 00:00 7 26BDE28 2 09:80 2,8 28

TetraBB InjS 3 10:40 4,2 49, 52 13C12 -PCB 138PBB-80 BDE-47 4 11:50 2,8 47 80

hexaPBB pentaBD 5 13:00 2,8 99, 100 155hex-PBB-BDE 6 15:50 2,8 154, 153 153 13C12 -BDE 139hepDEhexBB 7 19:00 2,8 183 169

deka-BDE 8 24:00 5,3 209* = Kongener-Nummer nach IUPAC-Nomenklatur.** = native und 13C12-Kongenere

SOP

63

SOP_07: Reinigung von Glasgeräten, Werkzeugen und Zubehör Verwendete Geräte und Chemikalien

Labor-Spülmaschine: Miele G7883 Umlufttrockenschrank: Heraeus UT12P Lösungsmittel I (LM I): Aceton Picograde® , Promochem, SO-1142-B040 Lösungsmittel II (LM II): n-Hexan Picograde® , Promochem, SO-1244-13025 Alkalischer Labor-Reiniger: RBS® 50, verdünnt auf 5% als Reinigungslösung in

Leitungswasser Deconex® 21 SOLID für die Labor-Spülmaschine Reinstwasseranlagen: Milli-Q, Elix 5, Fa. Millipore

Alle Arbeitsschritte bei denen mit Lösungsmittel gearbeitet wird werden unter laufendem Abzug ausgeführt. Graduierte Glasgeräte (Messzylinder, Mess-, und Vollpipetten, Einenggefäße, etc.) werden nicht ausgeheizt.

Durchführung: Einwegglasgeräte

Einwegglasgefäße werden nacheinander in LM I und LM II über Nacht eingelegt. Autosampler-Vials kommen dafür in 600 mL Bechergläser, Pasteurpipetten in Präperategläser, welche je nach Schritt ebenfalls mit LM I und LM II eingelegt und nach Befüllung verschlossen werden. Offene Gefäße werden mit (ausgeheizter) Alufolie verschlossen. Proben-Vials ab 7 mL werden einzeln mit den Lösungsmitteln gefüllt und mittels Schraubdeckel verschlossen.

Nach dem Dekantieren des LM II Glasgeräte im Behältnis, bzw. unverschlossen unter dem Abzug ausdampfen lassen, bis keine Lösungsmittelreste mehr vorhanden sind.

Vials werden in den Bechergläsern, Pasteurpipetten in den Präperategläsern, Vials ab 7 mL lose für 10 Stunden im Umlufttrockenschrank ausgeheizt auf 250 ºC.

Nach dem Abkühlen Autosampler-Vials in verschließbare, saubere Gefäße zur Aufbewahrung überführen. Pipetten und Proben-Vials werden im verschlossenen Präparateglas aufbewahren.

Durchführung: Mehrwegglasgeräte und Werkzeug

Becher-, Präparategläser, Rund-, Spitz-, Erlenmayer-Kolben, Schliffstopfen (Johnson-Restrepo, Adams et al.) in der Laborspülmaschine reinigen und 10 Stunden ausheizen (250 ºC). Die abgekühlten Glasgeräte werden mit ausgeheizter Alufolie verschlossen und werden im Schrank gelagert. Schliffstopfen werden in (ausgeheizten) Instrumentenschalen (Edelstahl) mit Deckel gelagert.

Maß-, Vollpipetten, PTFE-Schliffmanschetten und Eineng-Gefäße (Barkey®) für 5 Stunden in RBS® 50-Lösung einlegen. Anschließend mit heißem Leitungswasser, gefolgt von Vollentsalztem Wasser (Elix) spülen und trocknen lassen. Mit LM I und LM II spülen, unter dem Abzug ausdampfen lassen.

Dimroth-Kühler und Extraktoren (Soxhlet-Extraktion) für 5 Stunden in RBS® 50-Lösung einlegen, mit heißem Leitungswasser und vollentsalztem Wasser (Elix) spülen und für 10 Stunden ausheizen (250 ºC). Die abgekühlten Glasgeräte werden mit ausgeheizter Alufolie verschlossen und werden im Schrank gelagert.

Werkzeuge aus Metall (Skalpellgriff, Pinzetten) werden zusammen mit dem PTFE-Schneidebrett nach Benutzung (Probenkontakt) im heißen Seifenwasser (Pril®) vorgereinigt. Das Werkzeug wird weiter in der Laborspülmaschine gereinigt und für 10 Stunden ausgeheizt (250 ºC).

Das PTFE-Schneidebrett wird nach der Vorreinigung mit heißem Leitungswasser und vollentsalztem (Elix) Wasser gespült und trocknen gelassen. Mittels Papiertüchern jeweils getränkt in LM I und LM II, wird das Schneidebrett nachgereinigt und unter dem Abzug zum abdampfen belassen.

Die Edelstahlspitzen des Probenaufarbeitungssystems Barkey® Optocontrol 8 werden nach

SOP

64

Benutzung in einer 250 mL Reagenzienflasche mit LM I und LM II über Nacht eingelegt und für 10 Stunden ausheizen (250 ºC).

Anmerkungen:

Zum Verschließen der gereinigten und ausgeheizten Glasgeräte sollte ein entsprechender Vorrat an Alufolie stets mit ausgeheizt werden.

Die 5%ige in RBS® 50-Lösung sollte stets dem Probendurchsatz angepasst entsprechend erneuert werden.

Literatur

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