Enhancing nuclear receptor-induced transcriptionrequires nuclear motor and LSD1-dependent gene

networking in interchromatin granules

Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008

Qidong Hu et al.

Arquitectura del núcleo y regulación de la transcripción

Estudios previos demostraron que existen muchos sitios de unión a factores detranscripción en zonas intergénicas, algunos de ellos enhancers

Pregunta: ¿cómo se comunican estos sitios con los genes blanco que regulana través de largas distancias intra e inter-cromosómicas?

Esto lleva a un estudio más profundo de la arquitectura nuclear y losterritorios ocupados por los cromosomas

Territorios nucleares y el papel de la miosina-I

•El núcleo está organizado en compartimientos. En algunos de estos compartimientosSe encuentran los cromosomas (territorios cromosómicos)

•Actualmente se cree que en la periferia del núcleo se encuentra el DNA inactivo (heterocromatina), mientras que el DNA transcripcionalmente activo está cerca delcentro

•Los cromosomas son capaces de cambiar de territorio al momento de transcribirse

Se ha demostrado que la miosina-I (asociada a la polimerización de actina)está involucrada en el movimiento activo de los cromosomas a través de los

distintos territorios del núcleo

Territorios nucleares y el papel de la miosina-I

Un modelo propuesto:

Sitios discretos dentro del núcleodonde se lleva a cabo la transcripción:colocalización de RNA pol II y RNA naciente

Fábricas de transcripción

ER-α: factor de transcripción activado por la unión con 17β-estradiol (E2)Asociado a la aparición y desarrollo del cáncer de mama

Receptor nuclear ER-α

AF-1: dominio de activaciónDBD: dominio de unión al DNALBD: dominio de unión al ligando

Demetilasa de lisinas de histonas (LSD1)

Estudios previos confirmaron que LSD1 es esencial para la activación de genes dependientes de E2

LSD1 es reclutada por ER-α unida a ligando y quita los metilos de las lisinas 4 y 9 de la histona H3, permitiendo que se active la transcripción

LSD1 ayuda a prevenir que receptores no unidos a ligando activen la transcripción de sus genes blanco en forma constitutiva

Objetivo:

Analizar las interacciones intercromosómicas entre 2 genes (TFF1 y GREB1) ante la presencia o ausencia de estímulo con E2 y su relación con LSD1 y proteínas

motor como la miosina-I nuclear

Métodos

Tipos celulares:MCF7: células tumorales provenientes de tejido mamarioHMEC: células del epitelio mamario (no tumorales)

Identificación de interacciones:Ensayo “3D”: ensayo 3C acoplado a ChIP-DSL

Visualización de las colocalizaciones:2D y 3D-FISH: hibridación con sondas específicas fluorescentes

Tecnología 3C:

Métodos

MétodosChIP-DSL:DSL: DNA Selection and Ligation

·Se inmunoprecipita la cromatina conteniendo laproteína de interés (en este caso ER-α)·Se revierte C-L y se biotinila la cromatina·Hibridación con un pool de oligonucleótidoscon primers en los extremos·Selección en fase sólida y posterior ligaciónde los oligos con Taq ligasa·Amplificación por PCR a partir de los primers y adición de los fluoróforos·Hibridación en array

MétodosTecnología “3D”:

DSL

1) Identificación de interacciones intercromosomicas inducidas por estrógeno

Resultados

Gen TFF1 (cromosoma 21): se sabía queestaba regulado por E2

Se realiza 3D para buscar interacciones entreTFF1 y 6 intervalos en cromosomas diferentes,uno de ellos GREB1, gen localizado en elcromosoma 2 e inducido por ER-α

Resultado: de los 6 intervalos testeados, sóloGREB1 mostró señal GREB1 interacciona con TFF1

ResultadosFISH: analizar las interacciones entre TFF1 y GREB1 en presencia y ausenciade E2

Resultado: Inducción de 60 minutos con E2 favorece la colocalización de GREB1con TFF1 (aproximadamente la mitad son interacciones bi-alélicas para ambostipos celulares)

Control:

¿Las interacciones intercromosómicas se dan solamente por la formación de loops en el DNA o están acompañados por movimiento de cromosomas?

Chromosome painting

Resultado: Luego de la inducción con E2 los cromosomas se presentan asociados. Reorganización drástica de la arquitectura del núcleoSolamente hay interacciones crom. 2-crom. 21, pero nunca crom. 2-crom. 2 ocrom. 21-crom. 21

MCF7 HMEC

2) Requerimientos para las interacciones intercromosómicas dependientes de ER

Tratamiento es efectivo para bloquear las interacciones entre TFF1 y GREB1 inducibles con E2

Interacciones TFF1:GREB1 dependen de la unión al ER

Microinyección nuclear de siRNA contra ER

Microinyección nuclear de siRNAs o anticuerpos anti-coactivadores de ER

La inactivación de ambos impide que se produzcan interacciones entre TFF1:GREB1

Microinyección nuclear de siRNA contra LSD1

LSD1 demostró ser esencial en la activación de los genes dependientes de E2

Las interacciones intercromosomicas inducidas por E2 se producen previamente a la activación de los genes.

• Si bien no hay filamentos de actina en el núcleo, se sabe que la actina nuclear se encuentra presente en varios complejos transcripcionales y juega un rol importante en la activación transcripcional en levaduras.

• Realizan microinyección nuclear de IgG anti-actina nuclear (2G2) en células epiteliales mamarias, antes y después del tratamiento con E2. Detectan oligomerización de g-actina en el núcleo en ambos casos.

Rol de la actina nuclear

• Analizan el efecto que se produce en células epiteliales de mama, estimuladas con E2, al tratarlas con drogas que impiden la polimerización/despolimerización de actina.

¿Las interacciones intercromosomicas dependen de la dinámica de la reorganización nuclear?

Al interrumpir la polimerización de actina (latrunculina), y también al prevenir su despolimerización (jasplakinolida), hay una pérdida total de las interacciones intrercromosómicas inducidas por E2

Tanto latrunculina como jasplakinolida previenen la expresión inducida por E2 de 3 genes target de ER (TFF1, GREB1, TMPRSS3).

En células MCF7 las drogas tienen el mismo efecto: se produce una disminución en la expresión de TFF1 y GREB1 pero no se ve afectada la expresión de genes constitutivos (-actina)

• Cuando se realiza la microinyección de IgG anti- g-actina tampoco se producen las interacciones TFF1:GREB1

La actina nuclear es requerida para que se produzcan las interacciones intercromosómicas analizadas, y además su

dinámica es requerida para que se produzca la expresión de los genes inducidos por E2

CONCLUSIÓN:

Rol de la maquinaria de miosina

Microinyección nuclear de siRNA e IgG anti-NMI

Existe un requerimiento funcional directo de NMI en el núcleo.

Los efectos producidos no se deberían a un efecto indirecto causado por la disrupción del citoesqueleto

Participación de motores nucleares basados en NMI

En células microinyectadas con IgG anti-NMI se inyectaron plásmidos que expresaban NMI WT o mutantes de NMI que contenían mutaciones específicas en la cabeza de miosina-1:

• R353C: no puede unir actina

• S397L: carece de actividad ATPasa

Las interacciones intercromosómicas que fueron bloqueadas con IgG anti-NMI pueden ser restauradas mediante la expresión de un vector que contiene NMI WT, mientras que con los mutantes no

En células MCF7 se observó que luego de realizar el knockdown de NMI, la expresión de TFF1 y GREB1 podía ser restaurada cuando se expresaba el vector NMI WT, no siendo así cuando se expresaban las mutantes funcionalmente inactivas.

Los resultados obtenidos son consistentes con estudios que muestran que NMI es requerido para la activación transcripcional inducida por el looping del DNA fuera del territorio nuclear.

Rol de la cadena liviana de dineina-1 (DLC1)

• Se sabe que DLC1 interactúa directamente con el ER unido a ligando

• Analizan el efecto producido por la inactivación de DLC1 en células epiteliales mamarias, mediante la microinyección de siRNA o Ab anti-DLC1

Ambos tratamientos impiden que se produzca la interacción TFF1:GREB1

Al realizar una RT-qPCR se observó que se inhibe la expresión inducida por E2 de TFF1 y GREB1, pero no se afecta la expresión de genes constitutivos:

Resultados similares se obtuvieron cuando las células fueron microinyectadas con siRNA contra el factor remodelador de la cromatina BAF53.

Esto es consistente con el hecho de que la acción coordinada de estos factores permite la interacción entre cromosomas

MCF7

Cuando se bloquean DLC1 o NMI, utilizando siRNA, no se produce un reclutamiento aberrante de ER o sus coactivadores.

Los componentes del sistema motor nuclear actúan luego de que se produce: la unión de ER y los eventos de reclutamiento de los coactivadores.

ChIP: análisis de la unión de ER, Pol II y CBP al promotor de TFF1, en células MCF7

Control: Knockdown producido por siRNA.

Los experimentos se realizaron en células MC7 inducidas con E2 transfectadas con siRNA. Los transcriptos fueron cuantificados mediante una real time RT-PCR

Los experimentos anteriores sugieren que existe una relación entre las interacciones intercromosómicas y la activación de dichos genes…

Activación de los NI ambos alelos son igual de competentes para la activación de la trascripción.

La expresión de los genes target del ERα aumenta específicamente donde hay interacciones entre los cromosomas (efecto mas marcado en interacciones monoalelicas)

Cuantifican el volumen de la señal de los transcriptos

¿La trascripción de los loci que se encuentran asociados a las zonas de interacción intercromosómicas es mayor en comparación a alelos NI?

¿Es en los gránulos de intercromatina (speckles) donde ocurren las interacciones intercromosómicas?

SC35: marker speckles (IGCs)2D FISH

+E2: Las NI no colocalizan SC35-speckles(+)

+E2: Colocalizan en dos SC35-speckles(+)

Monoalelicas bialelicas

Como habíamos visto… las interacciones intercrom. dependen de una reorganización del núcleo y se establece por una red de acción de actina/miosina

LA: bloquea la polimerización de actina

JP: bloquea la despolimerización de actina

No hay colocalizacion + E2 + SC35 + LA/JP

siDLC1 / siBAF53 No colocalizan, no hay relación entre las interacciones intercromosómicas y la activación los genes asociados a ellas.

Estos resultados sugieren que los speckles funcionarían como la base para la formación de una red de activación de los genes en el núcleo.

Vimos que siLSD1 bloquean la trascripción E2 dependiente de TFF1/GREB1 loci pero no las interacciones intercromosomales:

+ E2 + siLSD no colocalizan

2D FISH

¿LSD1 tiene efectos en la unión de los loci a los speckles?

3D FISH

LSD1 es necesario para la asociación de TFF1/GREB1 loci a los speckles.

¿LSD1 tiene efectos en la unión de los loci a los speckles?

+LSD1 activa enz. restaura la asociación

Con siLSD1 se detecta una reducción parcial del reclutamiento de los coactivadores de ERα en respuesta a E2 como CBP/p300.

LSD1 regula la iniciación de la trascripción y la activación de los loci al promover la asociación de estos a los speckles.

Modelo propuesto para la inducción con E2

• actina/miosina/DLC1 involucrados en los movimientos de los cromosomas.

• LSD1 dependiente, responsable de la interacción de los loci con los ICGs.

Este modelo permite una rápida asociación de los loci específicos con los gránulos de intercromatina para una mayor unión de factores de trascripción con sus cofactores.

Programa de “2 pasos” reorganización nuclear

LSD1 induce la asociación entre los loci y los speckles.