ENEA UTS - Protezione studi & ricerche used to detect...

STUDI & RICERCHE

59ENERGIA, AMBIENTE E INNOVAZIONE 6/04

AbstractEngineered biomolecules and cells immobilised

on screen printed electrodes were employed for biosensing purposes in environmental analysis.

Three examples are reviewed: adapted cells of Pseudomoas putidaused to detect phenol detection in industrial wastes; engineered yeasts

(Kluyveromices lactis), which express acetyl cholinestrerase activityfrom rat, used for detection of organophosporus compounds;engineered photosystem II from Thermosynecoccus elongatus,

used to detect herbicides.

stu

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ric

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WALTER VASTARELLA, JAN MALY, AMEDEO MASCI,

MARIA RITA MONTEREALI,LIVIA DELLA SETA,

BRUNO LANZA, CARLO CREMISINI,

ROBERTO PILLOTON

ENEAUTS - Protezione

e Sviluppo dell’ambiente e delTerritorio, Tecnologie Ambientali

Electrochemical biosensor based on recombinant cells and molecules

Biosensori elettrochimicia inibizione basati su molecole e cellule ricombinanti

L’impiego di biosensori permette di ridurre i tempi e i costidelle analisi ambientali. Altri possibili campi di applicazione

sono la diagnostica clinica e alimentare.Per ottenere biosensori elettrochimici, biomolecole o cellule

geneticamente modificate sono state immobilizzate suelettrodi stampati. Nell’articolo sono riportati esempi

applicativi per l’analisi ambientale: la rivelazione dei fenolinegli scarichi industriali, la rivelazione di composti

organofosforici, l’identificazione di erbicidi triazinici

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60 ENERGIA, AMBIENTE E INNOVAZIONE 6/04

I metodi bioanalitici rivestono partico-lare rilievo perché consentono di ridurrei tempi e i costi delle analisi ambientali,impiegando molecole naturali o microor-ganismi interconnessi a trasduttori disegnale elettroottici per il riconoscimen-to di specie o classi di composti in matri-ci analiticamente complesse.Nel 2003 gli studi, le ricerche e le colla-borazioni, già da tempo avviate tra lediverse unità dell’ENEA, sono giunte all’ag-gregazione delle culture e delle compe-tenze necessarie per un tema multidisci-plinare come i biosensori (chimica ana-litica e organica, elettrochimica, micro-biologia e biologia molecolare, elettroni-ca) in un quadro favorevole di finanzia-menti provenienti dai Piani TriennaliRegionali, dal MIUR (FIRB), dalla comunitàeuropea (5FW) e di proficue collabora-zioni nazionali (Università di Roma, Firenze,Molise, CNR-Istituto Nanotecnologie eFotonica, ITC-IRST divisione Microsistemi,Istituto della Nutrizione ecc.) e interna-zionali (CEA-Sezione di Bioelettronica eBioenergetica-Francia, Cornell University-USA, Osaka University-Giappone,Accademia delle Scienze-RepubblicaCeca).I biosensori, dispositivi analitici risultantidall’accoppiamento di un mediatore bio-logico, che opera il riconoscimento selet-tivo dell’analita, con un trasduttore chetrasforma il segnale chimico in un segna-le elettronico, hanno recentemente cono-sciuto un momento di sintesi particolar-mente favorevole all’ENEA.Sono stati realizzati semplici dispositiviportatili basati su biosensori per i radi-cali liberi, per i fenoli e i polifenoli, per ipesticidi organofosforici e per gli erbici-di fotosintetici, impiegando enzimi puri-ficati come l’acetilcolinesterasi e la fosfa-tasi acida, batteri adattati (Pseudomonasputida), lieviti ingegnerizzati (Kluyvero-mices lactis) e il PSII purificato da ciano-batteri termofili (Thermosinechococcuselongatus). I trasduttori elettrochimici per

questi biosensori sono stati ottenuti contecniche di produzione massiva come lastampa serigrafica di materiali elettrodi-ci compositi e nanodispersi (nanoparti-celle di oro e nanotubi di carbonio) inmatrici polimeriche su supporti di mate-riale plastico (PVC). I trasduttori cosi pre-parati realizzano l’obiettivo del dispositi-vo “usa e getta” per il costo ridotto e lecaratteristiche di riproducibilità e sensi-bilità paragonabili a quelle di dispositivida laboratorio più costosi.Accanto agli aspetti applicativi e in rap-porto sinergico con essi, si è mossa laricerca di base sui biosensori e sui dispo-sitivi bioelettronici, che ha come obietti-vi lo sviluppo di microsistemi per la dia-gnostica clinica, alimentare ed ambientale,per effettuare micro-analisi a livello mole-colare con metodologie microanalitichebasate sulle strutture biomolecolari, sul-le nanotecnologie e in particolare sul pat-terning di biomolecole su µ-array di sen-sori. È su questi aspetti che le interazio-ni multidisciplinari con laboratori ed isti-tuzioni italiane ed estere hanno dato irisultati più promettenti portando, all’ini-zio del 2004, alla presentazione con altripartner di una proposta progettuale perla realizzazione di un “Laboratorio µ-Sistemi innovativi per la Genomica e laPostgenomica” (FIRB2003). Infatti l’inge-gneria genetica e le nanotecnologie rap-presentano nuovi e potenti approcci perottenere strutture molecolari più sempli-ci con nuove o migliorate proprietà (spe-cificità, stabilità, sensibilità) assemblatein monostrati molecolari. Un aspetto di par-ticolare rilievo scientifico e tecnologico,infatti, è rappresentato dalla preparazio-ne di film ordinati e orientati di biomole-cole che conservino le loro funzioni bio-logiche. Tra le varie strutture biomoleco-lari, i polinucleotidi sono ampiamente uti-lizzati come sonde molecolari grazie all’i-bridazione tra catene nucleotidiche com-plementari che viene normalmente sfrut-tata nelle principali tecniche della biolo-

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gia molecolare ed è il fondamento dellanascente tecnologia del “DNA Chip”, unapproccio rivoluzionario alla diagnosticagenetica e all’analisi genomica che rive-la il contenuto di specifiche regioni geni-che attraverso l’impiego di matrici minia-turizzate di sonde polinucleotidiche. Inquesta ottica e con questi obiettivi, i risul-tati di rilievo durante il 2003 hanno riguar-dato:• l’immobilizzazione reversibile e orien-

tata di film monomolecolari di diverseproteine ingegnerizzate impiegandouna procedura originale di sintesi orga-nica elettrochimica che ha consentito diindirizzare ciascuna biomolecola su unelettrodo specifico di un µ-array;

• la preparazione per via elettrochimicadi cablature molecolari conduttrici inscala nanometrica nell’intorno di pro-teine immobilizzate che consentono diosservare il trasferimento diretto, sen-za la necessità di mediatori, di elettro-ni dal sito attivo delle biomolecola allasuperfice di un elettrodo in un µ-chip;

• grazie allo specifico orientamento del-la biomolecola, alla ridotta distanza dalµ-elettrodo (8 nm) e all’impiego di caviconduttori molecolari (50-60 nm), è sta-ta osservata per la prima volta l’attivitàperossidasica nel citocromo b-559,componente enigmatico del fotosiste-ma 2 del quale, pur essendo conosciutala struttura ad alta risoluzione (3,8 Å),rimangono oscuri il ruolo, la funzionee il comportamento red-ox.

Questi risultati di rilievo costituiscono piùdi una premessa per la realizzazione didispositivi bioelettronici molecolari susingola molecola oligonucleotidica conun approccio bottom-up differente daquello seguito normalmente (top-down)con tecniche costose che non tengonoconto delle proprietà e delle peculiaritàchimiche offerte dalle molecole e dallemacromolecole nell’auto-assemblarsi inmodo orientato sulle interfacce elettroni-che.

Biosensori microbici stampatiper fenoli e polifenoli 2

Le cellule di Pseudomonas putida sono sta-te coltivate in presenza di fenolo come uni-ca fonte di carbonio organico e immobi-lizzate sulla superficie di diversi trasdut-tori (elettrodo di Clark commerciale, elet-trodo stampato d’oro commerciale4, elet-trodo di grafite stampato in laboratorio7)impiegando gelatina successivamentereticolata con GA.Inizialmente è stato impiegato un elettro-do commerciale per l’ossigeno per valu-tare la risposta di cellule indotte e nonindotte. Infatti, come le cellule adattate infenolo, anche quelle cresciute in gluco-sio come principale fonte di carboniosono state impiegate per realizzare un bio-sensore con diversa specificità verso dif-ferenti inquinanti. La valutazione è stataeseguita tramite calibrazioni con diversicomposti fenolici in soluzioni standard esu acque di scarico industriali sintetiche.Il microorganismo adattato e non, è sta-to successivamente immobilizzato anchesu elettrodi stampati commerciali di oroe, infine, su elettrodi stampati di grafite pro-dotti in laboratorio.

Coltura di Pseudomonas putida

Pseudomonas putida DSM 50026 (figura1) è stato coltivato in “Nutrient Agar”. Perottenere le cellule non adattate, è stato usa-

AbbreviazioniAChE: Acetil Colinesterasi; AChCl: AcetilColinaCloruro; Atrazina: 2-cloro-4-etilamino-6-isopropi-lamino-1,3,5-triazina; BSA: bovine serum albumin;ChOx: Colina Ossidasi; C.V.: Coefficiente di varia-zione; DQ: tetrametil-p-benzochinone; FeCy:Potassio Ferricianuro; GA: Glutaraldeide; LED: light-emitting diode; LOD: Limit Of Detection; LOQ: limitof quantitation; OP: insetticidi organofosforici; PB:Tampone fosfato [0.1M (pH=7,0)]; PBS: Tamponefosfato salino (NaCl 0,1M); PSII: fotosistema II;. RE:Elettrodo di riferimento (Ag/AgCl); SP: ScreenPrinting; WE: Elettrodo di lavoro.

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to glucosio come sorgente di carbonio.Il microorganismo è stato inoculato nelmezzo di coltura (MSM) contenente 250mg/l di glucosio e incubato a 28 oC. Dopo24 ore la biomassa è stata separata percentrifugazione e risospesa in MSM eancora centrifugata. Infine il supernatan-te è stato rimosso ed è stata ottenuta unapasta cellulare che è poi stata usata perrealizzare il biosensore. Le cellule adat-tate al fenolo (250 mM) sono state otte-nute attraverso le seguenti operazioni: ilmicroorganismo è stato inoculato ognigiorno in MSM con crescente concentra-zione di fenolo e decrescente concen-

trazione di glucosio fino alla concentra-zione finale di 250 mg/l di fenolo. Dopo24 h, quando le cellule sono cresciute, labiomassa è separata per centrifugazionee sospesa in MSM e poi ricentrifugata.Infine il supernatante è stato rimosso edè stata ottenuta una pasta cellulare che èpoi stata usata per realizzare il biosensore.La crescita cellulare è stata seguita spet-trofotometricamente misurando la den-sità ottica a 560 nm.

Biosensore microbico basato su elettrodo di Clark

Con il biosensore microbico basato suelettrodo di Clark sono state messe apunto le condizioni di misura. Nella figu-ra 2 è riportata la calibrazione del feno-lo impiegando due diverse soluzioni tam-pone: PB e MSM (Mineral Salt Medium).La sensibilità più elevata è stata osserva-ta nel tampone MSM che era già statoimpiegato come mezzo di coltura e perquesto motivo è stato scelto come tam-pone di misura per tutti i successivi espe-rimenti. In queste condizioni sperimentaliil tempo di risposta del biosensore è di5 minuti.La specificità ai diversi substrati fenolicidelle cellule di controllo e di quelle adat-tate sono state determinate inizialmentecon l’elettrodo di Clark commerciale. Co-me si può vedere, entrambi i tipi di cellu-le mostrano una risposta per il fenolo,acido 2,6-diidrossibenzoico e acido ben-zoico. Le cellule adattate rispondono an-che a DOPA, tirosina, acido siringico, re-sorcina, acido picrico, metil parathion,mentre nessun segnale è osservato con ilbiosensore ottenuto con le cellule di con-trollo. Questo può essere spiegato con l’ef-fetto dell’adattamento che ha causato unadifferente specificità per i substrati consi-derati. I nostri risultati (tabella 1) mostra-no che è possibile ottenere biosensori di-versi utilizzando le cellule di Pseudomonasputida adattate e non.

Figura 1Pseudomonas putidaDSM 50026 è un mi-croorganismo inge-gnerizzato gram ne-gativo, polare, flagel-lato e unicellulare

Figura 2Calibrazione per ilfenolo in 50 mM KPie MSM, pH 6,9

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La biodegradazione microbica dei feno-li infatti è determinata da diversi fattori:1) fattori diffusivi attraverso la membrana

cellulare che possono operare a) un tra-sporto passivo (idrofobicità, logP,solubiltà,pH) e b) un trasporto attivo mediato daspecifici meccanismi di membrana;

2) fattori cinetici come il raggiungimen-to del sito attivo (fattori sterici) e lavelocità della reazione enzimatica (fat-tori elettronici, cinetici);

3) molteplicità delle vie metaboliche: a)rottura dell’anello aromatico che puòavvenire, dopo l’idrossilazione a cate-colo, con il meccanismo dell’extra dio-lo (in posizione meta) o dell’intra dio-lo (in posizione orto) come riportato

Composti fenolici Segnale, (I, nA)* Adattate Controllo

Fenolo 6,5 61,5Catecolo - 23,0L-DOPA 23,5 2,0L-Tirosina 38,0 -Acido L-Siringico 30,5 -Acido caffeico - -Idrochinone - 34,5Adrenalina - 112,0Acido benzoico 59,0 38,5Resorcina 6,5 -Acido picrico 15,5 -3-idrossitiramina - 0,5Ac.2,6-diidrossibenzoico 10,5 6,52,3-diidrossinaftalene - 28,0Toluene 2,0 -Metil parathion 11,5 -

*concentrazione dei composti fenolici =1 mM

Tabella 1Risposta a diversifenoli dei biosensoriottenuti con celluledi controllo e celluleadattate immobiliz-zate su un elettrododi Clark

A B C

Figura 3Le vie metabolichedi degradazione deifenoli: A) e B) rottu-ra dell’anello aroma-tico, C) via del genti-sato

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nella figura accanto, e b) la via meta-bolica del gentisato che porta a diver-si prodotti della degradazione (AcetylCoA, succinato, fumarato, piruvato, ace-toacetato, acetato).

I dati riportati nella tabella 1 suggeri-scono che nelle cellule adattate siano sta-te soppresse le vie metaboliche che por-tano alla rottura dell’anello aromatico (figu-re 3A e 3B) e che la degradazione deifenoli proceda attraverso la via del gen-tisato (figura 3C)17.

Biosensore microbico basato su elettrodi d’oro commerciali

Sono stati realizzati biosensori microbi-ci basati su elettrodi stampati commer-ciali con elettrodo di lavoro in oro e nel-la tabella 2 sono riportate le curve di cali-brazione per entrambi i tipi di cellule. Per

questi composti sono stati determinatied indicati i campi di linearità. Al diso-pra di questi livelli di concentrazione siosserva saturazione da substrato. Questibiosensori sono stati applicati su duecampioni di acque di scarico sintetiche.A questo scopo, sono state preparatedue soluzioni con la seguente composi-zione.

Campione 1 Campione 2

(NH4)2SO4 (0,5 g), Come il campione 1

MgSO4 (0,1 g), +NaCl (50 g/l)

MnSO2 (0,01 g), Fenolo (100 g/l) in 1 M HCl

FeSO4 (0,0005 g)

Fenolo aggiunto in concentrazione nota

Acqua di rubinetto

pH 7,2

Entrambe le soluzioni sono state aggiun-te al tampone di misura (MSM) con diver-se diluizioni.I segnali ottenuti sono molto simili o coin-cidenti alle soluzioni di fenolo standard(tabella 3) mostrando che le matrici deidue campioni sintetici non hanno alcuneffetto sul biosensore.

Biosensore microbico ottenuto con elettrodi stampati di grafite

Le medesime prove condotte sugli elet-trodi di oro sono state condotte sugli elet-trodi di grafite prodotti in laboratorio. Irisultati della sperimentazione sono ripor-tati nelle successive tabelle 4 e 5.Questo biosensore, simile ad altri in let-teratura per il tipo di trasduttore stampa-to e per le condizioni miti impiegate,mostra un LOD di un ordine di grandez-za inferiore rispetto a quelli già realizza-ti. L’uso della membrana di acetato di cel-lulosa, depositata sull’elettrodo di lavoro,sembra essere responsabile di questocomportamento interessante. La diffusio-ne dell’ossigeno controllata da questamembrana consente di migliorare il rap-porto segnale rumore e di ottenere miglio-ri LOD.

Tipo di cellule Linearità Sensibilità(µM) (nA.µM-1) R2

Controllo Fenolo 0,10-1,00 16,54 0,9986Catecolo 0,50-5,00 5,07 0,9971Idrochinone 0,25-1,00 15,20 0,9972Acido benzoico 0,10-0,75 15,82 0,99811,2-Diidrossinaftalene 0,25-2,50 8,01 0,9992

Adattate Fenolo 0,50-6,00 5,03 0,9995L-tirosina 0,02-0,20 87,08 0,9988Acido L-siringico 0,02-0,20 37,01 0,9852L-DOPA 0,02-0,20 61,88 0,9989Metil Parathion 0,30-2,50 3,64 0,9917

Concentrazione rivelata (µM)Fenolo (µM) Adattate Controllo

(Campione 1)0,25 0,24±0,01 0,50 0,52±0,02 1,00 1,01±0,022,00 1,98±0,05

(Campione 2)0,25 0,25±0,010,50 0,51±0,031,00 1,01±0,022,00 2,02±0,03

Ogni analisi è stata effettuata 7 volte

Tabella 2Curve di calibrazio-ne di biosensori mi-crobici ottenuti conelettrodi stampati(oro) commercialicon diversi substra-ti fenolici con cellu-le adattate e di con-trollo

Tabella 3Applicazione deibiosensori microbi-ci (oro) a rifiutiindustriali acquosi

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zioni (1) e (2) catalizzate da AChE eChOx:

(2)

(3)

L’attività del primo enzima (AChE) risul-ta proporzionale alla concentrazionedi pesticida in soluzione, mentre ChOxtrasforma la Ch prodotta dalla primareazione in betaina e perossido di idro-geno che può essere rivelato con uncomune sensore elettrochimico.Nel passato l’accoppiamento delle duereazioni enzimatiche è stato realizza-to in diverse maniere:1) i due enzimi puri sono stati co-

immobilizzati su una membranaposta sulla superficie di un elettro-do di Pt. L’inibizione irreversibiledell’AChE ad opera dei pesticidi nelcampione rende presto inutilizzabi-li questi biosensori dopo pochemisure27.

2) La ChOx è stata immobilizzata suuna membrana posta sull’elettrodo diPt mentre l’AChE è stata utilizzatalibera in soluzione 28,35. Anche que-sto protocollo ha presentato seri pro-blemi per la forte tendenza dellaAChE ad adsorbirsi sulla membranae a trasformare il biosensore per laCh in un biosensore per l’AChClcome risulta da alcuni nostri espe-rimenti riportati in figura 4.

Biosensori enzimatici o microbici stampati per OP

I pesticidi sono ampiamente tuttora uti-lizzati in agricoltura, in virtù della loroelevata efficacia e della relativamenteveloce degradazione nell’ambiente. Il pro-blema reale è purtroppo legato al fatto cheil loro processo di riciclo e di distribuzionenell’atmosfera provoca danni irreversibi-li sugli organismi viventi, quando per-mangono nei suoli e nelle acque per untempo sufficientemente lungo da altera-re la catena alimentare. Essi agisconoprincipalmente sul sistema nervoso cen-trale e periferico, inibendo i siti attivi dideterminati enzimi o bloccando l’attivitàdi alcuni meccanismi cellulari.La valutazione e il monitoraggio di livellianche bassi di pesticida resta una pro-blematica ancora lungi dall’essere risol-ta, soprattutto in presenza di sostanzeinterferenti presenti nella matrice da ana-lizzare. HPLC, GC-MS, ELISA sono meto-dologie d’analisi comunemente utilizza-te ma prevedono comunque costi e tem-pi ancora alti e non forniscono alcunainformazione diretta degli effetti della lorotossicità sull’uomo. I biosensori rappre-sentano invece uno strumento utile per loscreening sul campo per valutare la tos-sicità di campioni ambientali, attraverso lamisura dell’attività residua di uno speci-fico enzima, dopo esposizione a diffe-renti classi di inquinanti.La misura dell’inibizione dell’attività coli-nesterasica ad opera dei pesticidi OP ecarbammici. è stata ampiamente studia-ta18-41. Il biosensore risulta dalle due rea-

Fenolo L-Tirosina L-DOPA

Equazione a Y=19,58X+0,01 y=112,88X-1,74 y=78,87X-0,48Linearità (M) 0,1-1 0,05-1 0,05-1Coefficiente di correlazione (r2) 0,9976 0,9977 0,9996Deviazione standard (D.S.)b ±0,008 (n=7) ±0,002 (n=5) ±0,006 (n=5)

a il coefficiente angolare è in nA/µM, l’intercetta in nA b Le misure di ripetibilità e il calcolo della deviazione standard sono state ottenute con n replichedi una soluzione 0,25 µM di composto fenolico

Fenolo aggiunto Fenolo rivelato(µM) (µM)

0,10 0,11±0,01

0,25 0,25±0,01

Tabella 4Caratteristiche ana-litiche del biosen-sore microbico perfenolo, L-tirosina eL-DOPA

Tabella 5Applicazione delbiosensore stampa-to ad acque di sca-rico industriale sin-tetiche (n=7)

* Infatti, le procedure di calcolo dell’inibizione dell’AChE ad opera dei pesticidi [35], richiedono normalmente la misuradell’attività enzimatica prima (slope Ib) e dopo (slope Ie) l’esposizione dell’enzima all’inibitore. L’attività enzimatica puòessere calcolata con la formula:

mentre l’attività residua (Ar) è espressa come il rapporto percentuale (adimensionale) tra Ub e Ue:

È dimostrabile che la sensibilità della misura, e di conseguenza il LOD, sono inversamente proporzionali alle unità di AChEpresenti inizialmente:

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3) La ChOx è stata immobilizzata su unamembrana posta sull’elettrodo di Ptmentre l’AChE è stata immobilizzata suuna membrana posta in soluzione29.Questo metodo consentiva di misu-rare concentrazioni di pesticida del-l’ordine dei 100 ppt poiché realizzavaun protocollo di misura basato sullaseparazione delle diverse fasi:• incubazione dell’AChE immobiliz-zata nel campione• lavaggio della membrana AChEper l’eliminazione delle possibiliinterferenze• incubazione della membrana AChEnella soluzione di substrato (AChCl)• estrazione della membrana• misura della Ch prodotta dalla rea-zione catalizzata da AChE con unbiosensore a Ch.

Dalla separazione negli stadi (a-e) deri-

vano un certo numero di vantaggi:• le operazioni a-d possono essere

condotte in parallelo riducendo iltempo richiesto per la misura di uncampione.

• i tempi delle due incubazioni (a e c)possono essere modulati in base alleconcentrazioni di pesticidi aspetta-te per la tipologia specifica di cam-pioni analizzati.È possibile ridurre notevolmente itempi di analisi se i campioni con-tengono abitualmente elevate con-centrazioni di pesticida (20-100 ppb).Viceversa, per raggiungere concen-trazioni molto basse (100 ppt, acquedi falda) è possibile diminuire lasuperficie delle membrane che sup-portano AChE ed incrementare i tem-pi delle incubazioni (a e c).

• l’operazione (e) è condotta in unasoluzione standard priva di interfe-renze sull’elettrodo, può essere rea-lizzata con un biosensore a Ch pri-vo di membrane selettive e quindipiù sensibile.

Mentre la procedura 2 (AChE libera insoluzione) è senz’altro da evitare per ilproblema dell’adsorbimento dell’AChEsulla membrana dell’elettrodo a Ch, imetodi 1 (AChE e ChOx co-immobi-lizzati) e 3 (AChE e ChOx immobilizzatisu diverse membrane) possono esse-re considerati complementari a secon-da dei requisiti richiesti dalla specificatipologia di campione*.

Figura 4Rette di calibrazioneper perossido di idro-geno (∆) e Ch (O)ottenute con un bio-sensore a Ch. Dopotre misure in presen-za di AChE libera insoluzione il biosenso-re diventa sensibileanche alla AChCl ( )come si può osserva-re dalla curva di cali-brazione

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La procedura di analisi 3 per la deter-minazione degli insetticidi OP è stataottimizzata. Essa si avvale dell’uso diun biosensore amperometrico a ChOxper misurare l’attività residua dell’en-zima AChE immobilizzato su mem-brane di nylon. La membrana conl’AChE non è posizionata sul biosen-sore ma utilizzata separatamente.Questo accorgimento consente di ese-guire un gran numero di incubazioniparallele delle membrane nel cam-pione contenente il pesticida, (stadiolento della misura, tipicamente 30 minu-ti) e di eseguire la misura dell’attivitàresidua dell’AChE con un solo bio-sensore a Ch che opera su soluzioni disubstrato sintetiche senza entrare incontatto diretto con i campioni e i rela-tivi interferenti eventualmente presen-

ti. È stata effettuata la comparazione didue sistemi, il primo basato sul clas-sico elettrodo commerciale a perossi-do di idrogeno e impiegato come ter-mine di confronto, il secondo basato suun elettrodo stampato.I risultati ottenuti con gli enzimi puri-ficati sono stati estesi all’enzima AChEprodotto da un lievito ingegnerizzato.In questo modo sono stati minimizza-ti drasticamente i costi del sistema ana-litico. Tutte le misure di inibizione sonostate eseguite con paoroxon comepesticida modello.

Biosensore a ChOx

Il range di misura per la Ch degli elet-trodi stampati è stato confrontato conquello degli elettrodi commerciali tra-

Figura 5A) Retta di taraturae curve di confiden-za (95%) per l’elet-trodo commercialedi Pt (Idronaut,Brugherio, Mi).y=(2,4+0,1)103x+(8+6)10-3; R2=0,9931;CV=4,2%B) Retta di taratura ecurve di confidenza(95%) per l’elettro-do stampato di gra-fite su PVC;y=(4,1+0,1)102x-(2+5)10-4;R2=0,9963;CV=2,4%

** Per il calcolo del LOD si è adottato il procedimento grafico riportato in figu-ra ed utilizza il limite di confidenza per individuare sia il LOD sia il LOQ. Ilsignificato di questi due limiti è importante nel fornire i risultati di un’analisicondotta mediante un retta di calibrazione. Si individuano tre possibilità:-il valore calcolato è inferiore al LOD: in questo caso non si può fornire il valo-re calcolato ma si deve fornire un’indicazione del tipo inferiore a X(lod)-il valore calcolato è compreso tra il LOD e il LOQ: in questo caso si può darecome risultato il valore calcolato ma senza alcuna informazione sulla suaincertezza (deviazione standard)-il valore calcolato è maggiore di LOQ: in questo caso il risultato può essere for-nito completo di deviazione standard. Queste possibilità sono rappresentate nel-la figura.

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dizionali di Pt (Idronaut, Brugherio, Mi).Le prove sono state tutte effettuate influsso tramite la cella descritta prece-dentemente.Come si deduce dai grafici di figura 5,l’elettrodo stampato (slope=0,4 nA/mM)è meno sensibile alla Ch di quellocommerciale (2,4 nA/mM) ma, nono-stante il più elevato rumore di fondoche si può osservare nei tracciati, pre-senta un migliore LOD calcolato con ilmetodo grafico di Meier e Zund** 65

(0,4 contro 0,8 µM) ed un miglior CV(2,4% contro 4,2%).

Immobilizzazione e misura dell’attività dell’AChE

L’immobilizzazione di questo enzima susupporti insolubili migliora il rendi-mento del biosensore rispetto all’AChElibera in soluzione che, adsorbendosisull’elettrodo determina segnali falsa-ti. La scelta del tipo di membrana sucui effettuare l’immobilizzazione del-l’enzima è un altro fattore importanteper l’ottimizzazione del metodo. Infattidiversi sono i parametri che influisco-no sulla scelta della procedura diimmobilizzazione, del materiale di sup-

porto e tra essi ricordiamo la resa diimmobilizzazione, la stabilità mecca-nica del supporto e catalitica delmediatore biologico. Considerazionipreliminari hanno motivato la sceltadel nylon come supporto di immobi-lizzazione. Queste considerazioni sonostate di carattere essenzialmente fun-zionale, la resistenza meccanica delsupporto e la semplicità delle opera-zioni manuali di utilizzo ne hanno moti-vato la scelta.Sono state impiegate reti di nylon fun-zionalizzate in laboratorio con gruppialdeidici e membrane di nylon com-merciali con gruppi amminici superfi-ciali (PALL amminiche).Dopo l’immobilizzazione covalente del-l’enzima è necessario rimuovere dal-le membrane la frazione di enzimaadsorbito con tre lavaggi di 10 minciascuno in un bagno ad ultrasuoni ein PB, NaCl 1M. Dopo questo tratta-mento l’attività immobilizzata covalen-temente su ciascuna membrana èvariabile (15-50 mU/membrana) mastabile come si può concludere dalgrafico di figura 7 dove è riportata l’at-tività di 24 membrane misurata in duemomenti successivi.La misura dell’attività enzimatica immo-bilizzata sulle membrane è ottenutaper incubazione in soluzioni di AChClin PB in pozzetti da 2,5 ml, impiegan-do un dispositivo che consente la rapi-da estrazione delle membrane dalbatch di reazione (figura 6).

Impiego di lieviti ingegnerizzaticon AChE di ratto espresso come ectoenzima

Dopo le fasi di ottimizzazione con l’en-zima purificato e l’elettrodo commer-ciale o quello stampato, è stato impie-gato un lievito (Kluyveromices lactis)ingegnerizzato che esprime sulla pare-te cellulare un’attività acetilcolineste-

Figura 6Il dispositivo per con-durre in parallelo su24 membrane l’inibi-zione e l’incubazioneper lo “sviluppo” del-l’attività colinestera-sica, è costituito daun coperchio di sili-cone sul quale sonoposizionati 24 aghiipodermici su ciascu-no dei quali si inseri-sce la membranaenzimatica. Questoaccorgimento con-sente di inserire con-temporaneamentetutte le 24 membranenelle soluzioni stan-dard di pesticida, neicampioni, nelle solu-zioni di lavaggio e disubstrato (AChCl)contenute in una pia-stra a 24 pozzetti da2,5 ml ciascuno

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rasica di ratto40,41. I lieviti sembranoessere ideali per realizzare biosenso-ri semplici da preparare, stabili neltempo ed economici. Infatti, l’uso diAChE liofilizzata commerciale rappre-senta la parte più economicamenteconsistente del protocollo di analisiproposto. L’utilizzo del lievito permet-te l’abbassamento dei costi, proprioper la sua facile ed economica pro-duzione.I lieviti utilizzati sono il MW278-20C eil CPK1, gentilmente forniti dal labo-ratorio del prof. C. Palleschi delDipartimento di fisiologia dell’Università“La Sapienza” di Roma.Il lievito è stato immobilizzato su unamembrana porosa di nylon per filtra-zione.Le condizioni operative con il lievitoingegnerizzato sono rimaste le stesseimpiegate con l’enzima purificato aparte i tempi per lo “sviluppo” del-l’attività colinesterasica nella soluzio-ne di substrato. Infatti il primo stadiodi inibizione dell’attività colinesterasi-ca del lievito ad opera del paraoxonrichiede 30 minuti come per l’enzimapurificato.Nella figura 8 è riportato il grado di ini-bizione della AChE nel lievito ad ope-ra di una soluzione di paraoxon 37 ppbespressa in concentrazione di Ch pro-dotta in funzione del tempo. Per il trat-tamento di incubazione nel substratosono richiesti, invece, 30 minuti controi circa 10 necessari nel caso dell’en-zima purificato come risulta dalla figu-ra 9 dove è confrontata la produzionedi Ch nel tempo ad opera di lievito oenzima purificato.Questa differenza potrebbe esseredovuta al tempo richiesto per la diffu-sione del substrato per raggiungerel’enzima all’interno della parete cellu-lare del lievito.Applicando questa modifica, i due bio-sensori, quello con l’enzima purifica-

Figura 7Attività colinesterasi-ca di 24 membraneottenuta con dueoperazioni di misurasuccessive

Figura 8Inibizione della AChEnel lievito ad operadi una soluzione diparaoxon 37 ppbespressa come con-centrazione di Chprodotta in funzionedel tempo di esposi-zione al pesticida

Figura 9Produzione di Ch daparte di a) enzimapurificato e b) lievito,entrambi immobiliz-zati su membrane dinylon. Per ottenere lamedesima produzio-ne di Ch ottenuta conl’enzima purificato incirca 10 minuti, il lie-vito richiede una incu-bazione di 30 minuti

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to e quello con il lievito ingegnerizza-to, risultano molto simili nella deter-minazione dell’inibizione dovuta aipesticidi.

Biosensori elettrochimici stampati per gli erbicidi fotosintetici42-64

Molte sostanze inibiscono la fotosinte-si nelle piante e nei cianobatteri60eper questa loro proprietà sono state esono tuttora utilizzate in agricolturacome erbicidi46,53,63. L’importanza delPSII per scopi analitici è dovuta al fat-to che molte sostanze inibiscono lafotosintesi bloccando proprio siti spe-cifici nei cloroplasti, dunque la stessareazione di inibizione può essere sfrut-tata per determinare l’eventuale pre-senza di erbicidi residui nelle acque.Sono inibitori della fotosintesi le tria-zine, le feniluree, gli uracili, i benzo-tiodiazoli, i nitrili, i carbammati e gliacidi carbossilici48; in particolare, iderivati della triazina (es: atrazina) edell’urea (es: diuron) si legano al sitoQB

62 della subunità D1 del PSII corecomplex e impediscono l’accesso allamolecola di accettrice di elettroni (chi-none), bloccando dunque la reazio-ne di Hill di evoluzione di ossigeno:

2H2O + A hν > AH2 + 2H+ +O2

(4)

Il PSII accoppiato ad un opportunosistema di trasduzione può essere quin-di utilizzato per la rivelazione dellaconcentrazione residua di erbicida incampioni ambientali tramite una sem-plice misura di ossigeno42-45, 48. Dallareazione 3 si può osservare che è pos-sibile misurare, oltre alla produzione diossigeno molecolare, anche la produ-zione della forma ridotta dell’accetto-re, tipicamente un idrochinone50.

Figura 10Esempio di tracciato ottenuto con un biosensore a PSII illuminato con un LED ros-so ad alta intensità ogni 20 minuti per 20 secondi

Figura 11Inibizione del biosensore a PSII dovuta alla iniezione di atrazina 10-7M

Figura 12La cella a flusso miniaturizzata impiegata per eseguire le misure con il biosen-sore a PSII basato su elettrodi stampati. La cella è dotata di un’entrata e unauscita per le soluzioni, un alloggiamento per l’elettrodo stampato e 2 per i LED(blu e rosso) impiegati per ottenere la reazione di Hill. A sinistra la cella smon-tata, a destra la cella durante l’illuminazione con il LED rosso ad alta intensità

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[nA

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Nella figura 10 è riportato un tipicotracciato ottenuto con un sensore diClark per l’ossigeno accoppiato conPSII purificato dal cianobatterio ter-mofilo Sinecococcus elongatus immo-bilizzato sulla superficie dell’elettro-do di lavoro.All’accensione di un LED rosso ad altaintensità per 20 secondi, si può nota-re la produzione di ossigeno dovuta allareazione di Hill.Analogamente, con un sensore stam-pato di grafite polarizzato a +620 mVvs Ag/AgCl, è possibile osservare unpicco dovuto alla riossidazione del chi-none. In presenza di erbicidi, la rea-zione di Hill risulta inibita per la com-petizione tra chinone (accettore) ederbicidi e il picco risulta ridotto inmisura proporzionale alla concentra-zione di questi ultimi (figura 11).Le misure sono state condotte in flus-so in un sistema fluidico analogo aquello riportato in figura 17E. La cel-la a flusso utilizzata con gli elettrodistampati è mostrata in figura 12.Analogamente ai biosensori coline-

sterasici, è possibile calcolare l’attivitàresidua percentuale a partire dall’in-tensità di corrente misurata prima edurante l’inibizione. In questo casoinfatti l’inibizione è reversibile e scom-pare quando il sensore è alimentato conla soluzione tampone. Nella figura 13sono riportate le curve di calibrazio-ne per diversi erbicidi ottenute con ilbiosensore basato sull’elettrodo diClark.A differenza dell’elettrodo di Clark, glielettrodi di grafite richiedono l’immo-bilizzazione del PSII mediante la reti-colazione con BSA/GA e per questomotivo si ottengono selettività diverseda quelle appena mostrate nei con-fronti degli erbicidi (figura 14).In figura 15 sono riportate le curve dicalibrazione ottenute con atrazina edue diversi accettori di elettroni.

Figura 13Curve di calibrazione per diversi erbicidi ottenuti con un biosensore a PSII basa-to su elettrodo di Clark

Figura 14Curve di calibrazione per Diuron e Dinoseb ottenute attraverso la misuradella forma ridotta dell’accettore di elettroni con un elettrodo a grafiteaccoppiato con il PSII immobilizzato mediante reticolazione con BSA/GA

Figura 15Attività residua (curva di calibrazione) vs concentrazione di atrazina impie-gando diversi elettron accettori

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Gli elettrodi serigrafati, basati sulla tecnologia SP [1],consentono al contempo l’impiego di metodi bionalitici sulcampo e la riduzione dei costi dei sensori nella logica dell’“usa e getta”. La tecnologia SP consente infatti la deposi-zione sequenziale di inchiostri contenenti materiali elet-trodici (Pt, grafite, Ag) su un supporto planare, tipicamentedi materiale plastico (PVC, metacrilato), realizzando la pro-duzione di massa di elettrodi e sensori riproducibili e a bas-so costo. La peculiarità di questa tecnica nel depositaresequenzialmente strati spessi di diversi materiali funzio-nali (piste di conduzione, isolanti, materiali elettrodici didiversa natura, membrane selettive, film di biomolecole sen-sibili) consente di realizzare, con estrema semplicità e ver-satilità, diversi lay-out costruttivi a seconda dell’impiegoanalitico e della configurazione fluidica richiesta.

Parte determinante per la realizzazione dei biosensori èla tecnica di accoppiamento delle biomolecole e deimicroorganismi con il trasduttore di segnale elettrodico.La tecnica d’immobilizzazione delle biomolecole sullasuperficie elettrodica riveste, infatti, particolare importanzaper diversi motivi riconducibili alla denaturazione enzi-matica, al tempo di vita del biosensore risultante e alla dif-fusione di substrati e prodotti attraverso il film depositatoper raggiungere la superficie sensibile del trasduttore.Ciascuna biomolecola o microorganismo ha richiestosoluzioni ad hoc per ottenere le migliori prestazioni in ter-mini di sensibilità, riproducibilità, tempo di vita e stabilità.

La serigrafia per la produzione massiva di sensori a basso costo

La tecnologia dello strato spesso (TFT)18, comune-mente adottata nel settore della microelettronica e perla creazione di circuiti integrati, ha aperto la strada ver-so la diffusione su vasta scala di biosensori monouso,portatili e a basso costo di produzione. Nella figura 17sono stati riportati alcuni esempi di configurazionielettrodiche create grazie alla TFT presso i nostri labo-ratori ENEA. Essi sono normalmente stampati su lastri-ne di PVC secondo un metodo che prevede la depo-sizione di una pasta che deve contenere il materialeconduttore. Per ottenere una precisa localizzazionedello schema stampato sul substrato e la deposizionea registro degli strati successivi è impiegata una stam-pante serigrafica, sulla quale è possibile regolare condei micromanipolatori la posizione del supporto, paral-lelamente allo stampo. Un tipico schermo serigraficoè costituito da una rete a maglie finemente intessute diacciaio inossidabile, nylon o poliestere, montata intensione su di una cornice metallica e sulla quale puòessere impressa fotograficamente l’immagine di un cir-cuito desiderata. Le paste utilizzate per la stampa di ele-menti sensibili sono composte da almeno due ingre-dienti: un veicolo organico ed un componente attivo ofunzionale. Il “veicolo organico” è una miscela di sol-venti volatili e polimeri (resine) che sono necessari amantenere le particelle di materiale attivo in unasospensione omogenea e con proprietà reologicheadatte alla stampa. Le stampe a strato spesso sono sog-gette spesso a cicli di essiccamento e di cottura (sin-terizzazione per i substrati ceramici) durante i quali ilveicolo organico viene rimosso ed avvengono unaserie di reazioni chimiche e fisiche che genererannole proprietà elettriche finali delle paste. Lo stadio diessiccamento è necessario per rimuovere i solventiorganici volatili e per fare aderire al supporto lo stra-to spesso, che ancora contiene leganti organici; essoavviene a temperature piuttosto basse (70-150 °C) e nonè dipendente dalle condizioni di riscaldamento purchéla velocità del processo sia tale da non causare una eva-

Figura 16. Sequenza di deposizione dei diversi strati spessi perla realizzazione di un trasduttore elettrochimico su un supportoplastico. A) supporto in PVC, B) piste di conduzione in argento,C) elettrodi di grafite, D) RE in Ag/AgCl, E) Isolante, F) elettrodostampato risultante.

A B C D

E

Figura 17. A) elettrodo commerciale stampato su supporto cera-mico; si osservano le piste di conduzione di argento, l’elettrodo dilavoro e ausiliario di oro, l’isolante blu; B) elettrodo stampato inlaboratorio su supporto di PVC; si osservano le piste di conduzio-ne di argento, l’elettrodo si lavoro in grafite, il contro elettrodo diAg/AgCl e l’isolante trasparente, C) fotografia della cella flusso perelettrodi stampati, D) schema della cella, E) schema fluidico impie-gato nelle misure con i biosensori: 1) soluzione tampone per l’ac-quisizione della linea di base, 2) soluzioni standard e campioni invia-te per mezzo di una valvola automatica a 8 canali, 3) rubinetto atre vie, 4) cella a flusso e biosensore stampato, 5) LED ad alta inten-sità (impiegato con i biosensori fotosintetici), 6) alimentatore e timer,7) pompa peristaltica, 8) scarico delle soluzioni

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porazione troppo violenta del solvente che possa dan-neggiare l’uniformità della stampa. Durante il proces-so di stampa l’inchiostro, o la pasta, viene stratificato sul-la superficie posteriore dello schermo, sotto il quale vie-ne posta la lastrina in PVC; una spatola flessibile o raclacon un bordo inclinato, esercitando una pressione sul-la superficie, porta lo schermo a contatto con il sub-strato.Mentre la spatola passa, le maglie dello schermo si allar-gano e “dosano” la quantità di inchiostro, andando a for-mare il disegno voluto sul substrato. Solitamente si usa-no come paste conduttrici il Pt, l’Ag/Pd, il carbone dro-gato (con Rh o Pt) o della semplice grafite, che vannosequenzialmente stampate prima o dopo una pasta diisolante.Laddove necessario è possibile usare delle paste poli-meriche con diversi gradi di conducibilità.Spesso bisogna ricorrere ad opportuni trattamenti del-la superficie stampata, allo scopo di migliorare ilresponso elettrochimico, ed ottimizzare la riproducibilitàdello stesso elettrodo finale. Nei nostri laboratori sonostate adottate e testate quattro possibili soluzioni: il dro-gaggio delle paste conduttrici, il trattamento chimicodegli elettrodi, il trattamento fisico, la ricopertura conmembrane.a) Doping: le paste di metalli conduttori, ad esempio

platino o rodio, mescolate e adsorbite sulle particelledi grafite stesse, possono essere addizionate allapasta comunemente usata per la stampa dell’elet-trodo di lavoro (WE), allo scopo di migliorare le carat-teristiche di conducibilità e conferire proprietà chi-miche specifiche. È stato dimostrato che la sensibi-lità della risposta amperometrica di un WE all’acquaossigenata (H2O2) aumenta proporzionalmente conl’aumento del contenuto di metallo nella pasta di gra-fite fino ad un massimo di 0,5%. L’inchiostro di car-

bonio può essere drogato anche con i cosiddettimediatori elettrochimici, come ferrocene, blu diPrussia, o persino con determinati enzimi, modifi-cando direttamente l’elettrodo prima della stampaper scopi biosensoristici.

b) I trattamenti elettrochimici risultano molto importantiper ridurre i tempi di stabilizzazione ed incremen-tare la sensibilità e la riproducibilità degli elettrodi.I trattamenti di pulizia superficiale dell’elettrodorimuovono le impurezze, presenti nelle paste con-duttive, che si possono ossidare o ridurre ai poten-ziali di misura.Durante le prime misure effettuate si è potuto con-statare che gli elettrodi stampati impiegano tempimolto lunghi prima di raggiungere la stabilità dellalinea di fondo e sono stati perciò sperimentati diver-si trattamenti di condizionamento della superficieelettrodica, dapprima con cicli di pulizia a potenzialecostante, infine con voltammetrie cicliche tra –1V e+1V vs Ag/AgCl sia in soluzione tampone, sia in solu-zioni a differenti pH.

c) Sono state effettuate varie prove di trattamento fisi-co, applicando differenti pressioni sugli elettrodi, perverificare quale fosse il valore ideale.È verificato che gli elettrodi sottoposti ad una pres-sione di 100 kg/cm2 presentano un incremento del-la conducibilità fino al 40%, mentre pressioni appli-cate 5-10 volte maggiori provocano la deformazio-ne del supporto di PVC, senza accrescere in modosignificativo la conducibilità, causando anzi occa-sionalmente il distacco dello strato di stampa dal sup-porto.Queste osservazioni sono ancora più evidenti osser-vando la superficie degli elettrodi pressati e non, tra-mite una fotografia prodotta con microscopia elet-tronica a scansione, SEM (figura 18).

Figura 18. Fotografie SEM di superfici di elettrodi di grafite pressati (destra) e non (sinistra)

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Conclusioni

Abbiamo visto che l’accoppiamento e lacombinazione fra sistemi biomolecolaricomplessi, quali microorganismi e lievitiricombinanti, e la tecnologia serigraficadegli elettrodi stampati conferisce a que-sto tipo di biosensori delle caratteristicheuniche e molto vantaggiose. Sfruttando l’e-strema specificità, e la possibilità di ridur-re i costi sul mercato dei primi, insiemealla facilità di produzione ed alla ben nota

economicità dei secondi, è possibiledotarsi di biosensori estremamente ver-satili, per analisi ambientali. È persinopossibile a seconda delle esigenzedisporre di sistemi monouso o riutilizza-bili per più di 200 analisi consecutive conuna buona riproducibilità. Gli esempiapplicativi che abbiamo portato in rela-zione a microorganismi ricombinanti,sfruttano il meccanismo di inibizione diparticolari enzimi da parte di erbicidi epesticidi specifici, la cui presenza può

I biosensori sono stati inseriti in sistemi fluidici miniatu-rizzati, alimentati da pompe a pistone commerciali a bas-so costo del tipo utilizzato per la somministrazione conti-nua giornaliera di farmaci in pazienti non ospedalizzati. Lastrumentazione elettronica portatile di controllo, realizza-ta in collaborazione con l’Università di Roma Tor Vergata,è alimentata con accumulatori a LiH, ha 4 canali di acqui-sizione, display a cristalli liquidi, pulsantiera di comando,memoria per l’archiviazione dei dati durante la misura incampo, interfaccia seriale e software di acquisizione perscaricare i dati dopo o durante le analisi su un computerportatile. Un altro sistema palmare con display grafico con-sente di operare con numerose tecniche elettroanalitiche(cronoamperometria, voltammetria ciclica, amperome-tria pulsata e differenziale, coulombometria) e di visua-lizzare i risultati delle analisi direttamente sul display gra-fico di un Pocket PC palmare. I metodi sviluppati con que-sti dispositivi basati sui biosensori non sono applicabili allesole analisi in campo su matrici ambientali ma anche al con-trollo e alla caratterizzazione igienico-sanitaria e nutri-zionale su matrici agroindustriali come il vino, il latte, la frut-ta (uva).

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dunque essere monitorata in differentimatrici, grazie a questi sistemi.Nel primo caso è stato sviluppato un pro-tocollo per la misura dell’attività dell’acetilcolinesterasi sui chicchi di uva che siapplica bene all’intervallo di concentra-zioni limite fissati dalle leggi; il lievitoingegnerizzato permette inoltre di ridur-re i costi della preparazione e di immo-bilizzazione dell’enzima senza perdere inprestazioni. Sono stati raggiunti limiti dirivelabilità di 0,1 ng ml-1 (per paraoxon)e rapidi tempi per effettuare analisi con-temporanee anche su 24 campioni.Nella seconda parte è stato mostrato unbiosensore SPE basato sul fotosistemaPSII per l’identificazione e la quantifica-zione di composti erbicidi triazinici. Sonostati raggiunti limiti di rivelabilità 10-10

mol dm-3 (per diuron).Questi ultimi risultati incoraggiano adestendere le procedure sperimentalianche su altre librerie biologiche, chepossono essere scelte a seconda del-l’applicazione specifica. In conseguenzaad una corretta orientazione nelle immo-bilizzazioni, tali risultati incoraggianoanche alla diffusione di nuovi biosensoriper analisi di varie matrici ambientali insitu che siano allo stesso tempo affidabi-li, sensibili, pratici e facili da usare.

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