Elisa Burdino e Valeria Ghisetti
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Elisa Burdino e Valeria Ghisetti
Laboratorio di Microbiologia e Virologia
Ospedale Amedeo di Savoia
TORINO
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1981 Primi casi di AIDS (CDC Atlanta, USA)
1983 1. Luc Montagnier e Barre-Sinoussi
Institut Pasteur a Parigi LAV – Lymphadenopathy virus
2. Robert Gallo, NIH, Bethesda, USA HTLV I, II – Human T-cell Leukemia viruses
3. HIV è l’agente che causa l’AIDS: Gallo identifica LAV come HTLV III
1985 Primi test sierologici 1995 HAART Highly Active Antiretroviral therapy
LA STORIA DELLA SCOPERTA DI HIV
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Nobel Prize for HIV descovery, 2008
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Luc Montagnier at Amedeo di Savoia Hospital, 2012
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Origins
SIVcpz
(Camerun)
SIVsmm
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substitution/base/cycle
HIV and genetic variability
10-9 10-7 10-5 10-3
Human genes
DNA Virus
HBV RNA virus
HIV
Primati
Uomo
Eventi genetici mutazionali
Salto di barriera genetica in almeno tre
occasioni dando luogo a 3 gruppi
(O,N,M)
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Variabilità genetica di HIV-1 gruppo M, N e O e isolati da primati
Analisi sequenza completa gene
Gruppo O
0.10
Gruppo N SIVCPZ-GAB
SIVCPZ-US
SIVCPZ-CAM3
SIVCPZ-ANT
env
Gruppo M Divergenza
•20-30% env •15-22% gag
Adattata da Korber B. in Field Virology 4th Ed.2007
Primati non umani
Uomo 100 anni fa?
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Distribuzione dei sottotipi di HIV e forme ricombinanti
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HIV-1 Replication Cycle
CCR5
CD4
CXCR4
Reverse Transcription Integration
Uncoating
Assembly
Budding
Attachment
Maturation
Reverse Transcriptase
Integrase
Protease
Principale cellula bersaglio del virus: Linfocita T CD4+
(e macrofagi, monociti, cellule della microglia SNC, cellule dendritiche cute e mucosa)
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Approved Antiretrovirals
AZT
Etravirine
1987 1991 1992 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 1988 1989 1990
RTI
PI
ABC
CBV
DDI d4T
DDC 3TC
Trizivir
NVP
DLV
RTV
SQV HG
APV
IDV
Kaletra NFV
2001
TFV
2002 2003 2004 2005 2006
T-20
ATV
FTC
Truvada
FI
Atripla
2007 2008 2009
Raltegravir
Maraviroc
R5-Inh
Integr Inh
TPV
DRV
Rilpavirine
NNRTI Fos-APV
EFV
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HIV/AIDS from 1990 to 2012 From San Francisco, 1990 to Washington, DC, 2012
Steinbrook, et al. JAMA. 2012;308(4):345-346
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HIV Research Network 32 483 patients received care at 12
clinics between 2001 and 2010
C Among patients recommended to receive ART: CD4 T-cell count of 200/μL or less for 2001-2006; CD4 T-cell count of 350/μL or less for 2007-2010.
Yehai, et al. JAMA, July 25, 2012—Vol 308 (4):339-341
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Metodi di Laboratorio per l’identificazione di HIV
Murray, 9th Ed, 2007
Ruolo nella diagnosi di infezione da HIV
Isolamento in coltura
Only for research
Ricerca Antigene
Ricerca di
HIV RNA
Test molecolari
Ricerca anticorpi Test sierologici
↑ ↑ ↑↑↑ ↑↑↑
Serology is the primary diagnostic methods HIV RNA is to confirm the diagnosis of HIV infection in the early
stages or when serology is negative (window period)
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Diagnosi di laboratorio
HIV-RNA
Antigene p24
Anticorpi
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Diagnosi di Laboratorio di infezione da HIV
Test di screening
Anticorpi anti-HIV
Test di conferma
Western blot
Test per la ricerca del virus
HIV RNA
Anticorpi anti-HIV 1/2
Test di screening
Sensibilità e specificità
molto elevate
Test di conferma
Western blot
Test per la ricerca del virus
HIV RNA
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0
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Evoluzione tecniche sierologiche per ricerca anticorpi anti-HIV
IgG HIV1 Lisato virale
sensibilità specificità
No IgM No HIV 2
1983-85
Sen
sit
ivit
y %
Sottotipo HIV-1 O
Riduzione fase finestra
2002
IgG + IgM
+ Ag p24 HIV1&HIV2 Ag ricombinanti Peptidi di sintesi
sensibilità
specificità
4°gen
IgG + IgM
HIV1&HIV2 Ag ricombinanti Peptidi di sintesi
“sandwich” format
sensibilità
specificità
1994
Antigene p24
3°gen
IgG HIV1 Ag ricombinanti
sensibilità
specificità
No IgM
1987-90
2°gen 1°gen
HIV-2
Test rapidi
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Test sierologici III g
Test sierologici combo Ab+Ag
Virological markers during the first weeks following infection with HIV
FASE FINESTRA
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Un buon numero di casi è già sieropositivo a 2-3 settimane dal primo contatto
La maggior parte positivizza entro 3 mesi.
Un test a 6 mesi è risolutivo.
Fase finestra
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Test rapidi per anticorpi anti-HIV
I risultati reattivi vanno sempre
confermati da un Laboratorio di
Riferimento e in tempi rapidi
www.cdc.gov 2008
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Perché è importante il test anti-HIV
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Perché è importante il test rapido
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Il test rapido ideale criteri ASSURED
• A= accessibile Affordable
• S= sensibile Sensitive
• S= specifico Specific
• U= user-friendly U
• R= robusto Robust
• E= equipment-free E
• D= disponibile Deliverable
Low cost: 5$
Peeling, Clin Microbiol Infect 2010
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Ora Quick Advance HIV 1/2
Uni-Gold Recombigen HIV 1
Reveal G3 HIV 1 ClearView HIV 1/2 Stat Pak
ClearView Complete HIV 1/2
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Test rapidi marcati CE
FDA approved
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Body Fluids Used for HIV Rapid Testing
Serum
Plasma
Whole blood
Oral fluids
Dried Blood spot
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3-Read
Easy to perform Capillary blood
1-Sample
Dispense: 2 drops of blood + 1 drop of buffer
Negative
Positive
15 min
HIV 1/2
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Oral Fluid Specimen
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Criticità dei Test rapidi: sensibilità
Infezione
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Test 3° gen
Test 4° gen “Combo”
“finestra”
giorni
Test rapidi (3° gen)
Test rapidi (3° gen): saliva
Saliva: concentrazione di anticorpi è 1/400 di quella del siero
Test rapido “Combo”
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• I risultati NON REATTIVI possono essere riportati come
NEGATIVI
– Se esposizione recente test di 4a GENERAZIONE
• I risultati REATTIVI richiedono conferma “IMMEDIATA”
con Western blot o HIV RNA
• I risultati INVALIDI vanno ripetuti con test di 4a
GENERAZIONE
Multi-test algorithms, CDC 2009
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www.cdc.gov 2006, 2008 e 2009 - FDA, 2007
I risultati reattivi/positivi al test di screening per anti-HIV vanno sempre
confermati con: Western Blot e/o HIV RNA
Linee guida WHO, CDC e Ministero della salute
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gp 110/120
p 64/68
p 31/34
p 24/25
gp 41
Western blot
(test di conferma)
E’ il classico test di conferma Viene eseguito su tutti i campioni non negativi
Rottura del virus
Elettroforesi proteine di HIV
Siero del paziente
Crescita su colture linfociti
Purificazione Ag
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CDC 2 bande tra p24, gp41, gp 110-160
FDA p24, p31, gp 41 o
gp 110-160
OMS 2 bande ENV e/o GAG e/o POL
Croce Rossa (USA) 1 ENV, 1 POL e 1 GAG
P. Ehrlich Institute 2 bande, di cui una ENV
gp 110/120
gp 160
p 64/68
p 55
p 52/53
p 31/34
p 24/25
p 17/18
gp 40
gp 41
banda di controllo
env
pol
gag
W. blo
t
Positività
![Page 35: Elisa Burdino e Valeria Ghisetti](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022060902/62991e4a10d2df0b70398194/html5/thumbnails/35.jpg)
- +
gp 110/120
gp 160
p 64/68
p 52/55
p 31/34
p 24
p 17/18
gp 41
+ + + - + IND +
![Page 36: Elisa Burdino e Valeria Ghisetti](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022060902/62991e4a10d2df0b70398194/html5/thumbnails/36.jpg)
Laboratorio di Microbiologia e Virologia Ospedale Amedeo di Savoia
Algoritmo diagnostico per accertare infezione da HIV
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Diagnosi di Laboratorio di infezione da HIV
Test di screening
Anticorpi anti-HIV
Test di conferma
Western blot
Test per la ricerca del virus
HIV RNA
Test di screening
Anticorpi anti-HIV
Test di conferma
Western blot
Test per la ricerca del virus
HIV RNA
![Page 38: Elisa Burdino e Valeria Ghisetti](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022060902/62991e4a10d2df0b70398194/html5/thumbnails/38.jpg)
HIV RNA
Identifica la presenza del virus e quanto il virus si replica
Conferma la diagnosi sierologica In tutti i casi ed è risolutivo per: 1. Fase finestra 2. Test di screening+/western blot negativi o
indeterminati
Identifica il genotipo di HIV Consente il Monitoraggio e valutazione di
efficacia della terapia Identifica la resistenza alla terapia
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Indication for plasma HIV RNA testing
U.S. Department of Health and Human Services DHHS,
BASELINE
Diagnosis
Therapy assessment After 4- 8 weeks from start
Every 3-6 months
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HIV RNA monitoring as a measure of the virologic response
1 year
Responders
>107
month 6
viral load drop
20-50
Test Detection limit
Copies/ml HAART
Transient Responders: Transient decreases of > 1 log
No responders Rapid progressors
< 1 log
![Page 41: Elisa Burdino e Valeria Ghisetti](https://reader033.fdocuments.us/reader033/viewer/2022060902/62991e4a10d2df0b70398194/html5/thumbnails/41.jpg)
HIV : Test di resistenza
Test genotipici Basati sul sequenziamento del virus HIV
Profilo genetico virale
Profilo di suscettibilità a farmaci
Antivirogramma
Scopo della terapia anti-HIV
Azzerare la replicazione di HIV: HIV RNA non rilevabile
No replication = No Mutation = No Drug Resistance
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HIV : Test di resistenza
Test genotipici Sequenziamento geni di HIV bersaglio di farmaci
Geni virali Farmaci
POL/PRO per Proteasi Inibitori della proteasi
POL/RT per Reverse transcriptasi
Inibitori transcriptasi
POL/IN per Integrasi Inibitori integrasi
Envelope Inibitori CCR5
Laboratorio di Microbiologia e Virologia Ospedale Amedeo di Savoia
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Genotype
PI mutations
PI
mutations NRTI and NNRTI mutations
HIV DRUG RESISTANCE DATABASE – Stanford University
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Grazie a tutti per l’attenzione!