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Ejemplo de un “insulator” con efecto barrera y bloqueador de enhancer
Ejemplo de un “insulator” con efecto bloqueador de enhancer
Ejemplo de “insulator” con efecto de barrera
Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF binding sites in the human genome Cell. 2007 March 23; 128(6): 1231
Fibroblastos humanos- ChIP-chip contra CTCF
Se encontraron 14000 sitios de binding CTCF.
ENCODE: encyclopedia of DNA elements
Comparación de los sitios de binding a CTCF en dos tipos de células
Distancias de los sitios CTCF a los extremos 5’ de genes
Objetivo: estudiar la regulación epigenética del locus de las apolipoproteínas
ApoA1, ApoA4 y ApoA5 constituyentes HDL-
ApoA3, constituyende VLDL
Antecedentes:
● Experimentos de ChIP-chip encontraron unos 14000 sitios de unión a CTCF en el genoma humano
. ● Muchos sitios CTCF se corresponden con el enriquecimiento en complejos de cohesina (RAD21), que median la cohesion de cromátidas hermanas en mitosis
● No se estudió si hay correlacion entre cohesina y CTCF en la actividad de los insulators
Distribucion de sitios enriquecidos en CTCF/Rad21 en el locus Apo
ChIP-chip en líneas celulares humanasVerificación por ChIP
comprobación in vitro por gel shift
Conclusión: hay tres sitios de unión a CTCF : AC1, AC2, AC3 (que unen tambien Rad21, y un sitio AR1 que si bien tiene secuencia de cierto renocimiento a CTCF no lo une, pero si une Rad21
Comprobación de la actividad bloqueante de enhancers de los AC1. AC2, AC3 y AR1
Conclusión: los AC son aislantes funcionales
1) Bloquean un 40-60% la acción del enhancer C3 en una respuesta independiente de la orientacion
2) Su efecto es mediado por la unión de CTCF
3) Se descarta que tengan efecto de silenciador
AR1 tiene un efecto bloqueante moderado
Efecto de HNF sobre el enhancer y promotor de ApoA4
-HNF: principal regulador transcripcional hígado
- produce activación a traves del promotor y del C3E
- ChIP demuestra que está unido tanto al promotor como al C3E
La expresión de HNF en HeLa promueve la expresión de los genes APOA1/C3/A4/A5 y no la de los tres genes vecinos
Por ChIP se demuestra que se une a los 4 promotores y al enhancer
Por lo tanto los elementos AC2 y AC3 actúan como aislantes
CTCF y cohesinas están involucrados en el control transcripcional de la región APO
Células Hep3B: tratadas o no con siRNA contra CTCF o Rad21. Medición de niveles de mRNA de cada gen por RT-PCR
Conclusiones: la deleción de CTCF/Rad21 afecta diferencialmente los genes dentro de AC2 y AR1 y los que estan fuera de esa región
CTCT y cohesinas y conformación cromosomal de la región APO del cromosoma
Metodología: 3C, framentos BglII; frecuencia de ligación con el enhancer APOC3
CTCT y cohesinas y conformación cromosomal de la región APO del cromosoma
Conclusión: los aislantes dependientes de CTCF y cohesinas mantienen la conformación global del locus APO
Localización espacial del locus
3C más resolutiva para resolver entre interacciones insulator-promotor; promotor-promotor, insulator-insulator
Se usa otra enzima de restriccion MflI
Mecanismo simplificado al mecanismo de propagación y de automantenimiento de la heterocromatina en S.pombe