Efficient concerted integration by recombinant HIV-1 integrase without cellular or viral cofactors
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Efficient concerted integration Efficient concerted integration by recombinant HIV-1 by recombinant HIV-1
integrase without cellular or integrase without cellular or viral cofactorsviral cofactors
Sapna Sinha, Michael H. Pursley and Duane P. Sapna Sinha, Michael H. Pursley and Duane P. GrandgenettGrandgenett
JOURNAL OF VIROLOGYJOURNAL OF VIROLOGY
Avril 2002Avril 2002
Différents types d’intégrationDifférents types d’intégration
Intégrase
Donneur ADN
Receveur
Intégration 1 LTR = Half-Site Integration
(HSI)
Intégration 2 LTR = Full-Site Integration
Integration Concertée(FSI)
CAGT ACTG GTCA TGAC
CAOH ACTG GTCA HOAC
2(pGpT)
CAOH ACTG GTCA HOAC
5’A C
TGAC
C A5’
CAGT
TGAC
CAGT
Formation d’extrémités 5’ sortantes : Processing
Transfert de brin
NOYAU
3’ 5’
5’ 3’
5’
5’
5’
5’
CYTOPLASME
3’
3’ Génome de la cellule hôte
ADN proviral
Duplications au niveau du Duplications au niveau du génome de l’hôtegénome de l’hôte
Au niveau de l’ADN cellulaire, l’intégration du génome viral entraîne une duplication de duplication de quelques paires de basesquelques paires de bases de chaque coté de l’ADN viral.
La taille de cette duplication est spécifique de spécifique de chaque viruschaque virus6 pb pour les virus ALSV
5 pb pour HIV-15 pb pour HIV-1 (Asante-Appiah and Skalka, 1997)
Etat des connaissancesEtat des connaissances 1° expériences avec INT purifiée – donneurs ADN linéaires – receveurs 1° expériences avec INT purifiée – donneurs ADN linéaires – receveurs
ADNADN efficacité et fidélité très variablesefficacité et fidélité très variables inefficacité de d’intégration concertée inefficacité de d’intégration concertée fidélité variable des duplications de 5 pbfidélité variable des duplications de 5 pb
EfficacitéEfficacité = 10% donneur intégré à la cible en 20 min à 37°C = 10% donneur intégré à la cible en 20 min à 37°C
Grande variabilité des résultatsGrande variabilité des résultats intervention de cofacteurs cellulaires ?intervention de cofacteurs cellulaires ? rINT de RSV: HMG 2 et HMG-I(Y) cellulaires rINT de RSV: HMG 2 et HMG-I(Y) cellulaires efficacité FSI efficacité FSI rINT HIV-1: HMG-I(Y) et NCrINT HIV-1: HMG-I(Y) et NC variation de l’activité de l’INT elle-même ?variation de l’activité de l’INT elle-même ?
rINT HIV-1 rINT HIV-1 in vitroin vitro inefficace seule pour FSI inefficace seule pour FSI Fidélité # 70%Fidélité # 70%
Anomalies de repliement ?Anomalies de repliement ? Agrégation ?Agrégation ?
Objectif de l’étudeObjectif de l’étude rINT de HIV-1wt peut-elle réaliser seule une rINT de HIV-1wt peut-elle réaliser seule une
intégration concertée efficace ?intégration concertée efficace ?
Ou nécessité de cofacteurs cellulaires ou viraux ?Ou nécessité de cofacteurs cellulaires ou viraux ?
StratégieStratégie Purification et utilisation INT recombinante purifiée à Purification et utilisation INT recombinante purifiée à
faible concentrationsfaible concentrations éviter l’agrégationéviter l’agrégation
Étude de la coexpression INT / protéines chaperonnes Étude de la coexpression INT / protéines chaperonnes GroEL-GroES chez des bactériesGroEL-GroES chez des bactéries
éviter les anomalies de repliement de rINTéviter les anomalies de repliement de rINT
Matériels et méthodes (1)Matériels et méthodes (1) Donneur LTR: ADN linéaire 480 pb Donneur LTR: ADN linéaire 480 pb
marqué marqué 3232P P SupFSupF sélection site restriction BglII unique
Receveur plasmide pGEM3
rINT Clonée dans pET11a expression dans cellules BL21(DE3)
Protéines chaperonnes plasmide pGroESL également exprimé dans BL21(DE3)
Matériels et méthodes (2)Matériels et méthodes (2) Purification de rINT BL21(DE3) : pET11a +/- pGroESL
Centrifugation
Tampon + sonicationsurnageant
culot
+ NaClLavages et centrifugationssurnageant
culot+ NaCl 1Mcentrifugation
surnageantINT 60% pureté
Seph
Hép
1 22’ INT >90%
pureté
+ tampon standard (Mg++)
3h
+ IPTG
Résultats (1)Résultats (1) Expression rINT dans BL21(DE3) Expression rINT dans BL21(DE3)
Niveau d’expression et de pureté indépendants de GroES et Niveau d’expression et de pureté indépendants de GroES et GroELGroEL
Stabilité des extraits INT /NaCl 1MStabilité des extraits INT /NaCl 1M
Lys
at
cell
ula
ire
T0
Lys
at
cell
ula
ire
IPT
GMatMatéériels et mriels et mééthodes (2)thodes (2)
INT recombinante purifiéeBL21(DE3) : plasmide INT +/ - pGroESL
Centrifugation
Tampon + sonicationsurnageant
culot
+ NaClLavages et centrifugationssurnageant
culot+ NaCl 1Mcentrifugation
surnageantINT 60% pureté
SephHép
1 22’
INT >90% pureté
+ tampon standard (Mg++)
surnageants
+ + chaperonchaperonss
Résultats (2)Résultats (2) Purification rINT et transfert de brinPurification rINT et transfert de brin éviter agrégation rINT en solution : faible concentrations
sur colonnes: utilisation totalité extrait NaCl 1M sur colonne 1
fractions les plus riches en INT colonne 2
rINT purifiée à basse concentration reste active HSI et FSI
Résultats identiques avec/sans GroES GroEL
Fractions 38 à 49- +
0 0 chaperonchaperons, 20 s, 20 min, min, 37°C37°C
Résultats (3)Résultats (3)
ConnaissancesConnaissances
Zn++, Mg++ et détergents non ioniques perturbent l’association des sous-unités d’INT
perturbation activité
Tampon standard contient Mg+Tampon standard contient Mg+++
Suppression Mg++ Suppression Mg++ ajout 10% glycérolajout 10% glycérol pureté identiquepureté identique transfert de brin transfert de brin
comparablecomparable
Activité rINT indépendante de la présence de Zn++, Mg++ et glycérol dans les tampons
Influence de la composition des tampons sur Influence de la composition des tampons sur activité rINT ?activité rINT ?
3-4: + chaperons, Seph x2 5-6: + chaperons, Hép-Seph7-8: Hép-Seph
Résultats (4)Résultats (4) Fidélité des duplications 5pb lors de Fidélité des duplications 5pb lors de l’intégration concertéel’intégration concertée
Utilisation préférentielle U5U5 pour intégration
Fidélité # 70%70% sans chaperonssans chaperons selon les études par les protéines chaperons ? séquençage de la zone d’insertion
Présence de protéines chaperons n’augmente pas la fidélité des duplications 5 pb
Résultats (5)Résultats (5) Comparaison qualitative des activités des Comparaison qualitative des activités des rINTrINT
Action des protéines chaperonsAction des protéines chaperons
3-7: 0 chaperons, gamme [rINt] 9-13: + chaperons, gamme [rINt]
9: reproductible concentration seuil rINT nécessaire
autre étude: chaperons améliorent très légèrement HSI -FSI
Action de Zn++Action de Zn++Zn++ stimule la multimérisation
des su d’INT et stimule légèrement HSI
Légère FSI
RésuméRésumé HIV rINT capable d’effectuer aussi bien HSI que FSI sans cofacteurs HIV rINT capable d’effectuer aussi bien HSI que FSI sans cofacteurs in in
vitrovitro
Modèle:
Modalités de préparation et d’utilisation de rINT influent Modalités de préparation et d’utilisation de rINT influent
sur ses facultés de polymérisation sur ses facultés de polymérisation
sur l’efficacité de l’intégration concertéesur l’efficacité de l’intégration concertée
Limites: Limites:
Étude Étude in vitroin vitro: intervention d’autres protéines chaperons : intervention d’autres protéines chaperons in vivoin vivo ? ?
Perspectives:Perspectives:
Mutagénèse dirigée pour étudier les interactions structurales nécessaires à Mutagénèse dirigée pour étudier les interactions structurales nécessaires à l’association en tétramèresl’association en tétramères
Détergents non ioniques
+
Zn++ +
+