Dra. Roxana Verdini [email protected] · ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato...
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LICENCIATURA EN CIENCIA Y Í TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Í QUÍMICA DE LOS ALIMENTOS ÁNALISIS DEL CONTENIDO DE PROTEÍNAS DE PROTEÍNAS EN LOS ALIMENTOS 2017 2017 Dra. Roxana Verdini Dra. Roxana Verdini [email protected]
Transcript of Dra. Roxana Verdini [email protected] · ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato...
LICENCIATURA EN CIENCIA Y ÍTECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
ÍQUÍMICA DE LOS ALIMENTOS
ÁNALISIS DEL CONTENIDO DE PROTEÍNASDE PROTEÍNAS
EN LOS ALIMENTOS
20172017
Dra. Roxana VerdiniDra. Roxana Verdini
Métodos de análisis del contenido proteínas en alimentos
óLa determinación de la CANTIDAD DEPROTEÍNA de un alimento no es sencilla y elvalor obtenido en cada caso depende delvalor obtenido en cada caso depende delMÉTODO utilizado.
Muchos ensayos dependen de la PRESENCIAMuchos ensayos dependen de la PRESENCIADE UNA DETERMINADA CADENA LATERALAMINOACÍDICA (Lowry, Biuret).AMINOACÍDICA (Lowry, Biuret).
los resultados analíticos se veráncondicionados por la proporción delcondicionados por la proporción delaminoácido en cuestión en las proteínassometidas al ensayo y necesitarán serreferidos a alguna proteína estándar.
Otros métodos se basan en la determinaciónÓdel contenido de NITRÓGENO TOTAL
(Kjeldahl).
Métodos de análisis del contenido proteínas en alimentos
Existen numerosas fuentes de NITRÓGENONO PROTEICO que pueden interferir enq palgunos métodos de análisis:
i á id lib é tidaminoácidos libres, péptidospequeños, ácidos nucleicos,fosfolípidos aminoazúcares porfirinafosfolípidos, aminoazúcares, porfirina,algunas vitaminas, alcaloides, ácidoúrico, urea, iones amonio, etc.úrico, urea, iones amonio, etc.
Otras fuentes de interferencia pueden serlos otros macronutrientes presentes en losalimentos como hidratos de carbono y lípidos.
Métodos de análisis del contenido proteínas en alimentos
Los métodos mas comúnmente empleados son:
Kjeldahl
Kjeldahl/Bethelot
Bi tBiuret
LowryLowry
Absorbancia a 280 nm
Fijación de colorantes
Turbidimétrico
Métodos de análisis del contenido proteínas en alimentos
Estos métodos se fundamentan en:
determinaciones de nitrógeno
enlaces peptídicos
i á id átiaminoácidos aromáticos
absortividad UV de las proteínasabsortividad UV de las proteínas
grupos amino libres
propiedades de dispersión de la luz
capacidad de adhesión de colorantes
Método de Kjeldahlj
Es un método oficial descrito en múltiplespnormativas: AOAC, ISO, Farmacopeas ydistintas Directivas Comunitarias.
Se basa en los siguientes supuestos:l ió d it ó t í ila proporción de nitrógeno no proteínicoen un producto alimenticio es demasiadopequeña para ser significativapequeña para ser significativa,una determinación del contenido denitrógeno total (refleja con suficientenitrógeno total (refleja con suficienteprecisión el contenido de proteína delalimentoalimento,la proporción que representa el nitrógenoen la mayor parte de las proteínasen la mayor parte de las proteínasalimenticias es de 16%.
Método de Kjeldahlj
FUNDAMENTO
Involucra la conversión del nitrógenot lf t d ipresente a sulfato de amonio por
DIGESTIÓN, DESTRUCCIÓN OXIDATIVA OMINERALIZACIÓN con ácido sulfúricoMINERALIZACIÓN con ácido sulfúrico.
Posteriormente el sulfato de amonio sePosteriormente el sulfato de amonio sedescompone por ALCALINIZACIÓN conhidróxido de sodio y DESTILACIÓN delamoníaco liberado captándolo en una soluciónácida.
Finalmente se realiza una VALORACIÓNdel amoníacodel amoníaco.
Método de Kjeldahlj El ácido sulfúrico OXIDA LA MATERIAORGÁNICA y se combina con el amonioORGÁNICA y se combina con el amonioformado. L l b hid ó Los elementos carbono e hidrógeno seconvierten en dióxido de carbono y agua.Durante la digestión se libera el nitrógenoproteico para formar iones de amonio.Esta determinación incluye todo elnitrógeno reducido presente (-NH2 y =NH),de modo que los compuestos amoniacales,urea y aminoácidos libres son tambiénvaloradosvalorados. El uso de perlas de vidrio sirve de núcleo
l f ió d b b jpara la formación de burbujas.
Método de Kjeldahlj
ECUACIONES
Digestión: n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2 Neutralización y destilación (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O NH3 + H3BO3 NH4
+ + H2 BO3-
Titulación H BO - + H+ H BOH2BO3 + H+ H3BO3
Método de Kjeldahlj
UN POCO DE HISTORIA
En 1883 el investigador danés JohannKj ld hl d lló l bá i d lKjeldahl desarrolló el proceso básico delconocido método actual de análisis deproteínas por el método Kjeldahl másproteínas por el método Kjeldahl, máspropiamente, para analizar nitrógenoorgánico.g
El método original fue sufriendo luegol d falgunas modificaciones.
Wilforth (1885) Wilforth (1885) Gunning (1889) Arnold Arnold Winkler
Método de Kjeldahl
UN POCO DE HISTORIA
En el método original la digestión seefectuaba con una mezcla de ácido sulfúrico yefectuaba con una mezcla de ácido sulfúrico yanhídrido fosfórico y la oxidación secompletaba mediante la adición deppermanganato de potasio.
d f d l é d hLas modificaciones del método que hanresultado más útiles emplean:
óxido de mercurio como catalizadorde oxidación (Wilfoth). K SO t l t d K2SO4 para aumentar el punto deebullición del ácido sulfúrico (Gunning). CuSO también como catalizador de CuSO4 también como catalizador deoxidación (Arnold).
Método de Kjeldahlj
UN POCO DE HISTORIA
Los catalizadores permiten acortar el tiempode digestión y actúan como transportadores deO2.
Cuando se usa Hg como catalizador, éste debeser precipitado mediante el agregado de tiosulfatode sodio para liberar el NH3.
Otra modificación ampliamente aceptada es laintroducida en la etapa de destilación propuestapor Winkler:por Winkler:
originalmente se utilizaba ácido sulfúricovalorado para captar el amoníacovalorado para captar el amoníaco,
titulando posteriormente su exceso conNaOH valoradoNaOH valorado.
Método de Kjeldahlj
UN POCO DE HISTORIA
La modificación consiste en:
recibir el NH3 sobre una solución deácido bórico,
valorarlo directamente con soluciónvalorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.
Ventajas: la solución de ácido bórico no necesitaser exactamente medida eliminando los errores enser exactamente medida, eliminando los errores enla medición del ácido valorado en el colector y porotra parte sólo se requiere una solución valoradaH2SO4 o HCl.
Método de Kjeldahlj
ESQUEMÁTICAMENTE
Método de Kjeldahlj
ESQUEMÁTICAMENTE
Método de Kjeldahlj
UNIDADES DE DIGESTIÓN Y DESTILACIÓN
Método de Kjeldahlj
ALGUNOS EQUIPOS
Los equipos mas modernos vienen con unÓ
psistema de EXTRACCIÓN YNEUTRALIZACIÓN DE GASES:
una unidad “Scrubber” que bloquea elq qpaso y neutraliza las condensacionesácidas,
una bomba de recirculación de agua que una bomba de recirculación de agua queproporciona un gran caudal de vacío parala aspiración de los gases.
Método de Kjeldahlj
UNIDADES DE DIGESTIÓN, SCRUBBER Y BOMBA
Método de Kjeldahlj
DESTILADORES
Método de Kjeldahlj
DESTILADORES Y TITULADORES
Método de Kjeldahl
VENTAJAS DEL MÉTODO
Apropiado para varios tipos dedproductos.
Alta confiabilidad.Usado como método de referencia.
DESVENTAJAS DEL MÉTODO
Interfieren compuestos nitrogenados noproteicosproteicos.Uso de catalizadores tóxicos o caros.Elección del factor de conversión.
Método de Kjeldahlj
FACTOR DE CONVERSIÓNEl contenido porcentual promedio de N enlas proteínas de diversos alimentos es delas proteínas de diversos alimentos es de16%.El factor para convertir N en proteínasEl factor para convertir N en proteínassería entonces 100/16 = 6,25.Este factor general de conversión no es sinEste factor general de conversión no es sinembargo exacto, ya que las proteínas deorigen animal contienen generalmente menosorigen animal contienen generalmente menosnitrógeno y las de origen vegetal más.Así el factor de conversión para laAsí, el factor de conversión para laproteína del trigo es 5,7 y para la deproductos lácteos es 6,38.productos lácteos es 6,38.
Método de Kjeldahlj
FACTOR DE CONVERSIÓN
Actualmente se conoce el contenido de N, ypor lo tanto el factor apropiado de una granpor lo tanto el factor apropiado, de una grancantidad de productos agrícolas.
b d l f ó d í dDebido a la confusión que podría derivarsedel hecho de utilizar el factor general deconversión 6 25 o el específico para laconversión 6,25 o el específico para laproteína en estudio
Es necesario aclarar siempre en losinformes el factor de conversión utilizado
l ál l d t ípara el cálculo de proteínas.
Método de Kjeldahlj
FACTOR DE CONVERSIÓN
Método de Kjeldahlj
ECUACIONES
Digestión: n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2 Neutralización y destilación (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O NH3 + H3BO3 NH4
+ + H2 BO3-
Titulación H BO - + H+ H BOH2BO3 + H+ H3BO3
Método de Kjeldahlj
CÁLCULOS
%N = V x N x 14 x 100%N V x N x 14 x 1001000 P
%N = V x N x 0,014 x 100P
V: mL de ácido N: normalidad del ácidoP: gramos de muestra0,014: equivalente volumétrico del N, q
Método de KjeldahljMétodo de Kjeldahl/Berthelot E é d b l d ó hú d Este método combina la digestión húmedadel método de Kjeldahl con la reaccióncolorimétrica de Bethelotcolorimétrica de Bethelot. Al producto de la digestión se le reduce la
id ll l fi l lacidez, lleva a volumen final y luego unaalícuota se somete a la reaccióncolorimétricacolorimétrica. El NH4
+ presente en la digestión sulfúricai l f l hi l it d direacciona con el fenol e hipoclorito de sodio
en medio alcalino, formándose un complejo decolor azulcolor azul. La intensidad del color producido esdirectamente proporcional a la cantidad de Ndirectamente proporcional a la cantidad de Namoniacal presente en la muestra.
Método de Kjeldahlj
Método de Kjeldahl /Berthelotj
La absorbancia del complejo de se leep ja 540 nm.
Se calibra con solución de sulfato deamonio.
Por lo tanto lo que se determina port ét d NITRÓGENO TOTALeste método es NITRÓGENO TOTAL.
Otros métodos m
Los alimentos son una matriz complejap jpor lo que se sugiere que estos métodosempíricos e indirectos sean calibrados conpel método de Kjeldahl.
Se espera una buena correlación entreestos dos tipos de determinaciones de
í l l óproteína cuando la relación N noproteico/N proteico es baja y constante.
Son satisfactorios para leche yl i ti f t i lcereales e insatisfactorios para la
mayoría de los vegetales y mezclas dealimentosalimentos.
Otros métodos m
Método de absorbancia a 280 nm El método se basa en la medición deabsorbancia a 280 nm.absorbancia a 80 nm. La mayoría de las proteínas muestran unaabsorción a 280 nm la cual se atribuye alabsorción a 280 nm., la cual se atribuye algrupo fenólico de la tirosina y al grupoindólico del triptofano.p
Otros métodos mMétodo de absorbancia a 280 nm E é d l á d Es un método simple, rápido y nodestructivo. Es un método directo para ladeterminación de proteínas que puede
li l i t li ti iaplicarse en algunos sistemas alimenticios. Es necesaria la calibración con unaproteína estándar.Generalmente se toma una proteínapcomo la Albúmina Sérica Bovina (BSA), quees soluble en agua, para construir curvas
ó d fpatrón que sirvan de referencia paracuantificar otras proteínas, que serán másprecisas mientras la proteína en cuestiónprecisas mientras la proteína en cuestiónse parezca más a la BSA.
Otros métodos mMétodo de absorbancia a 280 nm l ó d b l l lLa solución debe ser clara e incolora, laturbidez puede afectar los resultados. El contenido de aminoácidos aromáticosdifiere considerablemente entre las distintas
t íproteínas.Los ácidos nucleicos interfieren (anillos depurina y pirimida), no así el amonio.
Otros métodos mMétodo de BiuretComprende un ensayo colorimétrico de unComprende un ensayo colorimétrico de unpaso donde se cuantifica la formación de uncomplejo estable entre proteínas y cobre (II)p j p y ( )de configuración desconocida.El complejo presenta un color violetaEl complejo presenta un color violetacaracterístico, que se puede observar a310nm o 540-560nm, el cual se da por lapcoordinación de un átomo de cobre con cuatroátomos de nitrógeno.El complejo se basa en la desprotonación delos grupos amida para formar el enlace con elcobre (II) o por el establecimiento de unenlace coordinado entre el metal y los paresd l t lib d l át d ide electrones libres de los átomos de oxigenoy de nitrógeno del péptido.
Otros métodos m
Método de Biuret
Otros métodos m
Método de Biuret Después de la adición del reactivo decobre se requiere de tiempo para desarrollarcobre se requiere de tiempo para desarrollaruna coloración de Biuret estable; es necesarioconsiderar la posible influencia de aminoácidoslibres que forman buffer en configuración trisy amoniaco. El complejo tiene dos máximos a 330 y a545 nm. La lectura se hace usualmente a 545 nm,dado que a la longitud de onda de 330 es masq gsusceptible a las interferencias.
Otros métodos mMétodo de BiuretEs rápido simple y no detecta nitrógeno deEs rápido, simple y no detecta nitrógeno defuentes no proteicas o no peptídicas.
Es necesaria la calibración con una proteínaEs necesaria la calibración con una proteínaestándar.
Altas concentraciones de carbohidratosAltas concentraciones de carbohidratos,lípidos pueden causar opalescencia en la soluciónfinal.f .
Las sales de amonio también interfieren en lareacción.reacción.
Se ha encontrado poca aplicación en análisisde alimentos debido a la presencia dede alimentos debido a la presencia deinterferentes como azúcares reductores quereducen el ion cúprico en medio alcalinopproduciendo resultados insatisfactorios.Ejemplo: leche.
Otros métodos mMétodo de Lowry
El ét d d L bi l ió dEl método de Lowry combina la reacción deBiuret con la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico)Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico)por la oxidación de tirosina, triptofano, cisteína,cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen,1988)1988).
El proceso de oxido-reducción se acompaña del f ió d l l t í tila formación de un color azul característico.
Los quelatos de cobre en la estructura delé tid f ilit l t f i d l t dpéptido facilitan la transferencia de electrones de
los grupos funcionales amino al cromóforo ácido.
E t ét d útil d t i ñ Este método es útil para determinar pequeñascantidades de proteína en una disolución.
El d ll d l d di t d l HEl desarrollo de color es dependiente del pH,que se debe mantener entre 10 y 10.5.
Otros métodos mMétodo de Lowry
Otros métodos mMétodo de LowryTiene mayor sensibilidad que el método delTiene mayor sensibilidad que el método delBiuret.La respuesta del color varía de acuerdo alLa respuesta del color varía de acuerdo altipo de proteína.L i t id d d l l t i t tLa intensidad del color no es estrictamenteproporcional a la concentración de proteína.Los iones potasio, magnesio, EDTA ehidratos de carbono interfieren en la
ióreacción.Es menos afectado por la turbidez de lamuestra.Es afectado por la presencia de azúcaresp preductores al igual que el método de Biuret.
Otros métodos m
Métodos de adhesión de colorante
Controlando el pH y la fuerza iónica del mediolos grupos funcionales ácidos y básicos de lasg up fu yproteínas pueden interactuar con grupos orgánicosde carga opuesta.
Al realizarse la unión se presenta coloración obien un cambio de ésta.
Comúnmente se usan colorantes sulfonados loscuales reaccionan a pH ácido con el grupo ε-aminod l li i l idi d l i i lde la lisina y el grupo guanidina de la arginina, elimidazol de la histidina y un número limitado de α-amino terminales.am n t rm na .
Pueden adherirse colorantes ANIÓNICOS oCATIÓNICOS (BRADFORD).N ( DF D).
Otros métodos m
Métodos de adhesión de colorante aniónicoEl COLORANTE ANIÓNICO se une a losgrupos catiónicos de los residuos básicos degrupos catiónicos de los residuos básicos delas proteínas (histidina, arginina, lisina) yforman un complejo insoluble.El colorante en exceso permanece soluble yse relaciona inversamente con laconcentración de proteínas.El método con el colorante NARANJA 12El método con el colorante NARANJA 12está descripto en la AOAC para leche fluida,helados, leche en polvo descremada (λ=480pnm).Algunos compuestos no proteicos comoAlgunos compuestos no proteicos comoalmidón o metales pueden unirse al colorante.
Otros métodos mMétodo de Bradford b l ó d l lSe basa en la unión del colorante CoomassieBlue G-250 a las proteínas.Las proteínas (aminoácidos básicos yaromáticos) se unen a la forma azul paraf l j t í l tformar un complejo proteína-colorante con uncoeficiente de extinción mayor que elcolorante librecolorante libre.Este método es sensible, simple, rápido,b t t i i t fibarato y pocas sustancias interfieren en sudeterminación.E l f áEntre las sustancias que interfieren estánlos detergentes y las soluciones básicas.No interfieren los carbohidratos.
Otros métodos m
Método de Bradford
Los aminoácidos que son reconocidos por elLos aminoácidos que son reconocidos por elcolorante son arginina, fenilalanina, triptofanoy prolina.El azul de Coomasie libre se detecta a 470nm mientras que la forma unida a proteínas aq p595 nm.Esto se debe a que el Coomassie se uneEsto se debe a que el Coomassie se unepreferencialmente a los aminoácidosmencionados y cambia de un estadoycatiónico a uno aniónico.
Otros métodos m
Método de Bradford
Otros métodos mEspectroscopia infrarrojaSe aprovecha la absorción del grupo amidadel enlace peptídico. Ventajas:Es un método rápido análisis deEs un método rápido, análisis demulticomponentesNo destructivoNo destructivo.
DesventajasInterferido por agua.Proceso de calibración complejoProceso de calibración complejo.
Otros métodos mEspectroscopia infrarroja reflectante l l d La muestra se ilumina con seis longitudesde onda cercanas a la radiación infrarroja yse detecta la luz reflejadase detecta la luz reflejada.ConsideraciónEs necesaria la calibración contra unconjunto de muestras estadísticamentesignificativas, analizadas por métodos dereferencia tradicionales.
VentajasRápido análisis de multicomponentesRápido, análisis de multicomponentes.Aplicable a materiales sólidos.Cuantifica proteína en presencia deagua.
Determinación de la secuencia de maminoácidos
L d t mi ió d l m i ióLa determinación de la composiciónproporciona una información sobre unaproteínaproteína.A veces se necesita identificar la secuenciade los aminoácidos para lo que se cuenta conde los aminoácidos, para lo que se cuenta condos métodos: i ió d l d li tídi secuenciación de la cadena polipeptídicaen equipos automatizados llamadossecuenciadores de proteínassecuenciadores de proteínas. análisis con espectrometría de masasd l é tid dde los péptidos generados y sus masasmoleculares respectivas.
Determinación de la secuencia de maminoácidos
P l t m ñ d l m lé lPor el tamaño de las moléculas, sehidrolizan con proteasas específicas, paraposteriormente secuenciar e identificar másposteriormente secuenciar e identificar másfácilmente porciones de 10 a 20 aminoácidosde los péptidos generados.p p gLa combinación de proteasas específicas ylos péptidos generados alimentados a baseslos péptidos generados alimentados a basesde datos que tengan la información dedigestiones enzimáticas, permiten irg pcompletando las secuencias.Se ensaya el orden posible de los péptidosSe ensaya el orden posible de los péptidosal compararlos con bases de datos que tenganla información de digestiones enzimáticasprovenientes de proteínas cuya secuencia hasido ya elucidada.
Determinación de la secuencia de maminoácidos
P h Edm d b ió i dPehr Edman descubrió una secuencia dereacciones que permiten identificar los N-terminales y que al realizarse repetidamenteterminales y que al realizarse repetidamentepermiten identificar la secuencia completa delos polipéptidos en cuestión.p p pEl reactivo utilizado por Edman es elfenilsiotiocianato que reacciona con el aminofenilsiotiocianato que reacciona con el aminoterminal para producir el feniltiocarbamilo delpéptido.p pEl conocimiento de la secuencia deproteínas es cada vez más necesario paraproteínas es cada vez más necesario paraidentificar la presencia de variantes naturalesa la luz de los nuevos alimentos de origentransgénico.
Determinación de proteínas por m p pelectroforesis
P d li l t f iPueden realizarse electroforesis encondiciones nativas en las que las proteínasmigran conservando su diversidad ymigran conservando su diversidad ypropiedades físicas, especialmente su puntoisoeléctrico y peso molecular.y pEs posible utilizarla en una sola dimensión oen dos dimensiones (2D) Se les denomina 1Den dos dimensiones (2D). Se les denomina 1Do 2D-PAGE (por sus siglas en inglés,Electroforesis en Gel de Poliacrilamida).Una vez realizadas las separaciones,generalmente se continúa con una digestióngeneralmente se continúa con una digestiónproteolítica y la separación de los fragmentospor electroelución o para su análisis porespectroscopia de masas (MS).
Determinación de proteínas por m p pelectroforesis
L PAGE d ll bLa PAGE puede llevarse a cabo encondiciones denaturalizantes si se utilizantiol-reductores fuertes como mercaptoetanoltiol-reductores fuertes como mercaptoetanoly ditiotreitol (DTT) y un detergentedesnaturalizante fuerte: el dodecil sulfato desodio (SDS).El tratamiento con ambas sustancias lasEl tratamiento con ambas sustancias lasdespliega y las cargas negativas conferidaspor los grupos sulfato del SDS permite lap g p pmigración de las moléculas hacia el ánodo, deacuerdo con su peso molecular
l i texclusivamente.
Determinación de proteínas por m p pelectroforesis
L té i 2D mit dLas técnicas 2D permiten una segundaseparación que discrimina proteínas que en 1Dse traslapan por ejemplo cuando sonse traslapan, por ejemplo, cuando sonespecies moleculares múltiples, aun cuando setrate de proteínas purificadas.p pPara el primer paso en una 2D-SDS-PAGEse aplica una separación por carga eléctricase aplica una separación por carga eléctrica(isoelectroenfoque) y una segunda separaciónpor peso molecular.p pEsta poderosa técnica se ha convertido enun sinónimo de Proteómica y el mejor métodoun sinónimo de Proteómica y el mejor métodopara la resolución de mezclas complejas deproteínas.
Determinación de proteínas por m p pelectroforesis
L té i 2D mit dLas técnicas 2D permiten una segundaseparación que discrimina proteínas que en 1Dse traslapan por ejemplo cuando sonse traslapan, por ejemplo, cuando sonespecies moleculares múltiples, aun cuando setrate de proteínas purificadas.p pPara el primer paso en una 2D-SDS-PAGEse aplica una separación por carga eléctricase aplica una separación por carga eléctrica(isoelectroenfoque) y una segunda separaciónpor peso molecular.p pEsta poderosa técnica se ha convertido enun sinónimo de Proteómica y el mejor métodoun sinónimo de Proteómica y el mejor métodopara la resolución de mezclas complejas deproteínas.
