Documents, p 1

Document 1

Schémas de structures cellulaires de microalgues

A : algue unicellulaire B : cyanobactérie

cellule de 10 à 20 µm environ cellule de 5µm environ

Source : Prescott, Harley, Klein, Microbiologie, Ed. De Boeck Université 1995 p 474, 537.

Les thylacoïdes sont les membranes où se déroule la photosynthèse.

Le pyrénoïde est une structure cellulaire interne aux chloroplastes, qui concentre les enzymes responsables de la photosynthèse. Le pyrénoïde est un centre de production de l'amidon : des grains d'amidon viennent s'accoler à l'extérieur du pyrénoïde.

Les phycobilisomes sont des complexes hétéroprotéiques ancrés dans les thylacoïdes. Ils comprennent entre autres les pigments photosynthétiques.

Le carboxysome est un compartiment protéique contenant les enzymes responsables de la photosynthèse.

La cyanophycine constitue une réserve d’azote et de carbone.

Les granules de polyphosphate sont des réserves de phosphates inorganiques quand le milieu est carencé en phosphates.

La vacuole pulsatile intervient dans l’équilibre hydrique de la cellule.

Les vacuoles gazeuses permettent de moduler la flottabilité de la cellule.

membrane plasmique

vacuole pulsatile

amidon

reticulum endoplasmique rugueux

appareil de

Golgi

noyau

mitochondrie

paroi

chloroplaste

flagelle

thylacoïdes

vacuole

pyrénoïde

amidon

chloroplaste

membrane plasmique

glycogène

nucléoïde

paroi

ribosomes

vacuoles gazeuses

phycobilisomes

membrane plasmique

granule de polyphosphate

carboxysome

cyanophycine

thylacoïdes

Documents, p 2

Document 2

2.a Schéma de l’ultrastructure du chloroplaste

Source : http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Chloroplast.svg

1-membrane externe 2-espace inter-membranaire

3-membrane interne 4-stroma (fluide aqueux)

5-lumière du thylacoïde 6-membrane du thylacoïde

7-granum (thylacoïdes accolés) 8-thylacoïde inter-granaire (lamelle)

9-grain d'amidon 10-ribosome

11-ADN 12-plastoglobule (gouttelette lipidique)

2.b Schéma fonctionnel du chloroplaste

Source : G. Alkan-CART-P. Morin, Biologie Term.D, Ed. F. Nathan, p333

2.c Expérience

Culture après 6 jours

Des algues unicellulaires ont été mises en culture dans un milieu minéral et placées à la lumière. La photographie ci-contre montre la culture obtenue six jours après l’inoculation du milieu.

Documents, p 3

Document 3

Structures moléculaires des chlorophylles et spectr e d’absorption

Source : http://fr.wikipedia.org/wiki/Chlorophylle

Document 4

Schéma "en Z" de la photosynthèse, transfert acycli que des électrons.

Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Photosynthese-cours/image/Z1.gif

PSI et PSII sont les photosystèmes I et II qui contiennent chacun une molécule de chlorophylle comme centre réactionnel.

Les LHC (light harvesting complex) sont des ensembles de pigments et de protéines qui collectent l’énergie lumineuse pour la distribuer aux centres réactionnels des photosystèmes.

Documents, p 4

Document 5

5.a Expérience de Jagendorf et Uribe (1966)

A partir d'une suspension de chloroplastes, les chloroplastes sont cassés (par choc osmotique par

exemple) et les thylacoïdes sont isolés par centrifugation (le stroma a été éliminé). L'ensemble de

l'expérience est effectué à l'obscurité.

• 1 - cette suspension est placée dans un milieu acide tamponné à pH 4, • 2 - après quelques minutes, le pH des thylacoïdes s'est équilibré avec celui du milieu, • 3 - on transfère alors les thylacoïdes dans un milieu basique tamponné à pH 8 en présence

d'ADP, de phosphate inorganique (Pi) et de magnésium (Mg2+

).

Résultat : un dosage d'ATP dans le milieu de suspension montre qu'il y a eu synthèse d'ATP.

5.b Mesure de la concentration en protons dans la s uspension de thylacoïdes

Le dispositif de mesure (à gauche) permet l’enregistrement des variations de concentration en protons

dans le milieu de suspension des thylacoïdes lors de transitions obscurité / lumière (à droite).

5.c Thylacoïdes en coloration négative observés en microscopie électronique à transmission

(Cliché : Marcel Signol).

Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Chloroplaste/chloneg.htm

stroma

ATP synthases

thylacoïde

Documents, p 5

Document 6

Transferts d’électrons et de protons au niveau de l a membrane du thylacoïde

Source : http://svt.ac-dijon.fr/schemassvt/affiche_image.php3?id_document=2923

Membrane du

thylacoïde

Espace

intrathylacoïdal

Stroma

Documents, p 6

Document 7

Cycle de fixation du CO 2 dans la photosynthèse : cycle de Calvin (version simplifiée)

Source : http://svt.ac-dijon.fr/schemassvt/affiche_image.php3?id_document=2880

Document 8

Protocole opératoire de l’extraction des lipides to taux des cellules C. reinhardtii

Un protocole d'extraction a été décrit par Zhu et al. (2002). Il s'agit d'une modification de la méthode d'extraction par voie humide de Bligh et Dyer (1959). Les cellules sont récoltées par centrifugation à 8500 tr/min pendant 5 min et lavées une fois avec de l'eau distillée. Après séchage, les échantillons sont broyés dans un mortier et extraits par un mélange de chloroforme : méthanol (2:1, v/v ). Après agitation mécanique de l'échantillon pendant 5 h et des ultrasons pendant 30 min, les échantillons sont centrifugés à 3000 tr / min pendant 10 min. La phase solide est séparée avec soin en utilisant un papier filtre. La phase solvant est évaporée dans un évaporateur rotatif sous vide à 60°C. La procédure est répétée trois fois jusqu'à ce que la totalité des lipides soit extraite.

Source : http://www.ensaia.inpl-nancy.fr/marie/web/ntic/pages/2009/rapport05.pdf

Documents, p 7

Document 9

Séparation des lipides totaux de C. reinhardtii

par chromatographie sur couche mince

Témoins Extrait

lipidique

TAG : Triacylglycerol ;

MGDG : Monogalactosyldiacylglycerol ;

DGDG : Digalactosyldiacylglycerol ;

PG : Phosphatidylglycerol ;

PE : Phosphatidylethanolamine;

PC : Phosphatidylcholine.

TAG

MGDG

DGDG

PG

PE

PC

Documents, p 8

Document 10

Réactifs révélateur Classement SGH

(Sécurité)

Chlorure de manganèse et

méthanol en milieu

sulfurique SGH 02 SGH 05 SGH 06 SGH 07 SGH 08

Document 11

Danger Physique

Pictogramme Danger

SGH 01

Produits explosifs

Ces produits peuvent exploser au contact d’une flamme, d’une étincelle,

d’électricité statique, sous l’effet de la chaleur, d’un choc, de frottements, …

SGH 02

Produits inflammables

Ces produits peuvent s’enflammer, suivant le cas :

- au contact d’une flamme, d’une étincelle, d’électricité statique, … ;

- sous l’effet de la chaleur, de frottements, … ;

- au contact de l’air ;

- au contact de l’eau, s’ils dégagent des gaz inflammables (certains gaz

s’enflamment spontanément, d’autres au contact d’une source d’énergie :

flamme, étincelle, …).

SGH 03

Produits comburants

Ces produits peuvent provoquer ou aggraver un incendie, ou même

provoquer une explosion s’ils sont en présence de produits inflammables.

SGH 04

Gaz comprimés

Ces produits sont des gaz sous pression contenus dans un récipient. Certains

peuvent exploser sous l’effet de la chaleur ; il s’agit des gaz comprimés, des

gaz liquéfiés et des gaz dissous. Les gaz liquéfiés réfrigérés peuvent, quant à

eux, être responsables de brûlures ou de blessures liées au froid appelées

brûlures et blessures cryogéniques.

SGH 05

Produits corrosifs pour les métaux

Ces produits attaquent ou détruisent les métaux.

SGH 05 représente à la fois un danger physique et un danger pour la santé

Documents, p 9

Danger chimique

Pictogramme Danger

SGH 05

Produits corrosifs pour la peau et/ou les yeux

Ces produits peuvent ronger la peau et/ou les yeux en cas de contact ou de

projection.

SGH 05 représente à la fois un danger physique et un danger pour la santé

SGH 06

Produits toxiques (toxicité aigüe)

Ces produits empoisonnent rapidement, même à faible dose. Ils peuvent provoquer

des effets très variés sur l’organisme : nausées, vomissements, maux de tête, perte

de connaissance ou d’autres troubles plus importants entraînant la mort.

SGH 07

Produits altérant la santé

Ces produits chimiques ont un ou plusieurs des effets suivants :

- ils empoisonnent à forte dose ;

- ils sont irritants pour les yeux, la gorge, le nez ou la peau ;

- ils peuvent provoquer des allergies cutanées (eczémas) ;

- ils peuvent provoquer une somnolence ou des vertiges.

SGH 08

Produits portant gravement atteinte à la santé (CMR, STOT, Danger par aspiration)

CMR : Cancérigène, Mutagène, Reprotoxique

STOT : Toxicité spécifique pour certains organes cibles.

Ces produits rentrent dans une ou plusieurs de ces catégories :

- produits cancérogènes : ils peuvent provoquer le cancer ;

- produits mutagènes : ils peuvent modifier l’ADN des cellules et peuvent alors

entraîner des dommages sur la personne exposée ou sur sa descendance (enfants,

petits-enfants, …) ;

- produits toxiques pour la reproduction : ils peuvent avoir des effets néfastes sur la

fonction sexuelle, diminuer la fertilité ou provoquer la mort du fœtus ou des

malformations chez l’enfant à naître ;

- produits qui peuvent modifier le fonctionnement de certains organes comme le

foie, le système nerveux, … Selon les produits, ces effets toxiques apparaissent si

l’on a été exposé une seule fois ou bien à plusieurs reprises ;

- produits qui peuvent entraîner de graves effets sur les poumons et qui peuvent

être mortels s’ils pénètrent dans les voies respiratoires (après être passés par la

bouche ou le nez ou bien lorsqu’on les vomit) ;

- produits qui peuvent provoquer des allergies respiratoires (asthme, par exemple).

Danger pour l’Environnement

Pictogramme Danger

SGH 09

Danger pour le milieu aquatique

Ces produits provoquent des effets néfastes sur les organismes du milieu aquatique

(poissons, crustacés, algues, autres plantes aquatiques, …).

Documents, p 10

Document 12

La Rubisco d’après UC Davis - University of Califor nia - Ressources

The limiting reaction within the Calvin Cycle is carried out by the enzyme Ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase,

commonly referred as Rubisco (figure 1).

This enzyme was discovered by Melvin Calvin at Berkeley in the 1940’s. Rubisco has since been named as the

most abundant protein on earth.

The enzyme is located in the chloroplasts' stroma, consisting of at least 15% and up to 50% of the chloroplast

protein. The high concentration of Rubisco indicates a significant role for the metabolism. It is estimated that 4 .

1010

kg of the enzyme is made every second on earth.

Figure 1. Crystal structure ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from green alga

Chlamydomonas reinhardtii

Source: http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1IR1

Rubisco’s shape directly relates to its function. In order for Rubisco to function, it requires substrates supplied

from the surrounding environment. These include carbon dioxide and Ribulose 1,5 bisphosphate (RuBP).

The enzyme will perform a conformation change and essentially ‘slam’ the Carbon dioxide onto RuBP. The result

is a highly unstable six-carbon reaction intermediate

Due to the molecules instability the carbon splits into two molecules of 3-phosphoglycerate (3GP). In the Calvin

Cycle each of the 3GP molecules will be synthesized into Glyceraldehyde 3-phosphate (G3P).

In the analysis of the active site within Rubisco it has been studied that there is the involvement of Mg2+

. This

alkaline earth metal stabilizes formation of an enediolate carbanion equivalent that is subsequently carboxylated

by CO2, as shown in figure 2. This conformation change, as shown in studies, activates a broadband of visible and

infrared emissions. Once in stable formation Mg2+

, although not well depicted in figure 2, will form covalent

bonds with four Oxygen atoms. This formation can be described as square planar when considering only the

immediate ligands around Mg2+

.

Figure 2: Active site of the Rubisco (From UC Davis - University of California - Ressources)

Documents, p 11

Document 13

Détermination des grandeurs cinétiques de la Rubisco

Résultats d’une étude expérimentale

[Ribulose 1,5-

bisphosphate]

(µmol.L-1

)

0,0 1,2 2,4 4,8 7,2 9,6 12,0 24,0 32,0

vi sans effecteur

(nkat.mg-1

)

0,0 23,1 37,5 54,5 64,3 70,6 75,0 81,0 81,0

vi en présence de Fructose

1,6-bisphosphate

(nkat.mg-1

)

0,0 13,0 23,1 37,5 47,4 54,5 60,0 66,0 66,0

Représentation graphique

Rappel :

La représentation de Lineweaver et Burk (ou représentation des doubles inverses), a pour

équation : [ ] maxi)S,c(imaxi)S,c(M

i v

1

ebisphophat5,1Ribulose

1.

v

K

v

1 +=

Documents, p 12

Document 14

Composition du milieu de culture Tris – Acétate – P hosphate avec azote (TAP+N)

Le milieu de culture est réalisé à partir des solutions mères suivantes :

- Solution A (pour 1 L) : NH4Cl 8 g, MgSO4 7 H2O 2 g, CaCl2 2 H2O 1 g.

- Tris 0,2 M (pour 1 L) : C4H11NO3 24,2 g, ajuster le pH à 7,0 à l’aide d’acide acétique glacial.

- Tampon II (pour 100 mL) : K2HPO4 9,35 g, KH2PO4 6,3 g, ajuster le pH à 7,0.

- Solution minérale (pour un litre) : EDTA 50 g, H3BO3 11,4 g, ZnSO4 22 g,

MnCl2 5,06 g, FeSO4 4,9 g, CoCl2 1,61 g, CuSO4 1,57 g, (NH4)6Mo7O24 4 H2O 1,1 g.

Composition en solutions mères pour 1L de milieu TAP+N Volumes

Tris 100 mL

Solution A 50 mL

Tampon II 1 mL

Solution minérale 1 mL

pH ajusté à 7

Document 15

Détection de l’accumulation de lipides neutres dans les cellules d’une souche commune de Chlamydomonas reinhardtii (cw15)

Detection of neutral lipid accumulation in cw15, a common laboratory strain of C. reinhardtii

using Nile red staining.

The yellow fluorescence observed in the presence of Nile red indicates the presence of neutral

lipids while the red fluorescence corresponds to chlorophyll autofluorescence.

TAP+N : standard growth medium. TAP-N : nitrogen-depleted TAP medium. Bars = 8 μm.

Source : Siaut M. (2011) BMC Biotechnology

Documents, p 13

Document 16

Analyse de la composition en acides gras de C. reinhardtii

16. a Analyse de la composition en acides gras de C. reinhardtii :

Analysis of fatty acid composition in C. reinhardtii. Comparison of the fatty acid composition

of the TAG fraction and total lipids. The TAG fraction was isolated from cells cultivated in TAP-

N for 2 days while total lipids were from cells grown in TAP+N medium. Asterisks denote a

statistically significant difference.

Source : Siaut M.(2011) BMC Biotechnology.

16. b Noms systématique et commun des acides gras c ités dans le document 16. a :

Symbole Nom systématique Nom commun

connu

Symbole Nom systématique Nom commun

connu

16:0 Acide hexadécanoïque Acide

palmitique

18:0 Acide octadécanoïque Acide stéarique

16:1 (9) Acide hexadéc-9-

énoïque

Acide

palmitoléique

18:1 (9) Acide octadéc-9-

énoïque

Acide oléique

16 :1 (3t) Acide 3-trans-

hexadécénoïque

18:1 (11) Acide octadéc-11-

énoïque

Acide vaccénique

16:2 (7,10) Acide hexadéc-7, 10-

diénoïque

18:2 (9, 12) Acide octadéca-9, 12-

diénoïque

Acide linoléique

16:3 (7, 10, 13) Acide hexadéc-7, 10, 13 18:3 (5, 9, 12) Acide octadéca-5, 9, 12-

triénoïque

Acide pinolénique

16:4 (4, 7, 10, 13) Acide hexadéc-4, 7, 10,

13-tétraénoïque

18:3 (9, 12, 15) Acide octadéca-9, 12,

15-triénoïque

Acide α-linolénique

18:4 (5, 9, 12, 15) Acide octadéca-5,9, 12, 15-tétraénoïque

Acide

coniféronique

+N)

Documents, p 14

Document 17

Cinétique d’évolution des réserves en amidon (starc h), TAG et chlorophylle dans les cellules de C. reinhardtii cultivées sur le milieu TAP-N

Time course of accumulation of triacylglycerols, starch and chlorophyll in C. reinhardtii in

response to nitrogen depletion. Precultures of strain cw15 were grown in TAP+N medium for

2 days before changing medium to TAP-N (day 0).

Source : Siaut M.(2011) BMC Biotechnology.

TAP+N

Documents, p 15

Document 18

Etude des conditions opératoires d’extraction des l ipides de la micro-algue Chlorella vulgaris.

18. a Effet de la température de séchage des échant illons sur le rendement en lipides :

18 b Effet du temps de traitement des échantillons aux ultrasons sur le rendement en lipides :

Source : Widjaja and coll. (2008) Journal of Taiwan Institute of Chemical Engineers.

Documents, p 16

Document 19

Localisation des TAG de réserve dans les corps lipi diques

19.a Image of Chlamydomonas reinhardtii

Source : Siaut M. (2011) BMC Biotechnology.

19.b Modèle structural d’un corps lipidique

Source : Tzen and Huang (1993) JBC.

Corps lipidiques

Phospholipides (en rouge)

TAG (en bleu)

Protéines (en jaune)

Documents, p 17

Document 20

Fractionnement des protéines cellulaires de C. reinhardtii et identification de la MLDP associée aux corps lipidiques

20. a Protocole opératoire :

1) Extraction des protéines cellulaires :

- de la cellule entière (Tot. Prot.) ;

- des thylacoïdes (Thylakoïd) ;

- des pyrénoïdes (Eyespot) ;

- des corps lipidiques (Lipid Droplet).

2) Dépôt sur un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. Les extraits obtenus dans

l’étape 1 sont déposés respectivement pistes 1, 2, 3 et 4.

2) Migration électrophorétique

3) Révélation

20. b Résultats :

Les masses moléculaires des protéines sont indiquées sur la gauche de la figure en Kilodalton.

Les numéros placés à droite correspondent aux bandes d’intérêt excisées de la piste 4 du gel

pour une étude plus approfondie.

Source : Moellering (2009) Eucaryotic cell

+

_

Sens de migration

Pistes

1 2 3 4

Documents, p 18

Document 21

Mise en évidence d’une accumulation de lipides chez un mutant de C. reinhardtii cultivé en conditions de croissance normales

21. a Micrographies des cellules de C. reinhardtii colorées au rouge de Nile

Wild type = cellules sauvages de C. reinhardtii

Mutant = cellules obtenues par mutation

Source : Beisson (2012)

21. b

Documents, p 19

Document 22

Principe de l’interférence par ARN

Dégradation de l’ARN messager cible

ARNi = ARN interférant

Source : http://www.sidablog.fr/articles/3/nouveau-traitement-arn-interferences-contre-vih.php

1

1

1

ADN

5’ 3’

MLDP

MLDP

messager

2

ARNi

Documents, p 20

Document 23

Réduction de l’expression de la protéine MLDP par l a méthode

d’interférence par ARN

1 : Niveaux d’ARN messager dans deux lignées de cellules de C. reinhardtii contrôles (EV1 et

EV2) et dans quatre lignées de cellules modifiées grâce à l’interférence par ARN (A1, C7,

E9 et G11).

2 : Diamètre des corps lipidiques mesuré pour ces mêmes lignées contrôles et modifiées.

Source : Moellering (2010) Eucaryotic cell.

1

2

Documents, p 21

Document 24

Source : http://www.biosolis.org/ingenierie-des-photobio.html

Source : http://www.labcluster.com/images/Cryoconservation_Corning.pdf

24a : Culture en boîte 24b : Conservation en cryot ubes

24c : Effets des vitesses de congélation sur les cellul es

Documents, p 22

Document 25

Système de dénombrement des microalgues

Présentation de la technique :

J.C. DRUART et F. RIMET. Protocoles d’analyse du phytoplancton de l’INRA : prélèvement,

dénombrement et biovolumes. INRA-Thonon, Rapport SHL 283 - 2008, 96 p.

Détails de la plaque Wild :

Sédimentation Observation et dénombrement Montage de la lame

Surface de comptage : 1,70 mm2

Surface entière de la

chambre : 530,66 mm2

Plaque Wild

Microscope

inversé X40

Tube de

sédimentation

de 25 mL

Lamelle de

verre

Documents, p 23

Document 26

Logigramme d’acceptabilité des résultats

Source : Norme ISO 5725

Documents, p 24

Document 27

Résultats du dénombrement pour la réalisation de la courbe de croissance de Chlamydomonas reinhardtii

Jour 0 1 2 3 4 5 6

C (microalgues ; dispositif de culture) 50 100 5,00.103 2,50.105 1,25.107 6,25.108 3,12.1010

ln (C (microalgues ; dispositif de culture))

3,91 4,61 8,52 12,4 16,3 20,3 24,2

Documents, p 25

Document 28

Culture en photobioréacteur

28 a : Photo de photobioréacteur 28 b : Schéma de photobioréacteur

Source : http://www.hielscher.com/fr/algae_reactor_

cleaning_01.htm

Source : http://sitiosolar.com/SITIOSOLAR%20EN%20FRANCES/Les%20biocombust

ibles%20de%20microalgues.htm

28 c : Protocole d’ensemencement du photobioréacteu r

• Préculture au laboratoire dans un réacteur contenant le même milieu de culture que celui du photobioréacteur

• Transfert de la totalité de la préculture dans la cuve du photobioréacteur, soit un inoculum de 106 microalgues en phase exponentielle de croissance

• Incubation pendant un temps t nécessaire pour obtenir une population de 5,00.105 microalgues.mL-1.

Diamètre des tubes : 5 cm

Longueur des tubes : 80 m

Nombre des tubes : 8

Documents, p 26

Document 29

Dispositifs de culture industrielle des microalgues

Le procédé « raceway » ( champ de course) : un exemple de système solaire ouvert

C’est une culture réalisée en extérieur dans un bassin en forme de boucle. C’est donc une culture saisonnière puisque soumise aux aléas climatiques et non protégée des contaminations, à moins de cultiver des espèces extrêmophiles en milieu alcalin ou hypersalé. La culture d'algues circule dans le bassin sous l'action d'une roue à pales qui assure le brassage et évite la sédimentation des algues. La source de CO2 est atmosphérique, la source de lumière est naturelle. De l'eau filtrée, additionnée d'éléments minéraux est additionnée en continu afin de pallier l'effet d'évaporation. La taille des bassins est variable : de 0,5 à 105 m3, la concentration en biomasse atteint 0,1 à 0,2 g.L-1 et la productivité 10 à 30 t/ha/an.

Source : http://www.ceva.fr

Le procédé en photobioréacteur : un système artific iel fermé

Il présente de fortes similitudes avec les bioréacteurs bactériens. Les microalgues circulent entre un réservoir qui porte une colonne de dégazage et le collecteur de rayonnement solaire composé de tuyaux transparents qui laissent entrer la lumière. Les tuyaux sont disposés sous forme de plan incliné pour permettre d'augmenter le rayonnement incident. Les tubes ne dépassent pas un diamètre de 10 cm pour éviter les zones d'ombre. L'éclairement de ces tubes peut être réalisé à l'aide de sources lumineuses artificielles qui nécessitent un surcoût d’énergie. Un flux turbulent est maintenu dans l'écoulement au moyen d'une pompe afin d'éviter la sédimentation et les zones d'ombre. Un générateur assure l’approvisionnement en CO2 . Les paramètres de la culture peuvent être rigoureusement contrôlés. Le volume de ces réacteurs varie de 0,1 à 2 m3, avec une concentration en biomasse qui peut atteindre 10 g.L-1 et une productivité de 100 t/ha/an.

Source : http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167779908000218