Distributore per l’Italia Sistema LightScanner ® Rilevazione delle mutazioni e genotipizzazione...

Distributore per l’Italia

Sistema LightScanner®

Rilevazione delle mutazioni e

genotipizzazione ad alta resa


Sistema LightScanner • La caratteristica che contraddistingue il sistema LightScanner è la tecnica High Resolution Melting (Hi-Res Melting™).

– Hi-Res Melting è una tecnica post PCR per la rilevazione e lo scanning delle mutazioni omogenee.

VELOCE – risultati in meno di 5 minuti.SEMPLICE – nessun procedimento post PCR.ECONOMICO – costi nettamente inferiori rispetto alla concorrenza


Scanning con Hi-Res Melting

• Tubo-chiuso– dye dsDNA prima della PCR– Nessun processamento, aggiunte o separazioni– Nessuna esposizione esterna

• Rapido– 5-10 min per 96/384 campioni

• Non distruttivo– Se necessario, è possibile eseguire procedimenti

downstream (ex: sequenziamento)

• Manutenzione minima– Smaltimento dei rifiuti non dispendioso


Componenti essenziali della Hi-Res Melting

• Dye specifico per DNA a doppio filamento• LCGreen Plus™, specifico per la rilevazione degli eteroduplex che si formano durante la PCR, è prodotto esclusivamente da Idaho Technology.

• Strumentazione ad alta risoluzione• Lo strumento LightScanner è progettato specificatamente per le applicazioni Hi-Res melting


• LCGreen Plus rileva gli eteroduplex, a differenza dei dye usati tradizionalmente per la real-time PCR (ex: SYBR Green I)

Dye LCGreen® Plus

0

5

10

15

20

25

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40

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50

72 74 76 78 80 82 84 86

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72 74 76 78 80 82 84 86

Temperature (°C)

LCGreen Plus SYBR® Green I

-dF/

dT

wild type heterozygote

Heteroduplexes

0

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72 74 76 78 80 82 84 86

Temperature (°C)

LCGreen Plus SYBR® Green I

-dF/

dT

wild type heterozygote

Heteroduplexes


Dye non saturante Dye saturante

LC Green – un dye “di saturazione”


Strumento LightScanner

• Disponibile per piastre da 96 o da 384 pozzetti

• Uniformità sulla piastra +/- 0.15°C

• 100 punti di rilevamento raccolti per °C a

0.10 °C/sec


Tecnica Hi-Res Melting

1. Amplificazione dei campioni con il dye LCGreen• 2 ore inclusa la preparazione della PCR

2. Melting dei campioni• 5-10 minuti

3. Analisi dei dati• 5-10 minuti

4. Recupero dei campioni per il sequenziamento (se necessario)• 30-60 minuti


Melting Curves

Temperature

CG

TA

Heterozygote Amplification

TwoHomoduplexes

TwoHeteroduplexes

C

A

T

G

Observed Combinationof 4 Duplexes


Analisi di melting


SNP 1 homozygote

SNP 2

SNP 1

SNP 1 + 2

Analisi di melting


SNP 1 homozygote

SNP 1 + 2

SNP 1

SNP 2

Analisi di melting


Prodotto di 100 bp

C/C OmozigoteC/G EterozigoteC/T EterozigoteC/A Eterozigote

• Gli omozogoti vengono facilmente distinti dagli eterozigoti

• Eterozigoti diversi tra loro tracciano profili di melting unici


Rilevazione delle varianti omozogotiche


“Blinded Samples” di tumore


Dosaggio del target


• Highsmith et al., Electrophoresis (1999)

• Plasmidi costruiti con un contenuto in GC di 40%, 50%, e 60% e con A, C, G, o T in posizione uno

• Primers di PCR spaziati di 50 bp su ogni filamento

Utilizzo di un “toolbox” DNA come sistema modello per l’individuazione delle mutazioni

X

Reed and WittwerClin. Chem. 2004,50(10): 1748-54


Sensibilità e specificità in funzione della lunghezza del prodotto

•N=1248, ogni strumento•Tre target differenti•Tutti gli SNPs e i WTs possibili

Clin Chem. 2004;50:1748-54.

Sensibilità e specificità


Benefici del sistema

Hi-Res Melting• Hi-Res Melting utilizzando strumenti per real-time PCR– Gli strumenti per real-time PCR in commercio non

permettono il controllo preciso della temperatura, l’acquisizione della totalità dei dati e non sono dotati di un software di analisi che garantisca un corretto sviluppo del metodo.

Caratterisica LightScanner

Piattaforme Real-time

Risoluzione Alta Bassa

Software di analisi specifico per la Hi-Res Melting

Sì No

Compatibilità con la fluorescenza

Sì Non tutti sono compatibili con il dye LCGreen

Risultato in 5 minuti >30 minuti


Curve melting normalizzate di un amplicone di 110-bp in presenza del dye LCGreen Plus. I dati mostrano i vantaggi del sistema Hi-Res Melting. I profili reali di Hi-Res Melting permettono la distinzione tra campioni wild type (AA) in verde, mutanti eterozigoti (AT) in blu e mutanti omozigoti (TT) in rosso.

• La capacità dell’analisi di melting dipende direttamente dalla risoluzione dello strumento utilizzato

• La precisione delle curve di melting permette l’identificazione di campioni genotipicamente diversi tra loro

Benefici del sistemaHi-Res Melting

HR-1 Instrument Commercial Real-Time PCR Instrument

HR-1 Instrument Commercial Real-Time PCR Instrument


Presupposti:DHPLC a 2 temperatureSequenziamento in una direzione con utilizzo del sequenziatore a 48 capillari e del software per la rilevazione

Tempo necessario per processare 96 campioni

Data Taken from Dr C Taylor: Cancer Research UK Clinical Centre, St James's University Hospital, Leeds, UK

Processamento del campione


Costi per DHPLC, FSSCP e sequenziamento basati sui costi reali per campioni processati nel biennio 2002-2003. Costi per la Hi-Res Melting basati sul costo reale e stimato dei consumabili

Data Taken from Dr C Taylor: Cancer Research UK Clinical Centre, St James's University Hospital, Leeds, UK

Costi


È possibile eliminare il 99% dei sequenziamenti?

Scanning dei frammenti di PCR per le varianti

Sequenziamento del DNA

~1% Non identificato

Genotipizzazione con sonda non marcata delle varianti note

Variante genotipizzata

~ 9% Identificato

~ 90% Normale

~10% Anomalo

Wild type


Conclusioni

• Nel sistema LightScanner sono già incluse tutte le componenti necessarie al successo nelle applicazioni Hi-Res Melting – Dye LCGreen Plus– Master Mix per LightScanner– Strumento LightScanner

• Software disponibile per la progettazione di test, la rilevazione delle mutazioni e la genotipizzazione

– Protocolli on-line• Risparmio di tempo e denaro• Alta resa nella rilevazione delle mutazioni

e nello scanning dei geni


Per maggiori informazioni sul sistema LightScanner

Vi preghiamo di contattare:

Labogen S.r.l. (distributore per l’Italia)Tel.: 02.9390.7515 – Fax: 02.9390.9417

[email protected]

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