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Diseño de cebadores degenerados para lacaracterización de genes en Musa

Degenerated primers design for genecharacterization in Musa

C. Giménez-Alvarado y M. Colmenares-Esqueda

Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias, Uni-versidad del Zulia, Sector Grano de Oro, Edif. A1, piso 3, Laboratoriode Biotecnología Vegetal. Apto. 506, Maracaibo 4002, Venezuela.

Resumen

Existe gran cantidad de información de secuencias de ADN y proteínas conestudios funcionales en diferentes plantas modelo (Arabidopsis thaliana, Medicagotruncatula) y de interés agrícola (Orysa sativa, Solanum lycopersicum). Estainformación,disponible en las bases de datos en internet,ofrecen una excelenteplataforma bioinformática para el diseño de cebadores degenerados que permitanla amplificación de genes homólogos de interés, en especies vegetales cuyos genomasson totalmente desconocidos. En esta investigación se planteó el uso de la estrate-gia CODEHOP para el diseño de cebadores y su validación como herramientapara la caracterización de genes homólogos relacionados con la floración en Plá-tano Hartón Enano. Con este software se diseñaron y sintetizaron 13 oligos dege-nerados, seis para el gen “Flowering Locus T” (FT) y siete para el gen “CONSTANS”(CO) de los cuales se probaron 36 posibles combinaciones para FT y 49 para CO.Con estas combinaciones se lograron identificar y secuenciar tres genes análogosa FT y uno para CO en DNA genómico de Musa AAB Plátano Hartón Enano, conlo que se demostró la aplicabilidad de esta estrategia para la caracterización degenes relacionados con la floración en Musa (AAB) cv. Plátano Hartón Enano.Palabras clave: CODEHOP, genes de floración, genes homólogos, PCR, Pláta-no Hartón Enano.

Recibido el 11-11-2014 Aceptado el 19-5-2015Autor de correspondencia e-mail: [email protected]

Giménez-Alvarado y Colmenares-Esqueda

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Abstract

The huge amount of DNA and protein sequence information with functionalstudies from model (Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula) and crop (Orysasativa, Solanum lycopersicum) plants available in different databases offer anexcellent bioinformatics platform to design degenerated primers for PCRamplification of homologous genes from crops plants with unknown genomes.This research shows the use of CODEHOP strategy for primer design and itsvalidation as a tool for characterization of flowering time homolog genes of DwarfHarton Plantain. With this software 13 degenerated primers were designed andsynthesized, six for Flowering Locus T (FT) and seven for CONSTANS (CO)gene, which were tested in 36 possible combinations for FT and 49 for CO. Withthese combinations it was able to identify and sequence three genes analogous toFT and one for CO from genomic DNA of Dwarf Harton Plantain, showing theapplicability of this strategy for characterization of flowering genes of Musa (AAB)cv. Dwarf Harton Plantain.Key words: CODEHOP, Flowering genes, Homologous genes, PCR, Dwarf HartonPlantain.

Introducción

La secuencia de genomas comple-tos y la gran cantidad de informaciónsobre aspectos funcionales de secuen-cias genéticas, en diferentes plantasmodelos (Arabidopsis thaliana ,Medicago truncatula) y de interés agrí-cola (Orysa sativa, Solanumlycopersicum) ofrecen una excelenteplataforma bioinformática para el di-seño de cebadores, que permitan la am-plificación de genes de interés en otrasespecies vegetales, cuyos genomas sontotalmente desconocidos. Kanazin etal. (1996) reportaron por primera vez,el uso de cebadores degenerados parala caracterización de genes análogos deresistencia a enfermedades producidaspor bacterias y hongos en plantas desoya, a partir de información de se-cuencias conocidas de estos genes entabaco (gen N), arabidopsis (RPS2) ylinasa (L6), demostraron que estos

Introduction

The sequence of completegenomes and the big quantity ofinformation about the functionalaspects of genetic sequences in differentmodel plants (Arabidopsis thaliana,Medicago truncatula) withagricultural interest (Orysa sativa,Solanum lycopersicum) offer anexcellent bioinformatics platform forthe design of primers that allow theamplification of genes with interest inother vegetable species, which genomesare totally unknown. Kanazin et al.(1996) reported for the first time theuse of degenerated primers for thecharacterization of analogue genes ofresistant to diseases produced by bac-teria and fungi in soybean plants afterthe information of sequences known ofthese genes in tobacco (N gene),Arabidopsis (RPS2) and linasa (L6),showed that these resistant genes

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genes de resistencia presentaron domi-nios de aminoácidos altamente conser-vados, inclusive entre especies de plan-tas muy distantes. Esta informaciónpodría utilizarse como herramientapara el diseño de cebadores para am-plificar, clonar y secuenciar geneshomólogos en diferentes especies.

Rose et al. (1998) desarrollaronun software para el diseño de cebadoresllamado CODEHOP (según sus siglasen inglés, Consensus DegenerateHybrid Oligonucleotide Primers) queha sido utilizado desde entonces parala identificación y caracterización degenes ortólogos y parálogos en diferen-tes plantas (Drabešová et al., 2014,Morant et al., 2002), animales y espe-cies bacterianas (Chakravorty yVigoreaux, 2010). Con este software sediseñan cebadores altamente degene-rados en la región 3', basándose en lainformación de secuencia de al menostres o cuatro aminoácidos presentes enbloques conservados (http://blocks.fhcrc.org/codehop.html) que sonconstruidos mediante el alineamientodel mismo tipo de proteína en diferen-tes especies. El resto del cebador hacia5' no es degenerado y se diseña en fun-ción de los nucleótidos más probablesque se encuentran en las bases de da-tos, según su posición y secuencia en-tre los ADNs comparados.

En musáceas la estrategia parala caracterización de genes se ha va-lido de cebadores degenerados diseña-dos previamente para otras especies(Kanazin et al., 1996). Backiyarani etal. (2013) utilizaron esta estrategia ysecuenciaron genes de resistencia tipoNBS-LRR en Musa spp., y reportaronsus patrones de expresión durante lainfección con Pratylenchus coffeae.

presented highly conserved aminoacids, even between very distantplants. This information might be usedas a tool for designing primers toamplify, clone and sequence thehomologue genes in different species.

Rose et al. (1998) developed thesoftware for designing primers calledCODEHOP (named after the Englishacronym Consensus DegenerateHybrid Oligonucleotide Primers),which has been used ever since foridentifying and characterizing theorthologues and paralogues genes indifferent plants (Drabešová et al.,2014, Morant et al., 2002), animalsand bacterial species (Chakravorty andVigoreaux, 2010). With this software,highly degenerated primers aredesigned in the region 3', based on thesequence information taken from threeto four amino acids present inconserved blocks (http://blocks.fhcrc.org/codehop.html) builtafter the alignment of the protein indifferent species. The rest of the pri-mer until 5' is not degenerated and isdesigned in function of the nucleotidesthat are more likely to be in thedatabase, according to the position andsequence between the DNAs compared.

In musaceae, the strategy forcharacterizing the genes has validatedfrom degenerated primers previouslydesigned for other species (Kanazin etal., 1996). Backiyarani et al. (2013)used this strategy and sequenceresistance genes type NBS-LRR inMusa spp., and reported theirexpression pattern during the infectionwith Pratylenchus coffeae.

Other strategies for the design ofdegenerated primers have been usedfor characterizing different gene


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Otras estrategias para el diseño decebadores degenerados se han utilizadopara la caracterización de diferentes fa-milias de genes en Musa. Chee et al.(2011), reportaron un estudio compara-tivo de genes argonautas en Musa spp.y demostraron la presencia del motivoconservado Ago-7 PIWI. Un año despuésMlalazi et al. (2012), lograron publicarla secuencia de fitoeno sintasa y suspotenciales secuencias regulatorias. Sinembargo, ninguna de estas publicacio-nes describió la estrategia de diseño delos cebadores degenerados.

En este trabajo, el principal obje-tivo fue detallar paso a paso la estrate-gia de diseño de los cebadores degenera-dos mediante el software CODEHOP ydemostrar su aplicabilidad en la carac-terización de genes relacionados con lafloración en musáceas.

Materiales y métodos

Secuenciación de genes aná-logos a FT y CO en ADN de MusaAAB “Plátano Hartón Enano”

Extracción del ADNgenómico

Se realizó una extracción de ADNa pequeña escala, a partir de 100 mgde hojas frescas congeladas y tritura-das en nitrógeno líquido según la me-todología del Bromuro deHexadeciltrimetilamonio (CTAB)(Doyle y Doyle, 1990), con las modifi-caciones incorporadas por Giménez etal. (2008).

Diseño de cebadores degene-rados

Se realizó una búsqueda exhaus-tiva en bases de datos de secuenciasde nucleótidos y proteínas de los genesCONSTANS (CO) y Flowering locus

families in Musa. Chee et al. (2011),reported a comparative research ofargonauts genes in Musa spp. andshowed the presence of the conservedAgo-7 PIWI. A year later, Mlalazi etal. (2012), published the sequence ofphytoene synthase gene and itsregulatory potential sequences.However, none of these publicationsdescribed the design strategy ofdegenerated primers.

In this research, the mainobjective was to detail step by step thedesign strategy of degenerated primersusing the software CODEHOP and toshow its applicability in thecharacterization of flowering genes inmusaceae.

Materials and methods

Sequencing of FT and COgenes analogue in Musa AAB“Dwarf Harton Plantain DNA”

DNA extraction wasperformed

Was realized at a small scalefrom 100 mg of fresh frozen leaves andcrushed in liquid nitrogen followingthe hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB) methodology (Doyleand Doyle, 1990), with themodifications incorporated by Giménezet al. (2008).

Design of degeneratedprimers

An exhaustive search wasconducted in databases of nucleotideand proteins sequences of genes likeCONSTANS (CO) and Flowering locusT (FT), related to the process of floraltransition in different plant species.The search for these genes thatregulate flowering was carried out with

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T (FT), relacionados con el proceso detransición floral en diferentes especiesvegetales. La búsqueda de estos genesque regulan la floración, se realizó conel software disponible en la página Webdel “National Center of BiotecnologyInformation” (NCBI, según sus siglasen inglés) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html).

Genes tipo CO y FT reportadospara arabidopsis, arroz, maíz y ceba-da con estudios funcionales que los aso-ciaran al control del tiempo de flora-ción (Griffiths et al., 2003; Peerapat,2005)se usaron para generar gruposhomólogos de secuencias usando el soft-ware “Basic Local Alignment SearchTool” (BLAST- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)(Altschul et al., 1997), contra bancosde secuencias de proteínas. Luego es-tos grupos de secuencias relacionados,se alinearon mediante el softwareClustaW v 1.83 (Jeanmougin et al.,1998). A continuación, este formato desecuencias alineadas se usó como en-trada para encontrar bloques de se-cuencias consenso o conservadas me-diante el programa “Blocks MultipleAlignment Processor” (http://b l o c k s . f h c r c . o r g / b l o c k s /process_blocks.html) (Henikoff et al.,1999).

Estas regiones conservadas fue-ron utilizadas para el diseño de loscebadores degenerados con el softwareCODEHOP (Roseet al., 1998) (figura1, cuadro 1).

Condiciones para la PCRLos ciclos de temperatura necesa-

rios para la reacción de PCR, se realiza-ron en un termociclador BioRAD mode-lo i-Cycler. La enzima utilizada fue la

the software available on the websiteof the “National Center ofBiotechnology Information” (with theEnglish acronym NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html).

Gene type CO and FT reported forarabidopsis, rice, corn, and barley withfunctional studies that associate themwith the control of flowering time(Griffiths et al., 2003; Peerapat, 2005)were used to generate sequencehomologous groups using the software“Basic Local Alignment Search Tool”(BLAST - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Altschul et al., 1997),against banks of protein sequences.Then these related groups of sequences,were aligned using ClustaW softwarev 1.83 (Jeanmougin et al., 1998).Subsequently, this aligned streamingformat was used as input to find blocksof consensus or conserved sequencesthrough the program “Blocks MultipleAlignment Processor” (http://blocks.fhcrc.org/blocks/processblocks.html) (Henikoff et al., 1999).These conserved regions were used forthe design of the degenerate primerswith the CODEHOP software (Rose etal., 1998) (figure 1, table 1).

Conditions for the PCRThe temperature cycles required

for PCR reaction were carried out in athermal cycler, BioRAD model i-Cycler. The enzyme used was Taqpolymerase Platinum Invitrogene,with an initial desnaturalization of 2min at 94ºC for achieving a “Hot start”,the rest of the cycle was carried outwith a “touchdown” strategy accordingto Don et al. (1991), starting at 60ºCas initial coupling temperature of thedegenerated primers during 18 cycles,


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Figura 1. Bloque conservado de amino ácidos generado por “BlocksMultiple Alignment Processor” al alinear y compararsecuencias de proteínas de diferentes especies de plantas conClustaW (1.83), a partir de bases de datos en línea con elbuscador BLAST, para el diseño de cebadores anidadosdegenerados con el software CODEHOP. La zona sombreadarepresenta la región degenerada en dirección 3´ de uno de loscebadores anidados. Nucleótidos: Y: citosina o timina, N:adenina, guanina, citosina o timina. Aminoácidos: E: ácidoglutámico, S: serina, M: metionina, L: leucina, N: asparagina,A: alanina, P: prolina.

Figure 1. Conserved block of generate amino-acids by Blocks MultipleAlignment Processor, aligning and comparing proteinsequences of different plant species with ClustaW (1.83), afteronline data bases with the BLAST finder, for the design ofdegenerate primers with the CODEHOP software. Theshadowed area represents the degenerate region in 3’ directionof one of the primers. Nucleotides: Y. cytosine or thymine, N:adenine, guanine, cytosine or thymine. Amino acids: E:glutamic acid, S: serine, M. methionine, L: leucine, N:asparagine, A: alanine, P: proline.

CEBADORES ANIDADOS EN BLOQUE CONSERVADO

Taq Polimerasa Platinum Invitrogene,con una desnaturalización inicial de 2min a 94ºC para lograr un “Hotstart”,el resto del ciclado se realizó con una es-trategia “touchdown” según Donet al.(1991), comenzando en 60ºC como tem-peratura inicial de acoplamiento de loscebadores degenerados durante 18 ciclospara luego descender la temperatura -0,5ºC por cada ciclo hasta alcanzar 54°Cluego de 12 ciclos (figura 2). Seguidamen-te, una última extensión a 72ºC duran-te 10 min para favorecer el clonaje delos fragmentos de PCR en el vectorpCR®4-TOPO®.

Luego de la PCR, los productosde amplificación fueron resueltos en

then the temperature descended until- 0.5ºC per cycle until reaching 54ºCafter 12 cycles (figure 2). Then, a finalextension at 72ºC for 10 min to favorthe cloning of PCR fragments in thevector pCR®4-TOPO®.

After the PCR, the amplificationproducts were resolved in 1.5% agarosegels in Tris Base (89 mM), Boric acid(89 mM), EDTA pH= 8 (2 mM) (TBE1X) stained with an Ethidium Bromidesolution (0.5 μg.L-1). Stained gels wereobserved in an UV light trans-illuminator at 392 nm. Subsequently,the PCR band was selected to sequencebased on the expected size according tothe degenerated primers design. Later,

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Cuadro1. Cebadores degenerados diseñados sobre secuenciasconservadas de los genes Flowering Locus T y CONSTANSensayados en Musa AAB Plátano Hartón Enano.

Table 1. Degenerate primers designed on conserved secuences ofFlowering Locus T and CONSTANS genes essayed in MUSAAAB Dwarf Harton Plantain.

Código Secuencia Tm ºC

FLT-1F 5'-CGGACCTTCTACACCCTGGTnatggtngayc-3' 62,3FLT-2F 5'-CCTTCTACACCCTGGTGatggtngaycc-3' 62,4FLT-3F 5'-CCTTCTACACCCTGGTGATGgtngayccnga-3' 62,4FLT-1R 5'-GGACTCCCGCTGGcarttrwarwa-3' 60,5FLT-2R 5'-GCCGGACTCCCGCtgrcarttrwa-3' 62,7FLT-3R 5'-CGCAGCCGGACTCCckytgrcartt-3' 62,7CO-2F 5'-AACCGGGTGGCCTCCmgncaygarmg-3' 60,4CO-1F 5'-CGCCTACCTGTGCGCCwsntgygayrc-3' 62,7CO-3F 5'-CGGGTGGCCTCCCGncaygarmgng-3' 63,5CO-4F 5'-TGGCCTCCCGGcaygarmgngt-3' 60,4CO-1R 5'-CTTCTGGAACTTCCGGGTCtkyttyttytc-3' 60,6CO-3R 5'-CAGCACCCGGGCCtcnckntcywt-3' 62,0

Figura 2. Perfil de termociclado utilizado para las amplificaciones degenes análogos de floración en Musa AAB Plátano HartónEnano.

Figure 2. Thermal-cycle profile used for the amplifications of floweringanalogues genes in Musa AAB Dwarf Harton Plantain.

geles de agarosa al 1,5% en Tris Base(89 mM), ácido Bórico (89 mM), EDTApH= 8 (2 mM) (TBE 1X) teñidos conuna solución de Bromuro de Etidio (0,5μg.L-1). Los geles teñidos se observa-ron en un transiluminador de luz UVa 392 nm. Posteriormente se seleccio-nó la banda de PCR candidata a

it was proceeded to purify from theagarose, cloning and transformation inchemically competent E. coli DH5α-T1R (Invitrogene). The DNA recoveryof agarose gels was done using the QGkit (QIAGEN) following the manualindications of the distributing companyQUIAGEN www. quiagen.com/.


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secuenciar con base al tamaño espera-do calculado según el diseño de loscebadores degenerados. Después seprocedió a su purificación a partir dela agarosa, clonaje y transformaciónen E. coli DH5α-T1R químicamentecompetente (Invitrogene).

La recuperación del ADN de losgeles de agarosa se realizó mediante eluso del kit QG (QIAGEN), siguiendolas indicaciones del manual de uso dela compañía distribuidora QIAGENwww.quiagen.com/.

Procedimiento de ligación envector pCR®4-TOPO® (Invitrogene)

El procedimiento de clonaje quese utilizó, se basó en la propiedad de laenzima Taq DNA polimerasa, la cualcolocó después de cada fase de exten-sión, una adenina en los extremos delos fragmentos amplificados, lo que ge-neró extremos cohesivos en el fragmen-to de PCR y el vector presentó extre-mos libres de timina en el sitio de liga-ción. El kit TOPO de Invitrogene, seutilizó para ligar el fragmento de ADNamplificado por PCR, donde la enzimaADN topoisomerasa permitió la liga-ción del fragmento de PCR al vectorpCR®4-TOPO® en solo 5 min. El proce-dimiento para la ligación se realizósegún las indicaciones del manual deuso de la compañía Invitrogen (http://www.invitrogen.com/). Una vez realizadala ligación se procedió a la transformacióndel vector pCR®4-TOPO® con el inserto deinterés en bacterias E. coli DH-5α.

Transformación de bacteriasquímicamente competentes

Para la transformación de bac-terias químicamente competentes DH-5α, se aplicó el protocolo de choque tér-mico en cloruro de calcio según la casadistribuidora Invitrogene. Después de

Ligation procedure in vectorpCR®4-TOPO® (Invitrogene)

The cloning procedure used wasbased on the property of the Taq DNApolymerase enzyme, which placed aftereach extension phase an adenine in theends of the amplified fragments,causing cohesive extremes in the PCRfragment, and the vector presented atail ends of thymine for ligation. TheTOPO kit of Invitrogene was used toligate the DNA fragment amplified byPCR, where the DNA topoisomeraseenzyme allowed the ligation of the PCRfragments to the vector pCR®4-TOPO®

in only 5 min. The procedure for theligation was performed according tothe instructions of the manual of theInvitrogen company (http://www.invitrogen.com/). Once theligation is done, it was proceeded to thetransformation of the vector pCR®4-TOPO® with the ligated PCR fragmentin E. coli DH-5α bacteria.

Transformation ofchemically competent bacteria

For the transformation ofchemically competent bacteria DH-5α, the thermal shock protocol incalcium chloride was appliedaccording to the house distributorInvitrogene. After obtaining a goodnumber of isolated colonies (PCRfragment library), it was proceeded toamplify the greatest number ofisolates by colony PCR using the uni-versal primers T3 and T7, whichflanked the site of cloning vectorpCR®4-TOPO® (Invitrogene).

PCR of bacterial coloniesThe PCR of bacterial colonies

consisted of a PCR reaction, using astemplates the bacteria that adheredwhen picking a colony with the tip of

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obtener un buen número de coloniasaisladas (librería del fragmento dePCR), se procedió a la amplificación delinserto del mayor número de coloniasaisladas mediante PCR en colonia,usando cebadores universales T3 y T7que flanquearon el sitio de clonaje delvector pCR®4-TOPO® (Invitrogene).

PCR de colonias bacterianasLa PCR de colonias bacterianas,

consistió en una reacción de PCR,usando como templado las bacteriasque se adhirieron al picar una coloniacon la punta de la micropipeta, la cualse replicó en una placa y se le asignóun código. Luego, se lavó la punta dela micropipeta en 50 μL de agua esté-ril, usándose esta suspensión como tem-plado para la PCR. Para liberar el ADNde esta suspensión de bacterias, se ca-lentó a 98ºC por 10 min. Después serealizó una PCR usando los cebadoresuniversales T3 y T7 que flanquearonel sitio de clonaje del vector pCR®4-TOPO® (Invitrogene), para asegurarque lo analizado fuera una sola secuen-cia y no una mezcla. Luego de obtenerla amplificación del inserto, a partirdel plásmido bacteriano por PCR, seprocedió a un análisis con enzimas derestricción de corte frecuente.

Análisis de fragmentos dePCR amplificados a partir declones bacterianos aislados

Precipitación de productosde PCR

Este procedimiento se empleó paraconcentrar y purificar los fragmentos dePCR, con la finalidad de que sus compo-nentes no interfirieran con las reaccio-nes de las enzimas de restricción.

A la reacción de PCR se le aña-dió 1/10 del volumen de acetato de sodio3M a pH 4,6 y luego se añadió dos vo-

the micropipette, which wasreplicated in a plate and laterassigning a code. Then, the tip of themicropipette was washed in 50 μL ofsterile water using this suspensionas template for the PCR. To releasethe DNA of this bacteria suspension,it heated at 98ºC for 10 min.Subsequently, a PCR was performedusing the universal primers T3 andT7 that outflanked the cloning siteof the vector pCR®4-TOPO®

(Invitrogene) to ensure that the ma-terial analyzed was a single sequenceand not a mixture. After getting theamplification of the insert on thebasis of the bacterial plasmid byPCR, an analysis was carried outwith restriction enzymes of frequentcut.

Analysis of amplified PCRfragments from isolated bacterialclones

Precipitation of PCRproducts

This procedure was used toconcentrate and purify the PCRfragments, in order that thecomponents would not interfere withthe reactions of restriction enzymes.

Sodium acetate (3M, pH: 4.6) wasadded in 1/10 of the volume of PCRreaction; subsequently, two volumes of95% ethanol were added and mixed invortex until precipitating the DNA at-20ºC for 30 min. Later, it centrifugedat 14.000 xg for 15 min and thesupernatant was carefully aspiratedwith a micropipette, removing theliquid completely. Then, the pellet waswashed with 250 μL of 70% ethanoland the ethanol was carefully aspiratedwith a micropipette and let it dry byevaporation. Finally the pellet was


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lúmenes de etanol 95% y se mezcló envórtex para seguidamente precipitar elADN a –20ºC durante 30 min. Poste-riormente se centrifugó a 14.000 xgpor 15 min y se aspiró cuidadosamen-te el sobrenadante con unamicropipeta, removiendo el líquidocompletamente.

Posteriormente el precipitado selavó con 250 μL de etanol 70% y seaspiró cuidadosamente el etanol conuna micropipeta y se dejó secar porevaporación. Por último se resuspendióel precipitado en 20 μL de agua desti-lada estéril.

Luego que se purificaron los pro-ductos de PCR, se procedió a digerir-los con enzimas de restricción de altocorte, HINF I, RSA II, DRA I, quereconocieron cuatro pares de bases,según indicaciones del distribuidor.Los patrones de restricción obtenidos,se agruparon con la ayuda de undendograma que permitió seleccionarlas secuencias según su patrón de res-tricción.

SecuenciaciónPara la secuenciación se seleccio-

naron fragmentos de PCR de cada gru-po del dendograma y se amplificaron porPCR de colonias bacterianas, usandocebadores universales T3 y T7. Luegose purificaron con el kit QIAGEN paraproductos de PCR, descrito anteriormen-te y se procedió a su secuenciación enun secuenciador automático de la com-pañía “Eurofins Genomics” (http://www.eurofinsgenomics.com/). Obteni-dos los resultados de la secuenciagenética de los materiales amplificadospor PCR, se contrastaron con los ban-cos de datos de nucleótidos y proteínaspara verificar si lo clonado realmentefue un análogo de floración en Musa.

suspended in 20 μL of sterile distilledwater. After purifying the PCRproducts, it was proceeded to digestthem with high cut restrictionenzymes, HINF I, RSA II, DRA I,that recognized four base pairs,according to the indications of thedistributor. The restriction patternsobtained were grouped with the aidof a dendrogram that allowedselecting the sequences according totheir restriction pattern.

SequencingFor sequencing, the PCR

fragments were selected from eachgroup of the dendrogram and wereamplified by PCR of bacterial coloniesusing universal primers T3 and T7.Then were purified with the QIAGENkit for PCR products, as describedabove and proceeded to its sequencingin an automatic sequencer of thecompany “Eurofins Genomics” (http://www.eurofinsgenomics.com/). Theresults of the genetic sequence of thePCR-amplified materials werecontrasted with the data banks ofnucleotides and proteins to verify if thecloned was really a flowering analoguein Musa. After being cloned andsequenced, these results werecontrasted in different databases andanalyzed with the NCBI-blast2program searching for homologoussequences. These analyzes were basedon indexes calculated by algorithmsthat estimated the “E” probability(table 2 and 3) that a sequence seemsto another by pure coincidence, whichmade it possible to infer whether thesequence might have some functionalrelationship to its counterpart alreadyreported in the database.

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Luego de clonados ysecuenciados, estos resultados fueroncontrastados en diferentes bases dedatos y analizados con el programaNCBI-Blast2 en búsqueda de secuen-cias homólogas. Estos análisis se ba-saron en índices calculados poralgoritmos que estimaron la probabi-lidad “E” (cuadro 2 y 3) de que una se-cuencia se pareciera a otra por puracoincidencia, lo que permitió inferir sila secuencia podría tener alguna rela-ción funcional a su homóloga ya repor-tada en la base de datos.

Resultados y discusión

Diseño de cebadores degene-rados

En total se diseñaron y sintetizaron13 cebadores degenerados, seis para FT ysiete para CO, de los cuales se probaron36 posible combinaciones para FT y 49para CO. Con estas combinaciones se lo-graron secuenciar tres genes análogos aFT y uno para CO en DNA genómico deMusa AAB Plátano Hartón Enano.

Cuadro 2. Análisis BLASTX de las secuencia MUSAFLT2 (DQ153047).

Table 2. BlastX analysis of the MUSAFLT2 sequence (DQ153047).

DB:ID Descripción a.a. Indice Ident% Posit% E

Q76CC3_POPNI Flowering locus T. 174 351 90 91 6e-41Q84XL0_SOLLC SP3D. 177 350 86 91 7e-41Q76BW3_POPNI Flowering locus T. 174 350 90 91 7e-41Q6R3R0_POPDE Floweing locus T 174 350 90 91 7e-41A8WES6_MAIZE ZCN15. 177 341 87 90 9e-41Q93WM7_ORYSI Hd3a protein. 179 340 86 91 7e-31

Leyenda: Amino ácidos (a.a), índice de similitud basado en una matriz BLOSUM62 (Índice),Porcentaje de identidad (Ident%), Porcentaje de amino ácidos positivos (Posit%) y probabilidadde coincidencia por casualidad con la secuencia problema (E).

Results and discussion

Design of degenerate primersIn total 13 degenerate primers

were designed and synthesized, six forFT and seven for CO, out of which weretested 36 possible combinations for FTand 49 for CO. With thesecombinations were achieved threesequencing genes similar to FT andone for CO in genomic DNA of MusaAAB Dwarf Harton Plantain.

The combinations of degenerateprimers that originated positivesequences for these genes were:

Gen FT: FT-1F: 5'-CGGACCTTCTACACCCTGGTnat ggtngayc-3'

FT-3R: 5'-CGCAGCCGGACTCCckytgrcartt-3';

Gen CO: CO-1F: 5'-CGCCTACCTGTGCGCCwsntgygayrc-3'

CO-2R: 5'-GATCCGCGGCCGGryytcngcrta-3'

Analysis of the sequencesobtained by amplification usingthe degenerate primers designedby CODEHOP in Musa spp.


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Las combinaciones de cebadoresdegenerados que originaron secuenciaspositivas para estos genes fueron:

Gen FT: FT-1F: 5'-CGGACCTTCTACACCCTGGTn atggtngayc-3'

FT-3R: 5'-CGCAGCCGGACTCCckytgrcartt-3';

Gen CO: CO-1F: 5'-CGCCTACCTGTGCGCCwsn tgygayrc-3'

CO-2R: 5'-GATCCGCGGCCGGryytcngcrta-3'

Análisis de las secuenciasobtenidas por amplificación uti-lizando los cebadores degenera-dos diseñados por CODEHOP enMusa spp.

Estas combinaciones decebadores degenerados, permitieron laamplificación de bandas; sin embargo,solo para los cebadores de CONSTANSel tamaño teórico estimado de las ban-das (~ 800 pb) coincidió con el amplifi-cado.

Basado en el análisis BLAST,se encontró que los productos dePCR secuenciados eran análogos agenes de floración en otras especiesde plantas, monocotiledóneas comoarroz, avena y maíz y dicotiledóneascomo arabidopsis entre otras (cua-dro 2 y 3).

Cuadro 3. Análisis BLASTX de las secuencia MUSACO1 (DQ153049).

Table 3. BLASTX analysis of the MUSACO1 sequence (DQ153049).

DB:ID Descripción a.a. Índice Ident% Posit% E

Q7XQH7_ORYSJ OSJNBa0067K08 333 551 49 58 9e-55Q01IC4_ORYSA OSIGBa0092E01 331 551 49 58 9e-55Q8L4X3_HORVD CONSTANS-like. 323 548 48 57 2e-54

Leyenda: Amino ácidos (a.a), índice de similitud basado en una matriz BLOSUM62 (Índice),Porcentaje de identidad de amino ácidos (Ident%), Porcentaje de amino ácidos positivos (Posit%) y probabilidad de coincidencia por casualidad con la secuencia problema (E).

These combinations of degenerateprimers allowed the amplification ofbands; however, only for theCONSTANS primers the estimatedtheoretical size of the bands (~ 800 pb)agreed to the amplified. Based on theBLAST analysis, it was found that thePCR products that were sequencedwere analogous to flowering genes inother plant species, monocotyledonssuch as rice, oats and corn and dicotsas arabidopsis among others (table 2and 3).

The theoretical sizes of the PCRproducts were the first indication inorder to consider a band as a candidateto be sequenced. The combination ofdegenerate primers for the FT genesonly amplified a single band by reaction(523 - 514 bp), which was always of asize greater than the expected (~300bp). This phenomenon is due to thepresence of a ~212 bp intron amongthe consensus regions used to designthe degenerate primers (figure 3).

For the CO gen, the PCRamplified band corresponded to apartial exon with the expectedtheoretical size (figure 4). For the genetype FT, in plants such as O. sativa ithas at least three introns (Peerapat,

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Los tamaños teóricos de los pro-ductos de PCR fueron el primer indi-cio para considerar una banda comocandidata a ser secuenciada. La com-binación de cebadores degenerados paralos genes FT solo amplificaron una solabanda por reacción (523 - 514 pb), lacual siempre fue de un tamaño supe-rior al esperado (~ 300 pb). Este fenó-meno se debió a la presencia de unintrón de ~ 212 pb entre las regionesconsensos que fueron usadas para di-señar los cebadores degenerados (figu-ra 3). Para el gen CO, la banda de PCRamplificada correspondió a un exónparcial con el tamaño teórico esperado(figura 4). Para el gen tipo FT, en plan-tas como O. sativa tiene por lo menostres intrones (Peerapat,2005;DQ157461). Mientras que paralos tipo CO, estos tuvieron la particu-laridad que solamente se han reporta-do un intrón (Feng et al. , 2002;Q7XQH7). Por lo tanto, la probabili-dad de conseguir un intrón entre dosmotivos conservados fue muy baja, loque determinó que el tamaño teóricoestimado de las bandas fuera muy cer-cano al amplificado con los cebadoresde generados.

Análogos a FTen Musa (AAB)cv. Plátano Hartón enano.

Para el gen tipo FT, se encon-traron tres genes análogos en PlátanoHartón Enano, los cuales fueron regis-trados en la base de datos del GenBankdel NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/),como MUSAFLT1 (DQ153045),MUSAFLT2 (DQ153047),MUSAFLT3 (DQ153048).

Todos estos genes mostraron va-lores altamente significativos cuandose contrastaron en las bases de datos

2005; DQ157461). Meanwhile, for thetype CO, these had the particularitythat only one intron has been reported(Feng et al ., 2002; Q7XQH7).Therefore, the probability of getting anintron among two conserved motivewas very low, which determined thatthe theoretical size of the bandsestimated was very close to theamplified with the degenerate primers.

FT analogues in Musa (AAB)cv. Dwarf Harton Plantain

For the gene type FT, threeanalogue genes were found in DwarfHarton plantain which were recordedin the database of the NCBI GenBank(http: / /www.ncbi .nlm.nih.gov/Genbank/), as MUSAFLT1(DQ153045), MUSAFLT2 (DQ153047),MUSAFLT3 (DQ153048).

All these genes showed highlysignificant values when they werecontrasted in the databases with theBLASTX program (table 2), showingidentity values between 90 and 80%and indexes higher than 300, whichwas reflected in the low E probabilitythat these sequences are similar tothese genes by chance. These geneswere homologous to genes likeFlowering locus T, in S. lycopersicum(Q84XL0), O. sativa (Q93WM7),Populus nigra (Q76CC3), amongothers (table 2).

Possible structure of theMUSAFLT1 and MUSAFLT2 genes

An analysis of a greater amountof sequence information of genesMUSAFLT1 (523 bp) and MUSAFLT2(514 bp) showed how both genes hadthe same organization of exons andintrons, basically with variations at thelevel of the nucleotide sequence. Thestructure of these genes from 5' showed


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Figura 3. Esquema de la secuencia parcial del gen MUSAFLT1 análogoa FT. A: Secuencia nucleotídica de exones e intrones ytraducción de los marcos de lectura. B: Diagrama de la regiónsecuenciada dividida en dos exones (72 y 245 pb) separadospor un intrón de 212 pb.

Figure 3. Scheme of the partial sequence of MUSAFLT1 gene analogueto FT. A: nucleus sequence of exons and introns andtranslation of the readings. B: Diagram of the sequence regiondivided into two exons (72 and 245 pb) separated by an intronof 212 pb.

5´ 3´

B

A

MusaFLT1

Stop condonExón terminal (245 pb)

Exón (66 pb)72 pb

Intrón (212 pb)

Figura 4. Esquema de la secuencia parcial del gen MUSACO1 (778pb)análogo a CO. Secuencia nucleotídica y traducción delmarco de lectura. Dominios: B-box1, B-box 2 y CCT.

Figure 4. Scheme of the partial sequence of the MUSACO1 gene (778 pb)analogue to CO. Nucleus sequence and translation of thereadings. Domains: B-box 1, B-box 2 and CCT.

Motivo CCT

B-box 2B-box 1

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con el programa BLASTX (cuadro 2),mostrando valores de identidad entreel 90 y 80% e índices superiores a 300,lo que se reflejó en la baja probabili-dad E de que estas secuencias se pare-cieran a estos genes por casualidad.Las secuencias análogas a estos genesfueron homologas a genes tipoFlowering locus T, en S. lycopersicum(Q84XL0), O.sativa (Q93WM7),Populus nigra (Q76CC3), entre otros(cuadro 2).

Posible estructura del genMUSAFLT1 y MUSAFLT2

Un análisis de una mayor canti-dad de información de la secuencia delos genes MUSAFLT1 (523 pb) yMUSAFLT2 (514 pb) mostró como am-bos genes tuvieron la misma organiza-ción de exones e intrones, básicamentecon variaciones a nivel de la secuencianucleotídica. La estructura de estosgenes a partir de 5' mostró la secuenciaincompleta de un exónintermedio (72pb), seguida de un intrón (212 pb) y lue-go un exón terminal (245 pb) con uncodón de parada TAG (figura 3).

El Gen Hd3a (DQ157461)(Peerapat, 2005) ortólogo de FT en arroz,presentó alta homología conMUSAFLT2 (cuadro 2). Su secuenciagenómica de 3.836 pb, se transcribe enun RNA mensajero de 540 pb, para unaproteína de 180 aminoácidos (DQ157461,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).El resto de la secuencia genómica estácompuesta por al menos tres intronesy las regiones no traducidas UTRs (porsus siglas en inglés UntranslatedRegions) en 5' y 3'. Al comparar la se-cuencia de MUSAFLT2 con este genHd3a, se infiere que se debe secuenciaren dirección 5' para completar toda laregión codante del gen e identificar la

the incomplete sequence of anintermediate exon (72 bp), followed byan intron (212 bp) and then a termi-nal exon (245 bp) with a stop codonTAG (figure 3).

The Hd3a gene (DQ157461)(Peerapat, 2005) FT ortholog in ricepresented high homology withMUSAFLT2 (table 2). Its genomesequence of 3.836 pb, is transcribedinto a RNA messenger of 540 pb, for a180-amino acid protein (DQ157461,ht tp : / /www.ncbi .n lm.nih .gov /Genbank/). The rest of the genomesequence is composed of at least threeintrons and non-translated UTRsregions (for its acronym in English ofUntranslated Regions) in 5' and 3'. Bycomparing the sequence ofMUSAFLT2 with this gene Hd3a, itcan be inferred that it should besequence in the 5' direction to comple-te the entire region and identify theintron structure of MUSAFLT1 andMUSAFLT2 genes.

CONSTANS analogue inMusa (AAB) cv. Dwarf HartonPlantain

For the CONSTANS gene (CO),only one homologue of this gene wassequenced in Dwarf Harton plantain,registering it in the database of theGenBank (NCBI) as: MUSACO1(DQ153049) (778 bp).

With the BLASTX analysis itwas derived that the sequenced genewas a type CO gene, analogous to genesfrom other species such as O. sativa(Q01IC4) (Feng et al., 2002), Hordeumvulgare (Q8L4X3) (Griffith et al.,2003), etc. (table 3). The BLASTX indexvalues were high, the highest rate co-rresponded to an O. sativa gene(Q7XQH7) (Feng et al., 2002) with a


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estructura de intrones de los genesMUSAFLT1 y MUSAFLT2.

Análogo a CONSTANS enMusa (AAB) cv. Plátano HartónEnano

Para el gen CONSTANS (CO),solo se secuenció un homólogo de estegen en Plátano Hartón Enano, regis-trándolo en la base de datos delGenBank (NCBI) como : MUSACO1(DQ153049) (778 pb).

Del análisis BLASTX se derivóque el gen secuenciado fue un gen tipoCO, análogo a genes de otras especiesvegetales como O. sativa (Q01IC4)(Feng et al., 2002), Hordeum vulgare(Q8L4X3) (Griffith et al., 2003), etc.(cuadro 3). Los valores del índiceBLASTX, fueron elevados, el mayoríndice correspondió a un gen de O.sativa (Q7XQH7) (Feng et al., 2002) conun valor de 551 (cuadro 3). Este gen secaracterizó por estar compuesto por dosexones separados por un único intrón ylas regiones UTRs 5' y 3'.

En cebada (Hordeum vulgare L.)al estudiar la evolución de los genestipo CO en comparación con A.thaliana y O. sativa utilizando un aná-lisis Clustal W se mostró que estos po-drían tener hasta tres intrones(Griffith et al., 2003). Estos intronesse ubicaron entre los dominios B-box yCCT en la llamada región intermedia.En el caso descrito para el gen de arrozsolo se encontró un intrón (Feng et al.,2002, Q7XQH7) y para Musa AAB Plá-tano Hartón Enano no se detectó nin-gún intrón (figura 4), siendo toda lasecuencia un marco de lectura termi-nal, sin codón de iniciación, evidencián-dose que aún falta secuenciar hacia laregión 5' del gen para identificar elmotivo B-box1 completo y la región

value of 551 (table 3). This gene wascharacterized by being composed of twoexons separated by a single intron andthe UTRs regions 5' and 3'.

In barley (Hordeum vulgare L.)evolution studies of CO like genes incomparison with A. thaliana and O.sativa using a Clustal W analysis itwas showed that these could have upto three introns (Griffith et al., 2003).These introns were located between thedomains B-box and CCT in the so-called middle region.

In the case described for the ricegene, only one intron was found (Fenget al., 2002, Q7XQH7) and for MusaAAB Dwarf Harton Plantain noneintron was detected (figure 4), beingall the sequence a framework of ter-minal reading without starting codon,showing that it must be sequencedtoward the 5' regionz of the gene toidentify the complete B-box 1 and thepromoting region of the gene.Additionally, to continue the sequenceof the 3' region to characterize thepossible UTRs sequences in this area.

Conclusions

This research showed theapplication of the CODEHOP strategyfor sequencing genes or groups of genesin unknown genomes, takingadvantage of the information publishedin the data banks of protein sequencesin model plants with functional studies,or with completely sequence genomesfor the design of degenerate primersthat allowed sequencing genes or groupof homologous genes with flowering(MUSAFLT1, MUSAFLT2 andMUSAFLT3 and MUSACO1) in Musa(AAB) cv. Dwarf Harton Plantain.

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promotora del gen. Además, de conti-nuar la secuenciación de la región 3'para caracterizar posibles secuenciasUTRs en esta zona.

Conclusiones

Esta investigación mostró la apli-cación de la estrategia CODEHOP parasecuenciar genes o grupo de genes, engenomas desconocidos, aprovechando lainformación publicada en los bancos dedatos de secuencias de proteínas enplantas modelos con estudios funciona-les, o con genomas completamentesecuenciados, para el diseño decebadores degenerados que permitieronsecuenciar genes o grupo de geneshomólogos relacionados con la floración(MUSAFLT1, MUSAFLT2 yMUSAFLT3 y MUSACO1) en Musa(AAB) cv. Plátano Hartón Enano.

Agradecimientos

Este trabajo fue posible graciasal financiamiento de los Proyectos,FONACIT N° 2012001382 y CONDESCC-0334-13, que suministraron mate-riales y reactivos que permitieron lareapertura del laboratorio de genéticamolecular del Laboratorio deBiotecnología Vegetal de LUZ.

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Acknowledgment

This research was done thanksto the economic support provided to theFONACIT projects N° 2012001382and CONDES CC-0334-13, bysupplying materials and reactive thatallowed the re-opening of the moleculargenetics laboratory of the PlantBiotechnology Laboratory of LUZ.

End of english version

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