Differential effects of Human Differential effects of Human Papillomavirus DNA Types on p53 Papillomavirus DNA Types on p53

Tumor-Supressor Gene Apopitosis in Tumor-Supressor Gene Apopitosis in spermsperm

Lee, CA,Huang, CTF, King A, Chan PJ.

Gynecologic Oncology 85, 511–516 (2002)

Equipe: Cybelle Cristina

Maria Angélica

Papilomavirus Papilomavirus Estrutura:

DNA dupla fita circular

8 ORFs (E e L), 1 região de controle (LCR)

Capsídeo icosaédrico

Patogênese:

Infectam células basais do epitélio

Causam lesões hiperplásicas benignas

que podem evoluir para o câncer

HPVs de alto e baixo risco

Infecções latentes no epitélio e outros

tecidos

Presença do HPV no sêmen:

Alterações na motilidade do

espermatozóide (astenospermia)

Diminuição da capacidade reprodutiva

Fragmentação do DNA e apoptose em espermatozóides

p53:

Proteína nuclear que se liga ao DNA e regula

a expressão de pts envolvidas no controle do

ciclo celular

Possui três domínios: ligante ao DNA,

oligomerização e ativação da transcrição

Gene localiza-se no cromossomo 17

Encontra-se freqüentemente mutado durante infecção por HPV

HPV E6 + Ubiquitina-ligase + p53 p53

Objetivo

Determinar a integridade dos exons 5 e 8 do gene p53 de espermatozóide durante a exposição a diferentes tipos de HPV.

Materiais e Métodos

Preparação da amostra

•Amostras de espermatozóide foram coletadas de doadores HPV negativos e lavadas;

•Fragmentos de DNA de HPV dos tipos 6b/11 (157 pb), 16 (98 pb), 18 (83 pb), 31 (162 pb) e 33 (103 pb) e um fragmento controle HLA-DQA1 (242 pb) foram colocados em tubos e incubados juntos com as amostras por 24h.

Um tubo sem fragmentos de DNA também foi incubado (controle não tratado)

•Os fragmentos de DNA do HPV contém os genes E6 e E7

A integridade dos exons 5 e 8 do gene p53 foi avalida através dos ensaios DNA disc chip

Ensaio DNA Disc Chip

Descongelamento

Ressuspenção

Aquecimento p/

Desnaturação do DNA

Amplificação do DNA

Exons 5 e 8 p53

HPV e DQA

Primers antisense

Amostra não tratada

Primers sense

Marcação do DNA com corantes fluorescente

DNA fitas simples derivado amostras expostas ao DNA de HPV e DQACorante Syr Gold

DNA fitas simples derivado amostras não tratadasBisbemizide

Ensaio DNA Disc Chip

Discos de membrana confeccionados

DNA fita simples controle

DNA fita simples HPV

DNA fita simples DQA

Discos alinhados em um vidroFormação do Chip

Os discos foram analisados em um microscópio de epifluorescênciaImagens capturadas por uma câmera e gravadas em um computador

Imagens coladas para o programa Paint, convertidas em escala de cinza e analisadas

RESULTADOS

*A análise do gene P53 em esperma mostrou significante fragmentação apopitótica no exon 5 exposto ao DNA do

HPV tipo 18 acarretando uma queda na fluorescência exibida pelo exon;

*Em contraste, a exposição do DNA ao HPV tipo 16 resulta em fragmentação do DNA do exon 8 mas não do exón 5;

*O HPV dos tipos 31 e 33 não exibem fragmentação significante;

*O DNA intacto DQA1 exibe máxima fluorescência em contraste com o DNA danificado que devido a pouca hibridação exibe pouca fluorescência;

*A motilidade do espermatozóide foi reduzida na presença de fragmentos de DNA das regiões E6 e

E7em todos os tipos de HPV testados;

*A motilidade também foi reduzida na presença de fragmentos do controle positivo;

0

1

2

3

4

5

6

7

8

controle HPV 16 HPV 18 HPV6b/11

HPV 31 HPV 33 DQA1

motilidade %

deslocamento lateral dacabeça

DISCUSSÃO

* Neste estudo, fragmentos de DNA preferencialmente das regiões E6 e E7 dos genes de oncoproteínas de transformação foram utilizados para avaliar o efeito

direto na instabilidade da P53em esperma;

*A nível genômico, o efeito direto da integração do HPV no genoma do hospedeiro causando instabilidade no

gene P53 não foi claramente demonstrado, embora seja sugerida uma relação de causa e efeito;

*Embora em muitos casos o gene P53 tenha sido danificado, os dados sugerem que os danos dependem

do tipo de vírus pois estes tem alvo específico representado por importantes exons;

CONCLUSÃO

*Em suma, o presente estudo demonstrou que fragmentos das regiões E6 e E7 do DNA de HPV tipos 16 e 18 alteram a expressão dos exóns 5 e 8 do gene

da P53;

*Os HPVs tipos 31 e 33 não afetam significativamente os exóns da P53;

*A motilidade e progressão foram reduzidas em espermas expostos a fragmentos do DNA de HPV

sugerindo a diminuição da capacidade de fertilização e possibilidade de transmissão de genes modificados

pelos vírus durante a fertilização.