This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Zum Stoffwechsel des Lactobacillus bifidus\ die Umsetzung von radioaktiver uC-l-Glucose

V o n RICHARD KUHN u n d HEINZ TIEDEMANN

Aus dem Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung Heidelberg, Institut für Chemie (Z. Naturforschg. 8 b. 428—436 [1953]; eingegangen am 7. Juli 1953)

Dem Andenken an Otto Meyerhof gewidmet

Die Bildung von Essigsäure und Milchsäure aus d-GIucose und d-Galactose verläuft nicht über die Pentosen (d-Arabinose und ci-Lyxose). L. bifidus-Extrakte enthalten eine cystein-bedürftige Aldolase, deren M i c h a e l i s - M e n t e n - Konstante zu 0,003 m ermittelt wurde. Brenztraubensäure wird durch vorhandene „Milchsäuredehydrase" rasch zu Milchsäure redu-ziert. Aus radioaktiver 14C-l-Glucose bildet L. bifidus Essigsäure, die ebenso aktiv ist wie die gleichzeitig gebildete Milchsäure. Die Essigsäure entstammt, wie die Milchsäure, den C-Atomen 1 + 2 und 5 + 6 der Glucose (M e y e r h o f - Schema). Würde die Essigsäure aus den C-Atomen 2 + 3 hervorgehen, wie es bei anderen heterofermentativen Milchsäurebildnern für den Äthylalkohol nachgewiesen wurde ( G u n s a l u s - Schema), dann dürfte sie nidit radioaktiv sein. Radioaktives CO., wird von L. bifidus in Bakteriensubstanzen eingebaut.

Durch den Lactobacillus bifidus, der bei dem mit Brustmilch ernährten Säugling die Darmflora fast

vollständig beherrscht, werden aus V2 Mol. Lactose 0,7—0,9 Mol. Milchsäure und 0,9—1,2 Mol. Essig-säure gebildet. Kohlensäure wird nicht frei, auch an-dere C-l-Spaltprodukte wurden bisher nicht nach-gewiesen l ' 2 ' 3 . Er enthält keine Katalase und bil-det kein Acetylmethylcarbinol. Ammoniumsalze wer-den als Stickstoffquelle ausgenutzt4. L. bifidus ist mikroaerophil und wächst nur bei Anwesenheit von C 0 2 in der Atmosphäre.

Es interessierte nun, nach welchem Mechanismus die Bildung der Säuren durch L. bifidus erfolgt. Bis-her war nicht bekannt, ob die Milchsäure nach dem-selben Schema wie bei der Glykolyse (O. M e y e r h o f) entsteht oder ob der Abbau der Lactose durch L. bifi-dus auf einem ganz anderen Wege vor sich geht. Auf Grund einer von M e y e r h o f mit K u h n geführ-ten Diskussion5 war zu prüfen, ob nicht die durch L. bifidus gebildete Essigsäure den C-Atomen 2 u. 3 der Hexosen entstammt ( G u n s a l u s - Schema). In diesem Falle sollte bei Anwendung von Glucose,

1 R. M. T o m a r e 11 i , R. F. N o r r i s , P. G y ö r g y , J. B. H a s s i n e n u. F. W. B e r n h a r t , J. biol. Che-mistry 181, 879 [1949], — R. F. N o r r i s , T. F l a n -d e r s , R. M, T o m a r e l l i u. P. G y ö r g y , J. Bac-teriol. 60, 681 [1950],

S. O r l a - J e n s e n , The lactic acid bacteria, Erg.-Bd. Kopenhagen 1943, S. 101.

3 T. N e g r o n i u. I . F i s c h e r , Rev. del Inst. Bact. Buenos Aires 12, 276 [1944],

4 J. B. H a s s i n e n , J. Bacteriol. 62. 773 [1952], 5 R. K u h n , Angew. Chem. 64, 493 [1952].

deren C-l-Atom radioaktiv ist, inaktive Essigsäure gebildet werden.

Eine Untersuchung des Stoffwechsels des homo-fermentativen L. casei, eines Mikroorganismus, der nur Milchsäure bildet, mit Glucose, die am C-l-Atom radioaktiv markiert war, ergab, daß Lactat auf dem-selben Wege wie bei der Glykolyse gebildet wird6 . Nach M e y e r h o f entstehen die Carboxylgruppen der Milchsäure aus den C-Atomen 3 und 4 der Glu-cose, die Methylgruppen aus den C-Atomen 1 u. 6. Tatsächlich wurde nach Vergärung der radioaktiv-markierten Glucose durch L. casei die Aktivität in der Methylgruppe der Milchsäure gefunden. Dieser Chemismus der Milchsäurebildung ist aber nicht auf die homofermentativen Milchsäurebakterien be-schränkt, auch E. coli enthält die Fermente, die da-für erforderlich sind 7 , 8 . Intermediär wird von E. coli Brenztraubensäure gebildet; aus Brenztraubensäure und fixiertem C 0 2 entstehen als Endprodukte Milch-säure, Essigsäure, Äthylalkohol, Bernsteinsäure, Koh-lensäure und Ameisensäure.

Neue Gesichtspunkte erbrachte eine Arbeit von G u n s a l u s und G i b b s 9. Sie untersuchten unter anaeroben Bedingungen den Abbau von radioaktiv markierter Glucose durch Leuconostoc mesenteroides.

6 M. G i b b s , R. D u m r o s e , F. A. B e n n e 11 u. M. R. B u b e c k , J. biol. Chemistry 184, 545 [1950],

- J. T i k k a , Biochem. Z. 279, 264 [1935]. 8 M. F. U 11 e r u. C. H. W e r k m a n , J. Bacteriol.

42, 665 [1941], a I. C. G u n s a l u s u. M. G i b b s , J. biol. Che-

mistrv 194. 871 [1952],

Dieser Mikroorganismus bildet unter den gewähl-ten Versuchsbedingungen (ruhende Bakterien) aus 1 Mol. Glucose etwa 1 Mol. d(—)-Milchsäure, 1 Mol. Äthylalkohol und 1 Mol. C 0 2 . Wenn das C-Atom 1 markiert war, fand sich praktisch die gesamte Aktivität im gebildeten C O a , also abweichend von dem Schema M e y e r h o f s . Es wäre mög-lich, daß Glucose in diesem Falle zunächst zu einer Pentose abgebaut wird, die dann in ein C-2-und ein C-3-Bruchstiick gespalten wird. Pentosen werden durch L. mesenteroides und viele andere Mikroorganismen abgebaut. Neuere Versuche haben gezeigt, daß L. pentosus am C-Atom 1 radioaktiv markierte d-Xylose in d, /-Milchsäure und aktive Essigsäure spaltet. Die Essigsäure entsteht also aus den C-Atomen 1 + 2 der Xylose1 0 .

Beim aeroben Abbau von 14C-1-Glucose durch Pseudomonas saccharophila fanden E n t n e r und D o u d o r o f f ebenfalls fast die gesamte Aktivität im C 0 2 wieder11.

Eine weitere interessante Abbauweise der Glucose ist bei Clostridium thermoaceticum entdeckt wor-den12 . Dieser Mikroorganismus bildet aus 1 Mol. Glucose etwa 3 Mol. Essigsäure. Versuche mit radio-aktiv markierter Glucose und Kohlensäure haben ergeben, daß nur 2 Mol. Essigsäure aus der Glu-cose, und zwar aus C 1 + 2 und C 5 + 6, direkt ge-bildet werden. Aus C 3 + 4 entsteht C 0 2 , das aber gleich wieder fixiert und in Essigsäure umgewandelt wird. W o o d hat daraus geschlossen, daß der erste Schritt des Abbaues eine Spaltung in zwei Triosen ist, also nach dem M e y e r h o f - Schema vor sich geht.

V e r g ä r b a r k e i t v o n H e x o s e n u n d P e n t o s e n

Wir haben zunächst den Abbau verschiedener Hexosen und Pentosen durch die von uns isolierten L.bißdus- Stämme untersucht. Die Züchtung der Bakterien erfolgte unter anaeroben Bedingungen in einem halbsynthetischen Medium. Galactose und Lactose wurden zu den gleichen Produkten abgebaut. Es wurde, wie bereits bekannt, etwas mehr Essig-säure als Milchsäure gebildet. Die von unseren Stäm-men gebildete Milchsäure war in Übereinstimmung mit den Angaben der Literatur rechtsdrehend 2. Aus Glucose entstand die gleiche Menge /(+)-Milchsäure, aber weniger Essigsäure. Diese Abwei-

10 H. G e s t u. J. O. L a m p e n , J. biol. Chemistrv 194, 555 [1952].

Zucker

100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 90 mg 10 mg 90 mg 10 mg

100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg

Lactose . . . . Lactose . . . Lactose . . . . Glucose . . . . Glucose . . . . Glucose . . . . Galactose . . Lactose . . . Glucose . . . Galactose . . Galactose . . Glucose . . Glucose . . . Galactose . . Glucose . . . Galactose . . /-Arabinose* /-Arabinose*11

/-Arabinose*'1

d-Arabinose* eZ-Arabinose* d-Lyxose** d- Lyxose** /-Fucose**

3,4 3,1

3.0 3,6 3,9 4,4 3,9

3,6 3.1 4,1

3,8 1,3 1 ,1 0,45 0,53 0,61 0,42 0,31

W

3,8

5,8 3,5 1,8 2,3 3,3

5,2

6,5

+ S 3 0> :cS >1 vi 3 C <D Cfl C/3 SP'S "tn C vi C w <

7,1

3,6 1,4 5,1 6,4 2,4

5,3

0,23

0,73 0,49 0,84 0,75 0,39

0,59

* Nach Adaptation. ** Ohne Adaptation. - nicht bestimmt.

Tab. 1. Säurebildung aus Lactose, Hexosen und Pentosen. 48 Stdn. alte Kulturen (10 ccm) anaerob 37°. Alle Werte

in ccm n/10-Lösung.

chung ist, wie sich zeigte, reversibel. Mit Glucose als Substrat gewachsene Kulturen bildeten aus Lactose wieder maximale Mengen von Essigsäure. Fügte man 10% Galactose zu der Glucose hinzu, so stieg die Essigsäureproduktion, und es wurden wieder die gleichen Mengen gebildet wie bei der Vergärung von Lactose und Galactose. Außerdem entstand eine geringe Menge Ameisensäure, etwa 0,1—0,2 Mol. pro Mol. verbrauchter Hexose. Außer der Ameisen-säure war kein Spaltprodukt mit nur einem C-Atom nachzuweisen. Als Nebenprodukt fanden wir bis zu 0,1 Mol. Äthylalkohol.

Wie schon O r l a - J e n s e n 2 gezeigt hat, wird l-Arabinose ziemlich leicht angegriffen. Nach Adapta-tion wird sie etwa mit der gleichen Geschwindigkeit abgebaut wie die d- Hexosen. d-Arabinose und d-Lyxose werden wesentlich langsamer gespalten. Aus den Pentosen entstehen die gleichen Spaltpro-dukte wie aus den Hexosen: Milchsäure und Essig-säure. Die Säuremengen, die aus Hexosen und

11 N. E n t n e r u. M. D o u d o r o f f , J. biol. Che-mistry 196, 853 [1952].

12 H. G. W o o d , J. biol. Chemistry 199, 579 [1952].

Pentosen gebildet wurden, geben aus Tab. 1 hervor. Aus l-Arabinose und d-Arabinose wurde vorwiegend /( + )-Milchsäure gebildet. Nur einer von 8 unter-suchten Stämmen bildete racemisdie Milchsäure mit einem Überschuß an d(—)-Milchsäure. Der Drehungs-sinn der Milchsäure hängt nicht von der Konfigura-tion der vergorenen Zucker ab. Bei der Milchsäure-bildung wird also eine optisch inaktive Stufe durch-laufen. Da Bifidus-ZeWen eine Milchsäuredehydrase enthalten (s. u.), ist diese Zwischenstufe wahrschein-lich Brenztraubensäure.

Werden an l- oder d-Arabinose adaptierte Stämme, die als Stäbchen erscheinen, wieder in ein Medium gebracht, das Lactose als Substrat enthält, so wach-sen vielfach wieder verzweigte Formen, die fast reine /( + )-Milchsäure bilden. Einer der untersuchten Stämme bildete auch mit Z-Arabinose als Substrat viel-fach verzweigte Formen. Er zeigte schon ohne Adaptation gutes Wachstum.

Der langsame Abbau der c7-Arabinose und der <i-Lyxose ist besonders deshalb von Interesse, weil es denkbar war, daß aus d-Glucose und «^-Galactose diese Pentosen entstehen, die dann in Milchsäure und Essigsäure gespalten werden. Der langsame Abbau der beiden ci-Pentosen spricht gegen diese Annahme.

Natriumhexosediphosphat wird von den lebenden Bakterien nur sehr langsam angegriffen. E. coli und intakte Hefe greifen Hexosediphosphat ebenfalls nicht an 1 3 , 1 4 . Wahrscheinlich sind diese Organismen für den Phosphorsäureester nicht permeabel.

Spektrophotometrisch haben wir eine „Milchsäure-dehydrase" in L. bifidus nachgewiesen. Die Test-lösung enthielt Brenztraubensäure, Dihvdro-Cozymase und Bakterienextrakt. Bei Anwesenheit des spezifi-schen Fermentproteins übertrug Dihydro-Cozymase Wasserstoff auf die Brenztraubensäure. Die Abnahme der Lichtabsorption bei 340 mp wurde gemessen.

A l d o l a s e

In dem von M e y e r h o f aufgeklärten Chemismus der Milchsäurebildung hat das Enzym Aldolase eine Schlüsselstellung. Wir haben untersucht, ob L. bifidus Aldolase enthält. Der Test wurde nach zwei ver-schiedenen Methoden ausgeführt. Bei der Methode von W a r b u r g und C h r i s t i a n 1 5 wird bei der Spal-

13 L. F. L e l o i r , R. E. T r u c c o , C. E. C a r d i n i , A. C. P a 1 a d i n i u. R. C a p u 11 o , Arch. Biochemistry 24, 65 [1949],

14 C. N e u b e r g , E. F ä r b e r , A. L e v i t e u. E. S c h w e n k , Biodiem. Z. 83, 244 [1917],

tung von Hexosediphosphat entstehendes Glycerin-aldehyd-Phosphat durch im Überschuß zugesetztes oxydierendes Ferment in Gegenwart von Arseniat irreversibel zu Phosphoglycerinsäure oxydiert. Dabei entsteht Dihydro-Cozymase, deren Absorption bei 340 mp gemessen wird. Bei dem Test von S i b l e y und L e h n i n g e r 1 6 werden die Triosephosphate durch Hydrazin abgefangen und die Extinktionen der 2.4-Dinitrophenylhydrazin-Derivate der Triosen bei 540 mp gemessen.

W a r b u r g hat gefunden, daß Muskel-Zvmo-hexase zur Wirksamkeit keiner Schwermetall-Ionen bedarf, während Hefe-Aldolase durch Zn++, F e + +

und C o + + aktiviert wird. Eine Aldolase, die durch den Komplexbildner a,a'-Dipyridyl ebenfalls gehemmt wird, fanden G u n s a l u s und B a r d 17 in Clostri-dium perfringens. Dieses Ferment soll nur durch F e + + und C o + + aktiviert werden.

Wir haben in den Extrakten aus L. bifidus (s. ex-per. Teil) mit beiden Methoden Aldolase-Wirkung nachgewiesen (Tab. 2). Die Aldolase wird durch a,a -Dipyridyl gehemmt. Bei pn 7,0 beträgt die Hem-mung (0,15% Dipyridyl) etwa 5 0 % , bei pn 6,4 etwa 9 0 % . Die stärkere Hemmung bei pn 6,4 wird durch die festere Bindung der Schwermetalle durch Di-pyridyl bei saurer Reaktion verursacht. Wir haben keine Abhängigkeit der Fermentwirkung vom Sauer-stoffdruck gefunden, als wir die Wirksamkeit von Fermentlösungen, die mit Sauerstoff oder Stickstoff gesättigt waren, verglichen. Eine solche Abhängigkeit wäre zu erwarten, wenn F e + + und Co++ die Fer-mentwirksamkeit herstellen würden, da in einer Lö-sung die Eisen- oder Kobaltsalz und Cystein enthält, die Konzentration an 2- und 3-wertigen Ionen vom Sauerstoffpartialdruck abhängt1 5 . Es werden also ver-mutlich Ionen, die ihre Wertigkeit nicht ändern können, wie z. B. Z n + + , wirksam sein. Für die Wirk-samkeit der Bifidus-Aldolase ist ebenso wie für die Wirksamkeit der Aldolase aus Cl. perfringens C y -s t e i n e r f o r d e r l i c h .

Die Michaelis-Menten-Konstante der Enzym-Sub-stratbindung beträgt 0,003 m. Sie liegt in derselben Größenordnung wie die Konstanten anderer Aldo-lasen 1 6 , 1 7 .

O. W a r b u r g u. W. C h r i s t i a n , Biochem. Z. 314, 149 [1943],

16 J. A. S i b l e y u. A. L. L e h n i n g e r , J. biol. Chemistry 177, 859 [1949].

R. C. B a r d u. I. C. G u n s a 1 u s , J. Bacteriol. 59, 387 [1950],

Spektrophotometrischer Test

pH 7,0 20° 340m//

Kolorimetrischer Test Spektrophotometrischer Test

pH 7,0 20° 340m// pH 7,0 37° 540 m/i pH 6,4 37° 540 mp

Spektrophotometrischer Test

pH 7,0 20° 340m//

ohne Cystein mit Cystein mit Cystein

log io/i 30 Min. 0,327

log i0/i 60 Min. 0,596

0,065

ohne mit 0 ,15% Dipyridyl Dipyridyl

ohne mit 0,15 % Dipyridyl Dipyridyl

log io/i 30 Min. 0,327

log i0/i 60 Min. 0,596

0,065 0,511 0,265

48 % Hemmung

0,435 0,047

89 % Hemmung

Tab. 2. Aldolase*.

V e r s u c h e m i t 14C - m a r k i e r t e r G l u c o s e , E s s i g s ä u r e u n d K o h l e n s ä u r e

Durch Aldolase wird Hexosediphosphat in zwei Triosen gespalten; es blieb somit der Chemismus der Milchsäure-, Essigsäure- und Ameisensäure-Bildung aus den Triosen zu klären. Dieser Frage widmeten wir Versuche mit radioaktiv markierten Substanzen. Aus 14C -1 - G1 u c o s e (90 mg 14C-l-Glucose + 10 mg Galactose je Kultur) wurde radioaktive Milchsäure und radioaktive Essigsäure gebildet. Die Aktivitäten, gemessen in Impulsen/mMol/Min. der beiden Säuren waren etwa gleich. Jede der Säuren besaß nicht ganz die Hälfte der Aktivität der Glucose. Tab. 3 enthält ein Versuchsbeispiel. Die Milchsäure wurde durch Oxydation mit Permanganat abgebaut: die aus der Carboxylgruppe entstehende Kohlensäure enthielt keine Aktivität, während der Acetaldehyd die ge-samte Aktivität besaß. Die Methylgruppe der Milch-säure entsteht also aus den C-Atomen 1 + 6 der Hexose. Das Versuchsergebnis steht in Überein-stimmung mit dem von M e y e r h o f für die Milch-säurebildung aufgestellten Reaktionsmechanismus. Da die Essigsäure etwa die gleiche Aktivität besitzt wie die Milchsäure, muß sie ebenfalls aus den C-Atomen 1+2 und 5 + 6 der Glucose entstehen. Die Ameisensäure war nicht aktiv. Geringe Aktivität hatten das Acetontrockenpulver der Bakterien (2 bis 5 % ) und das Kohlendioxyd (2—5%). Der Äthyl-alkohol besaß keine Aktivität.

Milchsäure und Essigsäure entstehen offenbar aus einer gemeinsamen Vorstufe. Ein Versuch, bei dem eine geringe Menge Essigsäure, die in der Carboxyl-gruppe markiert war, zu einer Lactose vergärenden

Substanz o

puls

e/

lute

n /

Mol

0) 3 J2 G 3 5 3 & on 3

£ £ £ £ £ ^ 13 i ü S

Hexose verbraucht 0,50 1630 815 Milchsäure gebildet 0,40 803 321 CO-, aus -COOH der Milchsäure . 0 0 Acetaldehvd aus der Milchsäure . 773 309 Essigsäure gebildet 0,50 736 368 Ameisensäure gebildet 0,08 0 0 Bakterien (mit Aceton getrocknet) 19 Rückstand der Ätherextraktion. . . 31 CO) zugesetzt 0,098 0 CO> wiedergefunden 0,100 130 13

Tab. 3. Verteilung der Radioaktivität. 93% der eingesetz-ten Aktivität wurden wiedergefunden.

L. bifidus-Kultur hinzugefügt wurde, erbrachte einen weiteren Anhaltspunkt dafür. Etwa 12% der in der Essigsäure vorhandenen Aktivität fanden wir im C-a der Milchsäure wieder (Tab. 4). Essigsäure reagiert also teilweise zurück und wird vermutlich in die ge-meinsame C3-Vorstufe eingebaut.

In weiteren Versuchen haben wir radioaktives NaH 1 4 C0 3 zum Medium hinzugefügt. Es wird C 0 2 -ßxiert. Die Hauptmenge des fixierten C 0 2 fand sich in der Bakteriensubstanz (s. u.). Eine kleine Menge wurde in Ameisensäure und in Milchsäure eingebaut. Im Gegensatz zu den Versuchen mit 14C-l-Glucose fanden wir hier die gesamte Aktivität in der Carboxyl-gruppe der Milchsäure (Tab. 4). Aus Ameisensäure (bzw. C 0 2 ) und Essigsäure entsteht also über Zwi-schenstufen auch Milchsäure.

1 Nicht in Phenol + Wasser lösliches Zellmaterial. — - Gesamtzahl der Impulse der zugesetzten bzw. gebildeten Komponente. 3 11,6% der Essigsäure-Aktivität. — 4 Pro 100 mg.

Tab. 4. Einbau von CH314COOH und i4CO,>.

Impulse Zum Medium zugesetzt

Bakt

erie

n

Mild

r-sä

ure

(—C

OO

H

Ald

ehyd

)

Essi

g-sä

ure

Am

eise

n-sä

ure

Prot

ein

Poly-saccha-rid +

Nuclein-säuren

Rück

-st

and 1

Impulse(Gesamt)/Min.2 CH314COOH (0,1 mMol)

3516 173 4073 0 365

Impulse (Gesamt)/Min. Impulse/mMol/Min.

CuO., (0,15 mMol) 28180

1840 47 45 0 0 105 15504 10304 (800)

L i p m a n 18 setzte zu Extrakten von E. coli Brenz-traubensäure, earboxyl-markierte Essigsäure und mar-kierte Ameisensäure hinzu. Er konnte in der Car-bonyl- bzw. in der Carboxylgruppe markierte Brenz-traubensäure isolieren. Das Brenztraubensäure-Essig-säure-Austauschsystem ist auch in anderen Mikro-organismen nachgewiesen worden. Zu seiner Wirk-samkeit sind Adenosin-triphosphat und Coenzym A erforderlich.

Wahrscheinlich ist auch bei L. bifidus Brenztrauben-säure, Phosphoenol-brenztraubensäure oder Phospho-glycerinsäure, die gemeinsame Vorstufe der Milch-säure und der Essigsäure. Da keine äquivalente Menge Ameisensäure entsteht, und C 0 2 höchstens in Spuren auftritt, wird ein gewisser Teil von C-3 + 4 der Glucose zum Aufbau von Bakteriensub-stanz verwendet werden. Vielleicht hängt die geringe C02-Bildung mit der Entstehung von Pentosen aus Hexosen zusammen. Das C 0 2 erscheint aber nicht als Gas, da etwa 0,02 Mol. C 0 2 pro Mol. verbrauchter Hexose* von den Bakterien fixiert werden. Bei den Versuchen mit NaH 1 4 C0 3 enthielt das Bakterien-eiweiß die höchste Aktivität. Bei entsprechenden Ver-suchen mit E. coli fanden A b e l s o n , B o l t o n und A 1 d o u s 19 ebenfalls die größte Aktivität in der Proteinfraktion. Das Acetat war nicht aktiv. Im Gegensatz zu Cl. thermoaceticum besitzt L. bifidus also nicht die Fähigkeit, Essigsäure aus C 0 2 zu bilden.

Milchsäure und Essigsäure enthalten prozentual ebensoviel Sauerstoff wie die Hexosen, Ameisensäure

is F. L i p m a n , J. biol. Chemistry 187, 757 [1950]. * Die berechnete Menge an fixiertem C0 2 ist ein unte-

rer Grenzwert, da bei der Berechnung vorausgesetzt wird, daß COL> und 1 4C02 auch innerhalb der Bakterienzelle im Gleichgewicht stehen.

enthält dagegen pro Kohlenstoffatom ein Atom Sauerstoff mehr. Da L. bifidus unter streng anaeroben Bedingungen gezüchtet wurde, war es wahrschein-lich, daß auch Stoffe, die weniger Sauerstoff als die Hexosen enthalten, gebildet werden. In der Bak-teriensubstanz ließen sich etwa 2 ,5% Fettsäuren nachweisen, während das Medium praktisch keine Lipoide enthält. Auch der Äthylalkohol enthält weniger Sauerstoff, als der Formel CnH2nOn ent-spricht. Wie die Rechnung ergibt, können die von den Bakterien gebildeten Fettsäuren und der Äthyl-alkohol den Sauerstoffüberschuß der gebildeten Ameisensäure ausgleichen.

B e o b a c h t u n g e n m i t R e d u k t i o n s -i n d i k a t o r e n

Bei der Milchsäurebildung wird der Wasserstoff von Dihydro-Cozymase auf Brenztraubensäure über-tragen. Das Redoxpotential der Cozymase beträgt E'0 = — 0 , 2 8 2 mV (30°) 2 0 . Wir haben zu anaerob wachsenden Bifidus-Kulturen Triphenyltetrazolium-chlorid und Janusgrün zugesetzt. Aus T T C wurde tief-rotes Triphenylformazan gebildet. Janusgrün wurde bis zu einer rosa Farbtönung reduziert, die einem Gleichgewicht zwischen dem roten Diäthyl-Safranin und der Leukostufe entspricht. Das Redoxpotential des Janusgrün beträgt E'0 = — 0 , 2 6 3 mV 2 1 (korr. f. 30°), liegt also etwas höher als das Redoxpotential der Cozymase. Das Redoxpotential der Bakterien-kulturen liegt somit in einem Bereich, in dem Co-

i9 Ph. H. A b e l s o n , E. T. B o 11 o n u. E . A l d o u s , J. biol. Chemistry 198. 165 [1952].

-'OH. B o r s o k , J. biol. Chemistry 133, 629 [1940]. L. R a p k i n e , A . P . S t r u y c k u. R. W o r m s e r ,

J. Chim. physique 26, 340 [1929],

zymase und Dihydro-Cozymase nebeneinander vor-liegen können.

Beschreibung der Versuche

I s o l i e r u n g u n d Z ü c h t u n g d e r B i f i d u s -S t ä m m e

Die Bakterienstämme wurden aus frischem Stuhl 5 bis 7 Tage alter, nur mit Muttermilch ernährter Säuglinge isoliert. Die Proben wurden in dem 10-fachen Volumen physiologisdrer Kochsalzlösung suspendiert und auf Cystin-Leberagar, der 10% entrahmte Frauenmilch enthielt, aus-gestrichen. Die Züchtung erfolgte unter anaeroben Be-dingungen in einer Atmosphäre von 88% N.,, 10% CO., und 2—3% H,5. Durch glühenden Platindraht wird der Rest an Knallgas verbrannt. Zur Prüfung auf Abwesen-heit von 0 2 diente eine Lösung von Glucose, Natrium-arseniat und Methylenblau 22. Als Nährlösung verwende-ten wir das halbsynthetische Medium von T e p 1 y und E 1 v e h j e m , das von T o m a r e l l i , N o r r i s , G y ö r g y , H a s s i n e n und B e r n h a r t 1 für die Züchtung von L. bifidus modifiziert wurde. In diesem Medium wurde Natriumacetat durch Phosphatpuffer pH = 6,8 (3,53 g KH2P04 + 4,63 g Na£HP04 für 250 ccm Medium) er-setzt. Zu je 10 ccm durch Jenaer Bakterienfilter sterilisier-tem Medium wurden 10 mg sterilisiertes Natriumbicarbo-nat zugefügt. Diese Menge entspricht bei 10% CO., im Gasraum nach der Hasselbach-Hendersonschen Gleichung einem pt{ von 6,8. Das Medium wurde in gefrorenem Zu-stande aufbewahrt.

Bei den Versuchen mit 14C war es erforderlidi, die Aktivität der Kohlensäure zu messen. Um die Aktivität nicht zu verdünnen, erfolgte die Züchtung dann in einer Atmosphäre von O.,-freiem N.,. Nach 10 Min. langem Durchleiten des Stickstoffs wurden die Hähne geschlossen und das Bicarbonat aus dem Seitenarm des Gefäßes in das Medium eingekippt.

Für die Mehrzahl der Versuche verwendeten wir 10 ccm Kulturen, die 48 Stdn. bei 37° inkubiert wurden. Neue Kulturen wurden mit 0,1—0,05 ccm der 48 Stdn. incubier-ten Kulturen beimpft. Zur Bestimmung der optischen Aktivität wurde das Zinklactat aus 100—200-ccm-Kultu-ren isoliert. In einer 10-ccm-Kultur werden 15—20 mg Bakterien (Trockenpulver) gebildet. Am Ende der Ver-suche betrug der pH-Wert etwa 4,5. Ausstriche wurden nach Gram gefärbt.

M i k r o s k o p i s c h e s B i l d

Nach Gram gefärbte Ausstriche bieten ein sehr charak-teristisches Bild. Man sieht mehrmals verzweigte Stäb-chen, Y-Formen und unverzweigte Stäbchen. Die ver-zweigten Formen sind unter Versuchsbedingungen, die für eine maximale Essigsäureproduktion günstig sind,

22 J. A. U 1 r i c h u. A. M. L a r s o n , J. Bacteriol. 56, 373 [1948].

23 F. A u e r b a c h u. H. Z e g 1 i n , Z. analyt. Chem. 82, 264 [1930].

24 R. K u h n u. F. L ' O r s a , Z. angew. Chem. 44, 847 [1931].

sehr zahlreich. Mit Glucose als einzigem Substrat ge-wachsene Kulturen haben weniger verzweigte Formen und Kulturen, die Pentosen vergären, bilden nur kürzere und längere Stäbchen. In Übereinstimmung mit den Er-fahrungen anderer Untersucher1'2 gelingt es nicht immer, aus dem Säuglingsstuhl verzweigte Formen zu isolieren. Die unverzweigten Formen bilden nur Spuren flüchtiger Säuren. Zu den vorliegenden Untersuchungen wurden ausschließlich solche Stämme benutzt, die maximale Men-gen flüchtiger Säuren bilden.

A u f a r b e i t u n g d e s M e d i u m s

Die Bakterien wurden bei 5000 g abzentrifugiert. Zu je 10 ccm der überstehenden Lösung wurden 0,5 ccm konz. Phosphorsäure zugefügt und mit Wasserdampf destilliert. 150 ccm Destillat wurden unter Eiskühlung aufgefangen, unter Rückfluß und Durchleiten von N„ zur Entfernung der Kohlensäure ausgekocht und mit 1/10-n. NaOH (C02-frei, aus Öllauge bereitet) mit Phenol-phthalein als Indikator oder potentiometrisch bis p^ 8,0 titriert. Zu der neutralisierten und fast zur Trockne ein-gedampften Lösung wurden 30 ccm Wasser hinzugefügt. Ameisensäure wurde nach A u e r b a c h und Z e g 1 i n 23

gravimetrisch bestimmt. Um die 14C-Aktivität der dabei entstehenden Kohlensäure zu messen, erfolgte die Amei-sensäurebestimmung in einer von K u h n und L ' O r s a 24

und von L i e b und K r a i n i c k 2 5 angegebenen und für unsere Zwecke modifizierten Apparatur. Statt HCl und Na - Acetat verwendeten wir Posphatpuffer (900 mg KH2P04 + 125 mg Na.,HP04- 2H 2 0) . Die Kohlensäure wurde mit einem Stickstoffstrom durch eine Glassinter-platte (G 1) in n/lO-NaOH eingeleitet. Nach Zugabe von 5 ccm 0,5-m. BaCl„-Lösung wurde mit n/10-HCl unter Verwendung von Phenolphthalein und Durchleiten eines kräftigen N.,-Stromes (CO.,-frei) titriert. Das Barium-carbonat wurde nach dem Trocknen gewogen und die Aktivität bestimmt. Zu dem Filtrat des Kalomel-Nieder-schlages fügten wir 90 mg Silbersulfat, 6 ccm n/10-Bariumhydroxydlösung und 0,5 ccm Phosphorsäure, de-stillierten mit Wasserdampf, dampften das neutralisierte Destillat auf etwa 5 ccm ein und stellten mit «-Salpeter-säure pH 5,5—6.0 ein. Nach Zugabe des 5-fadhen Volu-mens gesättigter absol. alkoholischer Silbernitratlösung fällt Silberacetat. Die Essigsäure wurde außerdem durch die Lanthannitratprobe ( K r ü g e r und S c h i r s c h) identifiziert26. Der Rückstand der Wasserdampfdestilla-tion wurde in einem Kutscher-Steudel-Apparat 24 bis 72 Stdn. mit peroxydfreiem Äther extrahiert, das Zink-lactat aus der ätherischen Lösung nach P e d e r s o n , P e t e r s o n und F r e d 2 7 isoliert, umkristallisiert und bei 100° getrocknet. Aus 10-ccm-Kulturen, die 100 mg Hexosen enthielten, wurden 40—60 mg Ag-Acetat und 25—30 mg Zinklactat isoliert. Die optische Drehung des Zinklactat wird durch Zusatz von 1 ccm 24-proz. Ammo-

25 H. L i e b u. H. G. K r a i n i c k , Mikrodiemie 9, 367 [1931].

26 H. H i n s b e r g u. K. L a n g , Medizinische Che-mie, Berlin 1938, S. 132.

27 C. S. P e d e r s o n , W. H. P e t e r s o n u. E. B. F r e d , J. biol. Chemistry 68, 151 [1926].

niummolybdatlösung zu 3 ccm Lösung etwa 4-fach ver-stärkt -8.

Zinklaetat: Ber. C 29,56, H 4,13, ZnO 33,41. Gef. C 29,45, H 3,85, ZnO 33,20.

Silberacetat: Ber. C 14,08, H 1,77, Ag 64,62.

Gef. C 13,64, H 1.60, Ag 66.15.

Zinklaetat aus Glucose:

[«]D° = — 8,3° [ft]o° = — 28,8°

Zinklaetat aus Galactose:

[a]l° = - 7,5°.

Zinklaetat aus /-Arabinose:

[«]D° = + 4,5° [a]O° = + 20,0 :

Zinklaetat aus cZ-Arabinose:

[«]D° = — 4,8°. D r e h u n g s v e r m ö g e n d e r a u s P e n t o s e n

g e b i l d e t e n M i l c h s ä u r e : Zur Isolierung des Zinklactats wurden die Kulturen über 4—5 Passagen an cl- oder /-Arabinose adaptiert. Anschließend wurden sie wieder in ein Medium, das Lactose als Substrat enthielt, überimpft.

Für die spezifisdien Drehungen [a]f," (wasserfreies Salz, c ~ 2,5) wurden folgende Werte erhalten:

Medium

/-A

rabi

nose

cZ-A

rabi

nose

Lact

ose

(nac

h A

dapt

atio

n an

Z-A

rabi

nose

)

Lact

ose

(nac

h A

dapt

atio

n an

cZ-

Ara

bino

se)

Stamm VI — 4,1 — 6,5 — 7,3 — 7,9 Stamm V — 5,8 — 3,7 — 7,6 — 6,8 Stamm VII — 6,1 — 4,8 — 7,9 — 5,9

Für andere Stämme betrugen die spezifischen Drehungen des aus /-Arabinose gebildeten Zinklactats

[«]D° = - 1,6° [«]D = + 4,5° [« ]5 Ü = - 7,6°

[A]o° = — 8,20° [«]D° = — 6,3°.

Die Milchsäure wurde in 0,02—0,1 ccm Medium nach B a r k e r und S u m m e r s o n durch Oxydation zu Acet-aldehyd, der mit p-Oxybiphenyl eine rotviolette Farbe gibt, bestimmt-9. Die Zugabe der Schwefelsäure erfolgte unter Eiskühlung. Auf die Reinheit der verwendeten

28 O. M e v e r h o f u. W. S c h u l z , Biochem. Z. 297, 60 [1938].

29 J. B. B a r k e r u. W. H. S u m m e r s o n , J. biol. Chemistry 138, 535 [1941],

so G. D e n ig e s , Z. analyt. Chem. 38, 718 [1899], 31 Th. E. F r i e d e m a n n , J. biol. Chemistrv 123.

161 [1938]. 32 E. M. P. W i d m a r k , Biochem. Z. 131. 473 [1922],

Schwefelsäure muß besonderer Wert gelegt werden, da sonst eine schmutzig-grüne Farbe erhalten wird.

Im Filtrat der Zinklactat-Fällung gaben Bariumdilorid-lösung und Bleiacetat-Lösung keinen Niederschlag. Fügt man zu dem Filtrat eine schwefelsaure Lösung von Quecksilbersulfat und Kaliumpermanganat-Lösung, so ent-steht ein geringer weißer Niederschlag. Nach D e n i g e s ist die Reaktion für den Nachweis von Citronensäure charakteristisch 30. Es bildet sich eine Quecksilbersulfat-Additionsverbindung der Acetondicarbonsäure. Milch-säure gibt diese Reaktion nicht.

Alkohol wurde nach F r i e d e m a n n 3 1 isoliert und nach W i d m a r k 3 2 bestimmt. 2,078 mg Alkohol (ber. als Äthylalkohol), die in 23 ccm Lösung enthalten waren, wurden mit 5 ccm H.,S04 (1,84) und 20 ccm 5-n. Chrom-säure oxydiert. Die entstandene Säure wurde durch Wasserdampfdestillation isoliert und die neutralisierte Lösung eingedampft. Mit dem Rückstand wurde die C-Methylbestimmung nach K u h n und R o t h 3 3 ausge-führt. 4,38 ccm rc/100-Säure wurden gefunden (ber. 4,52 ccm n/100-Säure). Der Alkohol kann also nicht Methylalkohol sein, da Ameisensäure bei der C-Methyl-bestimmung zerstört wird.

Aus einem größeren Ansatz isolierten wir die bei der Oxydation mit Chromschwefelsäure entstehende Säure durch Wasserdampfdestillation und Fällung als Silber-salz (Ausb. 24 mg).

Silberacetat:Ber. C 14,08, H 1,77, Ag 64,62. Gef. C 13,83, H 1.80, Ag 65,37.

Die Blindwerte, die sich bei der Aufarbeitung des nicht inkubierten Mediums ergaben, wurden bei der Bestim-mung der flüchtigen Säuren, der Milchsäure und des Alko-hols von den Meßwerten abgezogen.

Die Gesamtlipoide der Bakteriensubstanz wurden nach L a s z t und V e r z a r 34, die Fettsäuren gravimetrisch nach S t r e e t 3 5 bestimmt: 261 mg getrocknete Bakterien ergaben 12,6 mg Gesamtlipoide (ätherlöslich) — 4,86% der Trockensubstanz und 6,80 mg Fettsäuren (Petrol-ätherauszug nach der Verseifung) - 2,6% der Trocken-substanz. Das Kulturmedium ist praktisch frei von Lipoiden. 10 g Caseinhydrolvsat (Aminovit Boehringer) enthalten 4,3 mg Lipoide.

Bei den Versuchen zum Nachweis des Einbaues von uCO., in die Bakterien wurde das Acetontrockenpulver in Polysaccharide + Nucleinsäuren und Proteine durch Fraktionierung mit Phenol und Wasser bei 68° auf-gearbeitet 36. Das ursprünglich für gramnegative Bakte-rien beschriebene Verfahren ist auch für den gramposi-tiven L. bifidus geeignet. Aus 100 mg Acetontrockenpulver erhielten wir 15 mg Proteine und 12 mg Polysaccharide + Nucleinsäure. Die Polysaceharid-Nucleinsäure-Frak-tion enthielt 5,38% N. Die in Wasser und Phenol nicht lösliche Fraktion betrug 67 mg. Wegen der geringen Sub-

33 R. K u h n u. H. R o t h , Ber. dtsch. chem. Ges. 66. 1274 [1933].

"4 L. L a s z t u. F. V e r z a r , Biochem. Z. 285. 356 [1936],

35 H. R. S t r e e t , J. biol. Chemistrv 116, 25 [1936], 36 O. W e s t p h a 1, O. L ü d e r i t z u. F. B i s t e r ,

Z. Naturforschg. 7b. 148 [1952].

mit Zusatz von Ammoniummolvbdat.

mit Zusatz von Ammoniummolvbdat.

stanzmenge war eine weitere Trennung in Polysaccharide und Nucleinsäuren nicht möglich.

F e r m e n t c h e m i s c h e M e t h o d e n

Aldolase wiesen wir durch die spektrophotometrische Methode von W a r b u r g und C h r i s t i a n 1 6 und durch die kolorimetrisdie Methode von S i b l e y und L e h -n i n g e r 1 7 nach. Das für die spektrophotometrisdie Me-thode benötigte oxydierende Ferment (Triosephosphat-Dehydrase) wurde nach C o r i , S 1 e i n und C o r i aus Kaninchenmuskeln kristallisiert37. Das dreimal umkristal-lisierte Ferment enthielt keine Aldolase. Als Cozymase verwendeten wir ein Präparat von Boehringer (75% Rein-heit).

Die abzentrifugierten Bakterien wurden mit Phosphat-puffer Ph 6,8 gewaschen und mit etwa der 5-fachen Menge Quarzsand und 0,95-proz. Natriumchloridlösung 15 Min. verrieben. 0,2—0,5 ccm des etwas opaleszenten Extraktes wurden für einen Test verwendet. Die Lösun-gen hatten folgende Zusammensetzung:

Für den spektrophotometrisehen Test Konzentration

der Stammlösung

Cozymase 0,1 ccm Kaliumhexosediphosphat . . . 0,5 ccm Oxvdierendes Ferment 0,1 ccm Natriumarseniat 0,3 ccm Cysteinchlorhvdrat 0,1 ccm Natronlauge 0,1 ccm Wasser

3-10-4-m. 0,05-m. (pH7,0)

1,7-10-2-m. 0,1-m. 0,1-m.

Gesamtvolumen: 3,0 ccm

Für den kolorimetrischen Test Konzentration

der Stammlösung

Veronalpuffer 2,4 ccm Kaliumhexosediphosphat.... 0,5 ccm Hydrazin 0,5 ccm Cysteinchlorhydrat 0,1 ccm Natronlauge 0,1 ccm Wasser

0,1-m. 0,05-m. 0,56-m. 0,1-m. 0,1-m.

Gesamtvolumen: 5,0 ccm

Durch Hydrazin werden Glycerinaldehydphosphat und Dioxyacetonphosphat im Verhältnis 1 : 1 abgefangen. Nach 30 Min. wurde das Ferment durch Trichloressig-

37 G. T. C o r i , M. W. S l e i n u. C. F. C o r i , J. biol. Chemistry 173, 605 [1947],

38 M. A. J e r m y n u. F. A. I s h e r w o o d , Biochem. J. 44, 402 [1949].

89 S. M. P a r t r i d g e , Nature [London] 164, 443 [1949].

säure inaktiviert. Zu der Vergleichslösung wurde Hexose-diphosphat erst nach dem Inaktivieren der Aldolase hin-zugefügt. Nach Zugabe von 2.4-Dinitrophenylhydrazin entsteht in alkalischer Lösung eine violette Farbe mit einem Absorptionsmaximum bei 540 mu. Bei dieser Wellenlänge ist die Farbintensität der 2.4-Dinitrophenyl-hydrazinverbindung von reinem Dioxyaceton etwa 4-mal so groß wie die von reinem Glycerinaldehyd. Bei dem Test wird die Farbe also im wesentlichen vom Dioxy-acetonphosphat gebildet.

Das Absorptionsspektrum wurde im B e c k m a n -Spektrophotometer mit dem Spektrum verglidien, das bei der Ausführung des Testes mit L e b e d e w - Saft er-halten wurde. Beide Spektren waren identisch. Der alkali-verseifbare Phosphor wurde nach M e y e r h o f und L o h m a n n , Biochem. Z. 271, 89 [1934], bestimmt.

Beispiel: In i0/i (540m,«) = 0,502; lccm der Testlösung enthält 9,5 y alkali-verseifbaren Phosphor.

Zum Nachweis der Lactase in den von uns verwende-ten Stämmen wurden 10 mg Acetontrockenpulver mit 1 ccm 10-proz. Lactoselösung 2—9 Stdn. bei 37° in-kubiert. Die Lactosespaltung wiesen wir papier chromato-graphisch nach (Schleicher & Schüll, 2043 b). Die Chro-matogramme wurden mit dem Gemisch von J e r m y n und I s h e r w o o d 3 8 entwickelt (18 Stdn. absteigend), die reduzierenden Zucker mit Anilinphthalat nachgewie-sen 39. Außer Glucose, Galactose und Lactose traten im Chromatogramm zwei langsam wandernde Komponen-ten, wahrsdieinlich Oligosaccharide, auf. Die RF-Werte dieser Komponenten betrugen das 0,21-fache bzw. 0,35-fache des Rp-Wertes der Glucose.

Isotopenmethoden. CH.,14COOH wurde aus CHjMgJ u. »CO, dargestellt 4<\ 14CH3J aus 14CH,OH nach' M e l -v i l l e , R a c h e l e und K e l l e r 4 1 . Aus d-Arabinose synthetisierten wir durch Kondensation mit 14C-Nitro-methan und Spaltung des Nitrohexit durch die N e f -Reaktion 14C-l-Glucose nach S o w d e n 4 2 . Als Kationen-austauscher verwendeten wir Nalcite HCR, als Anionen-austauscher Amberlite IR-45.

Das aus den Kulturen isolierte Zinklactat wurde, teil-weise nach Zusatz von nicht radioaktivem Z( + )-Zinklactat. umkristallisiert, bis eine konstante Aktivität erreicht war. Um festzustellen, welche C-Atome markiert waren, wurde die Milchsäure durch Kaliumpermanganat zu Kohlensäure und Acetaldehvd oxvdiert. Der Acetaldehyd wurde in 1,5-proz. Natriumbisulfitlösung, die Kohlensäure in n/10-NaOH aufgefangen. Die Acetaldehydbisulfit-Verbindung zerlegten wir durch Destillation mit Calciumcarbonat43. Das Destillat (20 ccm) wurde unter Kühlung in einem Kolben aufgefangen, der eine Suspension von 60 mg Dimedon in 5 ccm Wasser enthielt. Nach 12-stdg. Stehen-lassen bei Raumtemperatur war das Acetaldimedon aus-kristallisiert.

40 C. B a r e t u. L. P i c h a t , Bull. Soc. chim. France 18, 580 [1951].

41 D. B. M e 1 v i 11 e , J. R. R a c h e 1 e u. E. B. K e 1 -l e r , J. biol. Chemistry 169, 419 [1947],

42 J. C. S o w d e n , J. biol. Chemistry 180, 55 [1949]. 43 H. G. W o o d , C. H. W e r k m a n , A. H e m i n g -

w a y u. A. O. N i e r , J. biol. Chemistry 139, 377 [1941].

Mit Ausnahme des Acetontrockenpulvers und der Bak-terienfraktionen, die direkt gemessen wurden, wurden alle Substanzen als Bariumcarbonat getestet. Die Ver-brennung25 und der Abbau der Milchsäure erfolgten in der gleichen Apparatur wie die Oxydation der Ameisen-säure.

Zum Nachweis der /^-Strahlung diente ein Glockenzähl-rohr mit dünnem Glimmerfenster (2,5 mg/cm2). Von allen Meßwerten wurde der vor jeder Messung bestimmte Null-effekt (bei unserer Meßanordnung um 14 ± 1,2 Im-pulse/Min.) subtrahiert. Zur Korrektion der Selbstabsorp-tion wurde auf unendliche Schichtdicke umgeredinet. Bei hohen Impulszahlen wurden die Koinzidenzverluste nach der Näherungsformel Nw = Nr (1 + Nr r) berücksiditigt (Nw = wirkliche Impulszahl; NT registrierte Impulszahl, r — Löschzeit).

N a c h w e i s e i n e s B r e n z t r a u b e n s ä u r e -r e d u z i e r e n d e n F e r m e n t s („M i l c h s ä u r e d e h y d r a s e")

Zum spektrophotometrischen Nachweis des Ferments 44

dienten Extrakte, die in gleicher Weise hergestellt waren, wie die Extrakte zum Nachweis der Aldolase. Die vom Kulturmedium abzentrifugierten und mit Phosphat-

44 F. K u b o w i t z u. P. O 11, Biochem. Z. 314, 94 [1943].

puffer gewaschenen Bakterien wurden bis zur Bereitung des Extraktes bei —15° eingefroren.

Zusammensetzung der Testlösung:

1,7 ccm m/50-Pyrophosphatpuffer, pH 8,2, 0.25 „ Dihydro-Cozymase (5 mg/2,5 ccm), 0,03 „ Brenztraubensaures Natrium (110 mg/10 ccm), 0,1 „ Cystein-Chlorhydrat (0,2-m.), 0,2 „ n/lO-NaOH, 0,5 „ Bakterienextrakt.

Versuchsbeispiel: Temperatur 20° 334

Minuten 0 10 20 30 In itr/i 0,660 0,498 0,352 0,209

Dihvdro-Diphosphopyridinnucleotid wurde nach N e -g e 1 e i n und W u l f f 4 5 dargestellt. 10 mg Cozymase wurden in 50 ccm Wasser gelöst und mit n/lO-NaOH neutralisiert. 5 ccm Alkohol und 0,01 ccm Alkohol-dehydrase ( B o e h r i n g e r , Mannheim) wurden hinzu-gefügt. Im Verlaufe der Hydrierung wurde soviel n/100-NaOH zugegeben, daß pH 7,5—8,0 blieb. Nach 30 Min. wurde mit 1 ccm n/lO-NaOH alkalisch gemacht und nach 10 Min. mit n/10-HCl auf p^ 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde in gefrorenem Zustand zur Trockne gebracht.

45 E. N e g e 1 e i n u. H. J. W u 1 f f , Biochem. Z. 293, 351 [1937].

2-Jod-östron und 2-Jod-östradiol

V o n ANNELIESE H I L L M A N N - E L I E S , GÜNTHER HILLMANN u n d ULRICH SCHIEDT

Aus dem Chemischen Laboratorium der Medizinischen Universitätsklinik Tübingen und dem Max-Planck-Institut für Biochemie, Tübingen

(Z. Naturforschg. SB, 4 3 6 ^ 4 0 [1953]; eingeg. am 25. Juni 1953)

Herrn Professor Dr. A. Butenandt zum 50. Geburtstag gewidmet

Durch Jodierung von Östron und Östradiol mit Jod-Quecksilber-acetat in Eisessig werden 2-Jod-östron und 2-Jod-östradiol erhalten.

Bisher sind folgende Östron- und Östradiolderivate, die im aromatischen A-Ring substituiert sind, be-

kannt geworden: Östron-sulfonsäure1, Östron-carbon-säure2, Monobrom-östron, Monobrom-östradiol3, Di-brom-östradiol4, Monojod-östradiol sowie Dijod-östradiol5. Die Jod-östradiol-Derivate waren von A l b e r t , H e a r d , L e b l o n d und S a f f r a n 5

1 A. B u t e n a n d t u. H. H o f s t e t t e r , Hoppe-Seyler's Z. phvsiol. Chem. 259. 222 [1939],

2 J. B. N i e d e r l , US-Patent 2/322 311 [1944], 3 G. F. M a r r i a n u. G. A. D. H a s 1 e w o o d , J.

Soc. chem. Ind. 51, 277 [1932], 4 R. B. W o o d w a r d , J. Amer. chem. Soc. 62, 1625

[1940], 5 S. A 1 b e r t , R. D. H. H e a r d , C. P. L e b 1 o n d

u. J. S a f f r a n , J. biol. Chemistry 177, 247 [1949],

hergestellt worden, um nach Markierung mit 1 3 ,Jod den Stoffwechsel dieses Follikelhormonderivates im Tierversuch zu verfolgen. Zu dem gleichen Zweck hatten T w o m b l y und Mitarbeiter durch Addition von 82Brom an die 7.8-Doppelbindung des Equilins ein Isomerengemisch des 7.8-Dibrom-östrons dar-gestellt6.

Die von A l b e r t et al. durchgeführte Jodierung des Östradiols mit J2 in wäßrig-alkalischem Medium oder durch Umsetzung mit N-Jodacetamid unter wasserfreien Bedingungen ergab nach Reinigung

e G . H . T w o m b l y , J . M c C l i n t o c k u. M . E n g e l -m a n n , Amer. J. Obstetr. Gynecol. 56, 260 [1948]; G. H. T w o m b l y u. E. F. S c h o e n e w a l d t , Cancer 1950, 601.