DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LA ENFERMEDAD DE … · Real-Time PCR in faecal samples of Triatoma...
Transcript of DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LA ENFERMEDAD DE … · Real-Time PCR in faecal samples of Triatoma...
DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Juan Carlos Rodríguez DíazS. MicrobiologíaHospital General Universitario de AlicanteE-mail: [email protected]
Datos generales
• Se llama tripanosomiasis americana
• Producida por Trypanosoma cruzi
• Transmitida por un insecto hemíptero hematófago
(triatomino)
• Varios reservorios mamíferos además del hombre
Datos generales
Prevalencia
• 12-14 millones de personas infectadas, desde Méjico a Argentina (15 países)
Prevalencia
• La enfermedad de Chagas era un problema de América latina pero los cambios poblacionales de los últimos años hace que se convierta en un problema de salud global:
• En 15 países europeos excluyendo España, en 2005, el 2.9% de los 483,074 inmigrantes legales provenientes de América Latina estaban infectados
• En 2008, España recibió a 1,678,711 inmigrantes de Latinoamérica de los que el 5.2% estaban potencialmente infectados y 17,390 desarrollarán enfermedad.
• 24-92 neonatos pueden haber desarrollado infección congénita en 2007 en España
Schmunis GA et al. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Trop. 2010;115:14-21
Transmisión
• Picadura del insecto
• Exposición en mucosas
• Transfusiones de sangre
• Transferencia a través de la placenta
• Ingestión del parásito en la comida
Métodos diagnósticos
• Visualización de los tripomastigotes con Giemsa en la sangre periférica (buffy coat)
• En fase aguda se observan fácilmente
• En fase crónica no se observan salvo en reactivaciones febriles
L.S. García. Diagnostic Medical Parasitology. ASM 1993
Métodos diagnósticos
• Visualización de los amastigotes en nódulos linfáticos con Giemsa
• Puede confundirse con amastigotes de Leishmania
L.S. García. Diagnostic Medical Parasitology. ASM 1993
Métodos diagnósticos
• Cultivo en medio NNN (Novy, MacNeal, Nicolle)
• Puede confundirse con Leismania
• Incubación a 25ºC durante 30 días
L.S. García. Diagnostic Medical Parasitology. ASM 1993
Métodos diagnósticos
• Xenodiagnóstico• Tras poner en contacto muestras del paciente con vectores se
detecta la presencia del parásito en sus heces
• Microscopía
• PCR
Parasit Vectors. 2012;5:59. doi: 10.1186/1756-3305-5-59. Real-Time PCR in faecal samples of Triatoma infestans obtained by xenodiagnosis: proposal for an exogenous internal control. Bravo N, et al.
Métodos diagnósticos
• Detección de anticuerpos mediante métodos serológicos
• Reacciones cruzadas con otros parásitos como Leishmania
• Necesidad de confirmar en resultados por dos pruebas serológicas diferentes
L.S. García. Diagnostic Medical Parasitology. ASM 1993
Métodos diagnósticos• Detección de anticuerpos mediante métodos serológicos
• INMUNOCROMATOGRAFIA• Rápida
• Fácil de hacer, incluso en la consulta del clínico
• Importantes problemas de sensibilidad y especificidad
• ENZIMOINMUNOENSAYO
• Automatizable
• Útil en cribados de muchas muestras
• Permite diferenciar IgG e IgM
• INMUNOFLUORESCENCIA• Útil como técnica confirmatoria
• Se requiere personal experimentado
• Permite cuantificar los títulos de forma precisa
• Permite diferenciar IgG e IgM
• HEMAGLUTINACION• Permite cuantificar de manera precisa
Métodos diagnósticos
• Detección de anticuerpos mediante métodos serológicos
• INMUNOCROMATOGRAFIA
Métodos diagnósticos
• Detección de anticuerpos mediante métodos serológicos
• ENZIMOINMUNOENSAYO
Métodos diagnósticos
• Detección de anticuerpos mediante métodos serológicos
• INMUNOFLUORESCENCIA
Métodos diagnósticos
• Detección de anticuerpos mediante métodos serológicos
• HEMAGLUTINACION
Métodos diagnósticos
• Detección del DNA del parásito (Reacción en cadena de la polimerasa, PCR)
• Permite detectar la presencia de muy pocos microorganismos en la muestra
• Permite cuantificar el número de microorganismos (real time PCR)
• Puede hacerse en sangre o en tejidos
• Detección del DNA del parásito (Reacción en cadena de la polimerasa, PCR)
• Permite detectar la presencia de muy pocos microorganismos en la muestra
• Permite cuantificar el número de microorganismos (real time PCR)
• Puede hacerse en sangre o en tejidos
J Heart Lung Transplant. 2011;30:799-804. Usefulness ofqualitative polymerase chain reaction for Trypanosoma cruzi DNAin endomyocardial biopsy specimens of chagasic heart transplant
Métodos diagnósticos en neonatos
• Los anticuerpos de la madre atraviesan la placenta
• Todos los niños de madres infectadas presentan positivas las pruebas serológicas al nacer, aunque no estén infectados
• Estas pruebas se negativizan al cabo de varios meses (6-12) si el niño no está infectado
• En neonatos de madres infectadas tiene mucha utilidad la detección del genoma del parásito mediante PCR porque permite confirmar la infección
• Casi el 100% de los neonatos infectados se curan si se tratan rápidamente
Métodos inmunológicos versus microbiología molecular
• Ambas técnicas son complementarias
• Los métodos inmunológicos detectan la respuesta inmune del huésped
• En casos de primoinfección pueden ser negativos
• Más útiles en procesos crónicos
• Difícil interpretación en neonatos
* La IgG de la madre atraviesa la placenta
* El sistema inmune inmaduro del neonato puede no producir IgM
• Los métodos de microbiología molecular detectan la presencia del genoma del parásito
* Útiles en procesos agudos o reactivaciones febriles
Enferm Infecc Microbiol Clin. 2012 pii: S0213-005X(12)00282-0. Comparison between immunological and molecular techniques for the diagnosis of Chagas disease.Ferrer E, et al.
Consensos y revisiones
• Joaquim Gascón et al. Diagnosis, Management, and Treatment of Chronic Chagas’ Heart Disease in Areas Where Trypanosoma cruzi Infection Is Not Endemic. Rev Esp Cardiol 2007;60:285-93
• Maria Jesús Pinazo. Diagnosis, management and treatment of chronic Chagas’ gastrointestinal disease in areas where Trypanosoma cruzi infection is not endemic. Gastroenterol Hepatol.2010;33:191–20
• Murcia L, Carrilero B, Saura D, Iborra MA, Segovia M Diagnosis and treatment of Chagas disease. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2013;31 Suppl 1:26-34..
HACIA DONDE VAMOS
Desarrollo de nuevas pruebas confirmatorias
• Hay reacciones cruzadas entre parásitos por lo que se necesita confirmar los resultados positivos
• Utilización de dos pruebas
• Es importante conocer la sensibilidad y especificidad de las mismas
• Los antígenos utilizados como diana es un dato clave
• Western Blot: Estudia la producción de anticuerpos frente a antígenos específicos del parásito
Am J Trop Med Hyg. 2012;86:412-6. Identification of a Western blot pattern for the specific diagnosis of Trypanosoma cruzi infection in human sera. Riera C, et al.
Control serológico de la respuesta al tratamiento
• ¿Sirven los estudios serológicos para controlar la eficacia de los tratamientos?
• La negativización del estudio serológico a largo plazo se ha asociado a respuesta al tratamiento
• Disminuciones de la cantidad de anticuerpo o negativizaciones de los mismos se asocia de forma rápida a la respuesta al tratamiento
PLoS Negl Trop Dis. 2011;5:e1314. Doi: 10.1371. Impact of aetiological treatment on conventional and multiplex serology in chronic Chagas disease. Viotti R, et al.
Control serológico de la respuesta al tratamiento
• ¿Sirven los estudios serológicos para controlar la eficacia de los tratamientos?
• Cuestión polémica
• Hace faltan estudios a largo plazo para establecer los criterios
• Un abordaje es la búsqueda de antígenos específicos asociados a la respuesta
• Diagn Microbiol Infect Dis 2013: S0732-8893. Use of an enzyme-linked immunosorbent assay that utilizes the Tc13Tul antigen of Trypanosoma cruzi to monitor patients after treatment with benznidazole. Santamaría AL, el al
Control serológico de la respuesta al tratamiento
• Detección de la presencia del genoma del parásito en sangre y orina
• Se está evaluando en modelos animales
• Hace faltan estudios a largo plazo para establecer los criterios
• Puede ser útil en neonatos e inmunodeprimidos
• PLoS One. 2013;8:e58480. Detection of soluble antigen and DNA of Trypanosoma cruzi in urine is independent of renal injury in the guinea pig model. Castro-Sesquen YE, el al
Control serológico de la respuesta al tratamiento
• Se correlaciona el nivel de anticuerpos con la presencia del parásito en sangre
• Se deben hacer estudios cuantitativos con técnicas validadas y con controles de calidad externos e internos
• Estudios en paralelo de todas las muestras del paciente correctamente conservadas a lo largo del tiempo
Transfusion. 2012. doi: 10.1111/j.1537-2995.2012.03902.Antibody levels correlate with detection of Trypanosoma cruzi DNA by sensitive polymerase chain reaction assays in seropositive blood donors and possible resolution of infection over time. Sabino EC, et al. .
Control genético de la respuesta al tratamiento
• Se deben utilizar sistemas validados y estandarizados
• Método de extracción del DNA
• Gen parasitario amplificado
• Método de detección y control interno de amplificación
• Controles de calidad externos e internos
Acta Trop. 2013;125:23-31. doi: 10.1016/j.actatropica.2012.08.020. Towards the establishment of a consensus real-time qPCR to monitor Trypanosoma cruzi parasitemia in patients with chronic Chagas disease cardiomyopathy: a substudy from the BENEFIT trial. Moreira OC, et al.
Detección de mecanismos de resistencia a fármacos
• Caracterización de los mecanismos moleculares de resistencia
• Sistemas de entrada del fármaco en el parásito
• Estudio de librerías de RNA para conocer las proteínas que interaccionan con los fármacos
Parasitology. 2013:1-14. Genetic dissection of drug resistance in trypanosomes. Alsford S, et al.
Detección de genes de virulencia mediante secuenciación masiva del genoma
• La secuenciación masiva permite actualmente conocer todo el genoma de un parásito de manera rápida y económica
• Caracterizar la cepa causante de cada proceso infeccioso (medicina individualizada)
• Estudiar la presencia de genes de virulencia, patogenicidad y resistencia antibiótica
• PLoS One. 2013;8:e58967. Differential distribution of genes encoding the virulence factor trans-sialidase along Trypanosoma cruzi Discrete typing units. Burgos JM, et al.
Control de brotes alimentarios• La transmisión oral es un fenómeno emergente
• Puede llegar a poblaciones no endémicas por la globalización del comercio de alimentos
• Es importante controlar y caracterizar los brotes
• El desarrollo de técnicas moleculares de epidemiología molecular del parásito es clave en este propósito
PLoS Negl Trop Dis. 2013;7:e2041. Molecular epidemiology of human oral Chagas disease outbreaks in Colombia. Ramírez
JD, Montilla M, Cucunubá ZM, Floréz AC, Zambrano P, Guhl F.
Cuantificación del número de parásitos
• La cuantificación del número de parásitos puede realizarse mediante real time PCR (PCR a tiempo real o PCR cuantitativa)
• Puede realizarse en diferentes muestras: sangre, biopsias, etc
• Puede ser muy útil a la hora de:
• Control de tratamiento
• Riesgo de transmisión en infección congénita
• Predicción de riesgo de enfermedad crónica
PLoS Negl Trop Dis. 2013;7:e2000. Analytical performance of a multiplex Real-Time PCR assay using TaqMan probes for quantification of Trypanosoma cruzi satellite DNA in blood samples. Duffy T, et al.
Caracterización de la interacción parásito-huésped
• Las nuevas herramientas genéticas permiten caracterizar la interacción entre patógeno y huésped
• Las técnicas más útiles son:
• Microarrays
• Secuenciación masivade enfermedad crónica
• PLoS One. 2012;7:e50748. Diagnostic peptide discovery: prioritization of pathogen diagnostic markers using multiple features. Carmona SJ, et al. .
Caracterización de la interacción parásito-huésped
Caracterización de la interacción parásito-huésped