Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

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DIAGNOSTIC ANTENATAL ET FOETAL LES TECHNIQUES DE LABORATOIRE EN GENETIQUE METHODES D’EXPLORATION Dyschromosomies dont la fréquence varie entre 10 à 20% avec essentiellement les triploïdes et les trisomies mais également les disomies et les mosaïques confinées au placenta.

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DIAGNOSTIC ANTENATAL ET FOETAL

LES TECHNIQUES DE LABORATOIRE EN GENETIQUE

METHODES D’EXPLORATIONDyschromosomies dont la fréquence varie entre

10 à 20% avec essentiellement les triploïdes et les trisomies mais également les disomies et les

mosaïques confinées au placenta.

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l’organisation du génome humain Le génome = 3 milliard de pb

Nombre de gènes : environ 30 000

1) Les Chromosomes : - 23 paires- 400-550 bandes chromosomiques

2) Une bande : – 5 à 10 mégabases– 130 gènes en moyenne

(densité génique)– distance moyenne entre 2

gènes : 20 000 à 30 000 pb

3) Un gène : - la taille : 10 000 pb en moyenne avec d’énormes variations

1) Les anomalies des chromosomes -> maladies chromosomiques- Anomalies de nombre : aneuploïdies- Anomalies de structure > 5-10 Mbases

2) Les anomalies de régions chromosomiques : -> plusieurs gènes concernésSyndromes microdélétionnels

– délétions < 5 mégabases – duplications < 5 mégabases

3) Les anomalies géniques : un seul gène défectueux- séquence d’ADN

- méthylation de l’ADN

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les stratégies d’analyse en génétique

Analyse des trois niveaux d’organisation du génome

1 Analyse chromosomique = la cytogénétique : Caryotype la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH biologie moléculaire

2 Analyse de régions chromosomiques 3 techniques de FISH3biologie moléculaire

3 Analyse des gènes3 biologie moléculaire

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Les techniques de cytogénétique dans le DPN : le caryotype

1. définition du caryotype2. rappels sur la mitose et les chromosomes 3. réalisation d’un caryotype4. Différents prélèvements

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1.Définition du caryotype

La technique qui consiste à colorer les

chromosomes en métaphase puis à prendre une photo lorsqu'ils sont étalés pour les dénombrer, est appelée

technique de caryotypage.

On dit que l'on réalise un caryotype.

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2. Rappel sur les chromosomes Les différents stades de condensation de l’ADN

-(1) une molécule d'ADN double brin

- (2) et (3) chromatine (ADN avec histones) au cours de l'interphase

- (4) chromatine condensée au cours de la prophase

-(5) chromosome en métaphase.

télomère

télomère

centromère

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• coloration directe par un colorant basique : le Giemsa

• coloration par le Giemsa après dénaturation par la trypsine

• à bandes GTG (Trypsine Giemsa)

• coloration par le Giemsa après dénaturation par la chaleur

• à bandes RHG (Reverse Heat Giemsa)

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2. Rappel sur la mitose : place de la mitose dans le cycle cellulaire

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3. Réalisation d’un caryotype : prélèvement et recueil des cellules amniotiques

Centrifugeuse -> recueil des cellules

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3. Réalisation d’un caryotype : étape de culture cellulaire

Hotte à flux laminaire

milieu stérile nutritifIncubation à 37°C et 5% CO2

étuve

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3. Réalisation d’un caryotype : obtention de mitoses en métaphase

1 Arrêt des mitoses en métaphase par la colchicine :

chromosomes condensés au maximum augmentation de mitoses

2 Choc hypotonique : entrée massive d’eau dans la cellule éclatement des cellules dispersion des chromosomes

3 Fixation des chromosomes par un fixateur

4 Etalement sur lame des chromosomes fixéesthermotron : enceinte avec température et degré d’hygrométrie contrôléspour un étalement optimal de la goutte

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2.Rappel sur la mitose :Les quatre phases de la mitose

1

4

2

3

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Choc hypotonique :

entrée massive d’eau dans la cellule

éclatement des cellules dispersion des chromosomes

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• Fixation des chromosomes par un fixateur

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3. Réalisation d’un caryotype : Vérification de la richesse des mitoses

mitose

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3. Réalisation d’un caryotype : dénaturation et coloration des chromosomes

• coloration directe par un colorant basique : le Giemsa

• coloration par le Giemsa après dénaturation par la trypsine

bandes GTG (Trypsine Giemsa)

• coloration par le Giemsa après dénaturation par la chaleur

bandes RHG (Reverse Heat Giemsa)

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3. Réalisation d’un caryotype : analyse des mitoses au microscope à

contraste de phase

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3. Réalisation d’un caryotype : classement des chromosomes

• cellule diploïde : les chromosomes homologues par paire identique

• les chromosomes sexuels = gonosomes : XX ou XY

• les autosomes : 22 paires par taille décroissante fonction de la position du centromère

• le banding : 300 bandes400 bandes550 bandes >550 bandes

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3. Réalisation d’un caryotype : classement des chromosomes après giemsa

grands à centromères presque médian grands à centromère distaux

Chromosomes de taille moyenne

grands acrocentriques

petits à centromères médian petits acrocentriques Chomosomes sexuels

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3. Réalisation d’un caryotype : banding des chromosomes: 400-550 bandes

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4. Les différents prélèvements caryotype à partir de l’amniocentèse

• Quoi ?- Le liquide amniotique

• Quand ? Amniocentèse «  classique » : à partir de 14 SAAmniocentèse tardive : 32 SA

• Combien ? - quantité prélevée : 1 ml par SA- 2 flacons

• Comment ?- ponction transabdominale- asepsie rigoureuse (bloc opératoire, tubes falcon stérile)

• Prélèvement fragile ?- transport à température ambiante

• Mise en culture- deux tubes prélevés deux cultures

• durée de la culture : - multiplication spontanée des cellules -> autour de 10 j

• Le nombre de clones :- adhésion des cellules sur la paroi -1 cellule => un clone cellulaire

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4. Les différents prélèvements caryotype à partir de l’amniocentèse

• Réalisation du caryotype :- sur les deux cultures- deux marquages : bandes RHG et bandes GTG

• Avantages : - belles mitoses diagnostic des anomalies de structure

chromosomique- pas de contamination par des cellules maternelles- cellules du LA = cellules du fœtus

• Inconvénients :- complications liées au prélèvement : 0,5 à 1% de perte foetale- délai de réponse : 10 jours

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Dans le LA

Après culture

clones issus de cellules différentes

Culture A Culture B

Pseudo-mosaïcisme

Mosaïcisme vrai

Caryotype du liquide amniotique avec une mosaïque

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4. Les différents prélèvements

• Prélèvements prénataux caryotype fœtal

- les villosités choriales = fin du premier trimestre (10-13+6j SA)- le liquide amniotique = Amniocentèse : deuxième trimestre

Amniocentèse «  classique » : à partir de 14 SA

Amniocentèse tardive- le sang fœtal = cordocentèse : troisième trimestre- biopsie de tendon foetal

• Autres prélèvements caryotype constitutionnel

- sang des parents

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4. Les différents prélèvements 4.1.caryotype à partir du sang du cordon

• Prélèvement au bloc opératoire sous contrôle échographique - tube hépariné - transport à température ambiante

• Mise en culture - sous hotte à flux laminaire- dans un flacon Falcon avec milieu de culture- 1 -2 ml de sang - addition de phytohémaglutinine multiplication des lymphocytes T

• Culture à 37°C sous 5% de CO2 - 1 culture sur 3 jours

• Réalisation du caryotype

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5. les prélèvements prénataux : caryotype à partir des villosités choriales

1 mésoblaste extra-embryonnaire2 cytotrophoblaste3 syncytiotrophoblaste

1 Prélèvement - sous contrôle échographique- avec une canule d’aspiration- par voie vaginale ou par voie abdominale

2 Transport immédiat dans tube stérile au laboratoire

3 deux techniques au laboratoire - caryotype après culture- caryotype direct si

poids >5 mg

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4. Caryotype direct à partir des villosités choriales

Mitoses spontanées des cytotrophoblastes caryotype direct

• Technique :- sur la VC : colchicine, choc hypotonique, fixation des VC

- une étape supplémentaire : la dilacération de la VC dans du liquide d’éjection

isolement des cellules du cytotrophoblaste

- étalement avec un étaleur de mitoses

- marquage

- analyse et classement des chromosomes

• Avantages du direct :- résultat le jour même

- pas de contamination par des mitoses maternelles

• Inconvénient :- qualité moyenne des mitoses

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4. Caryotype après culture des villosités choriales

1 Les cellules mises en culture

= le tissu extra-embryonnaire, syncitiotrophoblaste et cytotrophoblaste

lavage pour enlever les caillots sanguins

nécessité de trier les VC avant la mise en culture

pour éviter une contamination maternelle

2 Mise en culture des cellules dissociation des VC par trypsine

3 La culture : comme le LA- une seule culture

4 Le caryotype :

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Origine des VC

Cytotrophoblaste = direct Tissu extra-embryonnaire = culture

caryotype de 2 tissus d’origine différente

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Problème des mosaiques sur VC

mosaïque retrouvée aussi chez le fœtus

mosaïque confinée au placenta = non retrouvée dans le LA ou le sang foetal : 1 à 2% des VC

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5. Anomalies du caryotype = anomalie des chromosomes

Anomalies de nombre = aneuploidie

> 46 chromosomes

triploïdie : 69 chromosomes

trisomie : 3 chromosomes homologues

marqueur surnuméraire : petit « chromosome » surajouté

< 46 chromosomes

monosomie : absence d’un chromosome

Anomalie de structure =

46 chromosomes

Structure modifiée :

• Échange de matériel entre 2 chromosomes

• Délétion

• Duplication…..

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5.1. Anomalies de nombre du caryotype : triploidie

69,XXXou XXY ou XYY

69,XXX ou XYY

69,XXX ou XXY

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5.2. Anomalies de nombre du caryotype : trisomie

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5.3. Anomalies de nombre du caryotype : marqueur surnuméraire : 47, XY,+mar

• Caryotype masculin

• un marqueur chromosomique en mosaique

(11/16) sur les cellules étudiées

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Les anomalies de structure équilibrées les plus fréquentes : les translocations

5.4. Anomalies de structure du caryotype

Translocation réciproque Translocation Robertsonienne

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5.5. Anomalies de structure du caryotype

45,XX,t(13;14)(q10;q10)

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Des anomalies de structure équilibrées moins fréquentes : les inversions et les insertions

5.6. Anomalies de structure du caryotype

Inversion paracentrique

insertionInversion péricentrique

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5.7. Anomalies du caryotype: Les anomalies de structure déséquilibrées

délétion duplication

chromosome en anneau

isochromosome

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5.6. Anomalies de structure du caryotypeRCIU post natal + CIA :46,XX,del(13)(q21.1)

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5.8. Anomalies de structure du caryotype

46,XX,r(14)(p11.2q32)

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6. Conseil génétique devant une anomalie du caryotype :

Anomalie de structure équilibrée

formation de gamètes déséquilibrés

FCS, MFIU nouveau-né avec malformation, dysmorphie,

retard mental

Méiose Population à risque : parent porteur d ’une

anomalie chromosomique équilibrée

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trisomie 13

45,XX,t(13;14)

méïose

trisomie 14

fécondation

Gamete normal Der(13;14) Disomie 14Disomie 13

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Les techniques de cytogénétique moléculaire dans le DPN

1 Analyse chromosomique = la cytogénétique : Caryotype standard

la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH biologie moléculaire

2 Analyse de régions chromosomiques 3 techniques de FISH3biologie moléculaire

3 Analyse des gènes3 biologie moléculaire

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Les techniques de cytogénétique moléculaire dans le DPN

1 le principe de la FISH

2 application : aneuvysion

3 application : microdélétions invisibles sur un caryotype

4 Application : identification des marqueurs Limite de la technique

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1. le principe de la FISH : Deux propriétés de la molécule d’ADN

1) La complémentarité de l’ADN

-double hélice

- constituée de bases complémentaires

-liée entre elles par des liaisons hydrogène

A = T G C

2) La dénaturation de l’ADN

- Thermique : rupture des liaisons hydrogène ADN simple brin

- Réversibilité : rétablissement des liaisons hydrogène ADN double brin

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1. le principe de la FISH = Fluorescence In Situ Hybridation

1) L’ADN cible : ADN sur lequel est faite

l’hybridation- In situ : les chromosomes

2) Une sonde : ADN ou ARN marqué- fixation de fluorochromes sur la sonde sonde fluorescente

3) Hybridation de l’ADN cible avec une sonde= Etablissement de LH entre la sonde fluorescente et l’ADN cible ADN cible fluorescent

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1. principe de la FISH : Les principales étapes d’une FISH

1 Etape de codénaturation- sur plaque chauffante - dénaturation des chromosomes- dénaturation de la sonde

2 Etape d’hybridation à 37°C pendant une nuit - fixation de la sonde sur les chromosomes- renaturation progressive des chromosomes et de la sonde

3 Lavages - élimination de l’excès de sonde non fixée sur les chromosomes Augmentation de la spécificité

4 Contre-coloration des chromosomes avec le DAPI- agent intercalant entre les bases de l’ADN - fluorescent

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1. le principe de la FISH : lecture

lecture avec un microscope à épifluorescence

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2. Applications de la FISH : différentes sondes

1) Peinture chromosomique un chromosome ou un bras chromosomique

2) Sondes spécifiques d’une région chromosomique- sondes locus spécifiques

régions impliquées dans un syndrome (plusieurs gènes)

-> aneuvysion : chromosomes 13 et 21

- sondes centromériques (CEP)

-> aneuvysion : chromosomes X,Y et 18

-> les centromères de tous les chromosomes

- sondes télomériques (tel)-> télomère du bras court

-> télomère du bras long

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2.1. Applications de la FISH aneuvysion à partir du liquide amniotique

1 Intérêts : - examen direct sur les noyaux des amniocytes : 24 heures- sensible : décompte faits sur 100 noyaux

2 Principe de l’aneuvysion* : hybridation sur les noyaux

Diagnostic fiable et rapide des principales aneuploidies

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2.1. indication de la FISH aneuvysion à partir du liquide amniotique

Indications- signes d’appel échographiques

- nuque épaisse sur échographie du 1° trimestre

18

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2.2. application de la FISH : diagnostic d’un syndrome microdélétionnel

• Signe d’appel échographique : cardiopathie

• caryotype normal

• Recherche d’un syndrome de DiGeorge

• Présence d’une microdélétion en 22q11

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2.3. application de la FISH

Identification d’un petit marqueur surnuméraire

Page 56: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

2.3. application de la FISH :Identification d’un petit marqueur surnuméraire

par FISH centromérique

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4. application de la FISH Identification d’un petit chromosome 15 surnuméraire

Page 58: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

2.3. application de la FISH Identification d’un petit chromosome 15 surnuméraire

FISH spécifique de la région Willy-Prader-Angelman

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2.3. application de la FISH :identification d’un isodicentrique du chromosome 15

CEP 15

CEP 15

SNRPN, D15S10

SNRPN, D15S10

47,XX,+idic(15;15)(q13;q13).ish15q11-q13 (SNRPN++,D15S10++)

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2.4. application de la FISH délétion

Page 61: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

2.4. application de la FISH délétion

délétion du gène du rétinoblastome RB1

Page 62: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

2.4. application de la FISH délétion interstitielle

une délétion interstitielle du chromosome 13

Page 63: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

Techniques de biologie moléculaire dans le DPN

1 Analyse chromosomique = la cytogénétique : Caryotype standard

la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH biologie moléculaire

2 Analyse de régions chromosomiques 3 techniques de FISH3biologie moléculaire

3 Analyse de l’ADN-> biologie moléculaire

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Techniques de biologie moléculaire dans le DPN

Anomalies multiples - Visibles sur le caryotype- invisibles sur le caryotype mais recherche ciblée- invisibles sur le caryotype et inconnues : pêche à la ligne !!!

Techniques multiples :- Synthèse d’ADN : amplification d’un segment d’ADN (PCR), marquage- Hybridation : amorces, sondes ADN ….- Electrophorèse : migration sur gel, sur capillaire

Début commun : une extraction d’ADN à partir d’un prélèvement

Les prélèvements :- fœtal : VC, LA, sang du cordon- parentaux : sang sur tube EDTA

Page 65: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(1) Les techniques de base de la biologie moléculaire

la PCR : amplification exponentielle

Anomalie ciblée pour le choix des amorces

Page 66: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(1) Les techniques de base de la biologie moléculaire électrophorèse sur gel après PCR

Séparation selon la taille

visualisation des bandes avec le bromure d'éthidium sous UV

but : séparer l’ADN chargé négativement au travers d'un gel sous l'effet d'un champ électrique

Page 67: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(1) Les techniques de base de la biologie moléculaire électrophorèse sur capillaire après PCR

Le nombre de paires de bases (pb)

Page 68: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / screening des exons

PCR Multiplex

Myopathie de Duchenne

Page 69: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct /recherche d’une petite délétion

Détection de la mutation deltaF508 du gène CFTR

1.Hétérozygote pour deltaF508

2.Homozygote pour deltaF508

3.Homozygote normal au locus F508

(En bleu le marqueur de poids interne)

PCR fluorescente

Migration sur un séquenceur automatique

Page 70: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / recherche d’une mutation ponctuelle

Enzyme de restriction

1.Hétérozygote (noir) : site de restriction2.Homozygote normal (noir)

Amorce en bleue d’un témoin de digestion hétérozygote

Page 71: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / séquençage : principe

H

OH

H

liaison diester

H

didNTP incorporé dans l’ADN -> arrêt de la PCR

Page 72: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de base de la biologie moléculaire

diagnostic direct / séquençage

• Amplification par PCR dans un seul sens

• Mélange de dNTP et de didNTP fluorescents

• incorporation de didNTP -> Arrêt de la synthèse d’ADN

• Fragments fluorescents de taille différente sur l’électrophorèse -> séquence du fragment amplifié

Page 73: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de base de la biologie moléculaire diagnostic direct / séquençage

Mutation de la CF

Mise en évidence directe de la mutationMutation uniqueMutation localiséesMutation familiale déjà identifiée

Page 74: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

• un microsatellite : répétition de nucléotides court (de 1 à 4 nucléotides) CACACACACA

• Un marqueur : variation du nombre de répétition varie selon les individus.

• Un marqueur non ambigu :

les séquences de part et d’autre du marqueur uniques

(2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe

Page 75: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe

Page 76: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(1) Les techniques de base de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe

Migration selon la taille des microsatellites amplifiés

Migration sur gel Migration dans un capillaire

Page 77: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : application au diagnostic indirect

1) Détermination du microsatellite lié à la maladie

2) Avantage :gène non connuéchec du diagnostic direct

2 ) Inconvénients :diagnostic probabilisteCas index familialParents informatifs

Fille atteinte d’une MAR

Page 78: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites :

diagnostic de disomie uniparentale

Une paire de chromosomes homologues héritée d’un seul parent

Invisible sur le caryotype

Page 79: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) application de la biologie moléculaire : amplification de microsatellites :

diagnostic de disomie uniparentale

Identification de l’origine des chromosomes :

- les microsatellites

Disomie uniparentale - individu 4

- Individu 5

Page 80: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

FCS due à la trisomie 14

correction de la trisomie 14 après fécondation

DUP14 mat

45,XX,t(13;14) 23,Y

méïose fécondation

Disomie 14

45,XY,t(13;14)45,XY,t(13;14)

Trisomie 14

Page 81: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) application de la biologie moléculaire : amplification de microsatellites :

anomalies du nombre de chromosomes

PCR fluorescente multiplexe quantitative sur des microsatellites sur les chromosomes 21

Page 82: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / sexe foetal

• ADN foetal circulant dans le sang maternel• Indications :

- les maladies récessive liées à l’X (MRX)- hyperplasie congénitale des surrénales (HCS)

• Intérêts :- non invasif - précoce

• En pratique : - MRX : pos à 10 SA ->VC- HCS : corticothérapie si nég à 8 SA-> contrôle à 10 SA

• Technique : PCR quantitative en temps réel du gène SRY

Page 83: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / sexe foetal

La quantité de fluorescence : proportionnelle à la quantité d’ADN amplifiée

Page 84: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(3) Les puces à ADN principe

ADN cible et ADN de référence

Marquage direct des ADNpar deux fluorochromes différents(cyanines)

cohybridation compétitive Sur une lame de verre

ADN cibleADN de référence

Page 85: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(3) Les puces à ADN principe

Lecture des signaux d’hybridation par un scanner de fluorescence Analyse des signaux par logiciel

- gain d’ADN : spot rouge- perte d’ADN : spot vert

Page 86: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

Anomalies de nombre du caryotype : marqueur surnuméraire : 47, XY,+mar

• Caryotype masculin

• un marqueur chromosomique en mosaique

(11/16) sur les cellules étudiées

Page 87: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(3) Les puces à ADN identification d’un marqueur

Page 88: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

• Un isochromosome 18 p

• une quadrisomie d'un bras court de chromosome 18.

Page 89: Diagnostic antenatal et foetal 2ème version

(3) Les puces à ADNintérêts

-pangénomique

-anomalie non connue

- Invisible au caryotype

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Techniques de biologie moléculaire dans le DPN

1 Analyse chromosomique par biologie moléculaire• disomies uniparentale par PCR de microsatellites• aneuploidies par PCR de microsatellites

2 Analyse de régions chromosomiques • Puce à ADN

3 Analyse de gènes• Détermination du sexe fœtal ou du Rhésus• Diagnostic direct des mutations par PCR ….• Diagnostic indirect par PCR sur microsatellites