Recombinant Expression and Purification of Aedes aegypti Midgut Serine Protease VII (AaSPVII)
Development of Purification Process of Recombinant Human ...
Transcript of Development of Purification Process of Recombinant Human ...
369
Korean Chem. Eng. Res., 55(3), 369-378 (2017)
https://doi.org/10.9713/kcer.2017.55.3.369
PISSN 0304-128X, EISSN 2233-9558
์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ด์ฉํ ์ฌ์กฐํฉ ์ธ๊ฐ ํ๊ด๋ดํผ์ธํฌ ์ฑ์ฅ์ธ์์ ์ ์ ๊ณต์ ๊ฐ๋ฐ
์ฑ๊ธฐํ ยท ๊น์ธํธโ
์ถฉ๋จ๋ํ๊ต ์์ฉํํ๊ณตํ๊ณผ
34134 ๋์ ๊ด์ญ์ ์ ์ฑ๊ตฌ ๋ํ๋ก 99
(2017๋ 1์ 16์ผ ์ ์, 2017๋ 3์ 15์ผ ์์ ๋ณธ ์ ์, 2017๋ 3์ 21์ผ ์ฑํ)
Development of Purification Process of Recombinant Human Vascular Endotherial
Growth Factor (VEGF) using Fusion Protein
Keehyun Sung and In Ho Kimโ
Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry Chungnam National University, 99, Daehak-ro,
Yuseong-gu, Daejon, 34134, Korea
(Received 16 January 2017; Received in revised form 15 March 2017; accepted 21 March 2017)
์ ์ฝ
ํ๊ด ๋ดํผ์ธํฌ ์ฑ์ฅ์ธ์(Vascular endotherial growth factor, VEGF)๋ ํ๊ด ํฌ๊ณผ์จ ์กฐ์ ์ด๋ ํ๊ด ์์ฑ์ ๊ด๋ จ๋ ๋จ
๋ฐฑ์ง๋ก ์์์ฉ์ผ๋ก ์ฐ์ผ ๊ฐ๋ฅ์ฑ์ด ๋๋ค. ์ด ๋จ๋ฐฑ์ง์ ๊ณ ์๋์ ๊ณ ํจ์จ๋ก ์์ ์ ์ผ๋ก ๋๋์์ฐ์ด ํ์ํ๋ค. ์ ๋นํดํด
์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง๋ก ์จํํ ์กฐ๊ฑด์์ ์ฉํด์ํค๊ธฐ ์ํด ๋ค์ํ ์กฐ๊ฑด์ ์ฐ๊ตฌํ์๊ณ , pH์ ๋ณ์ฑ์ ๋ณํ๋ฅผ ์๋ํ์๋ค. BL21
(DE3) ๋์ฅ๊ท ์์ฃผ์ธํฌ์์ pET28-a ๋ฒกํฐ๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ ์ฌ์กฐํฉ ๋์ฅ๊ท ์ ์ ์กฐํ์ฌ, 20 L์ ํ๋ถ์ ๋ฐฐ์์ผ๋ก 14 g/L๋๋
์ ์ธํฌ๋ฐฐ์์ ํ์๋ค. ๋ฐํจ ํUBP1 ํจ์ ๋ถํด์ ์ฌ์ ํ ๋จ๊ณ๋ฅผ ํฌํจํ 4๋จ๊ณ์ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ ๊ณต์ ์ผ๋ก ๊ตฌ์ฑ๋ ์
์ ๊ณต์ ์ผ๋ก VEGF๋ฅผ ์ ์ ํ์๋ค. ์ ๋นํดํด ์ตํฉ๋จ๋ฐฑ์ง๋ก 2 M ์์์ pH10 ์จํํ ์กฐ๊ฑด์์ VEGF์ ์ ์ ๊ฐ ๊ฐ๋ฅํ
์๋ค. 2๋ฒ์ Ni-affinity ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ ์ปฌ๋ผ์ ์ด์ฉํ์ฌ ๊ณ ํจ์จ์ ์ฌ์ ํ๊ณผ ์ดํฉ์ฒดํ ๊ณต์ ์ ์ํํ์๋ค. DEAE (Diethyl
Amino Ethyl) ์์ด์จ ๊ตํ ์ปฌ๋ผ์ ํตํ์ฌ ๋ณํ์ฒด(multimeric, misfolded)๋จ๋ฐฑ์ง๊ณผ endotoxin์ ์ ๊ฑฐ ํ ์ ์์๋ค. ์ ค ์ฌ๊ณผ
ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ dimer์ monomer๋ฅผ ๋ถ๋ฆฌ ํ์ฌ ์ดํฉ์ฒดํ VEGF๋ฅผ ์ ์กฐํ์๋ค. ์ต์ข VEGF์ ํน์ฑ๋ถ์์
SDS-PAGE (Soidum Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ์ ๊ธฐ์๋, RP-HPLC (Reversed Phase High
Performance Liquid Chromatography)์ผ๋ก ํ์ฌ ์๋ 97% (RP-HPLC๊ธฐ์ค) ๋ฅผ ์ป์๋ค.
Abstract โ Vascular endotherial growth factor (VEGF) is a potent mitogen that stimulates vascular permeability and
angiogenesis and has a potential in therapeutic applications. An industrial production method that provides high yield as
well as purity is needed. Researches for various factors of mild solubilization with combination of ubiquitin fusion pro-
tein to increase solubility were carried out as well as by changing pH and denaturant concentration. Usage of pET28-a
bacteral expression vector in BL21 (DE3) host cell was capable of producing approximately 14 g/L VEGF fusion protein in
20L fermentor. A purification process consisting of four chromatography steps including refolding and digestion with
UBP1 resulted in mild solublization under the conditions of 2M urea and pH 10.0 due to ubiquitin fusion tag protein that
increases in solubility of target protein VEGF. High yield of refolding and dimerization could be obtained between two
step Ni-affinity chromatography. Multimeric and misfolded proteins and endotoxin were removed by DEAE anion
exchange chromatography. Final monomers were removed from dimers by gel filtration chromatography. Characteriza-
tion analysis of purified dimeric VEGF was performed using SDS-PAGE and RP-HPLC with a purity of 97%.
Key words: VEGF, Refolding, Purification process
โ To whom correspondence should be addressed.E-mail: [email protected]โก์ด ๋ ผ๋ฌธ์ ์๊ฐ๋ํ๊ต ์ ๊ธฐํ ๊ต์๋์ ์ ๋ ์ ๊ธฐ๋ ํ์ฌ ํฌ๊ณ ๋์์ต๋๋ค.
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Com-mons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduc-tion in any medium, provided the original work is properly cited.
370 ์ฑ๊ธฐํ ยท ๊น์ธํธ
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
1. ์ ๋ก
ํ๊ด ๋ดํผ์ธํฌ ์ฑ์ฅ์ธ์(vascular endothelial growth factor,
VEGF)๋ ๊ฐ์์ ๊ฑธ๋ฆฐ ๊ธฐ๋ํฝ ๋ณต์์ ์ข ์์ธํฌ๋ก๋ถํฐ ๋ถ๋น๋ ๋จ๋ฐฑ
์ง์ ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ์ด๋ฅผ ํ๊ดํฌ๊ณผ์ธ์(vascular permeability factor :
VPF)๋ผ ํ์๊ณ , ๊ทธ ํ ์ด์๋ ๊ฐ๋ณ์ ์ผ๋ก ํ๊ด๋ดํผ์ธํฌ ์ฆ์์ ์ด
๋ํ๋ ๋ค๋ฅธ ์ฑ์ฅ์ธ์๊ฐ ๋ํ์์ฒด์์ ๊ธฐ์ธํ folliculostriate cell
์์ ๋ถ๋ฆฌ๋์ด ์ด๋ฅผ ํ๊ด๋ดํผ์ฑ์ฅ์ธ์๋ผ๊ณ ํ์๋ค[1]. ๊ทธ๋ฌ๋ ํ์
์ด ๋ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์๋ฏธ๋ ธ์ฐ ๋ฐฐ์ด์ ์กฐ์ฌํ ๊ฒฐ๊ณผ ๋์ผํ ๊ตฌ์กฐ๋ฅผ ๊ฐ์ก
์์ด ๋ฐํ์ก์ผ๋ฉฐ, ํ๊ด๋ดํผ์ธํฌ์ ์ฆ์๊ณผ ํ๊ดํฌ๊ณผ์ ๊ด์ฌํ๋ค๋
์ฌ์ค์ด ์๋ ค์ก๋ค[2].
VEGF๋ ์ฑ์ฒด์์์ ์ ์ํ๊ด์์ฑ(angiogenesis)๋ฟ๋ง ์๋๋ผ, ๋ฐฐ
์๋ฐ์์์์ ํ๊ด๋ฐ๋ฌ(vasculogenesis)์ ์กฐ์ ํ๋ ๊ฐ๋ ฅํ๊ณ ํน์ด
์ ์ธ ์ธํฌ๋ถ์ด ์๊ทน์ธ์์ด๋ฉฐ ๋ค๋ฅธ platelet-derived growth factor
receptors (PDGFRs), epidermal growth-factor receptors (EGFRs)
๊ณผ ๋ง์ฐฌ๊ฐ์ง๋ก ์์ฉ์ฒด ์ดํฉ์ฒดํ, ํ์ด๋ก์ ์ธ์ฐํํจ์์ ํ์ฑํ,
์ ํธ๋ณํ๊ธฐ์ ๋ํน์ฌ์ดํธ ํ์ฑ ๋ฑ์ ๊ธฐ์ ์ ํตํด ์กฐ์ ๋๋๋ฐ, ์ด๋ฅผ
ํตํด ์ธํฌ์ด๋, ์์กด, ์ฆ์ ๋ฑ์ ์ ๋ฐ์ ํ์ฑํ ์ ์๋ ์ ํธ๋ฅผ ์
๋ฌํ๊ฑฐ๋ ํ๊ดํฌ๊ณผ์ฑ์ ์กฐ์ ํ๋ ๊ธฐ๋ฅ๋ ๊ฐ์ง๋ค[3-5]. ๋ํ, VEGF๋
์ข ์ ํ๊ด์์ฑ์ ๋ํ ๊ฐ๋ ฅํ ์ธํฌ๋ถ์ด ์๊ทน์ธ์๋ก์จ, ์์ธํฌ์ ์ฑ
์ฅ์ ํ๊ด์์ฑ์ ์ ๋ํ๋ ์์ธํฌ์ ๋ฅ๋ ฅ์ ๋น๋กํจ์ผ๋ก์ VEGF๋
์ ๋ฐฉ์, ๋์ข ์, ๋์์ ๋ฑ ์๋ ค์ง ๊ฑฐ์ ๋ชจ๋ ์ข ๋ฅ์ ์์ธํฌ์์ ๋ฐ
ํ๋๋ ๊ฒ์ผ๋ก ๋ณด๊ณ ์์์ ์ผ๋ก ๊ฐ๊น์ด ๋ฏธ๋์ ์ธ๊ฐ ํ์ก์์
VEGF๊ฒ์ถ์ ์ ๊ฒ์ถ ๋ฐ ์น๋ฃ์ ์ง๋จ์ ์ฌ์ฉ๋ ๊ฐ๋ฅ์ฑ์ด ํฌ๋ค[6].
VEGF๋ ์ดํฉ์ฒด(dimer) ๋น๋จ๋ฐฑ์ง๋ก์จ ํฌ์ ๋๋ฌผ์ ๊ฒฝ์ฐ VEGF-A,
VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, ๊ทธ๋ฆฌ๊ณ ํ๋ฐ์ฑ์ฅ์ธ
์(placental growth factor)๋ก ํ์ธ๋์ด ์๊ณ , ์ด ์ค ์ธ๊ฐ VEGF-A๋
ํ๊ด์ ์์ ๊ฐ์ฅ ์ฐ์ํ๊ฒ ๊ด์ฌํ๊ณ ์ด๋ค์ ๊ฐ์ ์์น์ 8๊ฐ์
cystein ์๋ฏธ๋ ธ์ฐ ์๊ธฐ๋ฅผ ๋ณด์ ํ๊ณ ๊ทธ ์ค 2๊ฐ๋ ๋ถ์ ์ํธ ๊ฐ ๊ต์ฐจ
์ฐ๊ฒฐ ๋์ด ์ดํฉํ ๊ฒฐํฉํ์ฌ dimer๋จ๋ฐฑ์ง ํ์ฑ์ ๊ด์ฌํ๋ค. ์งง์ ์ฌ
์ฌ์ VEGF-121, 145, 165๋ ํ์ก์ผ๋ก ๋ถ์ถ๋๋ ์ฉํด์ฑ isoform์ด
๊ณ , ๊ธด ์ฌ์ฌ์ VEGF-189, 206์ ์ธํฌํ๋ฉด ๋ถ์์์ VEGF C-๋ง๋จ์
์์นํ ์ผ๊ธฐ์ฑ ์๋ฏธ๋ ธ์ฐ๊ณผ ๊ฒฐํฉ๋ ๊ธ๋ฆฌ์นธ์ด ์ธํฌ๋ฐ๊นฅ ์ง์ง์ฒด์ ํก
์ฐฉ๋์ด ์กด์ฌํ๋ฉฐ, ์ด์ค VEGF-165๊ฐ ๊ฐ์ฅ ๋ง์ด ๋ฐํ๋๋ ํํ๋ก
์ค์ถ์ ๊ฒฝ๊ณ ์ข ์์ด๋ ์ธํฌ์ ์ ๋ํ๋๋ค๊ณ ํ๋ค[7,8]. VEGF-165๋
165๊ฐ ์๋ฏธ๋ ธ์ฐ์ monomer 2๊ฐ๊ฐ ์ดํฉํ ๊ฒฐํฉํ๋ ํํ๋ก ์ด๊ฒ์ด
ํ์ฑํ์ด๋ค. VEGF-165๋ ์ฝ 45 kDa์ ๋ถ์๋์ ๊ฐ์ง๊ณ ์๊ณ , ์ด
๋ก ์ pI ๊ฐ์ 7.6์ด๋ค[9,10].
VEGF๋ ํ๊ด ๊ด๋ จ ์ธํฌ์คํ์ด๋ ์์๊ด๋ จ ์คํ์ ์ฐ๊ตฌ๋ชฉ์ ์ผ๋ก
์ฌ์ฉ๋์ด ์๋ค. ๊ทธ๋์ VEGF165๋ฅผ ์์ง๋ ๋จ๋ฐฑ์ง์ธ ๋ด์ง์ฒด๋ก ํ
์ํจ์ ๋ฐ๋ฅธ ๊ฐ์ฉํ์ ์ฌ์ ํ ๊ณผ์ ์ ๊ฑฐ์ณ ์๋ํฅ์๊ณผ ์๋ฌผํ์ ํ
์ฑ ํ์ธ์ ์ฐ๊ตฌ๊ฐ ์งํ๋์๋ค. ์ ํ์ฐ๊ตฌ์ ๋ฐ๋ฅด๋ฉด, ๊ณ ๋๋์
chotropic agent (Guanidine-HCl, Urea)์ ํ์์ (2-mercaptoethanol,
DTT)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ๋ด์ง์ฒด๋ฅผ ์ฉํดํ๋๋ฐ, Scorfani๋[11] 7 mol/L
Guanidine-HCl๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์๋ค. Keyt๋[12] 8 mol/L urea๋ฅผ ์ฌ์ฉํ
์ฌ์ ๊ฐ์ฉํ๋ฅผ ํ์๋ค. ๋ homodimer ํ์ฑ์ ์ํ ์ฌ์ ํ ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก
ํฌ์์ ์ฃผ๋ก ์ฑํํ์๋๋ฐ ์ดํฉ์ฒด ์์จ ํฅ์ ๋ฐ ์์ง ๋ฐฉ์ง์ ๋ํ
๋์ฑ ์ผ๋ก ์ฌ๋ฌ ๊ฐ์ง ์ฒจ๊ฐ์ ์ฌ์ฉ์ด ์๋๋์๋ค. Pizarro๋ [13]
VEGF165์ ์น๋ฃ์ฉ ์ ์ ๋ก ๋๋ ์์ฐ์ ์ฑ๊ณตํ์๋ค. ๋ํ ๊ฐ์ฉํ์
์ฌ์ ํ์ ํ๋์ ๊ณต์ ์ผ๋ก ์งํํ์๋ค. 3 L ๋ฐ์๊ธฐ ์์์ 1 M urea,
10 mM CHES, 100 mM L-arginine, 5 mM EDTA, 15 mM L-cysteine,
2 mM dithiotreitol (DTT), pH 9.8์ ์กฐ๊ฑด๊ณผ ๊ต๋ฐ์๋ 314 rpm, ๊ธฐ
์ฒด๊ณต๊ธ๋ 5 mL/min๋ก ์์ ์ ์์ฐ์ ์ํ ์คํ์ ํ์๋ค. ์๋๋
RP-HPLC๊ธฐ์ค 84%, SEC (Size Exclusion Chromatogarhy) - HPLC
๊ธฐ์ค 99%์๋ค. Shen์[14] ์ ์ ๊ณต์ ์ ๋จ์ํ๋ฅผ ์๋ํ์ฌ ์ ค ์ฌ๊ณผ,
์ด์จ๊ตํ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ VEGF165๋ฅผ ๋์ฅ๊ท ์ผ๋ก๋ถํฐ
์ ์ ํ์๋ค. ์ด์จ๊ตํ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ ๋จ๋ฐฑ์ง ๋ถ๋ฆฌ์์ ๋ฒ์ฉ์ผ๋ก
์ฌ์ฉ๋๋ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ ๋๊ตฌ์ด๋ฉฐ ๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์์ ์๋๋ฅผ ๋์ด๋๋ฐ
์ฌ์ฉ๋๋ค[15].
๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์์๋ fusion tag system์ ์ ์ ์ ๋์ ํ์ฌ ๋ด์ง์ฒด์
์ฉํด๋๋ฅผ ๋์ด๊ณ ์นํ์ฑ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ์ฌ์ฉํ๊ธฐ ์ํด Histidine
tag๋ฅผ ๋์ ํ์๋ค. ์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง๋ก Maltose-binding protein (MBP),
glutathione S-transferase (GST), thioredoxin (TRX), NUS A, ubiquitin
(UB), small ubiqutin-related modifier (SUMO)์ด ์๋๋ฐ, ๋ณธ์ฐ๊ตฌ์
์ฌ์ฉ๋ Ubiquitin์ 76๊ฐ์ ์๋ฏธ๋ ธ์ฐ์ผ๋ก ๊ตฌ์ฑ๋ ์์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ด๋ค.
Ubiquitin ์ตํฉ๋จ๋ฐฑ์ง์ ๋์ ์ผ๋ก ์ธํ ์ฉํด๋ ๊ฐ์ ์ ์๋ํ์๋ค.
์ด๋ ๋ฎ์ ๋๋์ denaturants ๋ฐ detergents๊ฐ ํฌํจ๋ ๊ฐ์ฉํ ์์ถฉ
์ฉ์ก ์ฌ์ฉ์ด ๊ฐ๋ฅํ๋ค.
2. ์คํ์ฌ๋ฃ ๋ฐ ๋ฐฉ๋ฒ
2-1. ์ฌ์กฐํฉ ๋ฐํ๋ฒกํฐ์ ์ ์กฐ ๋ฐ ํ์ง์ ํ ํ์ธ
์ ๋ถ๋ํ๊ต ์ฌ์ดํ ์นด์ธ ๋ฑ ํฌ๋ก๋ถํฐ pGEMT-easy vector์ ubquitin
-VEGF165 gene์ด ์ฝ์ ๋ ๊ท ์ฃผ๋ฅผ ๋ถ์ ๋ฐ์๊ณ DNA Extraction
Mini Kit (Clonetech)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ plasmid DNA๋ฅผ ํ๋ณดํ์๋ค. ๋ฐ
ํ ๋ฒกํฐ์ธ pET-28a vector (Novagen)์ Cloning ํ๊ธฐ์ํด ์ฝ์ ํ
์๋ค(Fig. 1(a)). ์์๋๋ PCR product ์ผ๊ธฐ์์ด์ ๋ค์๊ณผ ๊ฐ๋ค
(Fig. 1(b)).
Insert gene (Ub-VEGF165)์ ํด๋ก๋ Vector (pET28a)๋ฅผ SacII/
ShoI ์ ํํจ์(Takara)์ ์ด์ฉํ์ฌ ๊ฐ๊ฐ 37 oC 2์๊ฐ ๋ฐ์์์ผฐ์ผ๋ฉฐ,
agarose gel ์ ๊ธฐ์๋์ ํตํด ๊ทธ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ํ์ธํ์๋ค. ํ์ธ๋ ์ ค์
์ถ์ถํ์ฌ ๋์ผํ SacII/XhoI ์ฒ๋ฆฌ๋ ์กฐ๊ฐ๊ณผ vector๋ฅผ T4 Ligase
Enyme (Takara)์ ์ด์ฉํ์ฌ ์ ํฉ์ ์ํํ์๋ค. ์ ํฉ๋ ์ํ์
DH5a competent cell์ ์ด์ฉ ํ์ฌ ์ด์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ์ ํตํด ํ์ง์ ํ ํ
์์ผ๋ฉฐ, Kan+ ์ ํ๋ฐฐ์ง์์ ์ฝ๋ก๋๋ฅผ ์ ํํ์๋ค. ์ ํ๋ ์ฝ๋ก๋
์์ DNA๋ฅผ ์ถ์ถํ์ฌ T7 Primer๋ฅผ ํตํ์ฌ ์์ด๋ถ์ํ์ฌ ํ์ธํ
์๋ค. ํ์ธ๋ pET28a-Ub-VEGF Plasmid์ ๊ณ ๋ฐํ์ ์ํด BL21
(DE3)์ ํ์ง์ ํ์์ผฐ๋ค. ํ์ฒ๋ฐฐ์ง(Kan+)์์ ์ฝ๋ก๋๋ฅผ ํ์ธํ์
๊ณ , ๋ ๋ฆฝ ์ฝ๋ก๋๋ฅผ 10๊ฐ๋ฅผ ์ทจํ์ฌ ๋ฐํ ํ ์คํธ๋ฅผ ํ์๋ค. ๊ฐ๊ฐ์ ์ฝ
๋ก๋๋ ํ๋(OD, optical density) 0.8 ๊น์ง ๋ฐฐ์ํ์์ผ๋ฉฐ, IPTG
(Isopropyl-ฮฒ-D-thiogalactopyranoside, LPS, 367-93-1) 1 mM๋ก 5
์๊ฐ ์ ๋ํ์๋ค. ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ ํ SDS-PAGE๋ฅผ ํตํ์ฌ ๋ฐํ์ ํ์ธ
ํ์๋ค.
2-2. ํ๋ถ์ ๋ฐฐ์ ๋ฐ ๋ฐํ
1์ฐจ ์ข ๋ฐฐ์์ ์ํด ํ์ง์ ํ ๋ ์ฌ์กฐํฉ ๋์ฅ๊ท ๋ ๋ฆฝ ์ฝ๋ก๋ ํ๊ฐ๋ฅผ
kanamycin (100 ug/ml)์ด ํจ์ ๋ 2 ml LB ๋ฐฐ์ง(Difco)์ ์ ์ข ํ๊ณ ,
์งํ๋ฐฐ์๊ธฐ(๋น์ ผ๊ณผํ, VS-8480SR)์์ 37 oC, 6์๊ฐ, 100 rpm ๋ฐฐ
์ํ ํ OD 0.7์์ 2์ฐจ ์ข ๋ฐฐ์์ธ 200 ml LB๋ฐฐ์ง(+kanamycin
100 ug/ml)์ 1/50 (v/v)๋ก ์ ์ข ํ๋ค. ์ ์ข ํ 37 oC, 150 rpm, 10์๊ฐ
๋์ ์งํ๋ฐฐ์๊ธฐ๋ก ๋ฐฐ์ํ๋ค. ๋ณธ ๋ฐฐ์์ ์ํ์ฌ 30 L ๋ฐฐ์๊ธฐ(์ฝ๋ฐ์ด
์คํ )์ 20 L working volumn, 2 vvm ํต๊ธฐ๋, ๊ต๋ฐ๊ธฐ ์๋ 180 rpm,
์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ด์ฉํ ์ฌ์กฐํฉ ์ธ๊ฐ ํ๊ด๋ดํผ์ธํฌ ์ฑ์ฅ์ธ์์ ์ ์ ๊ณต์ ๊ฐ๋ฐ 371
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
์๋ ฅ 0.3 bar pH 7.0์ผ๋ก ๋ง์ถ์ด ๋์๋ค. ๋ณธ๋ฐฐ์์ ๋ฐฐ์ง ์กฐ์ฑ์
Table 1๊ณผ ๊ฐ๋ค.
2์ฐจ ์ข ๋ฐฐ์ ์ ๋์ ๋ฐฐ์๊ธฐ ์์ ๋ฌด๊ท ์ ์ผ๋ก ์ ์ข ํ๋ค. ์ ์ข ํ
UV spectrophotometer (๋์ผ์๋ง์ฆ, UV-1700)์ ์ด์ฉํ์ฌ OD
3.0~4.0๊น์ง ์ฑ์ฅ์์ผฐ๋ค. ๋ชฉ์ ํ๋ OD๊ฐ์ ๋๋ฌํ๋ฉด ์ต์ข 1 mM๊ฐ
๋๋๋ก ์ ๋์ ๋ก์จ IPTG๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์ ๋์์ผฐ๋ค. ์ ๋ํ ์๊ฐ๋
๋ณ๋ก ๋ฐํ์์ ์ฌ์ ํ์ธํ ๊ฒฐ๊ณผ 4์๊ฐ์งธ๋ถํฐ ๋์ผํ ๋ฐํ์์ ๋ณด
์ฌ ์ต๋ 5์๊ฐ๊น์ง ์ ๋์กฐ๊ฑด์ ์ ์งํ์ฌ ๋ฐฐ์ํ๋ค.
2-3. VEGF165 ๋ถ๋ฆฌ์ ์
2-3-1. ์ธํฌ ํ์์ ๋ด์ง์ฒด(Inclusion body, IB)ํ์
๋ฐฐ์์ก์์ ์ฐ์์์ฌ๋ถ๋ฆฌ๊ธฐ(ํ์ผ์ฌ์ด์ธ์ค, tubular separator J-
1050)๋ก ์ธํฌ๋ฅผ ํ์ํ๋ค. ํ์๋ ์ธํฌ๋ 298 g ์ด์๊ณ , ์ธํฌ ๋ฌด๊ฒ๊ฐ
15% (w/v)๋๋๊ฐ ๋๋๋ก ์์ถฉ์ฉ์ก(50 mM tris (J.T. Baker, 4109-02),
5 mM EDTA (๋์ฐ), 100 mM NaCl (๋์ ํ๊ธ), pH 8.5)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ
์ฌ๋ถ์ ์์ผฐ๋ค. ์ธํฌ๊ฐ ์์ ํ ํ์ด์ง ๋๊น์ง ํํ์์ผ homogenizer
(HS-2008)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์๋ ฅ์ 900~950 bar๊น์ง ์กฐ์ ํ๋ฉด์ ์ธํฌ๋ฅผ
ํ์ํ๋ค. ์ด๊ฒ์ ์ด 3ํ ๋ฐ๋ณตํ๊ณ , ์ข ๋ฃ ํ ํ๋ฏธ๊ฒฝ์ ํ์ธํ์ฌ ํ
์ ์ฌ๋ถ๋ฅผ ํ์ธํ๋ค. ํ์์ก์ ๋ถํผ๋ฅผ ์ ํํ ์ธก์ ํ๊ณ , ์์ถฉ์ฉ์ก์
์ด์ฉํ์ฌ 2๋ฐฐ๋ก ํฌ์ํ ํ ์ต์ข ๋๋๊ฐ 1%๊ฐ ๋๋๋ก triton X-100
(๋์ฐ)์ ์ฒจ๊ฐํ๋ค. ์ฒจ๊ฐ ํ ๋์ฅ ์ํ๋ฅผ ์ ์งํ๋ฉด์ 30 min ๋์
๊ต๋ฐ์ ์ค์ํ๋ค. ์ข ๋ฃ ํ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ๊ธฐ(ํ์ผ์ฌ์ด์ธ์ค, supra22k)๋ฅผ
์ด์ฉํ์ฌ 8,000 rpm, 30 min, 4 oC ์กฐ๊ฑด์ผ๋ก ๋ถ๋ฆฌ ํ ์๋ฑ์ก๊ณผ ์นจ์
๋ฌผ์ ๋ถ๋ฆฌ ์์ผฐ๋ค. ๋ด์ง์ฒด ๋๋๊ฐ ์ต์ข 10% (w/v)๊ฐ ๋๋๋ก ์ธ์ฒ์
์ถฉ์ฉ์ก(50 mM tris, pH 8.0)์ ์ด์ฉํ์ฌ ์ฌ๋ถ์ ์ํจ ํ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ๋ฅผ
ํ์ฌ ์๋ฑ์ก์ ์ ๊ฑฐํ๋ค. ์ด ๊ณผ์ ์ ์ด 3ํ ์ค์ํ์ฌ ์์ฌ triton X-
100์ ์ป์ด๋ธ ํ ์ต์ข ๋ด์ง์ฒด 80 g์ ์ป์๋ค.
Fig. 1. Schematic diagram of the recombinant expression vector pET-28a with Ub-VEGF165
gene and sequence of amplified PCR products.
Table 1. Media composition used in 20L-scale fermentation
Component Concentration (g/L)
D-sorbital 15
Yeast extract 10
Casein peptone 5
MgSO4
0.2
(NH4)2HPO
40.75
KH2PO
45.5
Ctric acid 0.2
372 ์ฑ๊ธฐํ ยท ๊น์ธํธ
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
2-3-2. His-tag ์นํ์ฑ(affinity) ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ์์ VEGF165 ์ ์
์ ์ฒด ๋ถ๋ฆฌ๊ณต์ ์ ๊ฐ์๋ Fig. 2์ ์ฃผ์ด์ก๋ค. ์ธ์ฒ๋ ๋ด์ง์ฒด๋ฅผ ์ต
์ข ๋๋๊ฐ 2% (w/v)๊ฐ ๋๋๋ก ๊ฐ์ฉํ ์์ถฉ์ฉ์ก(2 M urea, 20 mM
tris, 5 mM 2-mercaptoethanol, 500 mM NaCl, pH10.0)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ
์์ ๋ถ์ ์ํจ ํ ํญ์จ์์กฐ์ 37 oC๋ก 30๋ถ ๋์ ๋ฐฉ์น ์์ผฐ๋ค. ์จ
๋๋ฅผ 25 oC ์ดํ๋ก ๋ด๋ฆฐ ํ pH๋ฅผ 8.8๋ก ์ฒ์ฒํ ์กฐ์ ํ๊ณ 30๋ถ ๋์
๊ต๋ฐ ์ํจ๋ค. ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ๊ธฐ๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ 14000 rpm, 20 min, 4 oC ์กฐ๊ฑด
์ผ๋ก ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ๊ณ ๊ฐ์ฉํ ๋ ์๋ฑ์ก๋ง ์ทจํ์๋ค. ๊ทธ๋ฆฌ๊ณ 0.45 ยตm
capsule filter (Satorious Korea)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์ฌ๊ณผํ์๋ค.
1์ฐจ his-tag ์นํ์ฑ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ์ํด์ BPG100/500
(Amersham Phamasia Biotech)์ปฌ๋ผ์ Ni Sephaose 6 fast flow (GE
Healthcare)resin 0.5 L์ ์ถฉ์ง ํ์๋ค. ์ ์ 100 ml/min์ผ๋ก ์ ์ ์๋ฅผ
ํ๋ ค์ ๋ณด์กด์ก 20% ethanol์ ์ ๊ฑฐํ๊ณ , ํํ ์์ถฉ์ฉ์ก(2 M urea,
20 mM tris, 5 mM 2-mercaptoethanol, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole,
pH 8.8)๋ฅผ 10 CV ๋ถํผ๋ก ํ๋ ค์ UV ๊ธฐ์ค์ ์ ์์ผ๋ก ์์ ์์ผฐ๋ค.
์์ ํ ํ VEGF165 ์ํ์ ํฌ์ ํ๋ฉด์ ๋น๊ฒฐํฉ๋ flow through๋ฅผ
๋ฐ์ ๋์๋ค. ๋ค์ ํํ ์์ถฉ์ฉ์ก์ผ๋ก UV๊ฐ ๊ธฐ์ค์ ์ผ๋ก ๋จ์ด์ง ๋
๊น์ง ์ธ์ฒํ์๋ค. Ni ์ ค์ ๊ฒฐํฉ๋ VEGF165๋ฅผ ์ฉ๋ฆฌ ์์ถฉ์ฉ์ก(2 M
urea, 20 mM tris, 5 mM mercaptoethanol, 500 mM NaCl, 250 mM
imidazole, pH 8.8)์ ํ๋ ค ํ์ฐฉ์์ผฐ๋ค.
๊ทธํ UF/DF ํ์ธ์ฌ๊ณผ์ฅ์น(pellicon, PLCCC-C, 5k)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ
ํจ์ ๋ถํด์ฉ ์ฉ์ก(0.5 M urea, 20 mM tris, 1 mM mercaptoethanol,
250 mM NaCl, pH 8.5)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ 2๋ฒ์ฉ 10ํ ์์ถฉ์ฉ์ก์ ๊ตํํ์ฌ
์ํ ๋ด urea ๋๋๋ฅผ ๋ฎ์ถ๊ณ , imidazole์ ์ ๊ฑฐํ์๋ค. ์ด์ด์ ํจ์
๋ฐ์์ ์ํด Ubp1 (ubiqitin specific protease-1, ์ฐจ๋ฐ์ด์ค์ค๋์ค์ค
ํ )์ 10% (v/v)๋๋๋ก ์ฒ๋ฆฌ ํ ํญ์จ ์์กฐ์์ 37 oC, 2์๊ฐ๋์
๋ฐ์์์ผฐ๋ค. ๋ฐ์์ข ๋ฃ ํ ๋ถ๋ฆฌ๋ His-ubiquitin fusion tag์ 1์ฐจ ์น
ํ์ฑ ์ปฌ๋ผ ์ ์ ์์ ๊ฒฐํฉ๋์๋ ๋ถ์๋ฌผ์ ์ ๊ฑฐํ๊ธฐ ์ํ์ฌ 2์ฐจ ์น
ํ์ฑ ์ปฌ๋ผ ์ ์ ๋ฅผ ์งํํ์๋ค. ์ด๋ฏธ ์ถฉ์ง๋ ์นํ์ฑ ์ปฌ๋ผ์ ์ธ์ฒ์ฉ
์ก(1 M imidazole, 0.5 M NaCl, 1 M NaOH)์ผ๋ก 2 CV (column
volume)ํ๋ฆฐ ํ ์ ์ ์๋ฅผ ์ถฉ๋ถํ ํ๋ ค์ ์ ๋๋๋ฅผ ๋ฎ์ถ์๋ค. ์ธ์ฒ ํ
100 mM NiSO4 ์ฉ์ก์ผ๋ก 2 CV ํ๋ฆฐ ํ 30 min ๋์ ์ฌ์ํํ๋ฉฐ
์นผ๋ผ์ ์ฌ์์์ผฐ๋ค. 2์ฐจ ์นํ์ฑ ์ปฌ๋ผ์ ํํ์์ถฉ์ฉ์ก(0.5 M urea,
20 mM tris, 1 mM mercaptoethanol, 500 mM NaCl, 40 mM imidazole,
pH 8.5)์ ์ ์ 100 ml/min๋ก ํ๋ ค ์์ ํ์ํจ ํ, ๋ฐ๋ก ์ํ์ ํ
ํ์์ถฉ์ฉ์ก ์กฐ๊ฑด์ ๋ง์ถ์ด ์ฌ์กฐ์ฑํ์ฌ ํฌ์ ํ๊ณ , ์นํ์ฑ ์นผ๋ผ์
his-ub fusion tag์ ๊ธฐํ ๋ถ์๋ฌผ์ ๊ฒฐํฉ์ํค๊ณ , VEGF๊ฐ ํจ์ ๋
flowthrough (FT) ๋ถํ์ ์์งํ๋ค. ์นํ์ฑ ์นผ๋ผ์ ๊ฒฐํฉ๋ fusion tag๊ณผ
๋ถ์๋ฌผ๋ค์ ์ฉ๋ฆฌ์์ถฉ์ฉ์ก(0.5M urea, 20mM tris, 1mM mercaptoethanol,
500 mM NaCl, 0.5 M imidazole, pH 8.5)๋ก ์ ๊ฑฐํ๊ณ FT์์ SDS-
PAGE ์ ๊ธฐ์๋์ ํตํด์ VEGF165๋ฅผ ํ์ธํ์๋ค.
2-3-3. ์ด์จ ๊ตํ ๋ฐ ์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ
์ดํฉ์ฒดํ ๊ณต์ ์ ์ํด 2nd His-tag ์นํ์ฑ ์ปฌ๋ผ์ FT/์ธ์ฒ ๋ถํ์
20 mM tris, pH 9.0๋ก ํฌ์ํ์ฌ ๋ถํผ๋ฅผ ์กฐ์ ํ๋ค. ์ดํฉ์ฒดํ์ ์ํ์ฌ
2 ๋จ๊ณ๋ก ๋๋์ด ํฌ์์ ์งํํ๋ค. 1๋ฒ์งธ ํฌ์์ 20 mM tris,
200 mM NaCl, 0.2 M L-arginine, pH 9.0์ ์์ถฉ์ฉ์ก์ผ๋ก 2๋ฒ์ฉ 10ํ
์์ถฉ์ฉ์ก ๊ตํ์ ํ๋ค. 2๋ฒ์งธ๋ 20 mM sodium phosphate, 20 mM
NaCl pH 7.6์ ์์ถฉ์ฉ์ก์ผ๋ก 2๋ฒ์ฉ 10ํ ์์ถฉ์ฉ์ก ๊ตํ์ ํ๋ค.
์์ถฉ์ฉ์ก ๊ตํ ํ DEAE sepharose fast flow (GE Healthcare)
50 ml์ XK50 ์ปฌ๋ผ(Amersham phamasia Biotech)์ ์ถฉ์งํ๊ณ ,
FPLC (GE Healthcare, Aktaprime plus)์ ์ฐ๊ฒฐํ์๋ค. ์ ์ 20 ml/min
๋ก ํํ์์ถฉ์ฉ์ก(20 mM sodium phosphate, 20 mM NaCl, pH 7.6)๋ก
์์ ํ๋ฅผ ์ํค๊ณ , ์ํ์ ํฌ์ ํ์๋ค. FT๋ฅผ ์์งํ๊ณ , ํํ์์ถฉ์ฉ
์ก์ผ๋ก ๊ธฐ์ค์ ์ผ๋ก ๋จ์ด์ง ๋๊น์ง ์ธ์ฒํ์ฌ ์ด๋ฅผ FT์ ๊ฐ์ด ์์ง
ํ๋ค. ์ฉ๋ฆฌ๋ NaCl ๋๋๋ฅผ 50/100/150/200 mM ๊ณ๋จ์์ผ๋ก ๋๋๋ฅผ
๋์ฌ๊ฐ๋ฉฐ ์ํํ์๋ค.
FT, ์ธ์ฒ ์ํ์ ๋ชจ์ ์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ ์ถฉ์ง์ ๋ถํผ์
1%๊ฐ ๋๋๋ก ๋์ถ์ ์ค์ํ์๋ค. ์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ํ๊ธฐ
์ํ Sephacryl S-200๋ฅผ XK16/100 ์ปฌ๋ผ์ ์ถฉ์งํ๊ณ , FPLC์ ์ฐ
๊ฒฐํ ํ ํํ์์ถฉ์ฉ์ก(10 mM sodium phosphate, 137 mM NaCl,
pH 7.6)๋ฅผ ์์ ํ ๋ ๋๊น์ง ์ถฉ๋ถํ ํ๋ ค ์ฃผ์๋ค. ๋์ถ ์ํ์ ํฌ์
ํ๊ณ , ์ ์ 1 ml/min์ผ๋ก ์ค์ ํ์ฌ ํํ์์ถฉ์ฉ์ก์ ํ๋ ค ์ฃผ์๋ค.
UV ์ ํธ๊ฐ ๊ฒ์ถ๋๊ธฐ ์์ํ๋ฉด fraction collector๋ก 10 ml์ฉ ์์งํ
์๋ค. ์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ์ ์ฉ๋ฆฌ ๋ถํ ์ค ์ ๊ธฐ์๋ ์๋๊ฐ ๋์
๋ถํ์ ๋ชจ์์ Lowry๋ฒ์ผ๋ก ๋จ๋ฐฑ์ง ๋๋๋ฅผ ์ธก์ ํ์๊ณ , ์ต์ข ๋๋๊ฐ
0.5 mg/ml์ด ๋๋๋ก ๋์ถ์ ์ค์ํ์๋ค. ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ์ ์กฐ๊ฑด์
Table 2์ ์ ๋ฆฌํ์๋ค.
2-4. ํน์ฑ๋ถ์
์๋์ ๋ถ์๋ ๋น๊ต ๋ฐ ์๋ ํ์ธ์ ์ํด ํ์, ๋นํ์ ์กฐ๊ฑด์์์
์ ๊ธฐ์๋์ ์งํํ์๋ค. Laemmli SDS-PAGE ์ ๊ธฐ์๋ ๋ฐฉ๋ฒ์ ๋ฐ๋ผ
15% ์ ค ๋๋์ SDS-PAGE๋ฅผ ์กฐ์ ํ์ฌ 200 V, 60 mA, 55๋ถ๋์
์ ๊ธฐ์๋ ํ์๋ค. ์ด ํ Coomasie blue ์ผ์๋ฒ์ผ๋ก ์ ค ์ผ์ํ์๋ค.
๋จ๋ฐฑ์ง ๋๋ ๋ถ์์ Lowry๋ฒ์ผ๋ก ์ํํ์๋ค. 0.4 mg/ml BSA
ํ์คํ์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ํ์ ์ฌ์ฉ๋ ๋์ผํ ์์ถฉ์ฉ์ก์ผ๋ก ํฌ์ํ์ฌ ๊ฐ
๊ฐ 20/40/60/80 ยตg/ml๋ก ๋ง๋ค์๋ค. ํ์คํ, ๋จ๋ฐฑ์ง ์๋ฃ, ์์ถฉ์ฉ์ก์
๋์ผํ๊ฒ 750 ฮผL์ฉ ์ํ๋๋ฅดํ ํ๋ธ์ ์ทจํ๋ค. ๊ฐ๊ฐ์ ํ๋ธ์ ์
์นผ๋ฆฌ์ฑ ์ก์ 625 ฮผL๋ฅผ ๋ฃ๊ณ , ์ ์์ ํ, ํญ์จ์์กฐ์์ 30 oC, 10๋ถ๊ฐ
๋ฐฉ์นํ๋ค. ๋ฐ์์ด ๋๋๋ฉด ๊ฐ๊ฐ์ ํ๋ธ์ ํ๋์์ฝ(folin-ciocalteu
Fig. 2. Schematic of rhVEGF165 purification process for scale-up
production.
์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ด์ฉํ ์ฌ์กฐํฉ ์ธ๊ฐ ํ๊ด๋ดํผ์ธํฌ ์ฑ์ฅ์ธ์์ ์ ์ ๊ณต์ ๊ฐ๋ฐ 373
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
reagent)์ 125 ฮผL์ฉ ๋ฃ๊ณ ์ ์์ ํ, ํญ์จ์์กฐ์์ 30 oC, 30๋ถ๊ฐ
๋ฐฉ์นํ๋ค. ๋ฐ์์ด ๋๋๋ฉด UV-Vis Spectrophotometer๋ก 750 nm ํ
์ฅ์์ ํก๊ด๋๋ฅผ ์ธก์ ํ์ฌ ํ์ค๊ณก์ ์ ์์ฑํ์๊ณ ๋จ๋ฐฑ์ง ์ํ์
๋๋๋ฅผ ๊ฒฐ์ ํ์๋ค.
VEGF165์ ์ญ์ HPLC ์์์ ์๋ ํ์ธ์ ์ํ ์คํ์ ์งํ
ํ์๋ค. ์ด๋์ A (์ฆ๋ฅ์ 1 L์ TFA 1 mL), ์ด๋์ B (Acetonitrile 1
L์ TFA 1 mL.)์ ์ ์กฐํ์๋ค. Shimadzu HPLC System (.System
controller CBM-20A, Solvent Delivery System LC-20AD .UV-VIS
Detector SPD-20A, ์ญ์์ปฌ๋ผ Vydac C18)์ผ๋ก ์ค๋น๋ ์ด๋์์ ์ ์
1 ml/min, ํ์ฅ 280 nm, Stop Time 70๋ถ(๋ฐ์ดํฐ๋ฅผ ๋ถ์ํ๋ ์๊ฐ),
LC Time 70๋ถ(๊ธฐ๊ธฐ์ ๊ฐ๋์๊ฐ), ๊ธฐ์ธ๊ธฐ ์กฐ๊ฑด(1. Sample Injection 2.
20% ์ด๋์ B~0.01๋ถ 3. 1๋ถ๋น 1% ์ฉ ์ด๋์ B ์ฆ๊ฐ(0.01 to 40 min)
4. 5๋ถ ๋์ 60% ์ด๋์ B ์ ์ง(40 to 45min), 5. 1๋ถ๋น 12% ์ด๋
์ B ๊ฐ์(45 to 50 min) 6. 20๋ถ ๋์ 0% ์ด๋์ B ์ ์ง(50 to 70 min))
์ ํ๋ก๊ทธ๋จํ์๊ณ , ์ฃผ์ ๋์ 20 ยตl๋ก ์ค์ ํ์๋ค. ํ์คํ์ ๋๋๊ฐ
0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml ๋๋๋ก 10 mM ์ธ์ฐ์ผ saline
์์ถฉ์ก(pH 7.6)์ผ๋ก ํฌ์ํ๋ค.
3. ์คํ๊ฒฐ๊ณผ ๋ฐ ํ ์
3-1. E.coli์์ ์ฌ์กฐํฉ human VEGF165 ๋ฐํ ์์นํ์ธ
BL21 (DE3)์ cloning ๋ VEGF165 ๋ฐํ์ ๋ฐฐ์ ๋ฐ ์ ๋๋ฅผ ํ
์๊ณ , Novagen pET system manual์ verification protocol์ ๋ฐ๋ผ
์งํํ์๋ค. pET28a (+)๋ 5,369bp, T7 promotor, Kanamycin ์
ํญ๋ฅ์ ๊ฐ์ง๊ณ ์๋ค. ์ธํฌ ์ํ ํ ๋์ฅ๊ท ์ธํฌ์ ๋ฐํ ์ ๋๋ฅผ Fig. 3
๊ฐ์ด ํ์ธํ์๋ค.
์ ๋ ์ ยทํ์ ์ธํฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ๊ธฐ์๋ํ ๊ฒฐ๊ณผ ๋ฐํ ํ์ธ์ด ๊ฐ๋ฅ
ํ๋ค. ๋จ๋ฐฑ์ง ํํ๋ 6รHistidine (0.84 kDa)-Ubiqutin (8.5 kDa)-
VEGF165(์ฝ 21.5 kDa)์ผ๋ก ์์ ๋ถ์๋์ ์ฝ 32 kDa์ ๋๊ณ ์๋ค.
ํ์ ๋ ์ธํฌ์์ ๋ฐํ ์์น๋ฅผ ํ์ธํ ๊ฒฐ๊ณผ lane 4๋ฒ์ periplasm์
์ญ์์๋ ๊ฑฐ์ ์กด์ฌํ์ง ์์๊ณ , lane 5๋ฒ๊ณผ 6๋ฒ์์ ๋ฐํ๋จ์ ํ
์ธํ๋ค. ๊ทธ ์ค ๋ชฉ์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ด ๋ถ์ฉ์ฑ์ ๋ด์ง์ฒด๋ก ํ์ฑ๋จ์ ํ์ธํ
์๋ค. Ubiquitin ์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ํฅ์ผ๋ก ์ฉํด์ฑ ๋จ๋ฐฑ์ง์ผ๋ก ๋ฐํ๋
๊ฒ์ด๋ผ๋ ์์๊ณผ๋ ๋ฌ๋๋ค. ๋ด์ง์ฒด๊ฐ protease์ ๋ํ ์ ํญ์ฑ์ด ์์ด
๋จ๋ฐฑ์ง์ด ์ ์ง๋๋ ์ฅ์ ์ ๊ฐ์ง ์ ์๊ณ , ํนํ ์ ์ ๊ณต์ ์์ ์จํํ
์กฐ๊ฑด์ผ๋ก ๊ฐ์ฉํ ๋จ์ ๋ฐ๊ฒฌํ์๋ค. ๋ฐ๋ผ์ ์ ๋๋์ urea๋ฅผ ์ฌ์ฉํ
์ ์์๋ค.
3-2. ์ฌ์กฐํฉ ๋์ฅ๊ท ์ 20 L ๋ฐฐ์ ๋ฐ ๋ฐํ
๋ณธ๋ฐฐ์์ ํ๊ธฐ ์ 2๋จ๊ณ์ ์ข ๋ฐฐ์์ ์งํํ์๊ณ , ๊ทธ ์กฐ๊ฑด ๋ฐ ๊ฒฐ
๊ณผ๋ 1์ฐจ ์ข ๋ฐฐ์์ 20 ml ๋ฐฐ์์ก์ 37 oC, 5์๊ฐ 30๋ถ ๋ฐฐ์ ๊ฒฐ๊ณผ
OD 0.8์ด์๊ณ , 2์ฐจ ์ข ๋ฐฐ์์ ๋ฐฐ์ ๋ถํผ๋ ๋ณธ๋ฐฐ์ ๋ถํผ์ 1%์ธ
200 ml์ 37 oC, 6์๊ฐ 10๋ถ๋์ ๋ฐฐ์ํ์ฌ ์ต์ข OD๋ 1.2๋ฅผ ์ป์
๋ค. ๋ณธ๋ฐฐ์์ ์ ์ข ํ ์ ๋ํ๊ธฐ ์ ๊น์ง OD๋ 3.4์๊ณ , ์ ๋๋ฅผ ์ํด
์ต์ข ๋๋ 1 mM์ด ๋๋๋ก IPTG ์ฒจ๊ฐ ํ 5์๊ฐ ๋ฐฐ์ํ์ฌ ์ต์ข OD๋
12.7์ด์๋ค. ํ์๋ ์ธํฌ์์ 280 g (14 g/L)์ด์๋ค. Fig. 4 ์ ๊ธฐ์
๋ ์ฌ์ง์ lane 1์ ์ ๋ ๋ค์ด๊ฐ๊ธฐ ์ง์ OD 3.4 ์ํ์ ์ํ์ด๊ณ ,
lane 2๋ ์ ๋ ํ 5์๊ฐ ์ถ๊ฐ ๋ฐฐ์ํ OD 12.7์ ์ํ์ด๋ค. ์ฌ์ ์
cloning ํ ๋ฐํ ํ์ธ ๋์ ๋์ผํ ์์น์ ๋ฐด๋๋ฅผ ํ์ธํ์๋ค.
3-3. ์ ์ ๊ณต์ ๋ณ SDS-PAGE ์๋ ํ์ธ
3-3-1. ๋ด์ง์ฒด ๊ฐ์ฉํ
Fig. 5์์ ์ธํฌ ํ์์ก(์๋ฑ์ก+์นจ์ ๋ฌผ, lane 2~4) ์ ๊ธฐ์๋ ๋ฐด๋๋ฅผ
lane 5๋ฒ๊ณผ lane 6๋ฒ๊ณผ ๋น๊ตํ๋ฉด ๋ด์ง์ฒด ์ธ์ฒ ํ ๋จ๋ฐฑ์ง์ด ์๋ฑ์ก์ผ๋ก
๊ฑฐ์ ์ ์ถ๋์ง ์์๋ค. lane 2~4๋ฒ๊ณผ ๋น๊ตํด ๋ณด์์ ๋ lane 7๋ฒ์
์ต์ข 3์ฐจ ๋ด์ง์ฒด ์ธ์ฒ ํ ์นจ์ ๋ฌผ์์ ์๋๊ฐ ๊ฐ์ ๋ ๋ด์ง์ฒด๋ฅผ ํ์ธ
ํ ์ ์์๋ค. Triton X-100์ด cell debris์ ๋ถ์ฐฉ๋ ๋ถ์ ๋จ๋ฐฑ์ง์
์ ์ ๊ฑฐํ๊ธฐ ์ํด 150 mM NaCl์ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ ๋ด์ง์ฒด์ ์๋๋ฅผ ์ฆ์ง
์์ผฐ๋ค.
3-3-2. 1์ฐจ his-tag ์นํ์ฑ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ
๋จ๋ฐฑ์ง์ histidine ์๊ธฐ๋ค์ด ๊ณ ์ ํ๋ ๊ธ์๋ค์ ๊ฒฐํฉํ๋ ํ์์
Table 2. Chromatography process details
Parameter 1st Ni sepharose FF 2nd Ni sepharose FF DEAE sepharose FF SephaARYL S-200
Resin volume 0.5 L 0.5 L 200 ml 4 L
Column BPG 100/500 BPG 100/500 XK 50 XK 16/100
Volume flow rate (ml/min) 150 150 30 1
Operating mode Bind-elute Flow through Flow through Flow through
EQ/washing
2 M urea, 20 mM tris,
5 mM 2-mercaptoehanol,
500 mM NaCl, pH8.8
0.5 M urea, 20 mM tris,
1 mM mercaptoehanol, 500 mM NaCl,
40 mM imidazole pH8.5
20 mM sodium phosphate,
20 mM NaCl, pH7.6
10 mM sodium phosphate,
137 mM NaCl, pH7.6
Elution EQ-200 mM imidazole EQ-500 mM imidazole EQ-1 M NaCl EQ
Fig. 3. Verification of localization of recombinant human VEGF165
expressed in E.coli through SDS-PAGE: lane 1, protein size
marker; lane 2, total cell protein before induction; lane 3,
total cell protein after induction; lane 4, periplasmic space;
lane 5, soluble cytoplasm fraction; lane 6, insoluble cyto-
plasm fraction.
374 ์ฑ๊ธฐํ ยท ๊น์ธํธ
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
์ด์ฉํ์ฌ his-tag ์นํ์ฑ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ์ํํ์๋ค. ์๊ธฐ ์คํ์
์ํด์ ์๋น์คํ์ผ๋ก ๊ฒฐํฉ ์ฌ๋ถ ๋ฐ ์ฉ๋ฆฌ ์กฐ๊ฑด์ ํ์ธํ์๋ค. ๋จผ์ ์ ค์
XK16/20 ์ปฌ๋ผ์ ์ถฉ์งํ์ฌ ํ ์คํธํ์๋ค. Urea๋ 2-mercaptoethanol,
EDTA๋ ๊ฒฐํฉ๋ฅ์ ๋จ์ด๋จ๋ฆฌ๊ธฐ ๋๋ฌธ์ ๊ธฐ์ค ๋ถํผ(12 mg His-tag
protein/ml ์ ค)๋ณด๋ค 1.5๋ฐฐ ๋ ์ถฉ์งํ์๊ณ , ์ฉ๋ฆฌ๋ imidazole ๋๋ ๊ธฐ
์ค์ผ๋ก 50/100/150/200/250 mM ๊ณ๋จ์ ์ฉ๋ฆฌ๋ฅผํ์๋ค. ์๋น ์คํ
๊ฒฐ๊ณผ(Fig. 6) his-tag ๋จ๋ฐฑ์ง์ด Ni ์ ค์ ๋ํ ์นํ์ฑ์ ๊ฐ์ง๊ณ ์์ค
์์ด ์ ๊ฒฐํฉํ์๋ค. ํ์ง๋ง 100 mM์ 200 mM ์ฌ์ด์์ ๋์๋ค๋
๊ฒ์ urea์ mercaptoethanol์ ๊ฐ์ญ ํจ๊ณผ๋ก ์ตํฉ๋จ๋ฐฑ์ง์ด ์ฝํ๊ฒ
๊ฒฐํฉ๋จ์ ์๋ฏธํ๋ค.
์ด ๋ฐ์ดํฐ๋ฅผ ๊ฐ์ง๊ณ ์ค์ scale-up๊ณต์ ์์๋ ์ฉ๋ฆฌ ์กฐ๊ฑด์
250 mM imidazole ๋๋๋ก ์ ํ์ฌ ์คํ์ ํ์๋ค(Fig. 7) Scale up
๊ณต์ ์์์ ์ํ ํฌ์ ์์ FT์ผ๋ก ์ฝ๊ฐ์ ์์ค์ด ๋ฐ์ํ์๊ณ , ์ฉ
๋ฆฌ ์์ ๋ถ๋ฆฌ ๋์ง ์๋ ๋ถ์๋ฌผ์ด ์์๋ค.
3-3-3. Ubp1์ ์ํ ubiquitin-fusion tag ์ ๋จ
๊ธฐ์กด Ubp-1๊ด๋ จ ๋ ผ๋ฌธ์ด๋ ์ค์ ํ์ฑ์กฐ๊ฑด์ ์ธก์ ํ ๋ฐ์ดํฐ๋ฅผ ๊ธฐ
๋ฐ์ผ๋ก ์คํํด๋ณธ ๊ฒฐ๊ณผ ์ค์ ์์ธ์ NaCl ๋๋, pH, ์จ๋, ์๊ฐ์ด์๋ค.
ํ์ง๋ง ์ดํฉ์ฒดํ ์ ๊น์ง ํ์๋๊ณ ๋นํ์ฑ ์ํ์ ์ํ์ ํจ์๋ฐ์์ด
๋์ง ์์๋ค. ์ด๋ ubp-1์ด ์ํ ์์์ urea์ mercaptoehanol์
์ํด ํจ์ ํ์ฑ์ด ์ ํ๋๋ ๊ฒ์ผ๋ก ์ฌ๋ฃ๋์๋ค. ๊ทธ๋์ urea๋๋๋ฅผ
ํฌ์ํ์ฌ ์คํํ ๊ฒฐ๊ณผ 0.5 M urea ์กฐ๊ฑด์์ ์ํ์ ์นจ์ ๋ ๊ฑฐ์ ์
๊ณ , ๋ฐ์ ์์จ์ด ๋์๋ค. ๊ทธ๋์ UF/DF system์ ์ด์ฉํ์ฌ ์ต์ ์กฐ
Fig. 5. 15% SDS-PAGE anlysis of washed inclusion body after cell
disruption : lane 1, protein size marker; lane 2, total cell
protein before disruption(cell conc. 15%); lane 3, total cell
protein after disruption; lane 4, total cell protein treated by
triton X-100; lane 5, soluble fraction after 1st washing step;
lane 6, soluble fraction after 2nd washing step; lane 7, insol-
uble fraction after 3th washing step.
Fig. 6. Preliminary 1st Ni chromatography test in XK 20 column by using stepwise elution: lane 1, protein size marker, lane 2, loading, lane 3,
flow through, lane 4, 1st washing fraction (2 CV); lane 5, 2nd washing (2 CV); lane 6, elution 50 mM (3 CV); lane 7, elution 100 mM (3
CV); lane 8, elution 150 mM (3 CV); lane 9, elution 200 mM (3 CV); lane 10, elution 250 mM (3 CV).
Fig. 4. 15% SDS-PAGE analysis of expressed his-ub-VEGF165
in
20 L scale - fermentation.: lane 2, cell growth step before
induction; lane 3, expression of VEGF165 after induction.
์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ด์ฉํ ์ฌ์กฐํฉ ์ธ๊ฐ ํ๊ด๋ดํผ์ธํฌ ์ฑ์ฅ์ธ์์ ์ ์ ๊ณต์ ๊ฐ๋ฐ 375
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
๊ฑด์ธ 0.5 M urea, 20 mM tris, 1 mM mercaptoehanol, 250 mM NaCl,
pH 8.5๋ก ์์ถฉ์ฉ์ก ๊ตํ ํ ubp1 10% (v/v)์ฒ๋ฆฌํ์๋ค. ์คํ๊ฒฐ๊ณผ
Fig. 8๋ฅผ ๋ณด๋ฉด ์ฝ 70%์ ๋ฐ์ ์์จ์ ๋ณด์๋ค. ์์ถฉ์ฉ์ก ๊ตํ ๊ณผ์
์์ urea์ 2-mercaptoethanol์ ๋๋๊ฐ ๋ฎ์์ง๋ฉด์ VEGF์์
์ ๋๋ ์ดํฉ์ฒด ๋ฐ ํด๋ฆฌ๋จธ๋ฑ์ ๋ถ์๋ฌผ๋ค์ด ๋ณด์๊ณ , ํจ์๋ฐ์ ํ์
๊ทธ ๋ถ์๋ฌผ ๋ฐด๋์์ ์๋ฆฐ ๋ฐด๋๋ฅผ ๊ด์ฐฐํ ์ ์์๋ค.
3-3-4. 2์ฐจ his-tag ์นํ์ฑ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ์ด์ฉํ fusion tag ์ ๊ฑฐ
์ด ๊ณต์ ์์ ๋ฐ์๋์ด ์๋ ค์ง VEGF165๋ง ํ์ํ๊ณ , 1st his-tag
์ ์ ๊ณต์ ์์ ๋นํน์ด์ ์ผ๋ก ๊ฒฐํฉ๋์๋ ๋ถ์ ๋จ๋ฐฑ์ง๊ณผ ์๋ ค์ง
his-ubiquitin fusion tag์ Fig. 9์์ ๋ณด๋ฏ์ด ๋ถ๋ฆฌํ์๋ค. loading์
์ ๋ณด์ด๋ ๋ฐด๋๋ uncut-VEGF monomer, uncut-VEGF dimer, cut-
VEGF monomer, cut-VEGF dimer ๊ทธ๋ฆฌ๊ณ his-ub tag ๋ฐด๋๊ฐ ์๋๋ฐ,
์ด ์ค VEGF monomer์ ๋ชฉ์ ํ๋ VEGF dimer๊ฐ FT, washing
fraction์ผ๋ก ๋น ์ ธ๋์๊ณ , ์ฉ๋ฆฌ ๋ถํ์์ histidine-ubiquitine fusion
tag์ ํ์ธํ์๋ค.
3-3-5. DEAE ์์ด์จ ๊ตํ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ
์ด ๋จ๊ณ์์ ์ดํฉ์ฒดํ(dimerization)์ ์ฌ์ ํ(refolding)์ ์ํ
ํ๊ณ ์ด์จ๊ตํํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ ์ฃผ์ ์ํ์ ๋ง๋ค์๋ค. ๋ณ์ฑ์ ์ ํ
์์ ๊ฐ ์ ๊ฑฐ๋๋ฉด์ ์ดํฉ์ฒด์ธ์๋ ์์ง์ฒด ๋ฐ oligomer ํํ๊ฐ ๋๋
๋ฐ ์ด๋ฅผ ๋ง๊ธฐ ์ํด์ 2๋จ๊ณ๋ก ๋๋์ด ๋ง์ ์ด์ฉํด ์์ถฉ์ฉ์ก ๊ตํ์
์งํํ์๋ค. 1๋ฒ์งธ๋ 20 mM tris, 0.2 M L-arginine, 0.2 M NaCl,
pH 8.5์ ์กฐ๊ฑด์ผ๋ก ์ํํ์ฌ ์ํ์ urea์ 2-mercaptoethanol์
์์ ํ ์ ๊ฑฐํ๋ฉฐ ์์ง์ฒด๋ฅผ ๋ฐฉ์งํ์๊ณ , 2๋ฒ์งธ๋ 20 mM sodium
phosphate, 20 mM NaCl, pH 7.6์ผ๋ก ์์ถฉ์ฉ์ก์ ๊ตํํ๋ฉฐ ์ดํฉ์ฒด
ํ์ ์์จ์ ๋์๋ค.
์ดํฉ์ฒดํ ํ ๋์ถ๊ณผ์ ์์ ๋ณด์ด์ง ์์๋ oligomer protein๋ค์
์ ๊ฑฐ๊ฐ ํ์ํ๋ฐ, DEAE ์์ด์จ ๊ตํ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๊ฐ ๊ทธ
oligomer๋ค์ ์ ๊ฑฐ์ ํ์ํ ํจ๊ณผ๋ฅผ ๋ณด์ฌ ์ฃผ์๋ค. Fig. 10 ๊ฒฐ๊ณผ ์ค
lane2์ lane5๋ ๊ฐ๊ฐ ๋์ถ ํ์ DEAE ์์ด์จ ๊ตํ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋
ํผ ํฌ์ ์ํ์ ํ์ํ ๋นํ์ํ์ด๋ค. ์ด์ ์ ์ํํ ์ดํฉ์ฒดํ ๊ณต์
์ํ๊ณผ ๋ฌ๋ฆฌ ๋ง์ ๋ณํ์ฒด(VEGF monomer or aggregate species,
misfolds)๊ฐ ํ์ฐํ ๋ํ๋ฌ๋ค. ์ด ์ ์ ๊ณต์ ์ ํตํด monomer๋ฅผ ์
์ธํ ๋๋จธ์ง ๋ณํ์ฒด๋ ์ ๊ฑฐ๊ฐ ๊ฐ๋ฅํ๋ค. ์ด๋ pH 7.6์์ ์ ๋๋ก
์ ํ์ง VEGF๋ ํ๋ฉด์ ์ด ์ ํ๊ฐ์ด 0์ ๊ฐ๊น์์ง๋ฉด์ DEAE ์ ค๊ณผ
์ํธ์์ฉ์ ํ์ง ๋ชปํ์ฌ FT๋ก ๋น ์ ธ๋์๋ค. ๋ณํ์ฒด๋ค์ pH 7.6 ๊ทผ์ฒ
๊ตฌ๊ฐ์์ ์๋์ ์ผ๋ก ๋ ๊ฐํ ์์ฑ(โ) ์ ํ๋ฅผ ๊ฐ๊ฒ ๋จ์ผ๋ก์จ ์ด์จ
๊ตํ ์ ค์ ๊ฒฐํฉ๋์ด ์ ๊ฑฐ๊ฐ ๊ฐ๋ฅํ์๋ค.
3-3-6. ์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ
์์ DEAE ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ์์ ๋ถ๋ฆฌํ์ง ๋ชปํ monomer๋ฅผ ์
๊ฑฐํ๊ธฐ ์ํ ๊ณต์ ์ผ๋ก ์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ์ฑํํ์๋ค(Fig. 11).
์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ์ ๊ฒฝ์ฐ ํฌ์ ์ํ์ ๋ถํผ๊ฐ ์ ค ๋ถํผ์ 5%
์ดํ๊ฐ ๋์ด์ผ ๋ชฉ์ ํ๋ ํด์๋๋ฅผ ์ป์ ์ ์๊ธฐ ๋๋ฌธ์ DEAE ์
์ด์จ ๊ตํ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ FT์ ์ธ์ฒ ๋ถํ์ ๋ชจ์์ ์ ค ๋ถํผ์ 1%
์ธ 40 ml๊น์ง ๋์ถํ์๋ค. ๋์ถ๊ณผ์ ์์ oligomer๊ฐ ์๊ธฐ์ง๋ง ๋ถ์
ํฌ๊ธฐ์ ์ฐจ์ด๊ฐ ๋ง์ด ๋๋ oligomer์ ๊ฒฝ์ฐ ์ ค ๋ถํผ(4 L)์ ์ฝ 50%
Fig. 7. 1st Ni chromatography frations in scale-up stage: lane 1,
protein size marker; lane 2, loading; lane 3, flow through;
lane 4, 1st washing (2 CV); lane 5, 2nd washing (2 CV); lane
6, step elution 250 mM (5 CV).
Fig. 8. Identification of enzyme digestion reaction with 10% Ubp1:
lane 1, protein size marker; lane 2, dialysis of Ni column pool-
ing for enzyme reaction; lane 3, truncated VEGF165 after
enzyme reaction at 37 oC for 2 hours.
Fig. 9. 2nd Ni chromatography fration for puried monomer VEGF165:
lane 1, protein size marker; lane 2, loading sample; lane 3,
flow through fration; lane 4, elution fraction.
376 ์ฑ๊ธฐํ ยท ๊น์ธํธ
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
๋๋ ์(2 L)์ ์ฉ์ก์ด ํ๋ฅด๋ฉด ๋จผ์ ๋์ค๊ธฐ ์์ํ์ฌ ์ฉ์ดํ๊ฒ ๋ถ
๋ฆฌํ ์ ์์๋ค. ๋ถ์๋ ์ฐจ์ด๊ฐ ์์ dimer์ monomer์ ๊ฒฝ์ฐ
Sephacryl s-200์ผ๋ก ์์ ๋ถ๋ฆฌํ์ง ๋ชปํ์๋ค. UV recorder์์์๋
ํ ๊ฐ์ peak๋ก ํ์ธ๋์์ง๋ง Fig. 11์ SDS-PAGE๋ก ํ์ธ ๊ฒฐ๊ณผ
dimer VEGF๊ฐ ๋จผ์ ์ฉ์ถ๋์๊ณ , lane 9์์๋ถํฐ ํฌ๋ฏธํ๊ฒ monomer
๋ฐด๋๊ฐ ๋ณด์ด๊ธฐ ์์ํ์ฌ dimer ๋ฐด๋์ ๊ฒน์ณ ๋์๋ค. ๊ทธ๋ฌ๋ ์ดํฉ์ฒดํ
์์จ์ด ๋์์ monomer ๋น์จ์ ๋ฎ์๋ค. ํ์ ๋ fraction์ ๋ชจ๋
๋ชจ์ ๋จ๋ฐฑ์ง ๋๋๋ฅผ ๋ถ์ํ ๊ฒฐ๊ณผ 0.3 mg/ml์ด ๋์๋ค. TFF lab scale
system (Millipore)์ ์ด์ฉํ์ฌ ์ต์ข 0.5 mg/ml ๋๋๋ก ๋์ถํ๊ณ ,
SDS-PAGE๋ฅผ ํตํด์ ์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ ์ ์ ํ ์ํ ์๋๋ฅผ
์กฐ์ฌํ์๋ค.
3-4. ํน์ฑ๋ถ์
VEGF165์ ์๋๋ถ์ ๋ชฉ์ ์ผ๋ก SDS-PAGE์ ๊ธฐ์๋์ ์ค์ํ
์๋ค(Fig. 12). 15%์ ์ ค ๋๋ ์์์ ๋ชฉ์ ํ๋ ๋จ๋ฐฑ์ง์ 1~32๋ฐฐ๊น
์ง ์์ฐจ์ ํฌ์์ ํ์ฌ ์ต์ด ์์ก์ ์กด์ฌํ๋ ์ด ๋ถ์๋ฌผ ๋ฐด๋์ ํฉ์ด
๋ง์ง๋ง 32๋ฐฐ์ ์กด์ฌํ๋ VEGF165 ๋ชฉ์ ๋จ๋ฐฑ์ง๊ณผ ๋๋นํ์ฌ ๊ฐ์
์ ์ผ๋ก ์๋ํ์ธ์ ํด ๋ณด์๋ค. ์ด๋ ์ต์ด ์์ก์ VEGF165 band๋ฅผ
100%๋ผ ๋ณด์์ ๋ 32๋ฐฐ dilution band๋ ์ฝ 3.13%์ ๋ ๋๋ค๊ณ ๋ณผ
์ ์๋ค. ์ด๋ ์์ก VEGF165์ ์กด์ฌํ๋ ๋ถ์๋ฌผ band๊ฐ 32๋ฐฐ์
ํด๋นํ๋ VEGF165์ ๊ฐ์ band size๋ผ๋ฉด ์์ก์ ๋ถ์๋ฌผ band๋
3.13%๊ฐ ์กด์ฌํ๋ค๊ณ ํ๋จํ์ฌ ์๋๋ 96.87%๊ฐ ๋๋ค. Fig. 12์
๊ฒฐ๊ณผ์์ ๋ณด๋ฏ์ด (a)์ ๊ฒฝ์ฐ ํ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ ์ํ์ธ๋ฐ, ์ ํํ๊ฒ dimer
์์น์ ๋ํ๋ ๋ฐด๋๋ ํ์ sample buffer ์กฐ์ฑ ์ค 2-mercaptoethanol
Fig. 10. DEAE ion exchange chromatography for removing oligomer and endotoxin : lane 1, protein size marker; lane 2, concentrated DEAE
loading sample (reduced form); lane 3~4, blank; lane 5, concentrated DEAE loading sample (non-reduced form); lane 6, flow through
fraction; lane 7, washing fraction (2 CV); lane 8, 50 mM elution fraction (3 CV); lane 9, 1M elution fraction (3 CV).
Fig. 11. Gel filtration analysis through SDS-PAGE with reduced and non-reduced form : (A) lane 1, protein size marker; lanes 2~10, elution frac-
tions. (B) lane 1, protein size marker; lane 2, reduced form of concentrated gel filtration pool; lane 3, blank; lane 4, non-reduced form of con-
centrated gel filtration pool.
์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ด์ฉํ ์ฌ์กฐํฉ ์ธ๊ฐ ํ๊ด๋ดํผ์ธํฌ ์ฑ์ฅ์ธ์์ ์ ์ ๊ณต์ ๊ฐ๋ฐ 377
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
์ ์ฑ๋ถ์ด ์ฝํ์ฌ ๊ณต์ ์ ์ผ๋ก ๊ฒฐํฉ๋ ์ดํฉํ ๊ฒฐํฉ์ ์์ ๋์ด๋ด์ง
๋ชปํ ๊ฒ์ผ๋ก ํ๋จ๋๋ค. ๊ทธ ์ด์ ๋ ๊ทธ๊ฒ์ด ๋ง์ฝ VEGF165 ์ด์ธ์ ๋ถ
์๋ฌผ์ด๋ผ๊ณ ๊ฐ์ฃผ ์์ (b)์ ๊ฒฐ๊ณผ์ธ ๋นํ์ form์์๋ ๊ทธ ๋ถ์๋
์ด์ธ์ ์์น์์ ๋ฐด๋๋ฅผ ๋ณด์์ ๊ฒ์ธ๋ฐ, dimer์์น์ ๋จ์ผ๋ฐด๋๋ง
ํ์ธ ํ ์ ์๊ธฐ ๋๋ฌธ์ด๋ค.
์ต์ข ์ ์ ๋ VEGF165์ ์๋๋ฅผ ์ธก์ ํ๊ธฐ ์ํ RP-HPLC๋ฅผ ์ง
ํํ์๋ค. Fig. 13์์ VEGF165์ ์ฒด๋ฅ์๊ฐ์ ํ์ธํ๊ธฐ ์ํด ํ
์คํ ์ํ์ 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml์ ๋๋๋ก ๋ง๋ค์ด
๊ฐ๊ฐ ์ฃผ์ ํ์ฌ, ํ์คํ์ ์ฒด๋ฅ ์๊ฐ์ ์กฐ์ฌํ์๋ค. ์ฝ 18๋ถ ๋์์
3๊ฐ์ ํ์คํ์ด ๋์ผํ๊ฒ ๋์ค๋ ๊ฒ์ ํ์ธํ์๋ค. ์ต์ข ์ ์ ๋
VEGF165 ์ํ์ ์ฃผ์ ํ ๊ฒฐ๊ณผ ํ์คํ๊ณผ ๋์ผํ ์๊ฐ๋์ ๋์ด์
ํ์ธํ์์ง๋ง ์ฝ 23๋ถ ๋์ ์ฝํ ํผํฌ๊ฐ ๋ณด์๋ค. ์ด๊ฒ์ SDS-
PAGE gel ๋ถ์ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ์ฐธ๊ณ ํ๋ฉด monomer form์ผ๋ก ์์ธกํ์๋ค.
์ต์ข ์๋๋ >97%์์ ํ์ธํ์๋ค.
4. ๊ฒฐ ๋ก
pET-28a ๋ฐํ ๋ฒกํฐ๋ฅผ ์ด์ฉํ ์ฌ์กฐํฉ ๋์ฅ๊ท ์ ์ ์กฐํ์ฌ 20L-scale์
ํ๋ถ์ ๋ฐฐ์์ ์ต์ ํ ๋ ๋ฐฐ์๋ฐฐ์ง๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ wet cell weight
14 g/L์ ์ธํฌ๋ฐฐ์์ ํ์๊ณ , 6รhistidine-ubiquitine-VEGF165 (MW:
32 kDa)ํํ์ ์ตํฉ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ฝ 80 g์ inclusion body ํํ(์ธ์ฒ ํ
purified IB)๋ก ํ์ํ์๋ค.
์ตํฉ๋จ๋ฐฑ์ง์ his-tag๊ณผ Ni ์นํ์ฑ์ ์ด์ฉํ์ฌ Ni-affinity ํฌ๋ก๋ง
ํ ๊ทธ๋ํผ ๋ฅผ ์ํํ์๋ค. ์ฒซ ๋ฒ์งธ ์นํ์ฑ ์นผ๋ผ์์ 250 mM imidazole
์ฉ์ก์ผ๋ก ์ฉ๋ฆฌํ์ฌ ๊ณ ์๋์ ์ตํฉ๋จ๋ฐฑ์ง์ monomer ํํ๋ก์ ์
์ ๋ฅผ ํ์๊ณ ํจ์๋ฐ์์ ํตํ์ฌ his-ubiquitine tag์ ์ ๊ฑฐ ํ์๋ค.
๊ทธ ํ ํฌ์์ ํตํ์ฌ ์ฌ์ ํ์ ํ์๋ค. ํฌ์ ์ค ์์ง๋ฐฉ์ง๋ฅผ ์ํ ์
์นผ๋ฆฌ pH (9.0)์ํ์์ 200 mM NaCl, 200 mM L-arginine์ ์ฌ์ฉ
ํ์๊ณ , ๋ ๋ฒ์งธ๋ก pH 7.6์ผ๋ก ๋ด๋ฆฌ๋ฉด์ VEGF165๋ฅผ ํ์ฑํ์
dimeric form์ผ๋ก ๋ง๋ค์๋ค.
DEAE ์์ด์จ ๊ตํ ์ปฌ๋ผ์ ํตํ์ฌ ์ฌ์ ํ๊ณผ ๋์ถ ์ดํ ๋ฐ์ ๋
๋ณํ์ฒด(monomer, polymer, misfdoling) ๋จ๋ฐฑ์ง๊ณผ endotoxin๊น์ง ๋ถ๋ฆฌ
ํ ์ ์์๋ค. ์ ค ์ฌ๊ณผ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์ต์ข dimer์
monomer๋ฅผ ๋ถ๋ฆฌ ํ์ฌ ๊ณ ์๋์ fraction pool์ ์ํ๋ ์ ํ ๋๋์
๋ง๊ฒ ์ ์กฐํ์๋ค. ์ต์ข ๋ชฉ์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ํน์ฑ๋ถ์์ ํ์๊ณ , SDS-
PAGE ์ ๊ธฐ์๋, RP-HPLC ์ ์งํํ์ฌ RP-HPLC ๊ธฐ์ค์ผ๋ก 97%
์ด์์ ์๋๋ฅผ ์ป์๊ณ , VEGF165์ ์ ์กฐ๋ฅผ ์ํ ๋ถ๋ฆฌ๊ณต์ ์ ๊ฐ๋ฐ
ํ์๋ค.
Fig. 12. Purity analysis of finally purified VEGF165 by 2-fold serial dilution. (A) reduced-form. lane 1, size marker; lane 2, 1-fold; lane 3, 2-fold
dilution; lane 4, 4-fold; lane 5, 8-fold; lane 6, 16-fold; lane 7, 32-fold. (B) non-reduced form. lane 1, blank; lane 2, 1-fold; lane 3, 2-fold
dilution; lane 4, 4-fold; lane 5, 8-fold; lane 6, 16-fold; lane 7, 32-fold.
Fig. 13. RP-HPLC chromatograms of final sample in comparison with NIBSC standard. (A) internal standard injection with concentrations of
0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, and 0.125 mg/ml. (B) finally purified VEGF165 sample.
378 ์ฑ๊ธฐํ ยท ๊น์ธํธ
Korean Chem. Eng. Res., Vol. 55, No. 3, June, 2017
๊ฐ ์ฌ
๋ณธ ์ฐ๊ตฌ๋ ์ถฉ๋จ๋ํ๊ต ์์ฒด ์ฐ๊ตฌ๋น์ ์ํด ์ํ๋์์ผ๋ฉฐ ์ด์ ๊ฐ
์ฌ๋๋ฆฝ๋๋ค.
References
1. Abe, T., Okamura, K., Ono, M., Mori, T., Hori, S. and Kuwano,
M., โInduction of Vascular Endothelial Tubular Morphogenesis
by Human Glioma Cells : a Model System for Tumor Angiogen-
esis,โ J. Clin. Invest., 92, 54-61(1993).
2. Ferrara, N., โRole of Vascular Endothelial Growth Factor in the
Regulation of Angiogenesis,โ Kidney Int., 56, 794-814(1999).
3. Ferrara, N., โMolecular and Biological Properties of Vascular
Endothelial Growth Factor,โ J. Mol. Med., 77, 527-543(1999).
4. Drake, C. J., LaRue, A., Ferrara, N. and Little, C. D., โVEGF
Regulates Cell Behavior during Vasculogenesis,โ Dev. Biol., 224,
178-188(2000).
5. Nissen, N. N., Polverini, P. J., Koch, A. E., Volin, M.V., Gamelli,
R. L. and DiPietro, L. A., โVascular Endothelial Growth Factor
mediates Angiogenic Activity during the Proliferative Phase of
Wound Healing,โ Am.J. Pathol., 152, 1445-1452(1998).
6. Ferrara, N., โVascular Endothelial Growth Factor : Basic Science
and Clinical Progress,โ Endocrine Reviews., 25, 581-611(2004).
7. Houck, K. A., Ferrara, N., Winer, J., Cachianes, G., Li, B. and
Leung, D. W., โThe Vascular Endothelial Growth Factor Family:
Identification of a Fourth Molecular Species and Characteriza-
tion of Alternative Splicing of RNA,โ Mol. Endocrinol., 5, 1806-
1814(1991).
8. Xie, K., Wei, D., Shi, Q. and Huangb, S., โConstitutive and Induc-
ible Expression and Regulation of Vascular Endothelial Growth
Factor,โ Cytokine & Growth Factor Reviews., 15, 297-24(2004).
9. Lee, S.-B., Park, J. S., Lee, S., Park, J., Yu, S. Kim, D., Kim, H,
Byun, T. H., Baek, K., Ahn, Y.-J. and Yoon, J., โOverproduction
of Recombinant Human VEGF (Vascular Endothelial Growth
Factor) in Chinese Hamster Ovary Cells,โ J. Microbiol. Biotech-
nol., 18, 183-87(2008).
10. Wiesmann, C., Fuh, G., Christinger, H. W. Eigenbrot, C., Wells,
J. A. and de Vos, A. M., โCrystal Structure at 1.7 A Resolution of
VEGF in Complex with Domain 2 of the Flt-1 Receptor,โ Cell,
91, 695-704(1997).
11. Keck, R. G., Berleau, L., Harris, R. and Keyt, B. A., โDisulfide
Structure of the Heparin Binding Domain in Vascular Endothelial
Growth Factor: Characterization of Posttranslational Modifica-
tions in VEGF,โ Arch. Biochem. Biophys., 344, 103-113(1997).
12. Pizarro, S. A., Gunson, J., Field, M. J., Dinges, R., Khoo, S., Dalal,
M., Lee, M., Kaleas, K. A., Moiseff, K., Garnick, S., Reilly, D. E.,
Laird, M. W. and Schmelzer, C. H., โHigh-yield Expression of Human
Vascular Endothelial Growth Factor VEGF (165) in Escherichia
coli and Purification for the Therapeutic Applications,โ Protein
Expr Purif., 72(2), 184-193(2010).
13. Scrofani, S. D. B., Fabri, L. J., Xu, P. Maccarone, P. and Nash,
A. D., โPurification and Refolding of Vascular Endothelial Growth
Factor-B,โ Protein Science, 9(10), 2018-2025(2000).
14. Lee, I. L., Li, P. S., Yu, W. L. and Shen, H. H., โProkaryotic Expres-
sion, Refolding, and Purification of Functional Human Vascular
Endothelial Growth Factor Isoform 165: Purification Procedures
and Refolding Conditions Revisited,โ Protein Expr Purif., 76(1),
54-58(2011).
15. Ko, K. Y. and Kim, I. H., โMoment Analysis (MA) of Lysozyme in
Cation Exchange High Performance Liquid Chromatography
(HPLC),โ Korean Chem. Eng. Res., 54(4), 487-493(2016).