Determining the Sequence of DNAMethods:

1. Chain termination or dideoxy method F. Sanger

2. Shotgun sequence method3. 2nd generation sequence methods

Pyrosequencing

Sequentiation of NA

Frederick Sanger

"for his work on the structure of proteins, especially that of insulin”

The Nobel Prize in Chemistry 1958

Chain Termination with ddNTP

Sekvenování nukleových kyselinUrčení sekvence (pořadí) nukleotidů úseků DNA a RNAo několika stech bazí se provádí nejčastěji na principu konvenční Sangerovy metody (dideo-xynukleotidová, ddNTP reakce) nebo nověji pomocí cyklického sekvenování na termocykleru bez nutnosti alkalické denaturace. Označené produkty sekvenační reakce se rozdělí a detekují na sekvenačním gelu pomocí elektroforézy. Původní metoda vyžadovala 4 samostatné sekvenační reakce a také samostatné dělení při elektroforéze pro každý jednotlivý nukleotid. Metoda má čtyři fáze: přiložení primeru k analyzovanému fragmentu DNA, označení primeru, prodlužování primeru o další komplementární baze syntézou pomocí T7 DNA polymerasy, ukončení reakce inkorporací dideoxynukleotidu. Značení primerů se provádělo pomocí radioizotopů. Sekvenační 5% polyakrylamidový gel je denaturační (např. 7 mol/l urea), obvykle 0.3 mm silný, separační vzdálenost 50 cm, TBE pufr. Parametry zdroje pro separační rychlost asi 100 bazí za hodinu jsou 60 W (1900 V, 45 mA). Moderní sekvenování je plně automatizováno. Místo radioaktivního značení se používá značení fluoresceinem, místo značení primerů se používá značení terminátorů reakce (ddNTP), reakce se provádí na termocykleru pomocí Taq DNA polymerasy, všechny čtyři reakce je možno provést v jedné zkumavce a elektroforetické dělení je také z jednoho vzorku. Laserová detekce emise čtyř různých fluorescenčních barev se provádí pomocí fotonásobiče a velmi citlivého detektoru přímo z gelu. Počítačem je řízený posuv, fokusace, optimální laserový paprsek a vyhodnocení získaných dat. K dispozici je specializovaný software.

Automated DNA Sequencing

Smith et al. 1986 DNA molecules labeled with fluorescent

dyes Products of dideoxy-sequencing reactions

separated by gel electrophoresis Dye molecules are excited by laser beam Fluorescent signals are amplified and

detected by Photomultiplier tubes (CCD Camera)

Computer software identifies each nucleotide based on the distinctive color of each dye

PyrosequencingNote: No actual housesare burned down in pyrosequencing

Pyrosequencing(Life Sciences / Roche 454)A luciferase is an enzyme which emits light

in the presence of ATP.

Several organisms, such as the American firefly and the poisonous Jack-o-lantern mushroom, produce luciferases.

Emulzní PCR jako první krok k přípravě knihovny k pyrosekvenaci

Sequencing by synthesis Advantages:

AccurateParallel processingEasily automatedEliminates the need for labeled primers

and nucleotidesNo need for gel electrophoresis

Detecting polymerase activityRecall: Pyrophosphate is also known as PPi,

also known as “two phosphate groups stuck together”. During replication, each addition of a dNTP releases pyrophosphate

In the reaction mixture, PPi allows adenosine phosphosulfate (APS) to be converted to ATP; this ATP allows luciferase to luciferate (emit light).

Measures strand extension as it happens

Pyrosequencing cycle Add dATP. If light is emitted, your sequence starts with A.

If not, the dATP is degraded (or elutes past immobilized primer).

Add dGTP. If light is emitted, the next base must be a G. Then add T, then C. You now know at least one (maybe

more) base of the sequence. Repeat!

Pyrosequencing output

Runs of bases produce higher peaks – for instance, the sequence for (a)is GGCCCTTG. Sample (c) comes from a heterozygous individual (hencethe heights in multiples of ½)