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Détermination urinaire et plasmatique des métanéphr ines dans le cadre du diagnostic biologique

des phéochromocytomes et paragangliomes

Eliane M Billaud

Laboratoire de Pharmacologie-ToxicologieHôpital Européen G Pompidou, Université Paris Desca rtes, France

Waters Réunion utilisateurs- Session cliniqueParis, 14 octobre 2014

EMB WA Paris 14/10/2014

Dosage desMétanéphrines plasmatiques (P) et urinaires (U)

Contexte

Dépistage et diagnostic des phéochromocytomes et tumeurs neuroendocrines (paragangliomes héréditaires)Rares <1 /M habitant/an

Dont le diagnostic repose sur

- La démonstration biologique de l’hypersécrétion des catécholamines- Imagerie (scintigraphie à la mIBG I123)- Screening génétique (mutations SDHs succinate deshydrogenase subunit)

PGL.NET groupe des tumeurs endocrines et MECENE[GimenezRoqueplo AP][Plouin PF, 2010][Lenders JWM, 2014]



Contexte

Phéochromocytome , à croissance généralement lenteNéoplasme du tissu chromaffine (paraganglia sympatique et parasympatique)

- Surrénalien (adrénergique 80-85%) (phéo) ou ectopique (extra –adré 15-20%) (paragangliome sécrétant

≠ tête et cou non sécrétant HNPGL)

- Bénin ou malin

- Isolé ou associé , généralement dans un contexte familial Formes héréditatires (35%)

Von Hippel Lindau (VHL)RecklinghausenSipple

HNPGL Head and Neck Paraganglioma EMB WA Paris 14/10/2014


Contexte

démonstration biologique de l’hypersécrétion des catécholamines

Demi-vie plus longue et intégration dans le temps = Méthoxylés

Détermination des dérivés méthoxylés- NMN normétanéphrine- MN métanéphrine

U = totales (hydrolyse acide)P = libres [Pamporaki 2013]Libres meilleure performance diagnostique vs déconjuguées

P = libres 5-10% totales[Grouzmann 2010]

Libres peu ou pas affectées par la fonction rénale ≠ conjuguées [Eisenhofer 2005]

Risque faux positifs avec IR sévère APEC [Niculescu 2014] EMB WA Paris 14/10/2014

Malignité (10%-15%) ne peut être affirmée sur l’histologie de la tumeur primaire

Diagnostic devant une maladie métastatique progressive (imagerie,nott localisation scintigraphique de fixations à la MIBG, ds organes et tissus oùtissu chromaffine normt absent),après un ATCD de phéochromocytome

Associée à une plus grande fréquence chez porteurs de mutation SDHB

Bonne relation entre sécrétion de catécholamines et la taille tumorale

Phéochromocytome = confirmation histologique sur la pièce de résection chirurgicale


Contexte



Prélèvements

Urines acidification a posteriori et/ou congélation d’un échantillon

urines de 24h nécessaires, pas d’évidence d’une bonne corrélation sur une miction isolée ou un recueil partiel

Cr urinaire à mesurer sur l’échantillon pour la normalisation

Plasma Position discutée

Conservation congélation à -20°C suffisante

« Mieux on sait doser, plus ça se conserve »



Prélèvements

PlasmaPosition discutée (couchée, après combien de temps ou assis, à jeûn ou non)

[Campbell, réponse Eisenhofer 2011]

Il existe une influence nott en position debout, élevée pour les CA, moins marquée pour les méthoxylés. En pratique clinique difficile d’imposer le repos couché avant prélèvement mais à l’origine d’une majoration de 20-30% possible

[Därr 2013, réponse Chortis 2014, réponse Eisenhofer 2014]

Confirmation de l’influence à type d’augmentation de la position assis / couché Mais n’influence pas les valeurs enregistrées chez les porteurs de phéochromocytomePuissance diagnostique conservée

Débat médico-économique U/P


Dosage des Métanéphrines plasmatiques (P)Facteurs influençant

AgeIl existe une relation positive de l’âge, notamment sur la NMNp [Eisenhofer G 2013]

Intérêt d’un ajustement à l’âge du seuil diagnostique (>60ans)

GenrePossible influencePas d’impact sur le seuil diagnostique

Fonction rénaleFaible impact sur MNP libres

Groupe de référenceValeur observée chez VS différente des groupes contrôles (non phéo)

- CTL= HTA essentielle sur terrains incluant ménopause, cancer rénal, sténose artère rénale, hyperaldostéronisme primaire…

- Incidentalomes (masse abdominale)

Enjeux = éviter faux-négatifsgérer faux-positifs

Position AlimentationDebout> Assis > couché Apports en amine (banane…)



Suivis

Normalisation post-chirurgicalePeut prendre de qqs jours à qqs semainesContrôle dans le mois qui suit la résection

SurveillanceRécurrence ou nouvelle tumeur à surveiller : signe la malignité

à vie Si sporadique, < 5cm de diamètre, tous les 2 ansRamenée à tous les 1 an si facteurs de risque identifiés (familial, >5cm, mutation SDHB, maladie multiendocrinienne)[Amar L 2012]

Rôle de l’adrénalectomie uni ou bilatérale sur la valeur cible établie chez VS [Osinga 2013]

Peut-être pertinent mais ce qui compte c’est l’évolution cinétique / récidive



3MTT 3 Méthoxy-Tyramines

Intérêt potentiel : pistes pour améliorer le diagnostic de malignitéMutation SDHB, diamètre >5cm, localisation extra-adrénergiqueet 3MTT >0,2nM/L = facteur d’extension métastatique [Eisenhofer 2012]

Description de phéo métastatique à production de dopamine [Peitzsch M 2013]

Détermination des dérivés méthoxylés- NMN normétanéphrine- MN métanéphrine- 3MTT normalement accessibles dans le même run

3MTT = dérivé dopamine

Analytique = description de phénomène de « ionic cro ss-talk »Description d’une interférence entre MN et 3MTT en LC-MS/MSconduisant à une surestimation des 3MTT [Twentyman 2012]

Résolution en effectuant une meilleure séparation chromatographiquePassage d’une colonne HILIC [Danaceau 2012] à une BEH amide



Interférences

AnalytiquePar ailleurs report d’une interférence entre 4OH-3métoxy-methamphétamine et NMN (pharmacophore commun résultant ds la production du même produit de fragmentation ionique) [Dunand 2014]

PharmacologiqueActions PK et PD sur la production catécholaminergiquesDifférentes substances nott CV , antidépresseurs…

Borderline entre 1 et 2-3 fois la normale

Ré-évaluer en position couchéeChromogranine AMNUTest suppression clonidine

Ré-évaluer à distance [Plouin PF 2010]


NMN p< 0,50-1,39 nM/L [Peatson 2010 LCMSMS 1,18MN p< 0,13-0,85 nM/L 0,51


Activité HEGP LAPX

25 000 actes/an

25% IS 6% MN

STP

Addiction

Toxicologie proximité

Hormonologie

50% PF IA50% PF LC dont 90% en LC-MS/MS

MNU 1000/anMNP 700/an

File active 400 PGL

B 140 12,71 € HT/prélt

Coût majoritairement dépendant des colonnes Oasis

MS1 installation : Nov 5th, 2008First routine results (TRL) : January 2nd, 2009

MS2 installation June, 2009



Contexte

La démonstration biologique de l’hypersécrétion des catécholamines

Détermination des dérivés méthoxylés- NMN normétanéphrine- MN métanéphrine

UrinairesMNU

HPLC-électrochimieUrines 24hacidifiées

PlasmatiquesMNP

PlasmaEDTA*

UPLC-MS/MS

1985

2010

UrinairesMNU

Urines 24h+ HCl a posteriori

[PF Plouin WHA De JongG Eisenhofer KS Graham]

*Conservation -20°C suffisante vs -80°C [Ross HA 2011]

[Candito M SFBC 2002] [Heron E Ann Int Med 1996 ]



Concentrations Cibles

MNU Σ Σ Σ Σ < 3.7 < 3.7 < 3.7 < 3.7 µM/L M/L M/L M/L Σ/ Σ/ Σ/ Σ/ Cr < 0.354Cr < 0.354Cr < 0.354Cr < 0.354

MNP NMNP < 0.66 nM/LNMNP < 0.66 nM/LNMNP < 0.66 nM/LNMNP < 0.66 nM/LMNP < 0.31 nM/LMNP < 0.31 nM/LMNP < 0.31 nM/LMNP < 0.31 nM/L

Intérêt potentiel S’affranchir du recueil U24h pour le dépistageLimites Fonction rénale?, Niveau des concentrations


MNP G0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8NMN 0 0.164 0.218 0.328 0.656 0.957 1.367 2.732 4.098MN 0 0.152 0.202 0.304 0.609 0.888 1.270 2.540 3.807

Etalonnages

MNU G0 G1 G2 G3 G4 G5NMN 0 0.200 0.410 0.820 1.640 2.470MN 0 0.090 0.190 0.380 0.770 1.150

nM/L

µM/L

NMN, MN et De spécifiquesMilieu surchargé : H 2O

Calibrateurs Biorad

Calibrateurs fabriqués au laboratoire

MNP

Matériels et réactifs sont dédiés au secteur LC/MS

Elle est identique pour MNU et MNP

La prise d’essai des MNU s’effectue après hydrolyse acide (5mL)Et dilution au 1/100 ème (S Lefeuvre)


Préparation d’échantillon

Principe : extraction en phase solide sur colonne WCX par micro-élution

Etapes : Conditionnement, chargement, lavage, élution

Prise d’essai 200 µL


Dosage des MNP - Performances

MASSES Parent Daughter Cône Collision Dwell

MN 180.05 148.10 30 15 0.030

NMN 166.05 134.10 25 « «

MN D3 183.05 151.10 30 « «

NMN D3 169.05 137.10 25 « «

LDD LDQ Précision % Exactitude %

MN P 0.100 0.152 11.5 16.8

NMN P 0.100 0.164 14.2 12.4


UPLC

Colonne Atlantis WA HILIC 2.1x50 mm 3µ

Phase mobileCH3CN / formateNH4 100M pH3

0.35 mL/min

Volume injection

Run time 3 min


-16

-11

-6

-1

4

9

14

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0

MOY

EC

AR

T

y = 1,1615x + 0,0875R2 = 0,839

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

ELECTRO

MS

Dosage desMétanéphrines urinaires (U)

Patients - LCMS vs LC électrochimie (HEGP)

Σ Σ Σ Σ Delta : -0.6 Mean : 3.3

-18.6%

Σ Σ Σ Σ /Cr /Cr /Cr /Cr Delta : -0.1 Mean : 0.300

-17.8%



Patients – cohérence P vs UNMN y = 0,7379x - 0,5249

r = 0,9987

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60 70 80

NMNU

NM

NP

MN y = 0,2791x + 0,0813r = 0,9589

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 1 2 3 4 5

MNU

MN

P

NMN

MN


Dosage desMétanéphrines plasmatiques (P)

Patients – cohérence HEGP vs Pasteur Cerba

n = 98

NMNP 0.12 ± 0.34 n = 88

MNP 0.014 ± 0.071 n = 92

n = 15 (sept-oct-nov 2010)

NMNP 0.52 ± 0.12

MNP 0.21 ± 0.09

Écart

Normale HEGP

n = 125 (3ème T 2014)

NMNP 0.69 ± 0.34MNP 0.26 ± 0.12

n = 125 (3ème T 2014)

NMNP 95è percentile 1,40 90è percentile 1,13MNP 0,45 0,43


y = 0,0094x + 0,2014R² = 0,1879

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

0 50 100

Con

cent

ratio

n N

MP

Age

Concentration NMN P en fonction de l'âge

NMN P

Linéaire (NMN P)

y = 0,001x + 0,2195R² = 0,0156

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 50 100

Con

cent

ratio

n N

MP

Age

Concentration NM P en fonction de l'âge

NMN P

Linéaire (NMN P)


Porteurs de phéochromocytomes

Surveillance post phéo

sexe Age Date NMN P MN P NMN U MN U Somme Somme S/Cr

M 30 11/09/2014 0,80 0,25 1,6 0,8 2,4 0,198

F 62 26/07/2014 1,14 1,48

F 19 11/07/2014 1,29 0,10

F 44 18/09/2014 2,60 0,26 1,6 0,1 1,7 0,586

M 30 21/07/2014 2,84 0,10 1,8 0 1,8 0,409

M 53 23/07/2014 3,08 0,54 2,6 1,8 4,4 0,667

M 42 09/09/2014 3,89 1,30

F 74 02/07/2014 4,65 0,07

F 57 10/09/2014 6,10 2,40

M 69 02/09/2014 6,70 0,32

F 46 15/07/2014 38,18 0,52 43,1 1,3 44,4 9,061

M 66 07/07/2014 47,00 0,10 106,6 0,5 107,1 12,453

M 72 21/07/2014 49,00 0,64 60,5 1,7 62,2 7,494

M 60 29/08/2014 112,60 200,00 890 1690 2580 293


Organisation

Les manipulations de MNU et MNP sont programméessur une base hebdomadaire

Le passage entre mode HPLC et UPLC est simplePas de besoin de formation spécifique à l’utilisati on UPLC

Les besoins de rinçage à la fin des manipulations d e MNsont très importants et essentiels à l’absence de c ontamination

Phase mobile H 2O/CH3CN 50:50

60 à 80 cycles de rinçageInjections en alternance

dex3 H20 et x3 CH3CN

20 µL 40 µL

Les runs étant de 5 mn, compter 6h minimum, donc la nuit


NMNP

MNP


0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

2,5

1 11 21 31 41

BR1 NMN

C1NorMN

0,1

0,35

0,6

0,85

1 11 21 31 41

BR1 MN

C1MN

0,1

0,35

0,6

1 11 21 31 41

BR1 3MTT C13MTT

Dosage desMN urinaires (U)

CQI

MNU

CQI Biorad CQI Biorad CQI Biorad CQI Biorad


Dosage desMétanéphrines urinaires (U)

Evaluation externe de la qualité

MNU

PROBIOQUAL PROBIOQUAL PROBIOQUAL PROBIOQUAL

1,443 mM/L

1,430 mM/L

8,506 mM/L



EEQ

MNP?

Faute d’un programme EEQ [Australie?],

proposition(Cf recommandations d’organismes accréditeurs)organiser un échange de plasmas entre utilisateurs

CerbaBiomnis

LilleHEGP

Autres? Europe

La conservation des échantillons semble le permettre



CONCLUSIONS

MNU

MNPTQD limite pour NMN

Performances aux seuils décisionnels

Calibrateurs commerciaux

CQI, EEQ

Coût, dont immobilisation système pour rinçage

3MTT à finaliser


Merci de votre attention Pharmacologie

S. LefeuvreS. Bay

C. WolochV. Jullien

T. Le Saux

C. QuedvilleC. AdamyC. Dupuy

Clinique

PF. PlouinL. Amar

Génétique

AP. Gimenez-Roqueplo

Waters AssEMB WA Paris 14/10/2014

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