Detection of marine toxins using cell-based assays and Characterization of toxin profiles in ciguatera-related

natural samples: microalgae and fish.

(Detección de toxinas marinas mediante ensayos celulares y Caracterización del perfil toxinico en muestras naturales

asociadas a la ciguatera: microalgas y pescado)Amandine Caillaud

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UNIVERSIDAD DE BARCELONA

FACULTAD DE BIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR

Programa de Doctorado

Diplomatura en Estudios Avanzados en Biología Celular y Molecular

Bienio 2005-2007

Detection of marine toxins using cell-based assays and Characterization of toxin profiles in ciguatera-related natural

samples: microalgae and fish.

(Detección de toxinas marinas mediante ensayos celulares y Caracterización del perfil toxinico en muestras naturales

asociadas a la ciguatera: microalgas y pescado)

Memoria presentada por

Amandine Caillaud

Para optar al grado de

Doctor en Biología, mención doctor europeo

Directores: Tutor:

Dr. Jorge Diogène Fadini Dra. Mercè Durfort Coll

Dr. Pablo de la Iglesia González

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V. RESUMEN

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Las microalgas marinas tienen gran importancia en los ecosistemas en cuanto a su

papel en la producción primaria. Algunas poblaciones de microalgas, por ejemplo las

dinoflageladas, tienen la capacidad de desarrollarse en grandes proliferaciones, en

ocasiones llamadas mareas rojas. Algunas especies de dinoflageladas pueden producir

potentes toxinas que son transferidas a través de la cadena trófica dando lugar a episodios

de intoxicación en humanos por consumo de productos del mar (e.g. pescado, moluscos)

contaminados por toxinas. Existen diferentes tipos de intoxicaciones clasificados según el

tipo de síntomas asociados. El presente trabajo se focalizó en la intoxicación de tipo

ciguatera (o CFP, Ciguatera Fish Poisoning), la cual ocurre después del consumo de

pescado contaminado por ciguatoxinas (CTXs) [16, 17] y se caracteriza por síntomas

característicos como la pérdida de sensibilidad en las extremidades o una sensación

inversa entre calor y frio. La ciguatera ocurre normalmente en zonas tropicales y

subtropicales del océano Pacifico, Índico y Atlántico Oeste (Caribe) [159] pero fue

recientemente identificada como un problema emergente en Europa y especialmente en

las Islas Canarias [134, 135]. Las dinoflageladas del género Gambierdiscus son las

causantes de la producción de CTXs [31]. Tradicionalmente otros géneros de

dinoflageladas encontradas en las zonas ciguatericas, e.g Prorocentrum, Amphidinium,

Ostreopsis, Coolia han sido asociadas a la ciguatera por ser productoras de toxinas, pero

no producen CTXs.

La Unión Europea regula la presencia de toxinas en los productos del mar de

manera a proteger el consumidor y el sector de la pesca, tomando medidas preventivas

respecto a la presencia de toxinas en los productos de pesca y la presencia de

dinoflageladas productoras de toxinas en las zonas de producción [19]. Las regulaciones

establecen los niveles máximos permitidos (MPLs) de toxinas en ciertos productos del

mar [20] así que los métodos oficiales para la detección de los diferentes grupos de

����

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toxinas [21]. Respecto a la presencia de CTXs en los pescados, las regulaciones europeas

carecen de especificaciones respecto a los MPLs en CTXs y respecto al método de

detección de CTXs en pescado [84]. Según el tipo de toxinas, los métodos oficiales para

la detección de toxinas incluyen el bioensayo ratón, métodos analíticos [160] o

bioquímicos [161]. La Unión Europea favorece el desarrollo de metodologías alternativas

o complementarias al bioensayo ratón [23]. El papel de la investigación en el ámbito de

las toxinas marinas implica i) el desarrollo de métodos para la detección y caracterización

de toxinas en muestras naturales ii) la identificación de toxinas en productos del mar, en

las microalgas y en el agua, iii) trabajos “de campo” para identificar la presencia de

especies de microalgas productoras de toxinas y toxinas en los ecosistemas. En el

presente trabajo, contemplamos el uso de los ensayos celulares como un posible método

alternativo o complementario al ensayo ratón para la detección de toxinas marinas en

muestras naturales asociadas a la ciguatera: microalgas y pescado. Las toxinas estudiadas

incluyen las CTXs y las maitotoxinas (MTXs) producidas conjuntamente por las

dinoflageladas del genero Gambierdiscus y el ácido okadaico (AO) producido por

dinoflageladas del genero Prorocentrum. Las CTXs son neurotoxinas con alta afinidad

por el canal de sodio (Na+) voltaje dependiente incrementando el nivel de Na+ intracelular

[60]. Las MTXs son potentes activadoras de la entrada de calcio (Ca2+) intracelular por

mecanismos que todavía quedan para resolver [62]. El AO es un potente inhibidor de las

proteínas fosfatasas a serina y treonina tipo1 y 2A (PP1 y PP2A) [65].

El objetivo principal de este trabajo fue el estudiar la eficacia de los ensayos

celulares con células de neuroblastoma (Neuro-2a) para la evaluación del riesgo de

ciguatera. Para alcanzar este objetivo, el trabajo de tesis se ha desarrollado en varias

etapas:

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1- El desarrollo de métodos para facilitar la aplicabilidad de los ensayos con

células de Neuro-2a en la detección de toxinas en muestras naturales.

2- La aplicación de los ensayos con células Neuro-2a específicos para CTXs y

MTXs para la caracterización del perfil de toxinas en muestras de las

dinoflageladas Gambierdiscus spp y Prorocentrum rhathymum.

3- La aplicación del ensayo con células Neuro-2a especifico para CTXs para la

caracterización del perfil de toxinas en muestras de pescado procedentes de las

Islas Canarias y sospechosas de tener CTXs.

Los diferentes capítulos de la tesis siguen el orden de estas 3 etapas e incluyen los

resultados de 4 artículos ya publicados en revistas científicas y 3 sometidos o en

preparación para ser publicados.

CAPITULO I: Aproximaciones metodológicas para la detección de toxinas en

muestras naturales.

La aplicabilidad de los ensayos celulares a la detección de toxinas en muestras

naturales queda condicionada al desarrollo de metodologías para, entre otros aspectos, i)

eliminar posible interferencias de las matrices biológicas de las muestras (Articulo 1) y

ii) detectar con especificidad los diferentes grupos de toxinas (Articulo 2).

En una primera parte de este capítulo, hemos descrito las ventajas del

acoplamiento de los ensayos celulares con un fraccionamiento de los extractos por

cromatografía para eliminar las interferencias de las matrices biológicas (Articulo 1).

Presentamos dos ejemplos de esta estrategia; una muestra de microalgas del género

Gambierdiscus sp y una muestra de mejillón. Los resultados presentados en este artículo

demuestran la eficacia de esta estrategia para eliminar las interferencias de las matrices

biológicas, lo cual permite detectar niveles muy bajos en toxina y sirve de método de

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separación y purificación de los diferentes compuestos de las muestras. Por ejemplo, el

método ha permitido aislar fracciones con actividad tóxica de tipo CTX en una muestra

de la microalga Gambierdiscus sp.

En la segunda parte del capítulo I, abordamos la necesidad de diferenciar la

producción de CTX y MTX , dos toxinas que pueden ser producidas de manera

simultánea por las dinoflageladas del genero Gambierdiscus. Las CTXs pueden ser

detectadas y cuantificadas de manera específica con un ensayo celular con células Neuro-

2a tratadas previamente con ouabaina y veratridina [124, 126]. Hemos descrito la puesta

a punto de un ensayo celular con células de Neuro-2a tratadas con SK&F 96365 para

detectar y cuantificar de manera específica compuestos de tipo MTX (Articulo 2). SK&F

96365 ha sido previamente descrito como un inhibidor de la entrada de Ca2+ intracelular

[132] y un inhibidor de los efectos tóxicos de la MTX [133]. El ensayo especifico con

células Neuro-2a consiste en tratar las células con 30µM SK&F 96365 durante 30

minutos previamente a la exposición durante 2.5 horas de las células a la MTX o a

extracto de Gambierdiscus spp. para analizar. El uso de SK&F 96365 permitió obtener

una inhibición total de los efectos tóxicos de la MTX para concentraciones de hasta 11.4

nM MTX. El método demostró ser eficaz para detectar y cuantificar la toxicidad de tipo

MTX, cuantificada en equivalentes en MTX, en dos especies de Gambierdiscus spp. Este

ensayo especifico para MTX demostró tener aplicaciones para estudiar la taxonomía del

genero Gambierdiscus pudiendo discriminar entre cepas/especies productoras o no de

MTX, Por otra parte, el método puede ayudar a identificar las interferencias de la MTX a

la hora de purificar CTXs a partir de muestras de Gambierdiscus spp.

La eliminación de las interferencias de las matrices biológicas y el uso de ensayos

específicos para un tipo de toxinas, son dos aproximaciones metodológicas susceptibles

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de favorecer la aplicabilidad de los ensayos celulares a la detección de toxinas en

muestras naturales.

CAPITULO II: Aplicación de los ensayos celulares a la detección de toxinas en

muestras naturales: microalgas.

Las dos aproximaciones metodológicas descritas en el primer capítulo de la tesis,

es decir el fraccionamiento por cromatografía de los extractos crudos de microalgas y el

uso de ensayos específicos para un grupo de toxinas, fueron aplicadas a la caracterización

del perfil de toxinas en varias muestras de microalgas de los géneros Gambierdiscus y

Prorocentrum.

1- Caracterización del perfil toxínico en muestras de Gambierdiscus spp

(Articulo 3 y Articulo 4).

Nueve cepas de Gambierdiscus spp. fueron examinadas acerca de su contenido en

compuestos de tipo CTX y MTX con los ensayos con células de Neuro-2a específicos

para CTX y MTX (Articulo 3), Se estudiaron tres cepas de G. pacificus procedentes de

Malasia, tres cepas de Gambierdiscus sp1 (propuesta como la especie nueva G.

excentricus) procedente de las Islas Canarias, una cepa de Gambierdiscus sp2 (propuesta

como una especie nueva) procedente de Creta y dos cepas de Gambierdiscus sp3

procedentes de Indonesia. El ensayo con células Neuro-2a nos permitió detectar la

producción de compuestos de tipo CTX y MTX en todas las cepas de Gambierdiscus spp.

procedentes de Malasia, de las Islas Canarias y Indonesia. Gambierdiscus sp2 procedente

de Creta fue caracterizada como una cepa no tóxica según los limites de detección de los

ensayos empleados con células de Neuro-2a para CTX y MTX. Un análisis comparativo

del contenido en equivalentes de CTX tipo 1B (CTX1B) y MTX entre las diferentes

cepas permitió caracterizar a Gambierdiscus sp1 (G. excentricus) como un alto productor

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de CTX y MTX respecto a G. pacificus y Gambierdiscus sp3. Estos resultados tienen

implicaciones a nivel taxonómico, en especial para las dos nuevas cepas procedentes de

las Islas Canarias y Creta. Adicionalmente, estos resultados ilustran el riesgo de ciguatera

en Malasia, en las Islas Canarias y en Indonesia. La elevada producción de CTXs por

Gambierdiscus sp1 hace pensar que esta nueva especie podría ser el origen de los

diferentes episodios de ciguatera recientemente detectados en las Islas Canarias.

El seguimiento de la presencia y toxicidad de poblaciones de Gambierdiscus spp.

ha sido utilizado para prevenir posibles episodios de ciguatera en zonas endémicas de

ciguatera [142, 143]. El seguimiento de toxinas mediante adsorción en fase sólida, o

“SPATT” (Solid-phase Adsorption Toxin Tracking) emplea resinas adsorbentes para

captar la fracción disuelta de toxinas en el medio. Los SPATTs han sido utilizado

previamente para monitorizar la presencia de toxinas disueltas en los ecosistemas [146,

147] y ha sido propuesto como método de muestreo pasivo para seguir la presencia de

poblaciones de microalgas productoras de toxinas en las zonas de producción de

productos de la pesca [146, 147]. En esta segunda parte del Capítulo II de la tesis,

hemos evaluado, en el laboratorio, la posibilidad de aplicar el SPATT como herramienta

para seguir la presencia de CTX y MTX disueltas en los ecosistemas. En una primera

etapa, hemos evaluado la eficacia de la resina tipo HP20 Diaion® para recuperar CTX1B

y MTX disueltas en agua de mar en condiciones controladas. Los ensayos celulares con

células Neuro-2a para CTX y MTX han sido utilizados para detectar y cuantificar la

CTX1B y la MTX recuperadas por la resina y han permitido estimar los porcentajes de

recuperación de la CTX1B y MTX, estimados respectivamente en 85.5 y 66% después de

72 horas de exposición de la resina HP20 Diaion® a las toxinas disueltas. En una

segunda etapa hemos aplicado el método de SPATT a un cultivo de G. pacificus para

evaluar la capacidad de la resina HP20 Diaion® para recuperar toxinas tipo CTX y MTX

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en el medio de cultivo de la microalga. La presencia de compuestos de tipo CTX y MTX

se cuantificó con los ensayos con células Neuro-2a. Adicionalmente al método celular, la

identidad de los compuestos tipo CTX fue confirmada de manera tentativa con un análisis

por cromatografia liquida acoplada a un sistema de detección por masa en tándem (LC-

MS/MS). Los derivados 51-hydroxyCTX3C y 2,3-dihydroxyCTX3C fueron identificados

como los más abundantes. La actividad de tipo CTX de estos derivados ha sido

confirmada con el ensayo con células Neuro-2a. Los dos métodos, el ensayo celular y el

análisis por espectrometría de masas, han coincidido en la identificación de un contenido

en CTX disuelta mayor en la fase de crecimiento estacionario y en la fase de decadencia

del cultivo de G. pacificus. Estos resultados han demostrado la capacidad de la resina

HP20 Diaion® para adsorber CTXs y MTX y su posible aplicabilidad para seguir la

presencia de poblaciones de Gambierdiscus spp en los ecosistemas que puedan liberar

estas toxinas al medio. Adicionalmente, una comparación del contenido en CTX y MTX

disueltas en el cultivo de G. pacificus respecto al contenido intracelular, ha identificado el

uso de los SPATTs como una herramienta útil para realizar estudios fisiológicos sobre la

producción de toxinas por el género Gambierdiscus.

2- Caracterización del perfil toxínico en una muestra de P. rhathymum (Articulo

5)

Un fraccionamiento por cromatografía de un extracto P. rhathymum ha sido

acoplado a varios sistemas de detección de toxinas, incluyendo el ensayo celular con

células Neuro-2 y un ensayo de inhibición de la PP2A (PPIA) especifico para detectar

compuestos de tipo AO y derivados. La inhibición de la PP2A y una ligera disminución

de la viabilidad celular identificadas en la fracción número 29 sugirió la presencia de AO

o derivado en esta fracción. Esta hipótesis fue confirmada con un análisis por LC-

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MS/MS. Nuestro trabajo aporta la primera evidencia de la producción de OA por la

especie P. rhathymum una especie reconocida anteriormente como tóxica.

Adicionalmente a la producción de AO y derivados, otras fracciones han sido

identificadas como activadoras de la PP2A siendo a la vez tóxicas para las células Neuro-

2a. Este otro resultado indica en P. rhathymum la producción de compuestos bioactivos

con posible interés farmacológico.

CAPITULO III: Aplicación de los ensayos celulares a la detección de toxinas en

muestras naturales: pescado potencialmente ciguatóxico.

La disponibilidad de métodos de determinación de CTXs en muestras de pescado

y microalgas es una necesidad para confirmar posibles casos de ciguatera y poder evaluar

el riesgo de ciguatera en una zona determinada.

En una primera parte de este tercer capítulo, revisamos los numerosos aspectos

asociados a la ciguatera, como por ejemplo la transferencia de CTXs a lo largo de la

cadena trófica, los síntomas, los mecanismos de acción de las CTXs y la diversidad

estructual de las CTXs (Articulo 6). Como parte fundamental del trabajo se abordó una

visión exhaustiva de los métodos de determinación de las CTXs, incluyendo los

numerosos protocolos de extracción y purificación de las CTXs necesarios para facilitar

la determinación de CTXs en muestras de microalgas y pescado. Fueron revisadas las

diferentes metodologías para determinar CTXs, es decir el bioensayo ratón para CTXs, el

método celular con las células Neuro-2a especifico para CTXs, el método farmacológico

que evalúa la fijación de CTXs en sus receptores (RBA, Receptor Binding Assay), los

ensayos inmunológicos y finalmente los diferentes métodos analíticos instrumentales. Se

evaluó la aplicación, ventajas y limitaciones de cada uno de los métodos de

determinación de CTXs en rutina. Como conclusión de esta revisión bibliográfica

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identificamos los ensayos celulares con células Neuro-2a y el ensayo farmacológico

(RBA) como dos métodos con potencial para la evaluación de CTXs en muestras

naturales. Adicionalmente el método analítico con LC-MS para CTXs se identificó como

el método más prometedor para identificar inequívocamente y cuantificar las CTXs.

Estos métodos pueden aplicarse para la evaluación de riesgo de ciguatera. En esta misma

revisión bibliográfica, después de describir los diferentes eventos que sugieren la

aparición de ciguatera en Europa, describimos estrategias para el análisis de riesgo de

ciguatera y fueron propuestas algunas acciones preliminares a adoptar en Europa para una

gestión de la Ciguatera.

En la segunda parte del tercer capítulo, se verificó la eficacia del ensayo celular

con células Neuro-2a, específico para determinar la presencia de CTXs, en muestras de

pescado procedentes de las Islas Canarias. Se determinó el límite de carga en matriz de

pescado a 20 mg de carne equivalente mL-1 y el límite de detección del método a 0.0096

ng CTX1B g-1 de carne. El método ha sido aplicado a la detección de compuestos de tipo

CTX en trece muestras de pescado procedentes de las Islas Canarias, de las cuales tres

fueron implicadas en episodios de intoxicación diagnosticados como ciguatera. Los

resultados del ensayo celular con células Neuro-2a permitieron cuantificar las CTXs en

equivalentes de CTX1B en cuatro muestras de pescado, confirmando el diagnóstico de

las 3 muestras implicadas en la ciguatera. Adicionalmente al análisis de CTXs en dichas

muestras, un análisis genético por secuenciación de ADN fue realizado con el fin de

confirmar la identidad de las especies estudiadas. Este análisis ha permitido diagnosticar

las especies contaminadas con CTXs como Seriola dumerili y ha revelado diferencias

entre el diagnostico morfológico respecto al diagnostico genético. Los resultados de este

estudio constituyen claras contribuciones a la evaluación del riesgo de ciguatera en las

Islas Canarias.

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El presente trabajo de tesis demuestra la eficacia de los ensayos celulares con

células Neuro-2a para determinar la presencia de toxinas asociadas a la ciguatera en

muestras naturales. Los resultados de la tesis han permitido: i) confirmar el diagnostico

de ciguatera después del consumo de pescado procedente de las Islas Canarias, ii)

identificar les especies del género Seriola spp. como especies de riesgo de ciguatera en

las Islas Canarias y iii) confirmar Gambierdiscus sp1 (G. excentricus) como el potencial

responsable de los episodios de ciguatera en las Islas Canarias. Estos resultados han

contribuido a la evaluación de riesgo de ciguatera en las Islas Canarias y respaldan la

necesidad de establecer programas de vigilancia de CTX en esta zona geográfica para

prevenir posibles casos de ciguatera. En este sentido, el uso del ensayo celular con células

Neuro-2a especifico para CTX es una herramienta recomendable para seguir la presencia

de CTXs en pescado y evaluar la toxicidad de la poblaciones de Gambierdiscus spp

presentes en esta zona. Demostramos que el uso del SPATT es igualmente una

herramienta que podría favorecer el seguimiento de la presencia de poblaciones tóxicas

de Gambierdiscus spp.

En conclusión, los resultados presentados en este trabajo refuerzan el uso de los

ensayos celulares como posible método alternativo o complementario al bioensayo ratón

para la determinación de toxinas en muestras naturales, Su aplicación nos ha permitido

contribuir a una mejor evaluación del riesgo de ciguatera.

Las conclusiones más destacadas de este trabajo de tesis son las siguientes:

• La eliminación de las interferencias de las matrices biológicas y el uso de ensayos

específicos para un tipo de toxina mejora la aplicabilidad de los ensayos celulares

a la detección de toxinas en muestras naturales. El fraccionamiento por

cromatografía de los extractos acoplado a los ensayos celulares es una buena

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estrategia para eliminar las interferencias de las matrices, y es una herramienta

útil para detectar niveles muy bajos en toxina y para la purificación de toxinas. Un

tratamiento previo de las células Neuro-2a con SK&F 96365 permite detectar y

cuantificar de manera especifica compouestos de tipo MTX en extractos de

Gambierdiscus spp.

• Los ensayos con células Neuro-2a específicos para CTX y MTX han sido eficaz

para detectar y cuantificar compuestos tipo CTX y MTX en Gambierdiscus spp.

Gambierdiscus sp1 (G. excentricus) ha sido identificado como un potente

productor de CTX y MTX. Gambierdiscus sp2 procedente de Creta ha sido

identificado como no tóxico.

• La resina HP20 Diaion® ha sido identificada como eficaz para la recuperación de

CTX y MTX disueltas en el medio de cultivo de G. pacificus. Los ensayos con

células Neuro-2a permiten detectar y cuantificar CTX y MTX recuperadas por la

resina.

• Prorocentrum rhathymum es un productor de AO.

• El ensayo con células Neuro-2a específico para CTX ha permitido cuantificar

compuestos de tipo CTX en muestras de pescado procedentes de las Islas

Canarias. Seriola dumerilii ha sido identificada como una especie de riesgo de

ciguatera en las Islas Canarias. La identificación del riesgo de ciguatera a las Islas

Canarias soporta la hipótesis de una posible aparición de ciguatera a las Islas

Canarias.

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�����

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ANNEXES

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Annex 1

First approach towards the implementation of passive sampling adsorption devices for the identification of lipophilic toxins in the coastal embayments

of the Ebro Delta.

Sixth International Conference on Molluscan Shellfish Safety (2009). 336–342

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Annex 2

Toxin production and cell abundance of Prorocentrum spp in Sabah

coastal waters, Malaysia

UMT Annual Seminar 2010, submitted

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Annex 3

Informe de los directores de la tesis: Factor de Impacto y

Contribución del doctorante en cada articulo

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La tesis defendida por Amandine Caillaud,

“Detection of marine toxins using cell-based assays and Characterization of toxin profiles in ciguatera-related natural samples: microalgae and fish” (Detección de toxinas marinas mediante ensayos celulares y Caracterización del perfil toxínico en muestras naturales asociadas a la ciguatera: microalgas y pescado),

incluye cuatro artículos ya publicados y tres manuscritos. A tenor de lo que refleja la copia de tesis sometida, Amandine Caillaud ha contribuido con notoriedad al desarrollo de metodologías basadas en cultivos celulares para la determinación de toxinas ciguatéricas y a una mejor comprensión del riesgo de Ciguatera, entre otros lugares en las Islas Canarias. De esta manera, independientemente de los índices de impacto de sus publicaciones, podemos avanzar que su investigación tendrá una buena acogida dentro del campo de desarrollo de métodos celulares alternativos a los bioensayos con animales, y en particular dentro del campo de toxinas marinas. Igualmente, dentro del ámbito de la Ciguatera, la contribución de Amandine Caillaud responde a la actual necesidad de disponer de herramientas de cribado para diagnosticar casos de ciguatera, y posible aplicación a estudios de toxinas en alimentos.

En el presente informe adjuntamos una tabla que recoge el listado de las siete contribuciones, indicando el índice de impacto para cada uno de ellos. A continuación, resumimos la participación de la candidata a cada una de éstos trabajos, indicando que sólo la publicación número 1, “Cell-based assay coupled with chromatographic fractioning: a strategy for marine toxins detection in natural samples”, formará parte de otra tesis realizada en nuestro laboratorio y que igualmente se defenderá en la Universitat de Barcelona ; esta publicación también será utilizada por la candidata Elisabeth Cañete. Se indicará aquí, y en el informe correspondiente a la tesis de Elisabeth Cañete, la contribución de cada una de las candidatas a esta publicación.

Participación de la doctorante a las diferentes contribuciones

Respecto a la participación de la doctorante a las diferentes contribuciones, Amandine Caillaud es primera autora de todas. Ello refleja el grado de responsabilidad que ha tenido en la ejecución de las diferentes partes de todos y cada uno de estos trabajos, es decir, en la identificación de la problemática, el diseño experimental, la obtención de resultados, la obtención de conclusiones y la discusión de éstas dentro del contexto científico actual. Igualmente, Amandine Caillaud, ha contribuido a la coordinación entre los coautores de los trabajos, la puesta en formato de los manuscritos y su revisión final, incluyendo, las correcciones o modificaciones solicitadas por los revisores externos.

Adicionalmente a estas responsabilidades, detallamos a continuación, para cada uno de estos trabajos, la contribución más específica de Amandine Caillaud en las partes experimentales de los trabajos:

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Nº Titulo Autores IF (2009) Descripción de la participación de la doctorante en las partes experimentales de los trabajos que se describen en las contribuciones

1 Cell-based assay coupled with chromatographic fractioning: a strategy for marine toxins detection in natural samples. Toxicology in vitro

23 (2009), 1591-1596

A.Caillaud

E.Cañete

P. de la Iglesia

G.Giménez

J.Diogène

2.060 Cultivos de microalgas del género Gambierdiscus, recuperación de las células y obtención de extractos.

Fraccionamientos cromatográficos de extractos de Gambierdiscus.

Evaluación de la citotoxicidad de fracciones de extractos de Gambierdiscus e identificación de la actividad de tipo ciguatoxina o de tipo maitotoxina.

2 Detection and quantification of maitotoxin-like compounds using a neuroblastoma (Neuro-2a) cell based assay. Application to the screening of maitotoxin-like compounds in Gambierdiscus spp.

Toxicon

56 (2010), 36-44

A.Caillaud

T.Yasumoto

J.Diogène

2.128 Cultivos de microalgas, recuperación de las células y obtención de los extractos.

Desarrollo del ensayo celular, con las siguientes etapas :

Cultivos celulares en condiciones controladas Estudio de la sensibilidad de las células al compuesto SKF & 96365 y puesta a punto del método fijando condiciones Estudios con CTXs y MTXs determinando las IC50s Definición del cociente DR para la determinación cuantitativa de la MTX

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3 Comparative study of the CTX- and MTX-like toxicity of various Gambierdiscus spp. from distinct geographical origin using a Neuroblastoma (Neuro-2a) cell-based assay

Toxicon

Under preparation

A.Caillaud

S.Fraga

K.Aligizaki

N.Mohammad-Noor

J.Diogène

2.128 Mantenimiento de cepas de Gambierdiscusrecibidas en el laboratorio, su cultivo, recuperación de las células y obtención de los extractos.

Puesta a punto del método celular para la determinación de toxicidad tipo CTX.

Determinación de la toxicidad tipo CTX y MTX para cada una de las cepas mediante los ensayos celulares.

Estudio comparativo entre cepas.

4 Monitoring of dissolved ciguatoxin and maitotoxin using solid-phase adsorption toxin tracking devices:Application to Gambierdiscus pacificus in culture.

Harmful Algae

Submitted

A.Caillaud

P.de la Iglesia

E. Barber

H.Eixarch

N.Mohammad-Noor

T.Yasumoto

J. Diogène

2.500 Mantenimiento de la especie de Gambierdiscus pacificus , su cultivo, recuperación de las células y obtención de los extractos.

Desarrollo de las curvas de crecimiento de las microalgas.

Exposición de las resinas a los cultivos de las microalgas.

Procesado de las resinas expuestas y extracción de las toxinas.

Determinación de la toxicidad tipo CTX y MTX en la fracción particulada de los cultivos de G. pacificus y en las resinas mediante los ensayos celulares.

Interpretación de los datos y comparación de

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resultados obtenidos mediante ensayos de citotoxicidad con las determinaciones obtenidas por cromatografía acoplada a espectrometría de masas.

5 Evidence of okadaic acid production in a cultured strain of the marine dinoflagellate Prorocentrum rhathymumfrom Malasia.

Toxicon

55 (2010), 633-637

A.Caillaud

P.de la Iglesia

M. Campas

L. Elandaloussi

M.Fernández

N.Mohammad-Noor

K.Andree

J.Diogène

2.128 Cultivo de Prorocentrum rhathymum recuperación de las células y obtención de los extractos.

Evaluación de la citotoxicidad de los extractos.

Preparación de las muestras de microalgas para la identificación molecular de la especie.

6 Update on the methodologies available for ciguatoxin determination. A perspective for facing up the onset of ciguatera in Europe.

Marine Drugs

A.Caillaud

P.de la Iglesia

H.T.Darius

S.Pauillac

K.Aligizaki

2.863 En este extenso artículo de revisión, Amandine Caillaud se ha responsabilizado de todo su contenido , exceptuando los siguientes apartados :

2.3 Organisms producing CTXs

3.3.4. Immunoassays

3.3.5. Pharmacological assay: Receptor Binding

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8 (2010), 1838-1907 S.Fraga

M.Chinain

J.Diogène

Assay

3.3.6. Physico-chemical analysis: High performance liquid chromatography coupled with spectroscopic (UV, FLD) or spectrometric (MS/MS) methods

4.4. A risk analysis approach to confront CFP

7 Suitability of the Neuroblastoma (Neuro-2a) cell-based assay for ciguatoxin-like toxicity detection in fish caught in the Canary Islands.

Environmental Health Perspectives

Under preparation

A.Caillaud

H.Eixarch

P. de la Iglesia M.Rodriguez L.Dominguez

K.B.Andree

J.Diogène

6.19 Proceso de muestras de pescado y extracción de las toxinas

Puesta a punto del ensayo celular para determinación de CTXs en matriz de pescado, identificando, entre otros, el límite de carga, la sensibilidad del método y desarrollo de estudios de repetitividad y reproducibilidad del método.

Determinación del contenido en CTXs en muestras de peces mediante el ensayo celular

Interpretación de los resultados y comparación con datos clínicos y datos obtenidos mediante un kit comercial no validado de detección de actividad CTX.

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Y para que conste a efectos oportunos,

Director de tesis,

Jorge Diogène Fadini

Investigador

Seguimiento del Medio Marino

IRTA

Co-director de tesis,

Pablo de la Iglesia González

Investigador

Seguimiento del Medio Marino

IRTA