Design and synthesis of new thiazolated cross-linked DNA binding polyamides for altered sequence...

5
Design and synthesis of new thiazolated cross-linked DNA binding polyamides for altered sequence recognition Sanjay K. Sharma, Manju Tandon and J. William Lown p Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Alberta, E3-44 Chemistry Building, Edmonton, AB, Canada T6G 2G2 Received 17 October 2001; revised 14 January 2002; accepted 4 March 2002 Abstract ÐThe design and synthesis are described for six new thiazolated versions of cross-linked polyamides 9a± f), in which the Th±Py±Py array of heterocycles is tethered from the central pyrrole by C5 and C7 methylene chains. The thiazole ring in the different cross-linked polyamides 9a ± f) bears three different functional groups viz. H, NHCHO and NH 2 ). These six cross-linked polyamides were analyzed for their gyrase inhibition properties, which showed that amTh±Py±Py 9b), tethered by a C7 linker, with an inhibitory concentration against gyrase of IC 50 0.01 mM) is the most potent inhibitor among all the thiazolated cross-linked polyamides analyzed so far. q 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. 1. Introduction Over the past two decades signi®cant advances have been made in understanding the interactions of double helical DNA with small molecules important in antitumor, anti- biotic and antiviral chemotherapy. An understanding of drug±DNA interactions at the molecular level is crucial in facilitating the design of new drugs and probes that can recognize speci®c DNA sequences. 1±5 Netropsin and dista- mycin are two well studied members of the pyrrolocarb- oxamidine class of naturally occurring antibiotic oligopeptides. The discovery of Pelton and Wemmer 6 of stable side by side minor groove binding led to the design of hairpin, cross-linked stapled) and bispolyamides for extended recognition of the minor groove of DNA. 7 One legitimate aspect of molecular design in the context of poly- amides is the introduction of heterocyclic moieties capable of speci®c DNA recognition by hydrogen bond acceptance and donation. The natural product distamycin 1) was ®rst modi®ed for a change in sequence recognition from an AT site to a GC site by Lown and Dickerson 8 independently by introducing an imidazole ring in place of the pyrrole ring in the natural product. Since then, Lown's and Dervan's group have done extensive work on the introduction of new heterocycles in the polyamide system to alter sequence speci®cation and recognition as compared with the natural product. One such modi®cation performed by our group is the introduction of the thiazole ring in three ring systems 2 and 3 Fig. 1) and also to the cross-linked system. Recently Dervan's group has incorporated this ring modi®cation into a hairpin system. 9 We have studied the binding af®nities of a series of thiazole±imidazole±pyrrole TIP) monomers 3 and cross- linked dimers, and evaluated the effect on selectivity and binding af®nity by introducing different N-terminal head groups attached to the leading thiazole ring and different lengths of the crosslinking methylene chain. 10,11 In con- tinuation of our ongoing research to optimize the binding of these cross-linked polyamides in 2:1 stoichometry, we wish to report the synthesis of cross-linked thiazolated polyamides in which the linking is carried out with the polymethylene chain in the center with the 1H pyrrole ¯anked by the pyrrole with the side chain of dimethyl- aminopropylamine and the thiazole linkage with different active functionalities on the other side of the structure Tetrahedron 58 2002) 3417±3421 Pergamon TETRAHEDRON 0040±4020/02/$ - see front matter q 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. PII: S0040-402002)00285-5 Keywords: heterocycle; DNA; polyamides; thiazoles. p Corresponding author. Tel.: 11-780-492-3646; fax: 11-780-492-8231; e-mail: [email protected] Figure 1.

Transcript of Design and synthesis of new thiazolated cross-linked DNA binding polyamides for altered sequence...

������ ��� ������� � ��� ��������� ������������ ��� ���������������� �� ������ �������� ����������

������ �� ����� ���� ������ ��� �� ������ �����

���������� ���� ����� ������� �� ����� �� ���� �� �������� ����� ���� ���� �� �� � � ������� ��� ������ !"# $#$

�������� �� ������ !!�" ���#�� �$ ��� �� !! " ����%��� $ ���� !!

������&��� ��#�'� ��� #�����#�# �� ��#����� (� #�) ��� ����*������ ��#���# �( ��##+���,�� %�������# -��. /� �� ����� ��� ��.0�.0���� �( ����������# �# ������� (� ��� ������ %���� �� 12 ��� 1� �������� �����#� ��� ����*��� ��' �� ��� ��((���� ��##+���,��%�������# -��. / ���# ���� ��((���� ( �������� '� %# -��*� 3� 4313� ��� 43 /� ���#� #�) ��##+���,�� %�������# ��� �����*�� (����� '��#� ���������� %�%����#� ����� #����� ���� ���.0�.0� -��/� ������� �� � 1� ���,�� ���� �� ��������� ������������ �'���#�'��#� �( -512!�!�!� ��/ �# ��� �#� %����� �������� ���' ��� ��� ����*������ ��##+���,�� %�������# �����*�� #� (�� � !! 6�#����������� ���� 7�� �'��# �#�����

�� ����������

��� ��� %�#� ��� ������# #�'��8���� �������# ���� ������� �� ���#������' ��� ����������# �( �� ��� �������947 ���� #��� ���� ��# �%����� �� ����� �� ����+������ ��� �������� ��������%�� 7� ���#������' �(� '.947 ����������# �� ��� ���� �� ����� �# � ���� ��(����������' ��� ��#�'� �( ��� � '# ��� %���# ���� ������'��*� #%���8� 947 #�: ����#��.2 4���%#�� ��� ��#��+���� �� ��� ���� #� ���� ���# �( ��� %�������+�)������ ���## �( ��� ���� ��� ��' �������������'�%�%����#� ��� ��#����� �( 0����� ��� ���; �(#����� #��� �� #��� ��� '���� ������' ��� �� ��� ��#�'��( ���%��� ��##+���,�� -#��%���/ ��� ��#%�������# (��)������ ���'������ �( ��� ��� '���� �( 947�� �����'������ �#%��� �( ���� �� ��#�'� �� ��� �����)� �( %���+����# �# ��� ����� ����� �( ����������� ������# ��%�����( #%���8� 947 ���'������ �� ����'�� ���� ����%�������� ��������� ��� ��� �� %�� �� ��#������ -�/ ��# 8#����8�� (� � ����'� �� #�: ���� ���'������ (� �� 7�#��� �� � <1 #��� �� ���� ��� 9��,�#��= ����%�������� ������� ���' �� ����*��� ��' �� %���� �( ��� %���� ��' ����� ��� �� %�� ��� ����� ����� ����># ��� 9����># '� %���� ���� �)���#��� ��, �� ��� ����� ����� �( �������������# �� ��� %������� #�#�� �� ���� #�: ����#%���8������ ��� ���'������ �# ��%��� ���� ��� ��� ��%�� ��� ��� # �� ���8������ %�(��� �� � '� % �#��� ����� ����� �( ��� ����*��� ��' �� ���� ��' #�#��# ��� ! -?�'� �/ ��� ��#� �� ��� ��##+���,�� #�#��� ��������9����># '� % ��# ����%����� ���# ��' ���8������ ����� ���%�� #�#���@

�� ���� #� ���� ��� ������' �(8�����# �( � #���# �(����*���.����*���.%���� -�50/ ����# ! ��� ��##+���,�� ���#� ��� ���� ���� ��� �((��� �� #���������� ���������' �(8���� �� ����� ���' ��((���� 4+������ ����'� %# �������� �� ��� ������' ����*��� ��' ��� ��((�������'��# �( ��� ��##���,��' �������� �������!��� 5� ���+��� ����� �( � ��'���' �#���� �� �%���*� ��� ������'�( ���#� ��##+���,�� %�������# �� A� #���������� ����#� �� �%�� ��� #�����#�# �( ��##+���,�� ����*������%�������# �� ����� ��� ���,��' �# ����� � � ���� ���%����������� ����� �� ��� ����� ���� ��� �% %����B��,�� �� ��� %���� ���� ��� #��� ����� �( �������+����%�%������ ��� ��� ����*��� ���,�'� ���� ��((���������� ( ������������# �� ��� ���� #��� �( ��� #� �� �

��������� 2= - !! / C$��.C$ �0�'���

�6��7369��4

!!$!.$! !D! DE + #�� (��� ���� � !! 6�#���� ������� ���� 7�� �'��# �#�����055A �!!$!+$! !-! /!! =2+2

&��'���A ����������" 947" %�������#" ����*���#�� 1��#%�����' � ���� ����A ��+�=!+$@ +C;$;" (�)A ��+�=!+$@ += C�"�+���A ������������#���F ��������� "����� ��

�( &( ������ �� ��( ) !��������� *+ ,$--$. ��/01��$/C$�=

-�00/� ���#� ��##+���,�� %�������# ��� ���� ���� (����� '��#� ���������� ��������� ���#� ���������# �����%��� ���� ��� %���� # ����*������ ��##+���,�� %���+����# -��.5.0�/ -! ������� �� �������� ���,� (���� ������ ����*��� ��'/� ����� #���# ���� ��� -��.0�.0�/ - ������� �� �������� ���,� (� ��� ������ %������'/ �� �� %����� ��������# ���� ��� ����� �%������%� ��#�

� #����� ��� ����������

��� #�����#�# �( ��##+���,�� %�������# -��. / #��������� ��� #�����#�# �( ��� #%���8����� ( ���������*�� ��������#%���� ��� -$���/ -����� �/� ��� ������ �(%����������� ���,�# -13 /2 ��� -13 /� ��# ��#�� %��%���� # #� ���# ���� ���� �� � '� %��� ��� ��,������,�# -13 /2 ��� -13 /� ��� ����� ��� �� ��� ��,��������( ��� %���� ���� ��2+�����%������ ��� ���+�����+��%���� �� ��� %���##� #��� �( %���� (������� �� ��������������������� ��� �������� ���� �������������+������� ��� ( ��' ����� ���� �� ������ �������� �� ��� ��� $ %�#�����# �( ��� ��#+���,�� %���� �� '�����%� ��# -$���/ �#%��������� ��� #�����#�# �( ��##+���,�� ����%���� ��� -%���/ �������� ��� ��������� �� �+���� �( 2+GC+-�����������/%�%��H+�+�����+$+����%�+���+ +����)����� (������� �� ��� �� #�� �� %���' �(��� ���� �� $� �� 9�?D�3? -�A�/� ��� ������� ��#��%����� �(�� #����' ��� ������� �)� � �� ����%��� � (� 2 �� ��� ����%���� ��##���,�� %�������%� ��# % �8�� �� � #����� '�� ��� �� 1�%� �� %� ��#

#�����#�*�� �� � #���� ���� #��' $� �# ��� #�����'������� ��� ���� '� % �( %� ��# ������������� �� ����� �� ���� ����� ��# # �#�: ����� �� %��� ���� +����+$+����� ����*���+2+����)���� ���� & ������*�� �� ��C+��+�������)������������ ��� �+����)����*����*��� ������((���� ��� ��'�� ��##+���,�� %�������# �� �� C$I ������1�%� �� �� ��# #�����#�*�� �� � #���� ���� #�����'(� %�� 7���%�# �� ������ (������� �����' �# �( ������ ����� (�������� ���� ������ ��������D(��� ���� ��� ��� %�������� �( ���� ( ������ ���� ��+����+� �������+������ ��� ���� ������,��' �� ���� �)��## �( (��� ���� ������%���� (��� '� % ��� �# ���##( �� 5�#���� ����+� ����� �( ��� 4+(��� '� % �� ��� ��##+���,�� %���+����# ��# �������� �� �� %���' ��� �� ��� ���� �(-%���/ ���� +-(�������/+$+����� ����*���+2+����)���� ���� ' �# %���� #�� ��#������� �� �((��-����/ �� C2I ������ 7���%��� ����������# �( �� � � #��' ��� �%���� %���� �#�C ��� �# ���##( �� ������������ ��##+���,�� %�������# �� ��� �������� ���� %���' ��� �� ��� ���� �( %� ���� $+�����+2+������������� ����*��� ( �� $ I ������ ������� � ��#�������� �� �� %���' ��� �� ��� ���� �( %� ���� $+�����+2+������������� ����*��� (�

���#� ��##+���,�� %�������# �( ��� ��%� -����*���.%����.%����/ ��� �����*�� (� ���� 947 #�: ����#%���8� ���'������� �� ���# ���� #���� ���� ��� -13 /�%����������� ���,� ���� ���� ( �������� '� % �� �������*��� ��' �� #���'�� ����# �� ��� ��'�� 947 #�: ���������# �#� �( ��� ��%� ��# �� ��� �. #����� %��947 ������' #%���8�����2 �# ��������� �� � �����

)����� �� 3�� ��� ��� ��� � ��A -�/ 9�?D�3? -�A�/� ��� 2 �� � I� -��/ 3 D0�.1� ���3� 2! %#�� �� -���/ & � '� 9�?� 911� 3�J�� ��� $ �� C$� C2I�-��/ (� 9�?D�3? -�A�/� ��� 2 �� $ I�

�( &( ������ �� ��( ) !��������� *+ ,$--$. ��/01��$/ C$�@

#� ���#��$ ����(�� ��%� �� �� ����� ��# #� ���� (� ���'��#� ���������� �� ������'� ������� -����� �# �#� #%���+8�� ���� #� � �#������� (�'��� ���� � #��'�� #���''��#� #��� ��# #��/��; ��� C 0+�������� �; ��#�%��(�'��� (� %J� C ��# #�� �# # �#���� �� � ((��1�����'� ��� # �� ��� '��#� ���'������ #��� � <<11 7��� �# �������� �� %�#���� �( ��%�B�)����� 5� ���# ���������� (�'���# �� %�� ��� -#��� �� ��� '��/� 5� ���%�#���� �( ��� %������� �� ��� (������ �( ��� ���(�'���# �# ���������� ����� ��# : ������������ �������� #��' ��� �%���� %���� ���; 1�%������ �� ���� #� ���#�� ��� ��B ���� �� '��#� -(� �� 4� #��/ ������*��������'� �( ��� 947 #� ���# #����� ���� ��� -13 /���##+���,�� %������� -��/ �# ��� �#� %����� ������������ �� 512! ��� � !�!� �� �# ��%��� �� ���� �(-���.5.0�/�$� -13 /� 512! �# !��� ����$� ��� ���� �(��� ����# ��� !� ��� �( ��� �� %�� �� � �#��! ��� ��� #�: ���� �� �� � #��'�� '��#� #���� ������# ��������� �� ��� �; �% (�'��� - #��' J'55D�� C7+�; �% (�'��� (� %J�C / ��# #�� �# # �#���� ����� ������'� �##��� ��� ��#������ �)%���� ��� %��� ��������'��#� �((��� �( ��� ���� 7 #������ ���� '��#�������'� #��� -����/ ��# � ��'� �(8���� #��� - ��������/(� ��� %������� ��� ������� ��� ��� (���

1<7�<<11��11117��7�11�7**++77<<<<�77�7

5� #��# %�##���� ���� ������' �( ��� ��� ����' ��� 7�#�: ���� ���������' � ��7 ��#� %�� #��% ��� ��# ������' �(947 ��� ����� �(8������� ����,# ��� ��*�� �������������'� �� ��� %#��� ������� <<11 #������ K���,� ������ ��� ����# ��� ��#������ #����� �� � �������, ��������� �((���# �� ��� ������������# ��%����� ������ �( ��� ��� #���� �� ��'�� � ' ������������#�� �� �� �: ��� �� %�� �� ������'� �� # �� �# ����#� %����� �������� �( '��#� ������� ������'� �( ������ ����*������ ��##+���,�� %�������# ��#��� �� �����

!� ,-���������

!��� +������

7�� �������# #�� ��� �( ��'��� '���� ��� �������#��� ����� � � �� ������ # #������#� 7����� #2�2 �+�������(����� -9�?/� ������� -���3/�2�2+���#�%�%����������� -9567/� ����������� -�67/���C+���������)������������ -911/� �+����)����*�+���*��� -3�J�/� ��� $+���������*��� ��� % ���#��(� 7����� 1������ 1�� ��� ��� #�� ����� � ���% �8������� ��� �������# ��� ������� �� �������������� ���� ������'�%�� -��1/ #��' #����� '��-;!?+ 2$� ���,/ ������ �� �� ���,�� %����#� �34�� #%���� ��� ������ �� � C!! �3* #%���������� ��� ������� #��(�# �� �%���� �� � %% ���� �#%����� ���������#����� �# �� ������� #������� ��� ��� �# (���� �� %���' ���#���� -4/ �� �)%�##�� �� ���*� ��###%���� ��� ��'� �#�� ���� �## #%���� -3���/ ������� �� %�#�����+��� ������#%�� ����*����� ���� ����+�## L�%�%�� 3���� �����+��?� ������' %����# ����������� �� �� ����������� �����' %���� �%%��� #��� �� ���������

1�%� �� $.( ��� #�����#�*�� �� ��� �%���������������

!����� �.� ��/�.%�0����������1���2��2%�22/!.!�������������1�����3�������3��������$�������!��3�$�222 �������$�������������%��3�������3�����3�������3� ������-����� /��1� 0������ ������� -�!I� 2!! '/��# ����� �� � #�� ���� �( %� -��!! '� �� 2 ��/ �� ����+�� # 9�?D���3 -�A� �D�" �!! �/� 9�'�##��' �( ���#�� ���� ��# ���� �� �'��� ��� ���� ��� �)� � ��#����'������ �� � 0� #��,� (� � �� 2! %#�� ��� ������#���# ���� ����� �� 8������� ��� ��� 8����� ��# ��#������� �������� ��� ������� 8����� ��# ���%����� �����'� ��� �� ���� ����# �( �������� ��� �#�� ���� ��� %�� �� ��# ���##����� �� ������ # 9�?-2! �/� ��� ��%� �� & -C@; '� �2� ��/ ���3�J� -$�$ '� C�2� ��/ ��� ����� �� �� ���� ���#����#����'� 7 #�� ���� �( 911 -� C '� C�2� ��/ �� ����+�� # 9�? -C �/ ��# ����� #����� �� ��� ����� #����#�� ����� ��� ��� #����' �# ������ �� �� �� ��%��� �(� �� ���������� �= �� ��� ������� �)� � ��# 8����� ������ #������ ��# ����� �� ��� �� ��� �% � %�� �� ��#% �8�� �� #����� '�� ��� � ������'�%��� ��� % ���%� �� �� ��# �� ��� ���� 13 1� D���3D43$�3-=!A !A!�$� �D�D�/ �# � ������ %���� �� C$I �����-$C! '/� % �; .�;$�1� �3 4�� -9���+�;/A � �� 2-� 3/� ��2= -� 3/� ���; -:� $3/� � � -#� � 3/� �C� -��4���! 3*� $3/� �$= -#� ;3/� C� 2 -��� 4�;�! 3*� $3/� C�@�-#� ;3/� $�$� -�� $3/� ;�=C� ;�@$ - �� 4���; 3*� 3 ����/���C= -#� $3/� ���@ -�� 4���; 3*� 3/� =�!! -�� 4�;�! 3*� 3�9 � �)����'�����/� =� 2 -�� 4���� 3*� 3/� @�@2� �!� 2 - #� 3 ����� 9 � �)����'�����/� �C1 4�� -9���+�;/A ��=!� 2� �;=��C� �;��C�� �2=�2�� �22�$2� �C2�;@� �CC�=;��C!�C � � �==� � ����� ��=� �� ����$2� �!$�$!� 2$�2C�$���=� $ �!�� C=�2=� C;�!$� C2�2!� C!��@� =��C� 2�=2� $�$;� �2�2@� 3��� ����� (� 1$�3;24�;�;� �!�C�$���(� �� �!�C�$�� -���3� �!!I/�

!��� � �.� ��/�.'�4����������1���2��2%�22/!.!�������������1�����3�������3��������$�������!��3�$�222 �������$�������������%��3�������3�����3�������3� ������-����� /��1� ��� ����� ��%� �� ��# #�����#�*���� � #���� ��� �# ��#����� ����� (� %� ��� & �# ������� %���� �� C$I ����� -$$! '/� % �2=.�;C�1� �34�� -9���+�;/A � �� 2 -� ;3/� ��;! -� =3/� ��2 -#�� 3/� � 2 -�� 4���! 3*� $3/� �C= -#� ;3/� C� ! -��� 4�;�! 3*� $3/� C�=! -#� ;3/� $� 2 -�� $3/� ;�=!� ;�@$� ���2��� ! -$�� 4���; 3*� 3 ����/� ��$! -#� $3� 9 � �)����'�+����/� =�!= -�� 4�;�! 3*� 3� 9 � �)����'�����/� @�$$� @�=;- �� 3� 9 � �)����'�����/� �C1 4�� -9���+�;/A ��=!�!2� �;;�$ � �;!�$�� �2=�2�� �22�$2� �C;� C� �C��$ ��C!�C � � �==� � !��2� ��=� �� ��$��C� �!$�$!� 2��C=�$���@� $ �!�� C=�C�� C;��2� C2�2C� C!��@� �� $� 2�=2� C�;;� ��2�� !�!�� �2�=@� 3��� ����� (�1$@3;@4�;�;� �!$��2C�� (� �� �!$��2C -���3� �!!I/�

!���!� �.� ��/�.%�0����������1���2��2%�22/!.!�������������1�����3�������3��������$�������!��3�$�222 � ����������$�������������%��3�������3�����3�������3� ������-����� /��1� 1�%� �� %� -��!! '��� 2 ��/ ��# �� ��� �� %������ ������� -2!! '/�� � #���� ���� �# ��#����� ������ ��� �� ���%�� �� ��# ���##����� �� ������ # 9�? -2! �/ ��� '

�( &( ������ �� ��( ) !��������� *+ ,$--$. ��/01��$/C$ !

-$;2 '� �2! ��/ ��� 3�J� -$� '� C�2! ��/ �������� �� �� �� �� ��%��� � ��� ����'�� ���� ���#����#����'� 7 #�� ���� �( 911 -� � '� C�2! ��/ �� ����+�� # 9�? -C �/ ��# ����� �� ���# #���� #�� ����� ������ #����' ��# ������ �� �� �� ��%��� � (����������� �= �� ��� ������� �)� � ��# 8����� ��� ���#������ ��# ����� �� ��� �� ��� �% � %�� �� ��#% �8�� �� #����� '�� ��� � ������'�%��� ��� % ���%� �� �� ��# �� ��� ���� 13 1� D���3D43$�3-=!A !A!�C� �D�D�/ �# � ������ %���� �� C2I �����-$;! '/� % ��!.��C�1� �3 4�� -9���+�;/A � �� 2-� 3/� ��2$ -� 3/� ��;� -:� $3/� � ! -#� � 3/� �C� -��4���! 3*� $3/� �$2 -#� ;3/� C��2 -��� 4�;�! 3*� $3/� C�@2-#� ;3/� $�C2 -�� $3/� ;�=;� ;��$ - �� 4���; 3*� 3 ����/���2@ -#� 3� 9 � �)����'�����/� ��@ � -�� 4���; 3*� 3/�=�!! -�� 4�;�! 3*� 3� 9 � �)����'�����/� =��2 -�� 4���� 3*� 3/� =�22 -#� 3/� @�; � @��2 - #� 3 ����� 9 ��)����'�����/� �C1 4�� -9���+�;/A � �=��CC� �;�� C��;��C�� �2@�;!� �2;� C� �22�$2� �C2�;@� �C �=;� �C!�C �� �==� � ���� ��=� �� ��!�;C� �! � !� 2��=�� $���=�$ ��2� C;�2=� C;��$� C2�2!� C!��@� =� � 2�!�� $�C ��$��C� 3��� ����� (� 1$@3;24�;�=� �!;@�$;�� (� ���!;@�$;! -���3� �!!I/�

!���$� �.� ��/�.'�4����������1���2��2%�22/!.!�������������1�����3�������3��������$�������!��3�$�222 � ����������$�������������%��3�������3�����3�������3� ������-����� /��1� ��� ����� ��%� �� ��##�����#�*�� �� � #���� ���� (� %� ��� ' �# � ������%���� �� C�I ����� -$@! '/� % ��$.��=�1� �3 4��-9���+�;/A � �� 2 -� ;3/� ��;2 -� =3/� ��2 -#� � 3/� �C! -�� 4���! 3*� $3/� �$! -#� ;3/� C� @ -��� 4�;�! 3*�$3/� C�;2 -#� ;3/� $� ! -�� $3/� ;�= � ;�@=� ���2� �� ! -$��4���; 3*� 3 ����/� ��� -#� 3/� =�2� -#� 3/� =�!! -�� 4�;�! 3*� 3� 9 � �)����'�����/� @�2!� @�;= - �� 3� 9 ��)����'�����/� �C1 4�� -9���+�;/A � �=��!2� �;2�$���;�� C� �;!�CC� �2;�2$� �22�$2� �C;�$C� �C!�$ � �C!�C �� ��=@� � !� 2� ��=� $� ��$�$C� �!$�$C� 2��C$� $=� @�$ ���� C����� C;� C� C2�2!� C!��$� ��C$� 2�=2� C�;;� ��$C� !�!C� �2��2� 3��� ����� (� 12�3;@4�;�=�

�!@��$@ � (� �� �!@��$=@ -���3� �!!I/�

!���%� �.� ��/�.%�0����������1���2��2%�22/!.!�������������1�����3�������3��������$�������!��3�$�222$�������������%��3�������3�����3�������3� ������-������ /��1� 1�%� �� %� -�� ! '� ��!! ��/ ��# �� ����� %������ ������� -;!! '/ �� � #���� ��� �#��#����� ������ ��� �� ��� %�� �� ��# ���##����� �������� # 9�? -2! �/� ( -$@! '� �!! ��/ �� 9�?D�3? -�A�� �D� ! �/ ��# ����� �� ��� ����� �� ���%�� �� ��%��#� �� �� ��%��� � ��� ����'�� ���� %���� �( C! �� ��� ��� #����' ��# ������ �� �� ����%��� � (� ���������� �= �� ��� #������ ��# ����� ����� �� ��� �% � %�� �� ��# % �8�� �� #����� '�� ��� �������'�%��� ��� % � ��%� �� �� ��# �� ��� ����13 1� D���3D43$�3 -=!A !A!�$� �D�D�/ �# � ������%���� �� $ I ����� -$�2 '/� % �;C.�;;�1� �3 4��-9���+�;/A � �� 2 -� 3/� ��2! -� 3/� ��; -:� $3/� � ! -#� � 3/� �C! -�� 4���! 3*� $3/� �$2 -#� ;3/� C��! -���4�;�! 3*� $3/� C�=2 -#� ;3/� $�$! -�� $3/� ;��!� ;���� - ��4���; 3*� 3 ����/� ��;! -#� 3/� ��22 -#� 3/� ��= -�� 4 ���� 3*� 3/� =�!2 -�� 4�;�! 3*� 3� 9 � �)����'�����/�=��! -�� 4���� 3*� 3/� @��@� @�=! - #� 3 ����� 9 �

�)����'�����/� �C1 4�� -9���+�;/A � ��@� �� �;�� $��;��C$� �2=�2 � �22�$2� �$�� $� �C;���� �CC�=;� �C�� C�� ���� � ���$� ��=� C� �� �C � �!$�$�� 2$�;C� $=� =�$ ���� C=�2@� C;��$� C2�2!� C!��!� =��$� 2�;C� $�$;��2�� � 3��� ����� (� 1$�3;C4�$�;� @=C�$$@� (� ��@=C�$2 -���3� �!!I/�

!���&� �.� ��/�.'�4����������1���2��2%�22/!.!�������������1�����3�������3��������$�������!��3�$�222$�������������%��3�������3�����3�������3� ������-������ /� 1� ��� ����� ��%� �� ��# #�����#�*�� �� � #�������� �# ��#����� ����� (� %� ��� ( �# � ������%���� �� $2I ����� -$2! '/� % �;=.�� �1� �3 4��-9���+�;/A � �� ! -� ;3/� ���! -� =3/� ��! -#� � 3/� �C2 -�� 4���! 3*� $3/� �$ -#� ;3/� C�C! -��� 4�;�! 3*�$3/� C�;2 -#� ;3/� $� ! -�� $3/� ;�=!� ;�@ � ���!� �� $ -$��4���; 3*� 3 ����/� ��;! -#� 3/� =��2 -�� 4�;�! 3*� 3�9 � �)����'�����/� =�2; -#� 3/� @�2;� @�=C - �� 3� 9 ��)����'�����/� �C1 4�� -9���+�;/A � ��@�C2� �;;�$ ��;��$�� �2=�2�� �22�2$� �$ �C$� �C�� �� �C��$ � �C!�C �� C��;� � !��=� ��=� @� ��$��C� �!$�$C� 2��C=� $�� @�$ �!�� C=�C�� C;� C� C2��C� C!��@� �� $� 2��2� C�;;� ��2�� !���� �2�=@� 3��� ����� (� 1$@3;�4�$�;�

�!���$=!� (� �� �!���$=! -���3� �!!I/�

���������������

�� ����, ��� 4�� �� �������# ��� 6�'������' 1� ���� �(1����� ��� ��� 9�%����� �( 1���#��� K����#��� �(7������ (� 8������� # %%�� �( ���# ��, -�� �� �/�

#� �������

�� <����#(���� �� ��" 4����� ��" �� '�� �� ��" J���� 6� 6�"

9����� 0� J� 2����� ���'� �+0� ! �

� 9����� 0� J� �� ���� ��(&� $�$� $;$�

C� 9��,��#��� �� 7�" < *����� 0�" �� '�� �� ��" J���� 6� 6�"

��#��� 9� ��" <����#(���� �� ��" 9����� 0� J� 5��( 2���

����( �� ( ��� ���(� 6*� � =@!�

$� J������ 1�" 1����#� �� J� � ��7� ��� ����( ���(� 6� 2�C�

2� 5���� 3�" ���� <�" ����� �� �� ����( 8� �( � ������( ����� /-�

@�

;� 0������ �� <�" ���� 9� 6� 5��( 2��� ����( �� ( ��� ��(��

+"� 2� C�

�� -�/ �,�#��� ��" 0�,#� �� 6�" 9����� 0� J� 4( ��( ����( ��(

���$� //"� �@=C� -�/ �,#���� ��" 9����� 0� J� 4( ��( ����(

��( ���$� //"� C;;C� -�/ 1���� M� 3�" ����� �� �� 4( ��(

����( ��( ���$� //"� ;@@2� -�/ M� �': �#�� �� ��" 9�����

0� J� 4( ��( ����( ��( ��(%� /-0� 22 =�

=� -�/ ��%,�� �� ��" M���� 1�" <���#���� 9�" 0� �� 0�"

9��,�#��� �� 6� 5��( 2��� ����( �� ( ��� ��(%� +$� �C�;�

-�/ ����� �� ��" �����,�� ��" J���� K� <�" �,����'���� 7�"

9������,� �� 1� � ���� ���� ��(&� $*� �$!=�

@� -�/ ���� �� 6�" ����� �� <�" M���'��� J�" ����� �� �� ��� �

������ ��� ���( ���5� *� C� -�/ ��%,�� �� ��" <���#����

9� ��" 3��� <� ��" 1�� � �� ��" ����� �� ��" 9��,�#���

�� 6� ��������� ���'� *� �!CC� -�/ 4' ���� 9� 3�" �*���*�,�

�� ��" J���� 6� 6�" 9����� 0� J� � � ( 9��( ����( 55��

6� ��

�!� �>3��� 1� 1�" ���,� 9�" ������� ��" ����� �� ��" �����

�( &( ������ �� ��( ) !��������� *+ ,$--$. ��/01��$/ C$ �

�� ��" ��%,�� �� ��" 9��,�#��� �� 6�" 3������ �� 7� 5��(

2��� ����( �� ( ��� 55 � 66� � �

��� ����� �� ��" ������� ��" ����� �� �� 4( 8� ( ����( 555�

"*� ��! �

� � ����� �� ��" ������� ��" ����� �� �� ���( 4( 8� ( ����(

555� !@2�

�C� J� �� �� 7�" ���*'�� �� ����( ��( �� �( ��( ��&'� $� 2!C�

�$� -�/ J �,����� <�" ?��#��� 5�" ����� 3�" J���+3�#��(����

6�" ������� ��" ��� �*� 3�" ����� �� ��" ����� �� ��"

L��� 1�� 4( � ��( ������( ���( 555� $� C22 0���

6������� 1����#A 7������ 0�##� -�/ 1���� M� 3�" M��'�

M�" ����� �� �� 4( � ��( ������( ���( ���&� /�� $��

�2� J �,����� <�" ����� 3�" J���+3�#��(���� 6�" ������� ��"

����� �� ��" ����� �� ��" L��� 1� 4( � ��( ������(

���( 55 �� %�##�

�;� ����� 3�" �����'� J�" L��� 1� ���� :���( ���$� �*�� �@�

��� ��� �� ��" 4�,����� 9� J�" J ���� �� �� 2����� ���!� �"*�

2 !� � �� L� ��" 1���� �� ��" �������� 0� ��" J��,����� 5�"

J�,� 7� ��" 9��,�#��� �� 6� 4( 9�( � �( ���&� $"/� C@�