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Der Einbau von 32P in die Nucleolarsubstanz des Zellkernes

von Acetabularia mediterranea

V o n HANS STICH u n d JOACHIM HÄMMERLING

Aus dem Max-Planck-Institut für Meeresbiologie, Abt. H ä m m e r l i n g , Wilhelmshaven (Z. Naturforsdig. 8 b, 329—333 [1953]; eingegangen am 13. April 1953)

Aus einzelnen Zellkernen von Acetabularia mediterranea konnten die großen Nucleolen isoliert und dadurch der 32P-Einbau in sie bestimmt werden.

Der größte Teil des in die Zellkerne sehr bald eingebauten 32P ist in der Nucleolarsubstanz lokalisiert. Eine starke Einlagerung dürften die Ribonucleinsäure-Moleküle des Nucleolus besitzen.

Die Intensität des 32P-Einbaues in die Nucleolen ist vom physiologischen Zustand von Zelle und Kern abhängig: in junge noch wachsende Kerne und Nucleolen wird wesentlich mehr 32P eingebaut als in die viel größeren Nucleolen älterer Pflanzen.

Es wird diskutiert, inwieweit die Versuche den Schluß gestatten, daß im Nucleolus Ribo-nucleinsäure und Proteine synthetisiert werden.

Untersuchungen mit 32P erbrachten neuerdings be-kanntlich einen Einblick in den Stoffwechsel

phosphorhaltiger Substanzen der tierischen und pflanz-lichen Zelle. Hierbei zeigte sich, daß einerseits die einzelnen Stoffe innerhalb der Zelle einen sehr unter-schiedlichen 32P-Austausch besitzen, andererseits daß die Intensität der Erneuerungsraten in verschiedenen Zellteilen stark variiert. In die Ribonucleinsäure der Mikrosomen wird z .B. 32P wesentlich schneller einge-lagert als in die der Mitochondrien oder der nicht-abzentrifugierbaren RNS-Fraktion von Ratten- bzw. Mäuselebern 1 , 2 , 3 . Die Zellkerne können bei einigen Objekten einen niedrigeren spezifischen 32P-Einbau haben als die Cytoplasmafraktionen, bei anderen hin-gegen scheint er erheblich höher und schneller zu sein, wie z. B. bei Amoeba proteus*, Polytomella coeca1

und der Mäuseleber 2 - 4 . Die Intensitäten dieser Um-satzraten sind weitgehend vom physiologischen Zu-stand der Zellen abhängig 5.

Die bisherigen Befunde über den 32P-Umsatz der Zell kerne geben dagegen außer für DNS 27>28 im all-gemeinen bisher nur generelle Auskünfte. Nach den

1 R. J e n e e r u. D. S z a f a r z , Arch. Biodremistry 26, 54 [1950],

2 C . B a r n u m u. R. H u s e b y , Arch. Biodiemistry 29, 7 [1950],

3 I. D a v i d s o n in Isotopes in Biochemistry, Chur-chill-Verlag 1952.

4 A. M a r s h a k , J. cellular comparat. Physiol. 32, 381 [1948]; A. M a r s h a k u. F. C a 1 v e t , ibid. 34, 451 [1949],

5 z.B. B e r g s t r a n d , N. E l i a s s o n , E. H a m m a r -s t e n , B. N o r b e r g , P. R e i c h a r d u. H. v. U b i s c h , Cold Spring Harbor Sympos. quantitat. Biol. 13, 22 [1948].

chemischen bzw. cytochemischen Ergebnissen kommt Phosphor in den verschiedensten Kernstrukturen vor: so in der Desoxyribonucleinsäure (DNS) und Ribo-nucleinsäure (RNS) der Chromosomen6, in der RNS 7, in Phosphorproteiden 19—21 und Phosphorlipoi-den 8 des Nucleolus, und im Kernsaft, sofern dieser RNS enthäl t 9 , 1 0 ' 1 1 . Auch die Kernmembran enthält vermutlich Phosphorlipoide 12. Hierzu kommen noch phosphorhaltige Stoffe, wie z. B. Adenosindi- und -tri-phosphorsäure und die Co-Dehydrase, deren Vor-kommen im Kern sehr wahrscheinlich ist. Diese in ihrer Struktur und Funktion heterogenen phosphor-haltigen Kernbestandteile müssen ganz verschiede-nen Stoffwechsel haben. Wenn daher der Einbau von 32P in den Gesamtkern geprüft wird, läßt sich im all-gemeinen kein Schluß ziehen, in welchen Kernbe-standteil der Einbau erfolgt ist. Hierzu wäre eine Trennung der einzelnen Kernbestandteile erforder-lich. Bei den einkernigen Acetabularien erwies sich das insoweit möglich, als aus den Riesenkernen unter dem Binokular die großen Nucleolen isoliert werden konnten. Damit war die Voraussetzung gegeben, die-

e z. B. A. M i r s k y u. H. R i s , J. gen. Physiol. 31, 1, 7 [1947]; 34, 475 [1951],

7 z. B. T. C a s p e r s s o n, Cell Growth and Cell Func-tion, New York 1950; J . B r ä c h et, Embryologie chimique.

8 M. A l b u q u e r q u e u J. S e r r a , Portug. Acta Biol. 3, 187 [1951].

9 H . S t i c h , Z. Naturforschg. 6b , 259 [1951]. 10 H. S t i c h , Z. Naturforschg. 6 b, 319 [1951]. 11 J. B r a c h e t , Experientia [Basel] 7, 347 [1952], 12 T. W a n g , D. M a y e r u. L. T h o m a s , Exp.

Cell Res. 4, 102 [1953].

sen Umstand auch für Versuche mit radioaktiven Iso-topen auszunutzen.

M a t e r i a l u n d M e t h o d e

Als Material diente Acetabularia mediterranea. Die Pflanzen wurden in eine 32P-haltige Seewasserlösung ge-bracht. Nähere Angaben zur Aktivierung sollen in einer späteren Arbeit über den Einbau von 32P in das Cyto-plasma folgen13. Um eine meßbare Radioaktivität der Kerne und Nucleolen zu erhalten, mußten wesentlich höhere 32P-Konzentrationen angewendet werden, als für Untersuchungen über den Einbau in das Cytoplasma aus-reichend waren. Sichtbare Schäden traten an Hutpflanzen während und nach der Behandlungszeit bis zur Cysten-bildung nicht auf.

Die nach verschiedenen Zeitabständen aus der 32P-Lösung genommenen Pflanzen wurden in Carnoy fixiert, in 80-proz. Alkohol übergeführt, dann nach Entfernung des Alkohols in eine Gallocyanin- oder Anthracenblau-lösung gebracht (0,15 g Farbstoff in 100 ccm einer 5-proz. Chromalaunlösung) und nach 12 Stdn. Färbedauer durch Alkohol (70—80—96-proz.) geführt und in Euparal oder über Benzol in Caedax gelegt. Wie schon frühere Unter-suchungen zeigten, lassen sich in diesen Medien die ge-färbten, schon im Binokular gut erkennbaren Zellkerne relativ leicht isolieren14. Mit Hilfe feiner Nadeln gelang es nunmehr darüber hinaus, aus diesen Kernen die ein-zelnen Nucleolen zu isolieren und von anhaftenden Be-standteilen zu befreien.

Ohne Färbung ist der in einem der vielen Rhizoid-ästchen befindliche Kern nur selten aufzufinden. Es fragt sich daher, wie weit durch die bisher nicht zu um-gehende Vorbehandlung phosphorhaltige Stoffe extrahiert werden. Nach Angaben von H o f f m a n n 1 5 soll aus der Zelle bereits durch aqua dest. ein Teil des Phosphor-gehaltes, und zwar hauptsächlich der nicht gebundene anorganische Phosphor verloren gehen, Nucleinsäuren und die Phosphorproteide werden nach Fixierung in den Zel-len verbleiben. Auch die von uns angewandte Färbetech-nik beläßt die beiden letzten Substanzen in der fixierten Zelle. Sie entspricht derjenigen von L a g e r s t e d t 1 6 , E i n a r s o n 1 6 a und S a n d r i t t e r 1 7 , der sie sogar für quantitative Nucleinsäurebestimmungen geeignet fand.

Nach 30—45 Min. dauernder Behandlung der Zellen mit 90—95° C heißer 5—10-proz. Trichloressigsäure, mit der in einer Versudisreihe die Nucleinsäuren extrahiert wurden18, ließen sich die Kerne mit Gallocyanin und Anthracenblau nicht oder kaum mehr anfärben. Deshalb mußte für die Isolierung der Nucleolen aus solchen Kernen eine andere Technik verwendet werden. Hierfür erwies sich die Azocarminfärbung mit nachfolgender Alkohol-oder Anilinalkohol-Differenzierung als brauchbar. Azo-carmin und die nachfolgende Behandlung extrahierten selbst keine, zumindest keine eindeutig feststellbare Phos-

13 J. H ä m m e r 1 i n g u. H . S t i c h , Z. Naturforschg. 8 b, im Druck [1953].

14 J. H ä m m e r l i n g , Arch. Protistenkunde 97, 7 [1944], Abb. 2 c u. e, Tafel 2.

13 C. H o f f m a n n u. M . R e i n h a r d t , Kieler Mee-resforsdig. 8, 135 [1952],

phatmengen aus den Carnoy-fixierten Zellen. Eine mehr-malige, bis zu 3 Stdn. dauernde Behandlung von Acetabu-laria-Zellen, in die 32P eingebaut war, mit Azocarmin und 80-proz. Alkohol gab keinen merklichen Verlust der Aktivi-tät. Ferner blieb eine Färbung und Entfärbung ohne Einfluß auf die Zellbasophilie, wie mit Toluidinblaufär-bung vor und nach der Behandlung gezeigt werden konnte.

E r g e b n i s s e

1. Da bisher Angaben über einen etwaigen Phos-phoreinbau in die Nucleolarsubstanzen fehlen, prüf-ten wir zuerst an isolierten Nucleolen die Stärke der 32P-Einlagerung, wobei besonderer Wert auf eine möglichste Reinheit der Nucleolarsubstanz gelegt wurde. An den Nucleolen klebten oft Reste des durch die Fixierung gefällten Kernsaftes, der bei Acetabula-ria mediterranea RNS enthält, wie aus cytochemischen Befunden1 0 '1 1 und den UV-Aufnahmen (Abb. 1 *) er-sichtlich ist. Da in die RNS des Kernsaftes 32P ein-gebaut sein könnte, würden etwa ansitzende Kern-saftreste die wahren für die Nucleolen geltenden Impulswerte erhöhen. Wie Abb. 2 erkennen läßt, ist jedoch eine fast vollkommene Reinigung der Nucleo-len möglich. Aus je 3—5 Kernen von erwachsenen Acetabularien, deren Nucleolarsubstanz bekanntlich in mehreren, länglichen oder rundlichen etwa 10 p dicken und bis zu 60 p langen Gebilden vorliegt (Abb. 1 a und 3), wurden jeweils die günstigsten Nucleolen, in diesem und nur in diesem Falle also nicht die gesamte Nucleolarsubstanz, in einem klei-nen Tröpfchen Caedax oder Euparal isoliert, auf einem Objektträger gesammelt und mit einem Gei-ger-Müller-Zählrohr gemessen. Bereits nach 3 Stdn. Aufenthalt der Zellen in einer 32P-Seewasserlösung hatten die Nucleolen eine gut meßbare 32P-Menge eingebaut. Verblieben die Zellen bis zu 36 Stdn. in der 32P-Lösung, so nahm der Einbau langsam zu. Aus den Kernen dieser Pflanzen (insgesamt 74) wurde je-weils die gesamte Nucleolensubstanz isoliert. Aus diesen Versuchen können wir schließen, daß die Nu-cleolarsubstanz des Acetabulariakernes einen relativ sehr schnellen und starken Einbau von 32P besitzt.

2. Um eine Vorstellung von der mengenmäßigen Verteilung des in den Kernen eingebauten 32P zu er-halten, wurden zuerst ganze isolierte Kerne gemes-

10 S. L a g e r s t e d t , Acta Anatom. 5, 217 [1948]; ibid. Suppl. 9 [1949],

i e a E i n a r s on , Acta pathol. microbiol. scand. 28, 82 [1951],

17 W. S a n d r i t t e r , Z. wiss. mikroskop. Techn. 61, 30 [1951]; Z. Pathol. 63, 387, 423 [1952].

18 W . S c h n e i d e r , J. biol. Chemistry 161, 293 [1945], * Abb. 1 u. 2 s.Tafel S.332a.

sen, dann aus diesen wiederum die gesamte Nucleo-larsubstanz isoliert, durch Übertragung in mehrere Zwischenmedien gereinigt und ihre Radioaktivität be-sonders bestimmt. Auf diese Weise ließ sich an 28 Kernen ermitteln, daß etwa 8 0 % des nach der ge-schilderten Vorbehandlung im Kern verbleibenden radioaktiven Phosphors in der Nucleolarsubstanz lo-kalisiert war. Genaue, quantitative Angaben sind al-lerdings nicht möglich, obwohl nur möglichst reine Nucleolen verwendet wurden. Denn einerseits ver-blieb bei diesen Versuchen, bei denen einzelne Nu-cleolen nicht ausgesucht werden konnten, an die-sen vielleicht z. Tl. noch etwas gefällter Kernsaft, andererseits könnte dem Gesamtkern eine feine peri-nucleäre 32P-haltige Plasmaschicht anhaften — das dem Kern benachbarte Plasma ist relativ RNS-reich — und so die Radioaktivität der extranucleolären Kernbestandteile erhöhen. Im ersten Falle würde das Verhältnis Kern : Nucleolen zuungunsten, im zwei-ten Falle zugunsten der Nucleolen verschoben. Schließlich unterliegt aus noch nicht näher analysier-ten Gründen wahrscheinlich die Menge der Ribo-nucleinsäure im Kernsaft großen Schwankungen, was sich ebenfalls auf die Größe des extranucleolären 32P-Gehaltes auswirken könnte. Auch wenn die angeführ-ten Fehlermöglichkeiten nicht restlos ausgeschlossen werden können, so läßt sich doch schließen, daß ein sehr erheblicher Teil des 32P in die Nucleolen ein-gebaut wird.

3. Weitere Versuche bezogen sich auf die Frage des Einbaues in die Nucleolen junger und alter Kerne. Prüft man die Stärke des 32P-Einbaues in die Nucleo-len von großen 3,0—3,6 cm langen Zellen, so ist eine gewisse Beziehung zwischen dem ziemlich weit schwankenden Volumen der Nucleolarsubstanz und der jeweils eingebauten 32P-Menge festzustellen. Voll-kommen andere Verhältnisse treffen wir, wenn Nu-cleolen aus solchen Zellen mit Nucleolen aus jungen 1,0—1,5 cm großen Pflanzen verglichen werden, die in derselben 32P-Seewasserlösung und auch sonst unter möglichst gleichen Bedingungen gehalten wur-den. Die Nucleolen junger Pflanzen haben ebenso wie die ganzen Kerne ein wesentlich geringeres Volumen als die Nucleolen großer Pflanzen (Abb. 3). Eine eigentliche Volumenbestimmung ist allerdings kaum möglich. Besonders der heterogene Aufbau des Nu-cleolus aus blasenartigen Einschlüssen und einer kom-pakteren RNS-Eiweiß enthaltenden Substanz verhin-dert eine genaue Bestimmung der Nucleolarsubstanz-menge. In den 14 jungen und 16 alten Kernen, die

zugleich hinsichtlich ihrer Radioaktivität geprüft wurden, verhielten sich die Nucleolusvolumina durch-schnittlich wie 1 : 6, wenn wir einmal versuchen wol-len, Zahlenwerte in gröbster Annäherung anzugeben. Trotzdem war die Menge des eingebauten 32P in beiden Stadien ungefähr gleich (größte im Einzelfall gefundene Differenz 22%) . Auf das Volumen bezo-gen, hatten also die Nucleolen der jungen Pflanzen eine wesentlich höhere (etwa 6-fach so große) Radio-aktivität wie die alten Nucleolen. Für diesen zunächst erstaunlichen Befund gibt es drei Erklärungsmöglich-keiten: 1. Die kleinen Nucleolen könnten relativ mehr phosphorhaltige Substanzen enthalten als die alten. Diese Annahme erscheint uns recht unwahrschein-

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a b

Abb. 3. a) Nucleolen aus einem großen Kern einer 3,4 cm langen Acetabularia. b) Nucleolen aus einem kleineren Kern einer 1,2 cm langen Zelle. Die Pflanzen befanden sich 18 Stdn. in einer Seewasserlösung gleicher 32P-Aktivi-tät. Obgleich die Volumina der Nucleolen sich etwa wie 7 : 1 verhalten, war der Gehalt beider an eingebauten 32P

ungefähr gleich (Differenz 7%).

lieh. Wenn sie zutreffend wäre, müßte die Vergröße-rung der Nucleolen nicht auf einem echten Wachstum beruhen. 2. Die Umsatzrate der phosphorhaltigen Substanzen könnte in jungen Nucleolen größer sein. Diese Möglichkeit ist nicht auszuschließen. 3. Die hohe Aktivität könnte daran liegen, daß das Wachstum — also die Substanzvermehrung — der jungen Nu-cleolen stärker ist als bei den alten. Diese Voraus-setzung ist gegeben. Die Nucleolarsubstanz der älte-ren Pflanzen vermehrt sich nicht oder nicht mehr wesentlich, wohl aber die der jüngeren Pflanzen, wie wir eben sahen. In den älteren Nucleolen messen wir also vermutlich im wesentlichen die mit der Nucleolus-aktivität in Beziehung stehende 32P-Erneuerung, wäh-rend in den jungen Nucleolen zu ihrem Umsatz die Vermehrung der Nucleolarsubstanz dazukommen dürfte, wodurch allein schon eine höhere 32P-Einlage-rung bedingt sein müßte.

4. Die Bestimmung derjenigen Stoffe des Nucleo-lus, in die der 32P eingebaut wird, gelang bisher nicht vollkommen. In Betracht kommen außer der RNS

vor allem noch Phosphorproteide, deren Anwesen-heit z .B . in den Nucleolen von Triton19, Asterias20

und Limulus21 nachgewiesen werden konnte. Über das Vorkommen anderer P-haltiger Substanzen im Nucleolus ist nichts bekannt. Cytochemische Reaktio-nen1 0 und die UV-Aufnahmen bei 2570 Ä vor und nach 6 Min. langer Behandlung der Schnitte mit n-HC1 bei 60u C lassen in den Nucleolen des Acetabu-lariakernes eine größere Menge von RNS erkennen (Abb. 1). Diese ist bekanntlich auch mit 90—95° C heißer, 5—10-proz. Trichloressigsäure extrahierbar. Nach einer solchen Behandlung erfolgt eine Reduk-tion der meßbaren 32P-Aktivität der Nucleolen auf 2 0 — 2 5 % (44 Nucleolen gemessen).

Nach D a v i d s o n 3 werden Phosphorproteide nicht durch heiße Trichloressigsäure extrahiert. Außer der RNS würden aber sehr wohl eventuelle andere phosphorhaltige Substanzen extrahiert werden kön-nen, soweit sie nicht bereits durch die Carnoy-Fixie-rung eliminiert wurden (s. S. 330). Deshalb darf, um diese ungünstige Möglichkeit in Rechnung zu stellen, bis zur Ausführung von Kontrollversuchen mit kalter Trichloressigsäure, die RNS bekanntlich nicht extra-hiert, nicht gefolgert werden, daß die sehr erhebliche Senkung der Radioaktivität nur auf der Extraktion von 32P-haltigen Molekülen der RNS beruht. Um-gekehrt kann als ausgeschlossen gelten, daß in die nucleoläre RNS kein oder nur sehr wenig 32P ein-gebaut würde und die Aktivitätssenkung nur oder fast nur auf Kosten anderer 32P-haltiger Substanzen ginge. Vielmehr dürfte sie bedeuten, daß ein erheb-licher Teil des 32P in die RNS der Nucleolen einge-baut war (s. hierzu den Nachtrag S. 333).

D i s k u s s i o n

Versuchen wir diese ersten Ergebnisse über den Einbau von 32P in den Kern und besonders in die Nucleolen von Acetabularia zu verschiedenen Befun-den an anderen Objekten in Beziehung zu setzen, so ergeben sich einige allgemein wichtige Fragen. Zwar sind die Voraussetzungen, von denen wir ausgehen, nicht immer als bereits gesichert anzusehen, jedoch scheinen uns die folgenden drei Schlußfolgerungen möglich:

1. Der . Nucleolus des Acetabulariakernes besitzt

19 M. G e r s c h , Z. Zellforsch, mikroskop. Anatom. 30, 483 [1940],

-'» S. V i n c e n t , Proc. nat. Acad. Sei. USA 38, 139 [1952],

2 ' M. G a r d i n e r , J. Morphol. a. Physiol. 44, 267 [1927],

einen relativ starken und schnellen 32P-Einbau. Wahr-scheinlich erfolgt dieser, wie wir sahen, zu einem er-heblichen, wenn nicht größtem Teil in die RNS. Wenn diese Deutung richtig ist, wird der Schluß nahegelegt, daß die Synthese dieser RNS im Nucleolus selbst er-folgt. Zu demselben Schluß gelangten auch P o 1 -1 i s t e r und L e u c h t e n b e r g e r 2 2 auf einem ganz anderen Wege. Sie fanden bei UV-Absorptionsanaly-sen in den Nucleolen von Zea mays verschiedene Polymerisationsstufen von RNS. Auch die im Kern nachgewiesenen Fermente wie Ribonuclease, Estera-sen, Phosphatasen deuten auf dort stattfindende Auf-bauvorgänge von Nucleinsäuren23. Wie wir gleich sehen werden, kommt hierfür im Interphasenkern vornehmlich die RNS des Nucleolus in Betracht.

Dagegen ist es unwahrscheinlich, daß die Vermeh-rung der RNS des Nucleolus — sie muß gerade bei Acetabularia vom winzigen Zygotenkern bis zum er-wachsenen Riesenkern enorm groß sein — nur durch Anhäufung an anderer Stelle, z. B. im „nucleolus associated chromatin", aufgebauter RNS-Moleküle erfolgt. Gegen eine an sich schon unwahrscheinli-che Einwanderung aus dem Cytoplasma spricht der neuerdings von V i n c e n t 2 0 gefundene unterschied-liche Aufbau der plasmatischen und nucleolären RNS und gegen Einwanderung aus der bei Acetabularia ausnahmsweise vorkommenden RNS des Kernsaftes der Umstand, daß in den Nucleolus wesentlich mehr 32P eingebaut wird als in den gesamten übrigen Kern.

2. Allgemein wird heute eine Beziehung zwischen Geschwindigkeit des RNS-Umsatzes und der Inten-sität der Proteinsynthese im Cytoplasma angenom-men2 4 . Da nach unseren Versuchen an den Kernen von Acetabularia wahrscheinlich der größte Teil des 32P in die RNS der Nucleolarsubstanz eingebaut wird und diese offenbar einen hohen Umsatz besitzt, scheint uns der Analogieschluß berechtigt, daß im Nucleolus Proteine synthetisiert werden. Wir fanden diese Anschauung einmal bereits in einer früheren Arbeit von C a s p e r s s o n 2 5 ausgedrückt: „Daß der Nucleolus Ribosenucleotide enthält, dürfte mit der Rolle derselben bei der Synthese dieser Substanzen (Histone, Ref.) zusammenhängen." Späterhin ist Caspersson allerdings nicht mehr auf diese Frage zu-

2 2 A . P o l l i s t e r u. C. L e u c h t e n b e r g e r , Na-ture [London] 163, 360 [1949],

23 K. L a n g in Mikroskopische und chemische Organi-sation der Zelle, Springer-Verlag, Berlin.

24 Literatur in J . D a v i d s o n , The Biochemistry of Nucleic Acids. Methuen, London 1951.

25 T. C a s p e r s s o n , Chromosoma 1, 562 [ 1940].

H.Stich und J. Hämmerling, Der Einbau von 32P in die Nucleolarsubstanz des Zellkernes von Acetabularia mediterranea (S.329).

Abb. 1. UV-Aufnahmen eines Schnittes durch den Zellkern von Acetabularia mediterranea bei einer Wellen-länge von 2570 A mit dem Quarzmikroskop nach Koehler. Aufnahme und Bild sind stets gleich läng belichtet und entwickelt worden, so daß die Schwärzungsintensitäten miteinander vergleichbar sind, a) Vor der Extraktion und

b) nach der Extraktion mit n-HCl bei 60° C, 5 Min. N = Nucleolus, Ks = Kernsaft. Vergr. 500 X .

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Abb. 2. Isolierte einzelne Nucleolen aus dem Zellkern von Acetabularia mediterranea. Anthracenblaufärbung. Vergr. 500 X. (Für Isolierung der gesamten Nucleolen aus einem Kern vgl. Abb. 3.)

rüdegekommen, sondern der Nucleolus wird nur als Ort der Anhäufung von Histonen und RNS ange-sehen, die von dem „nucleolus associated chromatin" gebildet werden sollen26. Da enge Beziehungen zwi-schen Chromosomenorten und erster Entstehung der Nucleolen bei verschiedensten Zellarten nachgewie-sen sind, soll unser Analogieschluß nicht ausdrücken, daß das „nucleolus associated chromatin" auch als „Starter" der ersten Entstehung von nucleolärer RNS auszuschließen ist.

Nicht nur hinsichtlich der RNS, sondern auch hin-sichtlich anderer Substanzen scheint sich die Nu-cleolarsubstanz von Acetabularia in ständigem Auf-bau und Abbau zu befinden. Dies geht aus der in vivo zu beobachtenden häufigen Entleerung von Inhaltsstoffen der nucleolären Vakuolen in den Kern-saft hervor10. Dagegen verhält sich die DNS nach den in letzter Zeit mit verschiedenen Methoden und an verschiedenen Objekten erhaltenen Befunden we-sentlich anders: sie wird anscheinend zwischen zwei Teilungen nur in dem Maße aufgebaut, wie für die Verdoppelung der Chromosomensubstanz erforderlich ist, während ein Stoffumsatz, der nicht die Chromoso-menvermehrung betrifft im Vergleich zur RNS offen-bar nur gering ist 27> 28, unbeschadet der Wahrschein-lichkeit, daß verschiedene DNS-Fraktionen verschie-den starken Stoffwechsel besitzen 29. Die Tatsache, daß der Kern von Acetabularia ein besonderes Verhalten zeigt — zwischen zwei Teilungen vergehen mehrere Monate, und in dieser Zeit finden extrem starke Wachstumsvorgänge statt —, nötigt zwar zur Zurück-haltung, die Befunde an anderen Kernen auf unser Objekt und umgekehrt zu übertragen, immerhin kann darauf hingewiesen werden, daß der Kern von Ace-tabularia in der Interphase wahrscheinlich ein normal diploider Kern bleibt 29 a, ebenso spricht der Umstand, daß der größte Teil des 32P in den Nucleolus einge-

26 T. C a s p e r s s o n , Symposia Soc. exper. Biol. 1, 127 [1947]; Cell Growth and Cell Funktion [1950],

27 A. H o w a r d u. S. P e 1 c , Exp. Cell Res. 2, 178 [1951]; Nature [London] 167, 519 [1951]; Isotopes in Bio-chemistry, Churchill-Verlag 1952.

28 J. T a y l o r , Exp. Cell Res. 4, 164 [1953]. 29 A. B e n d i c h , Exp. Cell Res. Suppl. 2, 182 [1953];

dort weitere Literatur.

baut wird, dafür, daß die DNS der Chromosomen nur vergleichsweise geringe Synthesevorgänge und Umsatzraten besitzt.

An anderer Stelle soll auf die beiden hier berühr-ten Fragen noch näher eingegangen werden.

3. Abschließend möge kurz ein Vergleich angestellt werden zwischen dem RNS-Umsatz der Zellkerne, wie er an isolierten Kernen anderer Objekte ermittelt werden konnte, und den Ergebnissen an den Acetabularia-Nucleolen. Eine regenerierende Ratten-leber besitzt einen wesentlich höheren RNS-Umsatz in ihren Zellkernen als eine normale30. Weiterhin ha-ben stark wachsende Leberzellen einen wesentlich größeren Nucleolus als nicht mehr wachsende Zel-len 31. Wir finden also hier die gleichen Beziehungen wie bei jüngeren und älteren Zellkernen von Aceta-bularia, was die Annahme nahelegt, daß auch in der Leberzelle der erhöhte RNS-Umsatz seine Ursache hauptsächlich in der sich vermehrenden Nucleolar-substanz hat.

N a c h t r a g b e i d e r K o r r e k t u r : Mittlerweile wurde der Einfluß einer Behandlung mit kalter und hei-ßer Trichloressigsäure auf den 32P-Gehalt ganzer Kerne von Acetabularia mediterranea geprüft. Die 32P-Aktivität betrug bei den unbehandelten, bereits einen Hut besit-zenden Pflanzen nach 36 Stdn. Aufenthalt in einer 32P-haltigen Seewasserlösung im Durchschnitt 407 ± 3 m = 36 Impulse pro Min. (n = 14) unter unseren Meßbedin-gungen. Nach Extraktion mit kalter 10-proz. Trichlor-essigsäure, bei 4° C 60 Min. lang, erfolgte höchstens ein ganz sdiwacher Verlust von 32P: durchschnittliche Impuls-zahl pro Kern 374 ± 28/Min. (n = 12). Einen starken Ab-fall des 32P-Gehaltes der Kerne hingegen verursachte eine ebenfalls 60 Min. lange Behandlung mit 90° heißer 10-proz. Trichloressigsäure: 112 ± 38/Min. (n = 15). Die Größe der Extraktion von radioaktivem Phosphor ent-spricht vollkommen dem Ergebnis der bereits oben be-schriebenen Versuche.

29 a K. L. S c h u l z e , Arch. Protistenkunde 92, 179 [1939].

30 A. B e r g s t r a n d , N. E l i a s s o n , E. H a m m a r -l t e n , B. N o r b e r g , P. R e i c h a r d u. H. v. U b i s c h , Cold spring Harbor Sympos. quantitat. Biol. 13, 22 [1948].

31 S t o w e 11, Diskussionsbemerkung bei J . D a v i d -s o n , Cold Spring Harbor Sympos. quantitat. Biol. 12, 59 [1947]; S. L a g e r s t e d t , Acta Anatom. 3, 84, 190, 265 [1947].