cursus LC-MS 2001

1AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN


Cursus LC-MS-2001

1. Introductie massaspectrometrie2. Problematiek LC-MS3. Historisch overzicht LC-MS4. Electrospray5. APcI6. Bespreking MS toepassing AO-MO-CHROM7. Aanhalen praktische problemen


Sir Joseph John Thomson (1856 - 1940)

‘I feel sure that there are many problems in chemistry which could be solved with far more greater ease by this than by any other method. The method is surprisingly sensitive, requires an infinitesimal amount of material and does not require this to be specially purified…’

Statement about the technique of mass spectrometry, made by J.J.Thomson in 1913


Deel 1

1.1 Wat is MS?1.2 Instrumentatie1.3 Ionisatie1.4 Quadrupoolfilter1.5 Tandem massaspectrometrie


1.1 Wat is MS?

MS is een analysetechniek die ionen in de gasfase bestudeert.Toepassingen:

Kwalitatief en kwantitatiefOrganisch en anorganischStructuuropheldering van onbekende verbindingen

Eerste massaspectrometersir Francis William Aston (1877-1945)Cambridge, 1919


Eerste MS in 1919


Eerste MS spectrum


1.2 Opbouw MS

InlaatsysteemBronMassa-analysator in vacuümsysteemDetector


Inlaatsystemen

Doel: moleculen introduceren in de bronHoe:

Direct Insertion ProbeGCCE, CECLC


Bron

Doel: moleculen ioniserenHoe:

Electron Impact (EI)Chemische Ionisatie (CI)Desorptie Chemische Ionisatie (DCI)Field Desorption (FD)Fast Atom Bombardment (FAB)Fast Ion Bombardment (FIB)Thermospray (TSP)Thermal Desorption Laser Desorption (LD)Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)


Bron

Electrospray (ES)Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APcI)

Atmospheric Pressure Photon Ionisation (APPI)Sonic Spray Ionisation (SSI)


Analysator

Doel: ionen scheiden op basis van m/zm/z = massa over lading = Thomson (Th)

Hoe:Quadrupoolfilter (Q of q)Iontrap (IT)Magneet Sector (M)Time of Flight (TOF)Fourrier Transform Ion Cyclotron (FTMS)


Parameters van de analysator

Resolutie (R) R= m/∆m10% valley ofwel 50% (FWHM)

Massa-accuraatheidMassa-bereikGevoeligheidScan snelheidPrijs


Vacuümsysteem

Waarom vacuümsysteem?Ionen in de gasfase botsen met luchtmoleculenfragmentatie, verlies van gevoeligheid, verlies van resolutie

Hoe?Vacuümpompen

Voorvacuümpompen (tot 10-3 mb)– rotatievoorvacuümpompen

Hoogvacuümpompen (tot 10-9 mb)– Turbomoleculaire pompen

– Oliediffusiepompen

– Cryogene pompen


Detectoren

Doel: omzetten van ionen in een meetbare stroomHoe?

Electron multipliers (EM)Korte levensduur (enkele jaren)

Photonmultipliers (PM)Lange levensduur (10 jaar)Vnl Q


Werking Detector


Detectoren

Array detectoren (AD)Uiterst gevoeligKlein lineair bereikKwetsbaar en duurMagneet SectorTOFVb: MCP (Q-TOF)


Detectoren: MCP


Schema electrospray bron


Schema ES bron


Schema APcI bron


1.3 Ionisatie

Gemiddeld Moleculair Gewicht (Average MW)MW berekend met behulp van de gewogen gemiddelden van de natuurlijke isotopen van elk atoom (bvb zoals vermeld in MI, stoechiometrische berekeningen, ed)

Mono-isotopische Moleculair Gewicht (Nominal MW)

MW berekend met behulp van de massa van het meestvoorkomend isotoop van elk atoom (zoals gemeten met een Q)


Moleculair gewicht (MW)

Exacte Moleculair Gewicht (Exact MW)Is het mono-isotopisch MW, rekening gehouden met de massa-defecten (wordt gemeten via een hoge resolutie MS)

Voorbeeld voor 3 moleculen:Azijnzuur (C2H4O2; 60.0211)Ureum (CH4N2O; 60.0324)2-propanol (C3H8O; 60.0575)



Isobaren zijn moleculen met hetzelfde mono-isotopisch MW

Massa-eenheid: u of Da=1/12 van de massa van het 12C atoom=1/NA (NA=6.022 1023 mol-1)=1.66043 10-27 kg

12C = 12.000u



N

O

N

N

N

NOO

O

N

Cl

N N

Cl R051211 C-06.79.19.00 MW 705.64 Factor 1C35H38Cl2N8O4(+-)-(CIS)CDU : 3906 mg, 3 unitsITRACONAZOLE



Voorbeeld R051211Average MW: 705.6436Mono-isotopisch MW: 704Exact MW: 704.2393


Stikstofregel

Even MW: geen of een even aantal N-atomenOneven MW: oneven aantal N-atomenVoorbeeld R051211:mono-isotopisch MW 704, dus even aantal N-atomen (8)


Ionisatie (beperkt tot ES)

Positief of negatief:M → (M+H)+

M → (M-H)-

Nevenreacties (clustervorming)[M+NH4]+, [M+Na]+, [M+K]+


Fragmentatie (zeer beperkt)

Ion → ion + neutraal door toevoegen van extra inwendige energie

Extra spanningsveldBotsingsenergie (CID, CAD, …)


Massa spectrum

Curve van relatieve intensiteit (RI) in fuctie van m/z

Voorbeeld: R051211MW=704

[M+H]+=705m/z=705


Massa spectrum R051211


Isotopen

Hoofdpiek → mono-isotopisch→ alleen meest voorkomende isotopen

Koolstof: 12C (98.9%) en 13C (1.1%)Voorbeeld: R051211 (C35H38Cl2N8O4)

1x 13C in het skelet →signaal bij 704+1+1=706intensiteit: 1.1% x #C-atomen

2x 13C in het skelet →signaal bij 704+1+1+1=707intensiteit: 1.1% x 1.1% x 35 →verwaarloosbaar


Isotopen

Wat met Cl?35Cl (75.77%) en 37Cl (24.23%)algemeen 3:1voor R051211: piek bij 707Intensiteit: 3:1 x 3:1 = 9:6:1


Isotopen R051211


Isotopen

Wat met Br?79Br (50.69%) en 81Br (49.31%)algemeen 1:1twee Br-atomen in de moleculeIntensiteit: 1:1 x 1:1 = 1:2:1


Isotopen


Clustervorming

Naast [M+H]+

soms ook[M+NH4]+, [M+Na]+, [M+K]+

Voor- en nadeelvoordeel: duidt gemakkelijk MW aannadeel: verlies intensiteit [M+H]+


Massa spectrum R051211


Quizvraag


Meervoudig geladen ionen

OorsprongVoorbeeld R051211: [M+2H]2+

m/z bij (704+1+1)/2 = 353Scheiding 12C en 13C 0.5 uScheiding 35Cl en 37Cl 1 u


Meervoudig geladen ionen

15:19:4502-Oct-1998

AdministratorOpl1

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000m/z0

100

%

FKC-222-001-002 621 (32.117) Cm (619:625-(610:611+632:633)) 1: Scan ES+ 9.15e7705.5

91495072

353.418687148

256.44453118

325.53254019

354.513249136

671.55920441

707.570918080

708.527327742

727.418685352

729.513366653

730.55518147


Interpretatie MS

API gekendMeten onbekende

verschil → info over onbekendevb: verschil=+16hydroxy of N-oxF → Cl[M+Na]+ → [M+K]+

vb: verschil=+14methyleringCH2 →C=O

Verschil discrete waardenvb: verschil 11?


1.4 Quadrupoolfilter

º1953, Paul ( Nobelprijs 1989) en SteinwedelRelatief goedkoopEenvoudig en gebruiksvriendelijkResolutie = eenheidScan, gebaseerd op electrostatische velden


Quadrupoolfilter


Quadrupoolfilter

DC en RF spanningEnkel DC: blokkageEnkel RF: geen filtering, wel focusScannen?


Scan technieken

Twee verschillende: full-scan en SIR(M)Full-scaninstelling scan van laag naar hoogideaal voor identificatie werkSIRslechts 1 ion, voor- en nadeelvoordeel: enorm gevoelig (100x)nadeel: geen structuur informatie

Te vergelijken met Single Wavelength en PDA


1.5 Tandem massaspectrometrie

Combinatie van ‘2 MS’Techniek waarbij fragmentatie spectrum bekomen wordt van een ‘precursor’

Precursor ion (parent ion)Product ion (daughter ion)

Zowel in space als in timeVoorstelling:

MS1 selecteert precursorBotsingscel (fragmenten opwekken)MS2 bepaald fragmentatie spectrum

Voorbeelden zijnQqQ, QqTOF, BqQ, BqB, BqTOF, BqIT, IT, FTMS, QqQqQ, …



Gebruik:Structuur ophelderingQuantificatie!!!!

Voordeel:Uitzonderlijk selectiefZeer gevoelig

Nadeel:Bijzonder duur (uitgenomen IT)Ingewikkeld?



Enkele voorbeelden:Zonder noemenswaardige voorscheiding:

Geef het zuivere massa spectrum van verbinding ZGeef alle verbindingen die fragment Y bevatten (Precursor Scan)Geef alle verbindingen die X verliezen (Constant Neutral Loss scan)vb: alle Cl-verbindingen opsporen, verlies van water, verlies van MeOH, …



Kwantificatie:Kiezen twee ionen (overgang)


Deel 2: Problematiek LC-MS

2.1 Waarom koppeling HPLC met MS?

2.2 Vloeistof → gas2.3 Polaire moleculen2.4 Niet-vluchtige buffers


2.1 Waarom koppeling met MS?


2.2 Vloeistof →gas

Algemene gaswet leert:0.1 mL/min →135 cm3 gas bij 1 atmMS onder hoog vacuumvacuumpompen maar 5 cm3 gas bij 1 atmOplossingionisatie bij atmosferische drukdifferentieel pompen!Vloeistofstroom splitten!


2.3 Polaire moleculen

HPLC = ideale scheidingstechniek voor polaire moleculenPolaire moleculen zijn meestal thermolabiel Zachte ionisatie techniek gebruikenES, APcI, (APPI, SSI), …


2.4 Niet-vluchtige buffers

Worden gebruikt om HPLC methode te optimaliserenTe vermijden bij LC-MS

contaminatie ionenbron en MSsignaal onderdrukking (ion supression) MS spectrum

Beter met moderne ionenbronnen (Z-spray)Vluchtige buffers te prefereren


Niet-vluchtige buffersystemen

Vluchtige buffers:Ammonium acetaat, ammonium formiaat, ammonium carbonaatMierenzuur, azijnzuur, TFA

Te vermijden bij LC-MSAlle fosfaten, boraten en sulfatenZwavelzuur, fosforzuur

Opletten met modifiers, zoalsHPβCD, DEA, TEA, TRIS, …


Deel 3

Historisch overzicht LC-MS



Koppeling met gaschromatografie en massaspectrometrie reeds in 1958(gas, apolaire moleculen, laag moleculair gewicht, geen buffers, …)Vanaf ’70 koppelingspogingen HPLC en MSMeest succesvol en meest verbreid: ES (’90)



Moving belt: EI en CI (MacFadden, 1976)(Janssen 1983 -1986)Direct Liquid Introduction (1974)Thermospray (Marvin Vestal, 1983)(Janssen 1986 -1994)Particle Beam (Willoughby, 1984, EI en CI)Dynamic FAB (Caprioli, 1986)(Janssen 1994 -1996)



Electrospray (1984, Doyle & Fenn)(Janssen 1994 - )APcI (1974, Horning, opvolger thermospray, doorbraak ’90)(Janssen 1997-)APPI en SSI (eind ’90)nog niet commercieel


Deel 4: Electrospray

4.1 Algemene kenmerken4.2 Reden van succes4.3 Principe4.4 Experimentele gegevens


4.1 Algemene kenmerken

Electrospray is een fysisch verschijnsel beschreven in 1917 door Zeleny:door het aanleggen van een hoog-electrisch veld op een vloeistof in een capillair wordt een spray van geladen druppels gevormdWordt dagdagelijks toegepast in de verfindustrie (autolak)Dole, 1968, ionisatie-techniekFenn, 1984, introductie electrospray



Ionisatie gebeurt bij atmosferische druk en in de vloeistof faseZachte ionisatie techniek

Weinig inwendige energieLage kinetische energieDus weinig kans op fragmentatie

Ionisatie gebeurt bij lage temperatuur (<100°)Ideaal voor polaire, thermolabiele producten



Debiet vanaf 30 nL/min (nano-ES) tot 1 mL/minES is een ‘concentratiegevoelige’ detector, zoals UV, dus splitten mag!Bepalen van kleine moleculen (MW<100) tot macromoleculenrecord is het tetrameer van een hemoglobineachtige verbindingMW~4 000 000



Bij grotere moleculen meervoudige ladingen mogelijkKan gecombineerd worden met alle MS analysatorenZowel + als –Vb: HHM


4.1 vb: HHM


4.2 Reden van succes

Analyse van proteïnenZeer gevoeligGebruiksvriendelijkRobuustRelatief goedkoop


4.3 Principe

Aanleggen van een hoog electrisch veld (106 V/m, 3kV op een metalen tip van 100 µm)Spray van geladen druppels wordt gevormd Analyt-ion wordt gevormd in de vloeistoffase (klassieke zuur-base chemie)Geladen druppels verkleinen door solvent evaporatie


4.3 Principe


4.3 Theorie

Ion-evaporation model (Iribarne and Thomson)Druppel verkleint, Coulomb afstoting vergrootRaleigh limiet overschreven, druppel explodeert: ion in de gasfase (alleen kleine moleculen)

Mechanisme van Doyledoor solvent-evaporatie blijft uiteindelijk alleen ion over (alleen grote moleculen)


5.0 APcI

5.1 Algemene kenmerken5.2 Principe



Toepasbaar voor moleculen die apolairder zijn en minder ioniseerbaar dan deze voor ESMW<2000Vloeistof debiet 1 tot 2 mL/minMassa-gevoelig (kolom splitting reduceert gevoeligheid)In combinatie met alle massa-analysatorenIonisatie bij hoge temeratuur (~400°C)dus geen zachte ionisatie techniek



Ionisatie gebeurt in de gasfase, echte CIIonisatie gebeurt bij atmosferische druk+ en - ionenToepasbaar voor pesticiden, hormonen, …


5.2 Principe

Er wordt geen electrisch veld aangelegd aan de tipHoog vloeistofdebiet (1 mL/min – 2 mL/min)Een spray wordt gevormd door het eluens sterk te verhittenIonisatie van de solvent moleculen gebeurt dmv een onladingselectrodeDe geïoniseerde solvent moleculen ondergaan zuur – base reacties in de gasfase


5.2 Principe


6 Algemene toepassingen

6.1 Methode Ontwikkeling: SCM6.2 Methode Validatie: specificiteit6.3 Forced Degradation Studies6.4 Troubleshooting: identificatie onzuiverheden/afbraakproducten6.5 Gebruik van MS als supportieve techniek


6.1 Overzicht HPLC MO

Pro-Active Method

Development - Method Validation

Phase 1- Phase 2 methods

"Locked method"

Phase 3 Method

Development and validation

Supportive methods

Final Method

Development and

Validation

Secondarymethods


Gedetailleerd overzicht

(4)InitialBatchStress

samples (17)Placebo Stability

Excipients (9) ReportStress

(1) (5) solutionNotification of Method screening Optimization Optimization Method descriptionDevelopment Experiments Phase 1 - 2 Method Method is "Locked"

(6) Stress MV level 1 - 2 (16)dry (12)

Peak purity (10) Selectivity SamplesLC-MS/PDA

(7) (15)Retain

Plan PMD the samples Identification/Peak purity ID Sheetstudy (11) LC-MS/PDA/NMR/Others

(3) (13) (14)

(8) Supportive method(s) HPLC CE TLC LC-MS CE-MS etc…

(2)

"Teamleader" co-ordinates the Method Development Process


Screeningsmodule deel 1


Purity bepalingen

Op basis van PDAOp basis van MS


Purity met PDA

Via MassLynx routineEerst integrerenPeak Purity berekenen

0<P<100

Interpretatie P !!!P > 95 OK?


Purity met PDA

Visueel (via overlay)Op basis van 3 PDA spectra

Up-slopeApexDown-slope


Purity met MS

Visueel (via overlay)Op basis van 3 MS spectra

Up-slopeApexDown-slope


Purity met MS

Via MassLynxBepalen van RIC/TIC


RIC/TIC

RIC = som van alle ionen die product gerelateerdzijnproduct + fragmenten + clustersTIC = som van alle ionenook achtergrond ionen + onbekende ionen + ...

RIC/TIC ≅ 1 (of 100%)


BPI

BPI = curve van alle basis ionen in de spectraIs soms beter dan TICVb: R149524


BPI


Identificatie

Beperkte mogelijkhedenInstrumentatieAfspraak spectro


Toepassing SCM deel 1

PurityVoorbeeld R184798


Chemische structuur R184798

HO

O

NO O

O

Cl

HN

OH


Voorbeeld van een sample list in SCM deel I


R184798 chromatogram

AO-053017:54:37

05-Oct-2000pH=10; 70 gradenSample stress WJAN

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00Time-1

100

%

MO-90-R184798-1-1-4-16 2: Diode Array 230 1.00Da

1.06e612.35

13.27


R184798 purity

AO-053017:54:37

05-Oct-2000pH=10; 70 gradenSample stress WJAN

12.00 12.10 12.20 12.30 12.40 12.50 12.60 12.70 12.80 12.90Time0

100

%

MO-90-R184798-1-1-4-16 Sm (Mn, 2x3) 2: Diode Array 230 1.00Da

1.01e6Area

Area%100.00

Area220117.77

Height1005566

Time12.36

12.36;99%;220118


R184798 PDA-spectra

AO-053017:54:37

05-Oct-2000WJANpH=10; 70 gradenSample stress

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400nm0

100

%

0

100

%

0

100

%

MO-90-R184798-1-1-4-16 1490 (12.568) Cm (1490-1441) 2: Diode Array 6.26e5210.0


296.0



R184798 PDA-spectra overlay

AO-053017:54:37

05-Oct-2000WJANpH=10; 70 gradenSample stress

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400nm0

100

%



Screeningsmodule deel 2


Toepassing SCM deel II

Purity en IdentificatieVoorbeeld R184798


Voorbeeld van een sample list in SCM deel II


R184798 chromatogram peak purity

AO-053019:36:29

14-Nov-2000stress pH 2, 70C, 28 dagensample LVOS

12.00 12.10 12.20 12.30 12.40 12.50 12.60 12.70 12.80 12.90 13.00Time0

100

%

MO-90-009-008 Sm (Mn, 2x3) 3: Diode Array 230 1.00Da

8.47e5Area

Area%100.00

Area181795.14

Height845203

Time12.44

12.44;100%;181795


R184798 PDA overzicht

AO-0530stress pH 2, 70C, 28 dagensample LVOS 15-Nov-2000

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400nm0

100

%

0

100

%

0

100

%

MO-90-009-030 1497 (12.582) Cm (1497-1451) 3: Diode Array 7.25e5210


295



R184798 PDA overlay


200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400nm0

100

%



Overzicht massa spectra


200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z0

100

%

0

100

%

0

100

%

MO-90-009-030 340 (12.739) Cm (340-326x2.000) 2: Scan ES+ 1.78e6427

411409130

171 213229

294 341

429

430 465 875853

569500585

669663693

837775728

877 998995921

MO-90-009-030 332 (12.434) Cm (332-326x2.000) 2: Scan ES+ 3.63e6427

409130

294182 186213393

296

429

430

853449 487 569528

747693571674

758 855 891 997975

998

MO-90-009-030 329 (12.320) Cm (329-326x2.000) 2: Scan ES+ 2.01e6427

409130

154 258193 296 341391

429

430 853465 569500 571 689679704

757772

819875

899 995939 997


Overlay massaspectra


200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z0

100

%

MO-90-009-030 340 (12.739) Cm (340-326x2.000) 2: Scan ES+ 1.78e6427

411409130171 213

229294 341

429

430449

465 875853

467 569500585

669663693

837775728

877 998995921


RIC/TIC

Via MassLynx(vrij ingewikkelde) procedure


RIC/TIC

AO-053019:44:24

15-Nov-2000LVOSstress pH 2, 70C, 28 dagensample

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000m/z0

100

%

MO-90-009-030 331 (12.396) Cm (327:331-317:322x2.000) 2: Scan ES+ 1.97e5427.2

409.2

294.2186.2 217.2267.8

393.3378.9

302.4

428.2

449.1

853.3

451.1

465.1

467.1

487.1 500.1 569.0 689.3586.6

822.6770.0

855.3

875.3

877.3

878.4

995.1900.1


RIC/TIC

Sample Name: MO-90-009-030 Sample ID: sample

# Name RT Area1 RIC4 12.396 540242 RIC3 12.473 1787453 RIC2 12.396 1722274 RIC1 12.473 35829655 TIC 12.473 3955590


Opstellen van ID-sheets

Doel: bundelen van gegevensOnzuiverheden APIAfbraakproducten

Start bij AO-MO-CHROMAO server-Applications-ID-sheetsVroeger: overdracht SpectroNu: MO-CHROM blijft verantwoordelijk

Voorbeeld: R184798


Voorbeeld ID-sheet R184798


Eindresultaat R184798


6.2 Methode validatie: Specificiteit

SpecificiteitVoorbeeld Galantamine


Specificiteit

Specificity is the ability to assess unequivocally the analyte in the presence of components which may be expected to be present. Typically, these might include impurities, degradation products, matrices, etc…


Acceptatie criteria

All placebo and blank peaks should be separated from degradants, impurities and the main compoundAll specified and selectivity related substances should be separated from the main compoundAll specified degradants should be separated from each otherAll selectivity degradants and impurities should be separated from the specified degradants and impurities


Acceptatie criteria

All specified impurities should be separated from the degradants and preferably be separated from each otherThe PDA spectra and the ES-MS peak purity analysis should confirm that the API peak is indeed pureThe PDA spectra are comparableThe ES-MS spectra are comparable


Sample list van de specificiteitsstudie van

Galantamine


6.3 Forced Degradation Study(FDS)

Momenteel nieuwe richtlijnen op komst


6.3 Forced Degradation Study (FDS)

FDS is an experiment in which the stability indicating power of the assay/purity method for DP has to be demonstrated



Wordt meestal uitsluitend toegepast voor HPLC Is geen stabiliteitstudie!Wordt uitgevoerd door de ontwikkelaar zelf



Zowel placebo als DP in oplossingTijdsduur experiment: 7 dagen4 meetpunten:

0 en 7 dagenTwee intermediairen

Maximale afbraak 15% na 7 dagenWelke condities?



0.01N HCl 70°C 0.01N NaOH 70°C0.03% H2O2 25°CLicht Xe-lamp (cfr. ICH)



Peak purity APIPeak purity gespecifieerdeonzuiverheden/afbraakproductenIdentificatie ‘belangrijkste’ onbekenden



LC-MS apparatuurPDA 200 - 400 nmMS:

ES ⇔ APcI+ ⇔ -Enkel Q


6.4 Troubleshooting

Identificatie van onzuiverheden, afbraakproducten, ….

Relatief beperkt (Q) ⇒ hulp SpectroLC-MS niet afhankelijk van UV-chromofoor!


6.5 Supportieve methode LC-MS

Bepaling van palmitinezuur in project R092670 d.m.v. ES negatief


R092670

ProbleemPalmitinezuur geen UV-absorptiePalmitinezuur ES neg respons

Aantonen mogelijk?Semi-kwantitatief?

Afbraakproduct na bestraling?Afbraak in stabiliteit DP?


UV + MS chromatogram palmitinezuur

AO-039517:17:57

22-Jun-20000.5% palmitinezuur lot 00310275

WJAN

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00Time1

100

%

-9

100

%

palm_40 2: Diode Array 275 1.00Da

9.59e31.13

palm_40 1: Scan ES- TIC

4.86e651.86


UV + m/z 255 van MR092670PUA021

AO-039502:06:36

23-Jun-2000MR092670PUA021

WJAN

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00Time-5

100

%

0

100

%

R092670B 1: Scan ES- 255 1.00Da

1.26e351.98

19.5314.01

11.319.335.691.51

7.71

18.24

34.8623.28

26.13

30.83

29.01

44.8537.11

39.50

46.4350.07

58.3754.0355.38

60.72

R092670B 2: Diode Array 275 1.00Da

6.47e3

11.85

8.732.40

24.88

17.8441.31

37.53

55.95

48.16


UV + m/z 255 van ZR092670EXA002

AO-039503:22:30

23-Jun-2000ZR092670EXA002

WJAN

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00Time-3

100

%

0

100

%

R092670C 1: Scan ES- 255 1.00Da

4.48e351.98

16.7812.93

7.144.732.21 9.63

34.3319.4932.0828.7623.11

44.8337.20 40.65 50.5648.25 54.18 56.90

R092670C 2: Diode Array 275 1.00Da

8.04e3

24.8413.38

2.38 8.5317.77

19.52

37.53

34.78

29.35

41.30

39.42

46.55

48.15

55.91

54.31

52.49


UV + m/z 255 van 00J16/F10

AO-053019:17:43

24-Nov-200000J16/F10 start

LVOS

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00Time-1

100

%

1

100

%

MO-8-003-004 1: Scan ES- 255 1.00Da

6.61e651.90

4.191.03 9.036.69 14.5611.76 21.7918.16 43.7025.66 33.1329.16 37.56 40.13 47.56 49.9060.9054.67 57.63 64.03

MO-8-003-004 2: Diode Array 275 1.00Da

1.09e4

13.29

11.618.37

40.9634.60

23.6419.8237.26

46.24

54.4647.67


SIR m/z 255


UV van ZR92670EXA005 + SIR m/z 255


7. Enkele praktische problemen


Voorbeeld 1

Opletten met het gebruik van cyclodextrinen in stabiliteitsstalen


HPβCD


Voorbeeld 1:UV-chromatogramR160371

AO-053014:48:38

12-Oct-2000pH=6; 70 graden

WJAN

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00Time-20

100

%

MO-R160371-1-1-005-3 2: Diode Array 230 1.00Da

5.00e424.04

1.14


Voorbeeld 1:UV+MS chromatogram R160371

Stress sample

AO-053014:48:38

12-Oct-2000pH=6; 70 graden

WJAN

2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00Time8

100

%

-81

100

%

MO-R160371-1-1-005-3 2: Diode Array 230 1.00Da

1.25e424.041.14

MO-R160371-1-1-005-3 1: Scan ES+ TIC

5.09e97.03

6.13

4.781.28

3.43

2.83

8.088.48

24.08

23.7317.98

34.08


Voorbeeld 1: MS spectrum

AO-053014:48:38

12-Oct-2000WJANpH=6; 70 gradenStress sample

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000m/z0

100

%

MO-R160371-1-1-005-3 140 (7.026) 1: Scan ES+ 6.18e7279.1

221.0

203.0

185.0

155.2

222.0

441.1

383.1

280.1337.0

325.0

384.0

385.1

603.0

545.0

499.0

442.1

487.2

500.1546.1

557.0

823.2661.2

604.1

605.0

765.1

662.2

719.3

663.4

766.2

767.0

985.3

881.2824.2

927.4

882.2928.2

986.2


Voorbeeld 2: fosfaat buffer

Opletten met het gebruik van fosfaatbuffer in stabiliteitsstalen


Voorbeeld 2: fosfaat buffer massaspectrum


Voorbeeld 3: polymeren

Gebruik van polymeren in formuleringen, zoals OpaDry (PEG)


Voorbeeld 3: polymeren


Voorbeeld 4: modifiers en zouten

Modifiers beperken in concentratieS/N daalt (ion supression)Organische zouten kunnen bepaald worden



Voorbeeld: T002187DEA gebruikt in de HPLC methode


Voorbeeld 4: Na-acetaat


Besluit

MS toegevoegde waarde MO-CHROMOnafhankelijk van UV-chromofoorZeer gevoeligSemi-kwantitatief (Q)Koppeling met GC,LC,CE,CEC,…MS/MS

identificatiekwantificatieverhoogde selectiviteit (HR)

cursus LC-MS 2001

Documents

Transcript of cursus LC-MS 2001