UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE AGRONOMÍA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE HORTICULTURA

Curso: Floricultura II

Práctica Nº 3

“Cultivo In Vitro de semillas de Orquídeas”

Docente: Ing. Agr. Mg. Sc. Jaulis Cancho, Juan Carlos

Estudiantes:

Alcantara Lobo, Claudia

Basaldua Jauregui, Pamela

Cueva Gonzales, Mayra

Huaraca Ramírez, Wilson

Javier Silva, Jacquelyn

Grupo: A*

La Molina, abril del 2015

1. INTRODUCCION.

La familia Orchidaceae es una de las más abundantes del mundo, la elegancia y belleza de sus flores representa un gran potencial para la industria ornamental.Son las plantas más evolucionadas del reino vegetal además son la familia de plantas más abundantes del mundo. Los bosques donde encontramos abundancia de orquídeas nos proporcionan una idea del índice de conservación que tiene el lugar.Muchas de las especies de orquídeas están gravemente amenazadas debido a la indiscriminación deforestación, los incendios forestales y los saqueos de dichas especies para fines comerciales; esto ha provocado que numerosas especies de orquídeas estén desapareciendo de los bosques naturales. La idea de propagar orquídeas, surge con la necesidad de recuperar especies nativas en peligro de extinción ya que la incursión indebida del hombre en los medios naturales a generado desequilibrio tanto en las orquídeas como en otras especies nativas, por tal motivo, la propagación in vitro permite dar posibles soluciones y ayudar a evitar la pérdida masiva del material biológico.Al utilizar la técnica del cultivo in vitro se obtienen plantas libres de virus, que luego pueden ser propagadas masivamente, ya que se obtienen individuos genéticamente idénticos de la planta madre.

2. OBJETIVOS.

2.1. Conocer las técnicas y el método de propagación in vitro de orquídeas.2.2. Constatar la importancia de propagar orquídeas mediante cultivo invitro.2.3. Complementar el curso llevando a cabo una práctica donde nosotros los

alumnos podamos realizar micro propagación de orquídeas.

3. REVISION BIBLIOGRAFICA:

Para la propagación in vitro de orquídeas se deben tener en cuenta diversos pasos para lograr una adecuada instalación.

Planta madre: se elige aquella planta madre que se quiere propagar in vitro, en este caso se utilizara una orquídea.

Medio de cultivo: se elige un medio de cultivo en donde mejor pueda desarrollarse la orquídea.La preparación de los medios exige una serie de cuidados en el momento de pesado de los reactivos y evitar que se contaminen, para lo cual es indispensable su esterilización antes de la siembra. Es posible preparar medios de cultivo sustituyendo las sales minerales y los reguladores de crecimiento como medios en base a extractos de banano, tomate, agua de tomate, que den los nutrientes principales para la germinación del embrión y el desarrollo de la planta. En este caso se usó Murashige y Skoog, donde también se adiciona plátano verde y carbón activado (para capturar los fenoles que hacen daño a la semilla). Si se desea más cantidad de brotes en la orquídea se puede usar harina de plátano.

Ex plante: puede usarse diferente tipos de ex plantes, como meristemas, hojas, tallos, raíces, embriones. En el caso de la orquídea se utilizó las semillas.

Las flores polinizadas originan unas capsulas que maduran en uno o dos meses por lo general, formando entre miles y millones de semillas que apenas superan los 2 mm. La semilla está constituida por un embrión envuelto por una testa y todo ello por una fina capa que le da apariencia globosa, lo que facilita su dispersión por el viento.

Al no poseer o ser muy escaso el endospermo, es necesario en condiciones in vitro la germinación mediante micorriza ion (asociación simbiótica). Generalmente son hongos del genero Rhizoctonia. Los valores de germinación obtenidos en medios naturales son del 5% de los que muy pocas alcanzan la madurez.

Desinfección: Se puede utilizar alcohol, lejía, o bicloruro de mercurio.

Siembra: Puede ser en un tubo o en un frasco. Las semillas de orquídea se colocan dentro de un frasco que contiene el medio de cultivo elegido. Esto se hace en un lugar libre de aire contaminado.

Incubación: Este frasco se deja en una cámara de incubación donde tienen un fotoperiodo de 16 h luz y 8 de oscuridad, y una temperatura de 26 C. Con estos factores la semilla empieza a desarrollarse.

3.1. Multiplicación:

También llamada transferencia o repique. Se hace la transferencia para darle más espacio a la planta para que siga desarrollando, sino la planta entra en latencia y se demora en crecer. Se realiza cuando la planta ya tiene unas cuantas hojas grandes.Se llaman sub cultivos cuando de las mismas plantas que se encuentran en un frasco se siembran en otro. Para dicotiledóneas se multiplica por esquejes, para monocotiledóneas se multiplica por hijuelos.

3.2. Enraizamiento:

Luego de la transferencia se debe dejar que crezca la parte radicular de la planta, así soportara mejor la fase de aclimatación.

Es una práctica corriente realizar in vitro el enraizamiento, pero esto produce problemas en muchas ocasiones. Así, Grout y Aston [Hort. Res., 17, 1 (1977)] observaron cómo tras el enraizamiento in vitro de sus plantas la zona de transición entre la raíz y el tallo era anormal, con unas conexiones vasculares débiles y malformadas, lo que producía problemas en la absorción y circulación de agua desde las raíces al tallo. Esta disfunción se corrige, al menos parcialmente, tras una adecuada aclimatación. En otras ocasiones el problema estriba en que las raíces que crecen en agar son defectuosas, carecen de pelos radicales y suelen necrosarse al trasplantar las plántulas, lo que provoca una parada en el crecimiento de la planta [(Deberg y Maene, Scientia Hort., 14, 335 (1981)].

También se ha observado como las raíces formadas in vitro eran gruesas y con pelos radicales engrosados y anormales, siendo sus sistemas vasculares anómalos, en comparación con raíces formadas en un sustrato arenoso. En las raíces que no mueren durante el proceso de trasplante se producen nuevas raíces laterales y adventicias normales durante el proceso de aclimatación y estas ya crecen activamente. Por ello la razón raíz: tallo siempre es más alta en plantas enraizadas ex vitro que in vitro.

3.3. Aclimatación:

En la fase de aclimatación se pretende que las plantas que han crecido in vitro y por lo tanto sólo han estado expuestas a un microambiente escogido por ofrecer unas condiciones mínimas de estrés y cuasi óptimas condiciones para la multiplicación de las plantas, se adapten a condiciones ex vitro donde las condiciones no son asépticas, ni la luz, temperatura y humedad están controladas, y donde el crecimiento a ser autotrófico y no heterotrófico como in vitro.

Es pues necesario reconstruir y desarrollar los sistemas que por adaptación a la condiciones in vitro, es el caso de la lignificación, cubiertas cuticulares, estomas y estructuras fotosintéticas.

Todas estas deficiencias o disfunciones provocadas por o durante la incubación in vitro es necesario corregirlas de forma gradual, e incluso como ya hemos citados comenzar la adaptación en condiciones in vitro, incluso induciendo fotoautotrofía in vitro mediante incrementos de la tasa de CO2 y de irridancia en los contenedores de cultivo, al objeto de mejorar la calidad de la planta, los niveles de producción y los costes del proceso de micro propagación.

Para esta fase debe tener al menos 3 hojas completamente desarrolladas y 3 raicillas bien desarrolladas. Se traslada la planta a un invernadero que presenta unas estructuras que parecen túneles, que se encuentran forrados con un plástico blanco, donde se las coloca en bandejas con musgo blanco.

Los túneles permiten mantener la Humedad relativa alta y temperatura, así se aclimata al medio ambiente.

4. MATERIALES:

Explante: cápsula cerrada (en verde) de Vainilla spp. Cámara de flujo laminar Bisturí, pinzas y bandeja metálicas Papel blanco esterilizado Mechero de alcohol Alcohol al 70% Frascos de vidrio Lejía Medios de cultivo con Harina de plátano.

5. MÉTODOS Y PROCEDIMIENTO:

Para vainilla (Vainilla spp):La ventaja es que no se requirio de la esterilización de las semillas, ya que la cápsla se encuentra cerrada, lo que evito su deterioro, pero se desinfecto la cubierta con lejia.

5.1. Procedimiento de introduccion:

Se introdujo la capsula en un frasco con lejia al 100%. Este proceso se deberia de repitir dos veces.

Se introdujo la cápsula por 10 minutos aproximadamente en la lejía.

Se transfirió la cápsula sumergida en la solución de cloro a la cámara de flujo laminar.

Se retiró la cápsula de la solución de cloro y se sumergió en alcohol al 100%, luego de unos minutos se flameó, esto con dos propósitos, eliminar patógenos y hacer una breve termoterapia. Luego se paso por agua destilada 3 veces .

Luego se procedió a cortar longitudinalmente la cápsula, se realiza varios cortes transversales.

Finalmente se levantó la cápsula (cortes transversales) con las pinzas y se deposito las semillas en el medio de cultivo, que debe tener harina de plátano.

5.2. Procedimiento de separacion para Cymbidium:

Cuando los brotes necesitan mas espacio para poder desarrollarse, se realiza un re trasplante. Usando el mismo medio MS (murahinge stook + harina de platano).

Se desinfecta la camara de flujo laminar para iniciar el proceso. Antes de coger el material se desinfectan las manos con alcohol. Se retira el papel aluminio, se flamea la boca del frasco. Se flamea los instrumentos, para proceder a realizar los cortes de los brotes. Los cortes se introducen en un nuevo frasco los pequeños brotes usando las

pinzas para facilitar la labor. Se flamea la entrada del frasco para luego colocar el papel aluminio y sellarlo,

se coloca la fecha de realizacion del proceso, con el nombre de la especie, ademas las iniciales del que realizo el proceso.

Se colocan los frascos en la zona donde reciviran la temperatura y humedad ideal para que se pueda desarrollar el cultivo.

6. DISCUSIONES

1. En la práctica de cultivo in vitro de orquídeas se pudo observar que algunos alumnos no tuvieron los cuidados adecuados al momento de micropropagar la semillas de orquídea, ya que no cumplieron con varias pautas como: no retirar los frascos fuera de la cámara de flujo laminar, desinfectar y flamear los materiales o no sellar de la mejor manera el frasco para que se conserve en un medio adecuado y con la humedad necesaria.

2. Con los resultados que se observaron en el laboratorio se puede decir que la germinación y el desarrollo de la orquídea es más eficiente en in vitro, que al aire libre, debido a que la primera práctica se realiza en un ambiente acondicionado, y sin competencia con hongos y bacterias.

3. La densidad a la que se siembran las orquídeas dependen de la proporción de las semillas viables y también de la especie de orquídea de que se trate, esto es un punto muy importante a tomar en cuenta ya que en muchos laboratorios el objetivo principal es obtener mayor cantidad de plántulas para generar un mayor ingreso, y esto hace en parte que se descuide las condiciones adecuadas que se le debe de dar a las orquídeas para que se desarrollen.

4. en el proceso de separación de cymbidium realizados por los alumnos, algunos dañaron los brotes al momento de la separación, dañando así el explante que generaría una nueva planta por falta de práctica de algunos alumnos

7. CONCLUSIONES:

7.1. Podemos concluir que el conocimiento y la práctica en el procedimiento del Cultivo In vitro de semillas nos servirá para obtener mejores resultados de ello; y por ende, mayor cantidad de plantas de Orquídeas.

7.2. De una manera general, podemos constatar al final del informe que el Cultivo In Vitro de semillas de Orquídea aumenta el porcentaje de germinación de las semillas obteniendo un mayor número de plantas que pueden ser cultivadas en un periodo de tiempo relativamente menor.

7.3. Todos logramos completar y entender la importancia de propagar las orquídeas mediante las técnicas de in vitro, dándonos una mejor idea y así poder conservar tantas especies de orquídeas que muchas son oriundas de nuestro país y que tienen una gran acogida en el mercado

8. RECOMENDACIONES:

Se dan algunas recomendaciones para futuros trabajos relacionados al tema:

8.1. Trabajar con los materiales cuidadosamente esterilizados, ya sea con alcohol o lejía, para que no haya contaminación al momento de la siembra.

8.2. Al momento de trabajar en la cámara de flujo laminar, se recomienda colocar los materiales a 15 cm del borde de la mesa.

8.3. No hay que olvidar el uso de mascarillas y guantes nuevos a la hora de trabajar en la cámara de flujo laminar.

8.4. Al trabajar en la cámara de flujo laminar, no hay que olvidar de flamear los materiales antes de manipular la cápsula.

8.5. Después de terminar la siembra, no hay que olvidar de colocar la etiqueta con el nombre de la especie, la fecha y las iniciales del nombre de la persona.

9. BIBLIOGRAFIA.

9.1. Menchaca, R. (2011). Manual para la propagación de Orquídeas. (1era ed.).. México: CONAFOR

9.2. FISCHER, A. (2007). Cultivo de Orquídeas (1era ed.). Buenos Aires: Grupo Imaginador de Ediciones.

9.3. FREULER, M. (2006). Orquídeas (1era ed.). Buenos Aires: Albatros.9.4. RÖLLKER, F. (2002) Orquídeas: rápido y fácil. (2da ed.). Barcelona, España:

Hispano Europa.

10.ANEXO: