The use of cell selection to obtain novel plant genotypes resistant to mineral stressesAna Cristina Rios Mejía

C.P. Meredith, A. J. Conner, and T.M. Schettini. IOWA STATE JOURNAL OF RESEARCH/ May, 1988

• Diseño de estrategias de selección aislamiento de nuevos genotipos de plantas resistentes.

• Resistencia a estrés mineral. (Variantes resistentes a cantidades tóxicas de aluminio en suelo).

• Células vegetales cultivadas in vitro son genéticamente heterogéneas.

-Mutaciones puntuales-Alteraciones cromosómicas-Amplificación de genes-Transposones

Mecanismos de variación no están bien definidos

Características heredables identificadas dependiendo del fenotipo

Selección Celular

•Algunos fenotipos pueden ser identificados a nivel celular.

-Grandes cantidades de células sembradas en poco espacio

-Métodos de selección aplicados a toda la población celular

•Diseño de estrategias de selección•Condiciones de cultivo son más fáciles de

establecer tratándose de fenotipos resistentes.

•Sin embargo, muchas características importantes no se expresan o no son reconocidas a nivel celular.

•Adición de un atributo deseado a un genotipo conocido. (No todas las plantas son capaces de retrocruzamiento convencional)

Germoplasma limitado (sin caracterizar)

Transformación genética limitada a pocas características deseables.

Bases moleculares no conocidas

Nutrición mineral-Activación de enzimas-Forman parte de componentes esenciales para la planta•Nutrición mineral de las plantas son fundamentalmente

celular, por lo que son viables a manipulación in vivo. •Deficiencias de estos elementos resulta en una disrupción

de los procesos celulares.•Altas concentraciones de minerales resultan en toxicidad.-Inactivación de enzimas-Sustitución de elementos esenciales en sus sitios

funcionales•Células en cultivo son sensibles a estrés mineral.

Se sabe poco de nutrición mineral a nivel molecular

•Respuestas en plantas a estrés mineral Adaptaciones en morfología de raíz y función.

•Respuestas en células a estrés mineral Alteraciones en mecanismos membranales de transporte.

¿Tolerancia expresada a nivel celular se expresara a nivel planta adulta?

•Diferencias entre genotipos de Agrostis en resistencia a toxicidad de zinc y cobre se mantuvieron en cultivo de callos. (Wu and Antonovics, 1978)

•Anthroxanthum en resistencia a zinc (Quereshi et al. 1981)

•Soja en eficiencia de hierro (Sain and Johnson, 1984)

Estrategias•Estrés mineral simulado modificando la

composición química del medio de cultivo.

•Condiciones deben ser lo más cercanas al entorno químico del suelo.

•pH Cambia la solubilidad y estado iónico del compuesto de interés.

• Interacción de todos los elementos presentes.

•En algunos estudios plantas no podían ser regeneradas de las células seleccionadas.

•En otros casos la regeneración de plantas no era un objetivo.

• (Ojima and Ohira, 1982) Sugieren que plantas regeneradas de células de zanahoria resistentes a aluminio conservaron tolerancia.

•Variantes resistentes a aluminio de cultivos de células de Nicotiana plumbaginifolia.

•Manipulaciones y análisis in vitro e in planta.

•Alta frecuencia de regeneración, viable a análisis genético, tiempo de generación corto, auto fertilidad.

•Modelo de especie ideal

Pocos reportes de selección de células en cultivo para resistencia a estrés mineral.

Adaptación genética a estrés mineral puede ser manipulada vía identificación y aislación de variantes genéticos a nivel celular.

Selección de variantes resistentes•Resistencia a aluminio. •Variación genética en las plantas resistentes a

aluminio. (Foy et al., 1978)•Medio de cultivo para selección: -Reducción de [] de fósforo de 1250 uM a 10 uM -Se bajó el pH de 5.8 a 4.0-Se utilizó un soporte celular de papel filtro soportado

en poliuretano saturado de medio líquido. -Reducción de [] de calcio de 23.0 mM a 0.1 mM• Inhibición de crecimiento celular total 600 uM de

aluminio

Selección directa •Método de selección directo Se cultivaron células

directamente al medio modificado conteniendo 600 uM de aluminio.

•El medio se cambió cada dos días•Variantes resistentes fueron evidentes después de

5-10 semanas de cultivo y después de 14 semanas no fueron encontrados nuevos variantes.

•En este tiempo las células sobrevivientes se transfirieron a un medio no modificado.

100 petri 29 colonias recuperadas 1 de estas expresó resistencia en la planta regenerada.

Selección de rescate

•Cultivo en suspensión 600 uM de aluminio x 10 días

•Después se transfirieron a cultivo no modificado para recuperación

•Se detectaron colonias resistentes después de 5/6 días utilizando feeder cells o 2 semanas después sin estas. (Conner and Meredith, 1985b)

115 petri 217 colonias resistentes 39 expresando resistencia en plantas regeneradas

•Todos los variantes obtenidos de los dos métodos de selección fueron cultivados como callos en la ausencia de aluminio de 6 a 12 semanas y después reseleccionados de suspensiones monocelulares. (119/246).

•Se mantuvieron en callos de 6 a 9 meses, sólo 67 tuvieron la resistencia.

•De las 67, 40 fueron regeneradas a plantas.

•Fueron consistentes con lo esperado para una mutación puntual dominante.