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Cottier & /Guerry 2000, Génie Génétique et Clonage 3www.unifr.ch/nfp37 Introduction Générale

Source d'images:Une partie des images utilisée pour ce dossier à été reprise des sites internet liés au

regroupement 'Industries Canada' (www.ic.gc.ca)

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A) Introduction générale

1) Qu'est-ce qu'une cellule?

La cellule est l'unité du monde vivant et les millions de typesdifférents d'organismes qui peuplent la Terre ont tous undénominateur commun : ils sont constitués de cellules. Elles sonttrès petites. Une bactérie, qui est formée d'une seule cellule, agénéralement un diamètre d'un micron (µm). Pour avoir une idée dela longueur d'un micron, imaginez que vous divisez la plus petitedivision d'une règle graduée (1 millimètre) en 1 000 segmentségaux. Chacun de ces segments mesure un micron. Les êtreshumains sont constitués de billions de cellules, qui sont dix fois plusgrosses qu'une cellule bactérienne (10 µm), mais qui ne peuvent êtreobservées à l'oeil nu. Il faut un microscope.Les cellules appartenant à de grands organismes (comme les êtreshumains) ne sont pas toutes pareilles. Ces cellules différentes ontune fonction et un aspect fort différents car elles se sont spécialiséesdans certaines tâches très diverses. Par exemple, les cellules T, quifont partie de notre système immunitaire, sont très différentes de noscellules nerveuses. Les cellules T sont structurées de sorte à nous aider à combattre l'infection, tandis que les cellulesnerveuses doivent pouvoir transmettre et recevoir les impulsions électriques qui caractérisent lafonction cérébrale. Mais toutes les cellules humaines ont quelque chose en commun, depuis lescellules du cerveau jusqu'à celles des yeux en passant par les cellules des muscles et de la peau : ellescontiennent de l'ADN, le « patrimoine génétique ». Et chacune d'entre elles, peu importe sa forme ousa fonction, contient une série complète d'ADN. C'est ce même ADN que l'on retrouve dans toutecellule du corps d'un individu.




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2) Qu'est-ce que l'ADN?

L'ADN, abréviation d'acide désoxyribonucléique, se trouvedans le noyau de la plupart des types de cellules. Il contient lesinstructions propres à la cellule et détermine comment les traitsd'une personne seront transmis d'une génération à l'autre. Dansle noyau d'une cellule humaine, on compte 23 paires dechromosomes, soit 46 chromosomes en tout. Chaquechromosome est formé de chromatine enroulée qui estcomposée d'ADN enrobant des protéines appelées histones.Les 23 paires de chromosomes dans le noyau font office de« manuel d'instructions » pour le développement d'unindividu. L'ADN détermine si la personne aura les yeux bleusou bruns ou les cheveux foncés ou blonds.Comment les molécules (et les brins d'ADN sont desmolécules) peuvent-elles donner des « instructions »? Pour lecomprendre, examinons comment nous communiquons etcomprenons les livres à partir desquels nous obtenons desinformations.

Au niveau le plus fondamental, nous ne comprenons les livres que s'ils utilisent un code que nouspouvons comprendre. Le code s'appelle par exemple français ou anglais. Vous comprendrez le texteque vous êtes en train de lire si vous comprenez chacun des mots de français ou d'anglais qu’ilcontient. Par ailleurs, les mots véhiculent rarement une information complète ou compréhensible.L'information est mieux communiquée si l'on regroupe des mots, et, comme vous le savez déjà, lasérie de mots qui véhicule une pensée complète s'appelle une phrase. Le langage de l'ADN, commel'anglais et le français, comprend des mots et des phrases également! Chaque «mot» est une unité dela molécule d'ADN appelée nucléotide. Chaque « phrase » est une longue chaîne de nucléotidesappelée gène. Mais parlons d'abord des mots de l'ADN.

Formation d'une molécule d'ADN : Nucléotides

Les « mots » de l'ADN sont de petites molécules appeléesnucléotides. Le génome humain, constitué de 23 paires dechromosomes, contient au total quelque trois milliards denucléotides. Chaque nucléotide comprend une armature et unebase azotée. L'armature sert à attacher les nucléotidesensemble.




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Il convient de parler d'un autre aspect importantdes nucléotides : l'adénine (A) se lie uniquementà la thymine (T) et la cytosine (C) uniquement àla guanine (G). De ce fait, on dit que A estassociée à T et que C est associée à G. Il estbien plus facile de rompre les liaisons A-T et C-G (appelés liaisons hydrogènes) que de rompredes liaisons reliant ensemble l'armature desnucléotides dans la chaîne d'ADN (appelésliaisons covalentes). Cette propriété prendra del'importance par la suite, lorsque nous parleronsde la synthèse des protéines.

Formation d'une molécule d'ADN : Comment les nucléotides se lient :Les molécules d'ADN sont formées en réalité de deux chaînes parallèles de nucléotides. On dit quechaque chaîne est complémentaire de l'autre, car chaque nucléotide d'une chaîne se lie à sonpartenaire complémentaire de l'autre côté. Il serait utile de représenter la molécule d'ADN commeune échelle, dont les deux montants sont composés des armatures de nucléotides reliées entre elles,et dont les échelons sont les paires de base complémentaires A-T et G-C. Ainsi, si un côté del'échelle a la séquence AATGC, le côté complémentaire aura la séquence TTACG.En réalité, l'échelle d'ADN est entortillée et forme une double hélice. Comme les liaisonshydrogènes (reliant G à C ou T à A) sont plus faibles que les liaisons covalentes reliant lesnucléotides entre eux, les deux chaînes complémentaires formant l'échelle entortillée peuventfacilement être déroulées et séparées.




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3) Gènes: les phrases de l'ADN

Un gène est une série de nucléotides (mots d'ADN) qui constitue une unité d'informationhéréditaire. Chacun des chromosomes dans le noyau d'une cellule humaine contient desmilliers de gènes. Tout l'ADN contenu sur les 23 paires de chromosomes dans unecellule humaine renferme les 80 000 gènes (et en conséquence, toutes les instructionsgénétiques) qui constituent le génome humain.

Mais qu'entend-on par « unité d'informationhéréditaire »? On peut donner une définition plusprécise du gène : région d'ADN qui esttranscrite. La transcription, processus biologiqueassuré par les enzymes constitue la premièreétape du processus de synthèse de protéines.Comme son nom l'indique, le processus desynthèse des protéines donne lieu à la productiond'une protéine. Les protéines sont les moléculesbiologiques qui donnent aux cellules vivantesleurs formes et fonctions diverses. Ainsi, un gèneest une séquence d'A, de T, de C et de G - dansun ordre particulier - qui code pour une fonctionbiochimique précise, en général par la productiond'une protéine particulière. Ce sont les protéinesproduites à l'aide de gènes comme matrice, quisont responsables des caractéristiques d'unecellule ou d'un organisme particulier.

Les gènes ont des tâches spécifiques, à des moments particuliers. Tous les gènes ne sontpas « actifs » en même temps. Par exemple, de nombreux gènes ne sont « actifs »(entraînant la production de protéines) que pendant le développement du foetus humain. Unefois l'enfant né, les protéines associées à ces gènes ne sont plus requises, et ces derniers sont« désactivés », peut-être à jamais, sauf lorsqu'ils sont transmis aux générations suivantes.D'autres gènes ne sont « activés » que lorsque le corps en a besoin. Par exemple, le gèneresponsable de la production d'insuline est régi par la quantité de glucose (sucre) présentedans le sang d'une personne. Après la consommation d'un repas, le sang renferme une plusforte concentration de glucose, ce qui déclenche la production d'une quantité accrued'insuline par les cellules du pancréas. L'insuline stimule l'absorption de glucose par destissus comme les muscles squelettiques et les tissus adipeux (graisse), ce qui ramène laconcentration de glucose dans le sang à un niveau normal. Une fois que le taux de glucosedans le sang est revenu à la normale, la quantité d'insuline sécrétée par les cellules dupancréas est également réduite.




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4) Qu'est-ce que l'ARN?

L'ARN est l'abréviation d'acide ribonucléique. Toutcomme l'ADN, les molécules d'ARN sont fabriquées dansle noyau de la cellule. Toutefois, contrairement à l'ADN,l'ARN ne se limite pas au noyau. Il peut migrer dansd'autres parties de la cellule. De l'ARN, appelé ARNmessager communique le message génétique que l'onretrouve dans l'ADN au reste de la cellule afin de favoriserla synthèse de protéine. La façon dont une séquence degènes dans l'ADN se traduit par la suite en une protéinecorrespondante fait l'objet de la section sur la synthèse desprotéines.

Tout comme l'ADN, les molécules d'ARN sont composées de nucléotides. Toutefois, alorsque les molécules d'ADN sont formées de deux brins parallèles de nucléotides, une moléculed'ARN n'en compte qu'un.Par ailleurs, la structure chimique de l'« armature » du nucléotide de l'ARN est légèrementdifférente de la structure de celle de l'ADN. L'armature de l'ADN contient des moléculesde sucre désoxyribose (d'où le D dans ADN) et celui de l'ARN des molécules de sucreribose (d'où le R dans ARN).Trois des quatre bases azotées pouvant se lier à l'armature de l'ARN sont les mêmes quecelles pour l'ADN. Tout comme l'ADN, les nucléotides de l'ARN peuvent avoir des bases deguanine (G) et de cytosine (C) et tout comme dans les nucléotides d'ADN, le guanines'associe (se lie) à la cytosine (G-C). Une troisième base que l'on retrouve dans l'ARN -adénine (A) - est également la même que dans l'ADN. Mais au lieu de la thymine (T),l'ARN comporte de l'uracile (U) qui se lie à l'adénine (U-A).

5) Les protéines

À quoi servent les protéines?

De nombreux gènes codent pour des chaînes polypeptidiques particulières. Et les protéinescomprennent une ou plusieurs chaînes polypeptidiques.

Ce sont les protéines qui sont responsables des caractéristiques d'un organisme ou d'unecellule. La façon dont les protéines sont construites, selon une matrice génétique, est décritedans la section sur la synthèse des protéines.

Les protéines ont diverses vocations et donnent aux cellules vivantes leurs diverses formes etfonctions. Certaines protéines ont une fonction structurale; ces protéines fabriquent lecartilage, les cheveux et les ongles, par exemple. Une catégorie spéciale de protéines, les




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enzymes, catalysent d'importantes réactions chimiques dans la cellule qui ne pourraientnormalement se produire en leur absence. Certaines protéines servent de canauxmembranaires qui facilitent le passage des particules moléculaires vers ou hors de lacellule. Certaines hormones, comme l'insuline, sont des protéines qui régulent les fonctionsdu corps (l'insuline contrôle le taux de sucre dans le sang). Les protéines sont égalementrequises pour la contraction des muscles et aident les cellules du corps à se défendrecontre les envahisseurs étrangers. Les fonctions susmentionnées ne constituent qu'une partiedes diverses fonctions des protéines.

Structure de la protéine

Toutes les protéines sont constituées d'une ou deplusieurs longues molécules appelées polypeptides.Chaque polypeptide est composé de petites moléculesreliées bout à bout et appelées acides aminés. Les 20types d'acides aminés utilisés par les cellules vivantesont tous une structure d'armature identique, qui sert à lierensemble les acides aminés en une longue chaîne.Chaque type d'acide aminé possède également ce qu'onappelle un groupe latéral, distinct sur le plan chimique,selon le type d'acide aminé. Bien qu'il ne soit pasnécessaire d'exposer en détail la façon dont varient lesstructures des groupes latéraux, mentionnons qu'ilspeuvent être regroupés en plusieurs catégories.

Par exemple, certains groupes latéraux sont nonpolaires, tandis que d'autres sont polaires. Lesmolécules polaires et non polaires restent généralementéloignées les unes des autres. (Avez-vous jamaisremarqué que l'huile de cuisson et l'eau ne se mélangentpas, mais demeurent ensemble dans de grosses bulles?C'est justement parce que les molécules d'huile sont nonpolaires, et les molécules d'eau, polaires) Les moléculesd'eau sont polaires, et comme les molécules non polairesn'aiment pas s'associer à des molécules polaires, nousappelons souvent les molécules non polaireshydrophobes (du grec, « craignant l'eau »). Par ailleurs,les molécules polaires sont hydrophiles (du grec,« aimant l'eau »), car elles aiment interagir avec l'eau.

Les protéines, qui flottent dans la cellule oun'importe où dans votre corps, sont entourées d'unmilieu principalement aqueux.. Qu'arrive-t-il à lalongue chaîne d'acides aminés, dont certains sonthydrophobes et d'autres hydrophiles?

La protéine se plie en une structure en trois dimensions où la plupart des acides aminéshydrophobes sont tournés vers l'intérieur de la structure (s'écartant de l'eau) et où la plupartdes acides aminés hydrophiles se trouvent en surface, tournés vers l'eau. En conséquence, les




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types d'acides aminés et l'ordre dans lequel ils se situent dans la chaîne déterminerontcomment la protéine finira par se plier dans l'eau, et, dès lors, sa structure en troisdimensions dans votre corps.

Cette structure tridimensionnelle est essentielle au bonfonctionnement de la protéine. Une protéine detransport membranaire, par exemple, est intégrée dansla membrane de la cellule et a la forme d'un tunnel oud'un corridor reliant chaque côté de la membrane àl'autre. Elle a pour tâche de permettre à certainesmolécules qui le peuvent d'entrer ou de sortir de lacellule. De toute évidence, la forme de la protéine detransport est très importante pour qu'elle puisse remplircorrectement sa fonction! Une protéine de transport malformée peut avoir un corridor « bloqué », ce qui signifieque les grosses molécules ne peuvent entrer ou sortir dela cellule. Les enzymes constituent un autre exemple decatégorie de protéines dont la forme est essentielle à leurbon fonctionnement.

6) Les enzymes

Qu'est-ce qu'un enzyme?

Un enzyme est un catalyseur biologique. Mais qu'est-ce qu'un catalyseur?

Un catalyseur est une substance qui accélère la vitesse d'une réaction biochimique sansêtre altérée dans le processus. Des centaines de réactions chimiques différentes se produisentsans arrêt dans nos cellules et dans notre corps. Dans notre estomac et notre intestin grêle, desréactions chimiques décomposent les aliments que nous mangeons en particules plus petitesqui peuvent être absorbées par nos cellules. Par exemple, une molécule de sucre complexeprésente dans les produits laitiers, appelée lactose, doit d'abord être décomposée en deuxmolécules -- glucose et galactose -- avant de pouvoir être absorbée par les cellulessomatiques. Cette réaction se produit normalement avec l'aide d'un enzyme appelé lactaseprésent dans l'intestin grêle.

De nombreuses réactions chimiques, y compris la décompositiondu lactose, ne se produisent pas spontanément. Le lactose ne sedécompose pas s'il ne réside pas suffisamment longtemps dansdu lait ou du fromage, car les molécules en cause doiventposséder une certaine quantité d'énergie pour que la réactionpuisse se produire.




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La quantité d'énergie requise pour qu'une réaction donnée ait lieu s'appelle énergied'activation. Bien que la décomposition du lactose soit possible, elle ne se produira que si lesmolécules du lactose possèdent l'énergie requise. Dans le lait, le fromage ou la crème glacée,la molécule moyenne de lactose ne dispose tout simplement pas de l'énergie nécessaire poursubir la réaction de décomposition, ce qui fait qu'il faudrait attendre bien longtemps avantque cette réaction ne se produise par elle-même.

Comment les catalyseurs accélèrent-ils donc les réactions chimiques? Ils permettent à laréaction de se produire alors que l'énergie d'activation est insuffisante. En d'autres termes, enprésence d'un catalyseur adéquat, les molécules réactantes auront besoin de moins d'énergiepour se transformer en produits. Le catalyseur ne réagit pas lui-même et n'est pas altérépar la réaction. Les catalyseurs facilitent la réaction en permettant à une série demolécules réactantes de se transformer en produits, pour ensuite aider d'autres molécules àsubir la même réaction. Certains catalyseurs biologiques (enzymes) sont si efficaces qu'unseul suffit pour qu'à chaque seconde, plus de 600 000 molécules réactantes se convertissenten molécules de produit!

Il convient de noter que les enzymes sont très spécialisés. Lalactase qui aide les molécules de lactose à se décomposer enmolécules de galactose et de glucose, est structurée de sorte à nepouvoir catalyser qu'un seul type de réaction. Les enzymes sontsi sélectifs qu'ils ignorent les milliers de molécules dans lescellules somatiques et les fluides organiques pour lesquels ils nesont pas conçus.

On appelle substrat la molécule qu'un enzyme aide à réagir. Ainsi, le lactose est le substratde la lactase. Pour comprendre comment les enzymes peuvent être spécifiques, nousexaminons la structure de l'enzyme et le modèle clé-serrure de la fonction enzymatique.

Structure de l'enzyme : le « modèle clé-serrure »

À l'exception de quelques enzymes composés d'ARN, lesenzymes sont des protéines. Souvenez-vous qu'une protéine estcomposée d'une ou de plusieurs chaînes d'acides aminés reliées,et que chaque chaîne d'acides aminés prend une formetridimensionnelle selon la séquence d'acide aminé et la façondont les acides aminés de la chaîne interagissent entre eux etavec la solution environnante.

Les enzymes se plient de telle façon qu'on observe une échancrure ou une poche à leursurface. On appelle cette poche site actif. Le modèle clé-serrure repose sur le principe selonlequel les formes des molécules réagissantes (les substrats) et le site actif de l'enzymes'emboîtent comme une clé dans la serrure pour laquelle elle est conçue. Ainsi, la moléculede lactose s'adapte parfaitement au site actif de la lactase, ce qui signifie que cet enzyme peutuniquement catalyser la décomposition du lactose.

Les enzymes sont importants!

Les enzymes produisent des centaines de réactions chimiques essentielles à notre survie. Ils




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provoquent les réactions nécessaires à la digestion des aliments, à la formation et à ladécomposition de l'ADN et de l'ARN, ainsi qu'à de nombreux autres processus vitaux. Unedéficience en lactase, par exemple (relativement courante chez les êtres humains) rendimpossible la décomposition du lactose et entraîne une intolérance au lactose, état qu'il estpossible de surmonter en prenant des pilules contenant des enzymes de lactase avant deconsommer des produits laitiers.

LISTE DES OUVRAGES DE RÉFÉRENCE

1. S.S. Zumdahl, Chemical Principles, D.C. Health, Lexington, 1995

2. L.A. Moran, K. G. Scrimgeour, H. R. Horton, R. S. Ochs et J. D. Rawn.Biochemistry, Neil Patterson, New Jersey, 1994




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7) Synthèse des protéines

Voici un aperçu de la façon dont un gène (une section de la molécule d'ADN) sert de matricepour la synthèse d'une protéine. Le processus peut être divisé en deux phases : la Transcription,suivie de la Traduction.

Transcription :

La transcription est le processus parlequel un morceau particulier d'ARN -appelé ARN messager (ARNm) - estconstruit à l'aide d'une séquencegénétique particulière (ADN) commematrice.

Tout d'abord, les enzymes déroulent unepartie de l'hélice d'ADN bicaténaire etrompent les liaisons entre les paires debase complémentaires dans la sectionnon déroulée. Ensuite, un brincomplémentaire d'ARN messager estsynthétisé, utilisant comme matrice l'undes brins de l'ADN non déroulés. Parexemple, si une partie d'un brin del'ADN non défait lit GATCAT, laséquence d'ARN messagercomplémentaire lira CUAGUA.(Souvenez-vous que les nucléotidesd'uracile [U] prennent la place de lathymine dans l'ARN). Enfin, une foisque l'ARN messager complémentaire estformé, le segment d'ADN reprend saforme originale, soit celle d'une doublehélice.

La transcription donne lieu à la créationd'une molécule d'ARN messagercomplémentaire à une section donnéed'ADN (qui constitue un gène).Contrairement aux molécules d'ADN,les molécules d'ARN messager sontlibres de sortir du noyau par les poresde la membrane nucléaire pourvoyager dans le reste de la cellule(appelé cytosol). C'est dans le cytosolque prend place la traduction.




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Traduction :

C'est le processus de fabrication d'unemolécule, en fonction de l'informationcontenue dans une molécule d'ARNmessager. Mentionnons d'abord quecomme l'ADN et l'ARN, les protéinessont des chaînes de petits éléments reliésentre eux. Dans le cas de l'ADN, cespetits éléments s'appellent nucléotides,et dans le cas des protéines, on lesappelle acides aminés. La séquence denucléotides dans l'ARN messager estsimplement transformée en uneséquence d'acides aminés, selon un codeuniforme.

Chaque séquence de trois bases d'ARNmessager code pour un acide aminéparticulier. Par exemple, la séquenced'ARN messager AUG code pour unacide aminé appelé méthionine. Lesribosomes, les « machines » qui assurentla synthèse des protéines, s'attachent aubrin d'ARN messager et descendent, «lisant » ainsi la séquence de nucléotideset reconstituant la protéine adéquate àmesure qu'ils se déplacent. La premièresérie de trois nucléotides que lit leribosome est toujours AUG, et ce parceque la séquence AUG sert de balise,indiquant au ribosome où il « doitcommencer à lire ».

À mesure que le ribosome descend lelong de l'ARN messager, il ajoute l'acideaminé adéquat à la chaîne grossissantecorrespondant à chaque série de troisnucléotides. Chaque triplet denucléotides qui code pour un acideaminé particulier s'appelle codon. Lesvingt acides aminés employés pourfabriquer des protéines biologiques ontau moins un codon correspondant.

Par exemple, le codon CGA code pour un acide aminé appelé alanine. Et le codon AAU codepour un acide aminé appelé asparagine. En conséquence, une partie d'une séquence d'ARN




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messager qui se lit AUG GCA AAU donnera lieu à la chaîne suivante d'acides aminés :méthionine-alanine-asparagine.

En lisant toute la séquence d'ARNmessager, le ribosome construit unelongue chaîne d'acides aminés, quiconstituent la protéine.

OUVRAGE DE RÉFÉRENCE

1. P. H. Raven et G. B. Johnson. Biology, troisième édition, Mosby Year Book, St. Louis,1992, p. 308.

8) Les bactéries

Les bactéries sont des organismes unicellulaires. Bienque certaines bactéries soient un agent infectieux dansde nombreuses maladies humaines, il existe denombreuses souches inoffensives voire mêmeessentielles aux êtres humains. De nombreuses souchessont très importantes dans les laboratoires debiotechnologie! Les cultures bactériennes servent,entre autres, à la production de protéines utiles. Parexemple, une espèce de bactérie appelée E. coli peutêtre génétiquement modifiée de façon à produired'importantes quantités d'insuline humaine, qui peut êtreadministrée aux diabétiques. Voici un aperçu decertaines caractéristiques des bactéries qui fontqu'elles conviennent parfaitement à de nombreusesapplications biotechnologiques.

Photographie : Conseil national derecherches du Canada

Les bactéries sont des procaryotes, ce qui signifiequ'elles ne contiennent pas de noyau. Bien qu'ilsprolifèrent souvent en groupes où les bactéries adhèrentl'une à l'autre, les procaryotes sont composés d'une seulecellule. On appelle ces groupes de bactéries descolonies. Le génome bactérien comprend un grandemolécule circulaire d'ADN bicaténaire située dans lecytoplasme cellulaire. Cette grande molécule d'ADN,le chromosome bactérien, contient la plupart des gènes bactériens. Outre cette grandemolécule d'ADN, les bactéries renferment souvent de petites molécules d'ADN circulairesappelées plasmides. Ces plasmides contiennent également des gènes, mais contrairement augrand chromosome circulaire, ils sont extrêmement mobiles. Ils peuvent passer facilement




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d'une bactérie à l'autre, et, de cette façon, les gènes sont transmis entre bactéries. Lesmolécules de plasmide, une fois dans la cellule bactérienne hôte, peuvent s'intégrer enpermanence au grand chromosome bactérien.

La capacité des plasmides à pénétrer dans les cellules bactériennes et à s'intégrer auchromosome de ces cellules en fait des outils très utiles pour insérer un gène dans unecellule bactérienne. Nous expliquerons comment les plasmides sont employés de cette façondans la section portant sur le génie génétique.

9) Les virus

Qu'est-ce qu'un virus?

Les virus sont constitués de matériel génétique (soit d'ADN soit d'ARN) entouré d'une coucheprotectrice de protéines. Certains virus d'animaux sont également entourés d'une membrane delipides (gras). Un virus n'est pas un organisme vivant de manière autonome. Les virusn'existent que pour se multiplier, et à moins qu'un virus ne se trouve dans une cellule vivante,il est inactif et ne peut se reproduire. Lorsqu'un virus ou une partie de virus parvient à pénétrerdans une cellule, on parle d'infection.

Selon le virus, c'est le virus tout entier qui pénètre dans la cellule ou seulement le matérielgénétique qui est « injecté » dans la cellule tandis que la couche externe demeure à l'extérieur.Dans le cas du bactériophage T14 -- un type de virus qui infecte certaines bactéries --, l'ADNinterne est injecté dans la cellule à infecter. En revanche, tout le virus du sida (appelé VIH)pénètre dans les cellules T de l'être humain pour les infecter.

Dans les deux cas, par suite de l'infection virale, le matériel génétique du virus pénètredans le cytoplasme de la cellule, qui renferme tous les enzymes nécessaires et d'autresmatériels indispensables à la reproduction du matériel génétique du virus et à la synthèse deses protéines.

Pourquoi une infection virale peut-elle nuire à une cellule?

Un virus nuit à la cellule qu'il infecte, car il « prend les commandes » du gène de la cellule etde la machine à fabriquer les protéines, ce qui donne lieu à la production de morceaux de virusuniquement. Une fois ceux-ci fabriqués, ils forment une myriade de nouveaux virus, quiremplissent la cellule.

Ces nouveaux virus quittent la cellule, quelques-uns à la fois (bourgeonnement) ou par unprocessus appelé lyse, où l'on assiste à une rupture de la membrane cellulaire, qui libère toutesles particules du virus en même temps, ce qui a pour effet de tuer la cellule hôte, tandis que lesparticules du virus libérées s'en vont infecter d'autres cellules.




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Rétrovirus -- un type d'infection différent

Parfois, un virus ne prend pas les commandes de la machine à fabriquer des cellules dès qu'ill'infecte. Les rétrovirus, qui possèdent de l'ARN comme principal matériel génétique, portentégalement un enzyme spécial qui utilise l'ARN pour fabriquer une molécule d'ADNbicaténaire complémentaire. L'enzyme (connu sous le nom de transcriptase inverse)synthétise l'ADN à partir de l'ARN du virus, et cet ADN peut s'intégrer au génome de lacellule hôte situé dans le noyau.

Pendant une période de latence, les gènes viraux sont dormants dans les chromosomes de lacellule hôte. On pense que de nombreux segments du génome humain sont formés derétrovirus endogènes, qui sont de l'ancien ADN défectueux d'un rétrovirus, qui s'est intégré ily a des milliers d'années et qui est présent, sans causer d'effets nocifs depuis. On pourrait direque la « période de latence » de ces virus est pratiquement infinie! Par ailleurs, le virus du sida(un rétrovirus) a une période de latence beaucoup plus courte (une moyenne d'environ 8 ans).

Après la période de latence, les gènes viraux seront activés et, selon le processus ordinaire desynthèse de protéines, ils prendront les commandes de la machinerie cellulaire, rendant virauxl'ARN et les protéines et entraînant la production de particules de virus.




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Comme les rétrovirus parviennent bien à incorporer leur propre matériel génétique au génomede leur cellule hôte, ils sont souvent utilisés comme vecteurs d'ADN recombinant. End'autres termes, si nous voulons intégrer un gène particulier qui a été isolé, mis au point oumodifié à l'aide du génie génétique (c'est ce qu'on entend par recombinant), dans le génomed'une cellule, nous ajoutons le gène dans l'ADN du rétrovirus, enlevons les parties nocives del'ADN du rétrovirus qui provoquent la « prise des commandes » de la cellule, et utilisons lerétrovirus pour transporter le gène voulu dans la cellule. Lorsque nous permettons au virusmodifié d'infecter la cellule hôte, l'ADN viral ainsi que le nouveau gène s'intègrent au génomede la cellule hôte. On trouvera une description plus complète de ce processus dans les sectionssur le génie génétique et sur la thérapie génique.

10) Génie génétique

QU'EST-CE QUE LE GÉNIE GÉNÉTIQUE?

Le génie génétique est le processus par lequel on identifie et isole l'ADN d'une cellule vivanteou morte pour l'introduire dans une autre cellule vivante. Avant d'introduire le matérielgénétique, on peut le modifier en laboratoire. Lorsque la manipulation génétique réussit, lenouvel ADN est intégré à jamais dans les chromosomes de la nouvelle cellule, et apparaîtraégalement dans l'ADN des cellules des descendants. Comment les scientifiques peuvent-ilsfaire des manipulations génétiques? Ils utilisent la technologie de recombinaison de l'ADN.

TECHNOLOGIE DE RECOMBINAISON DE L'ADN

On appelle technologie de recombinaison de l'ADN les méthodes mises au point pour isoler,manipuler, amplifier, couper et épisser des séquences identifiables d'ADN. Dans les troisprochaines sections, nous présentons plusieurs techniques de recombinaison de l'ADNemployées pour localiser, isoler et amplifier l'ADN. Dans la dernière section, nous montronscomment utiliser d'autres techniques de recombinaison pour introduire du nouvel ADN dans




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les cellules.

11) Localisation d'un gène

De nombreuses techniques en biologie moléculairesont employées pour déterminer où se trouve ungène spécifique dans le génome humain. Cettetâche est loin d'être facile, puisque le génomehumain contient des milliers de gènes, dont bonnombre n'ont pas encore été découverts ouséquencés. Les sondes d'ADN sont bien utiles àcette fin.

Qu'est-ce qu'une sonde d'ADN?

Il est possible de trouver un gène particulier àl'aide d'une sonde d'ADN, une molécule d'ADNmonocaténaire relativement courte qui estcomplémentaire de la séquence sur le gènerecherché. En d'autres termes, si un segment dugène recherché est connu comme étant AGTTCG,le segment complémentaire de la sonde d'ADNsera TCAAGC, car A se lie à T et C se lie à G. (Enfait, en raison de certains détails structurels sur lesmolécules d'ADN, la séquence complémentaires'écrirait en fait comme suit : CGAACT, ce quidonne TCAAGC à l'envers. Toutefois, nousutilisons le format techniquement incorrect ici,pour éviter toute confusion.)

Une véritable sonde d'ADN serait probablementconstituée d'au moins quelques douzaines denucléotides associés à un segment de la mêmelongueur sur le gène recherché. La sonde estconçue de façon à être radioactive, de sorte qu'ellepuisse être détectée facilement.

Comme la sonde d'ADN se lie à l'ADNmonocaténaire, on a recours à une techniqueappelée transfert de Southern qui permet deséparer l'échantillon d'ADN bicaténaire en un seulbrin et de le transférer à une membrane en nylon.Lorsque les sondes sont incubées avec lamembrane dans une solution, elles se lient à desrégions complémentaires dans l'ADN et « adhèrent» à la membrane. Ensuite, la membrane est mise encontact avec une pellicule photographique sensible




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aux émissions radioactives. Les sections del'échantillon où se trouve le gène ressortent enfoncé sur le papier, car ce sont les seules sectionsliées à une sonde radioactive.

Les sondes d'ADN ont plusieurs applications en biologie moléculaire, y compris les méthodesgénétiques de prédiction et de diagnostic des maladies, où l'on emploie des sondes quiidentifient les séquences de gènes que l'on sait responsables de maladies. Les sondes d'ADNpeuvent également être employées pour les empreintes génétiques, technique à laquelle lesexperts en criminalistique ont souvent recours pour déterminer si l'ADN retrouvé sur les lieuxd'un crime correspond à celui du suspect.

Comment construit-on les sondes d'ADN?

Il est possible de construire une sonde d'ADN bienavant de connaître la séquence des gènes elle-même! Pour ce faire, on travaille à partir duproduit protéique du gène. Rappelez-vous que dansnotre description de la fabrication des protéines,nous avons dit qu'un gène était transcrit en ARNmessager (ARNm), selon les simples règles de lacomplémentarité des bases. L'ARN messager esttransporté hors du noyau et utilisé comme matricepour la formation d'une chaîne d'acides aminés, quise transforme en une protéine.

Nous pouvons isoler la protéine produite par legène qui nous intéresse, et trouver quels sont les 30premiers acides aminés de la protéine. Selon cetteinformation, nous pouvons déterminer les 90premiers nucléotides de cette matrice d'ARNmessager de la protéine (n'oubliez pas que chaquetriplet de nucléotides code pour un acide aminé,d'où le rapport 90:30). Et comme la matrice d'ARNmessager est complémentaire du gène recherché,nous savons que notre sonde d'ADN devrait avoirune séquence complémentaire des 90 premiersnucléotides du gène recherché.

Pour construire une sonde d'ADN, nous utilisonsune « machine à gènes » capable de synthétiser enquelques heures à peine une molécule courted'ADN monocaténaire contenant la séquencevoulue de nucléotides.




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12) Isolement d'un gène

Si nous voulions introduire un gène humain dans une autre cellule, il ne nous suffirait pas desavoir où se trouve ce gène dans le génome humain. Nous devrions également isoler une copie dugène, de façon à pouvoir l'insérer dans la nouvelle cellule.

Par exemple, le gène de l'insuline humaine doit être isolé des cellules humaines de sorte à pouvoirêtre introduit dans les cellules de la bactérie E. coli. Par suite de l'incorporation du gène, lescellules bactériennes produisent la protéine de l'insuline humaine que l'on peut administrer auxdiabétiques.

Pour isoler un gène, on peut travailler à rebours à partir de son produit protéique. Tout d'abord, aumoins une partie de la protéine est séquencée, ce qui signifie que l'ordre des acides aminés quiconstituent la chaîne protéique est déterminé. En général, il suffit de connaître les 30 premiersacides aminés de la protéine. Ensuite, selon la séquence connue d'acides aminés et si l'oncomprend le processus de synthèse des protéines, on peut prédire la séquence de nucléotides d'unepartie de la matrice d'ARN messager de la protéine.

Ensuite, on construit une sonde d'ADN monocaténaire complémentaire de la séquence prévued'ARN messager. Par exemple, si une partie de la séquence prévue d'ARN messager est CUAGUA CGA, la section correspondante de la sonde d'ADN serait GAT CAT GCT, car G s'associeà C et A à T. (En fait, en raison de certains détails structurels relatifs aux molécules d'ADN, laséquence complémentaire devrait réellement s'écrire comme suit : TCG TAC TAG, quicorrespond à GAT CAT GCT à l'envers. Toutefois, nous utilisons un format techniquementincorrect ici, pour éviter la confusion.) La sonde d'ADN est conçue pour être radioactive, de sortequ'elle soit décelable lorsqu'elle se lie à son « image symétrique » d'ADN.




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La sonde d'ADN monocaténaire est ensuite incubée avec un échantillon censé contenir la matricecomplète de la protéine d'ARN messager. Lorsque nous isolerons l'ARN messager auquel se lie lasonde d'ADN, nous aurons probablement trouvé l'ARN messager que nous cherchions.

Une fois que l'on a trouvé le brin d'ARN messager, il suffit de travailler à rebours -- nous devonssynthétiser le brin d'ADN qui aurait servi de matrice pour l'ARN messager. Il nous fautsynthétiser de l'ADN à partir d'ARN. Il existe un enzyme appelé transcriptase inverse qui nouspermet de faire cela. On retrouve cet enzyme dans certains virus appelés rétrovirus. Ces virusemploient l'ARN comme matériel génétique et utilisent la transcriptase inverse pour générer del'ADN une fois qu'ils ont infecté une cellule hôte. Les biotechnologistes peuvent mélanger unetranscriptase inverse avec des ARN messagers in vitro (à l'extérieur de cellules vivantes, enlaboratoire, généralement dans un petit tube en plastique). Par conséquent, la séquence d'ADNpour le gène recherché est synthétisée par l'enzyme, selon le brin d'ARN messager présenté.Comme l'ADN produit a été fabriqué de manière artificielle en vue d'être complémentaire del'ARN messager, on l'appelle ADN complémentaire.




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13) Amplification de l'ADN : amplification en chaîne par lapolymérase

Souvent, la quantité des échantillons d'ADN est trop petite pour qu'on puisse les utiliser.Heureusement, on peut avoir recours à une technique inventée dans les années 1980,l'amplification en chaîne par la polymérase (ACP) pour « amplifier » les quantités d'ADN deces échantillons.

La machine d'ACP n'est en fait rien de plus qu'un dispositif très précis de chauffage et derefroidissement. La machine comporte de petites fentes où sont insérés de petits tubes contenantl'échantillon d'ADN et d'autres ingrédients nécessaires à la réaction. Ces ingrédientssupplémentaires englobent une bonne quantité de nucléotides (A, T, C et G), de courtesmolécules d'ADN monocaténaire appelées amorces et un enzyme appelé polymérase Thermusaquaticus (polymérase Taq, en abrégé). La polymérase Taq est dérivée de bactéries qui viventdans des sources chaudes et comptent parmi les rares enzymes capables de fonctionner à de trèshautes températures.

Le cycle commence lorsque la machine chauffe letube à une température d'environ 90-95 °C, ce quientraîne la séparation de chaque molécule d'ADNbicaténaire de l'échantillon d'origine en deuxbrins.

(Souvenez-vous que les liaisons hydrogènes quirelient deux brins complémentaires d'une doublehélice d'ADN sont bien plus faibles que lesliaisons covalentes qui relient les nucléotidesformant chaque chaîne. Le chauffage provoque larupture des liaisons hydrogènes, qui déroulent etséparent les deux brins, tandis que les liaisonscovalentes ne sont pas touchées.)

Ensuite, on abaisse la température légèrement, cequi permet aux amorces d'ADN de se lier auxbrins séparés. Les amorces se lient, car elles sontcomplémentaires de certaines séquences dechaque brin d'ADN qui « flanquent » l'ADN àrépliquer au milieu. Une fois que les amorces sesont attachées aux brins, la polymérase Taq sesynthétise, en utilisant les nucléotides flottantdans le tube, un brin complémentaire pour chaque




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brin monocaténaire d'origine. Cette réactionboucle le premier cycle, et double la quantitéd'ADN présente dans le tube.

Au cours du cycle suivant, la machine d'ACPchauffe et refroidit comme auparavant, ce quientraîne la séparation des nouvelles moléculesd'ADN bicaténaire, et la synthèse des nouveauxbrins complémentaires par la polymérase Taq.

Chaque fois qu'un cycle est complété, la quantité de copies de la séquence d'ADN désirée(située entre les deux amorces) est, en théorie, multipliée par deux. Après une trentaine decycles (qui durent généralement environ trois heures), on disposera de suffisamment de copies decette séquence d'ADN pour l'application d'autres techniques biotechnologiques.

14) Introduction d'un gène dans une cellule

Un gène, probablement isolé sous forme d'ADN complémentaire, peut être introduit dans unecellule à l'aide d'un vecteur. Un vecteur est un véhicule par lequel de l'ADN étranger est transmisd'une cellule à une autre.

Par exemple, les virus modifiés et les plasmides sont des vecteurs.

Les virus en tant que vecteursLes virus constituent d'excellents vecteurs, car au terme de longues périodes d'évolution, ils ontacquis la capacité d'éviter d'être détruits par le système immunitaire humain et d'insérer leurpropre matériel génétique dans certaines cellules. Comme nous l'avons vu dans la section portantsur les virus, une infection virale se produit lorsque du matériel génétique étranger (viral)pénètre dans la cellule et emploie la machine à fabriquer des protéines et de l'acide nucléique dela cellule pour produire ses propres protéines ainsi que son propre ADN et ARN. Pour utiliser unvirus comme vecteur, on remplace les segments nocifs de son ADN par l'ADN complémentaireque l'on souhaite introduire dans la cellule. Ensuite, on laisse le virus « infecter » la cellule hôteet, si tout va bien, l'ADN complémentaire pénètre dans la cellule et servira à fabriquer laprotéine voulue.

Certains virus peuvent produire leur propre ADN et l'insérer dans legénome de la cellule hôte. Ces rétrovirus à base d'ARN sont lesvecteurs viraux les plus courants utilisés en thérapie génique où lesgènes ayant une valeur thérapeutique sont introduits dans lesrétrovirus qui, au moment de l'infection, les insèrent dans le génomede la cellule hôte.

Il convient de noter que les virus employés comme vecteurs sontconçus de sorte à ne pouvoir se reproduire. En d'autres termes, les




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segments nocifs du génome viral qui servent à produire un nombreaccru de particules virales ont été enlevés et remplacés par uneséquence qui code pour la protéine recherchée.

Les plasmides en tant que vecteursL'ADN complémentaire de l'insuline humaine est introduit dans descellules bactériennes à l'aide d'un plasmide. Un plasmide estsimplement une molécule d'ADN circulaire contenant des gènes quipeuvent facilement se répandre dans des cellules bactériennes ou ensortir. Bien que les plasmides soient présents naturellement danscertaines bactéries, ceux employés en vue d'introduire un gèneétranger dans une cellule et de l'en extraire ont été modifiés de tellesorte que les séquences qu'ils renferment sont fort différentes desplasmides présents à l'état naturel desquels ils sont tirés.

En premier lieu, le plasmide contient plusieurs séquences courtes spécialisées appelées sites derestriction. Les enzymes appelés endonucléases de restriction reconnaissent ces sites etcoupent l'ADN du plasmide. Par exemple, un enzyme de restriction appelé EcoR1 reconnaît laséquence GAATTC et procède à la coupure entre le G et le premier A. Il convient de noter quela séquence complémentaire est CTTAAG, soit GAATTC à l'envers! Ainsi, l'enzyme coupe lesdeux brins de plasmide comme suit :

Mentionnons que la découpe à l'aide de l'EcoR1 donne lieu à deux « extrémités adhésives » quiconsistent en un seul brin de nucléotides qui se lieront à une série complémentaire d'« extrémitésadhésives » monocaténaires. Qui plus est, le plasmide est conçu de sorte que cette séquenceparticulière de restriction n'est présente qu'une seule fois, coupera le plasmide bicaténaire en unseul site.

L'ADN complémentaire (qui renferme le gène de l'insuline humaine) à insérer dans le plasmideest modifié selon l'enzyme de restriction employé pour couper le plasmide. Pour revenir à notreexemple avec l'EcoR1, il faudrait les extrémités adhésives suivantes à chaque extrémité de




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l'ADN complémentaire :

Maintenant, nous incubons la séquence d'ADN complémentaire modifiée dans une solutionrenfermant un plasmide coupé à l'aide de l'enzyme EcoR1 et un enzyme qui relie les segmentsd'ADN (appelé ADN ligase). On obtient alors un plasmide circulaire fermé qui renferme l'ADNcomplémentaire et, par là même, le gène de l'insuline humaine.

Le plasmide est ensuite incubé avec des cellules bactériennes (dansle cas du processus de fabrication de l'insuline, l'espèce de bactérieemployée est E. coli) dans des conditions particulières quifavorisent l'absorption du plasmide par les cellules bactériennes.

En théorie, le plasmide contenant le gène de l'insuline humainepénétrera dans toutes les cellules bactériennes et toutes ces cellulestranscriront la protéine et produiront de l'insuline humaine, quipourra ensuite être récupérée et utilisée pour traiter les patientsdiabétiques.

Malheureusement, les cellules bactériennes n'absorberont pas toutesle plasmide. En fait, dans la plupart des cas, elles seront peunombreuses à le faire. Comment les biotechnologues peuvent-ilsuniquement sélectionner les cellules bactériennes qui ont absorbé leplasmide?




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Ils le peuvent en fonction des conditions de la culture bactérienne etd'une autre modification spéciale intégrée dans les plasmides issusdu génie génétique. Les bactéries, après avoir été incubées enprésence du plasmide (et certaines l'ont absorbé), sont cultivéesdans un milieu qui renferme un antibiotique, comme l'ampicilline.L'ampicilline tuera la bactérie E. Coli, à moins qu'elle ne soitprotégée d'une façon ou d'une autre. Le plasmide que les bactériesont absorbé contient également un gène qui confère une résistance àl'ampicilline. En conséquence, seules les bactéries ayant absorbé leplasmide résisteront à l'antibiotique et survivront. Comme leplasmide renferme également le gène de l'insuline humaine, nous nepermettons qu'aux bactéries capables de produire de l'insuline desurvivre et de se reproduire.

OUVRAGES DE RÉFÉRENCE

1. P. H. Raven et G.B. Johnson. Biology, troisième édition, Mosby Year Book, St. Louis,1992

2. W. Bains. Biotechnology: From A to Z, Oxford, New York, 1993

3. L.A. Moran et K.G. Scrimgeour, Biochemistry Resource Book, Neil Patterson, NewJersey, 1994

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5. J. L. Southin, Fourty-Eight Lectures in Modern Biology, Kendall/Hunt, Dubuque, 1993

6. E. S. Grace, Biotechnology Unzipped: Promises & Realities, Trifolium, Toronto, 1997

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