Control of Hoxd Genes’ Collinearity during Early Limb

Development

Basile Tarchini and Denis Duboule

Developmental Cell - January, 2006

Introduction

• Les gènes hox

Impliqués dans l’identité cellulaire le long de axe du corps

Codent pour facteur transcription régulateurs de gènes

4 complexes homologues de gènes hox (a, b, c et d)

Introduction

Notion de colinéarité

Extrémité 3’ plus tôt – structures antérieures

Extrémité 5’ plus tard – structures postérieures

Étude de hox d : développement précoce du

bourgeon de membre

Introduction

• Expression selon 2 vagues d’activation

1er vague : phase précoceMal caractériséeGène hoxd 1-9 tout le bourgeon au stade E9Gène hoxd 10-13 localisé vers partie postérieurePermet formation stylopode et zeugopode

Postérieur

Antérieur

Sens d’expression

Introduction

• Expression selon 2 vagues d’activation

2nd vagueGènes hoxd 10-13 uniquement localisés dans partie distalePermet formation autopodePrésence d’un enhancer en 5’

Distal

Sens d’expression

Délétions et duplications dans cluster hoxd

(Fig. 1)

Insertion d’un site Lox / lignée

Recombinaison méthode Cre-Lox par croisement

Obtention de lignée avec délétion ou duplication

Délétion

Duplication

• On aura différentes souches

Délétions de gènes internes

Délétions des gènes en 5’ du cluster

Duplications de gènes internes

Objectifs de l’article

Quels sont les mécanismes régulateurs de la

colinéarité spatiale et temporelle des gènes

hoxd dans le développement précoce du

bourgeon du membre supérieur de la

souris ?

Résultats

Matériels et méthodes

Utilisation d’embryons de souris à différents stades de développement

Hybridation in situ des embryons avec des sondes ARN des différents transcrits des gènes hoxd

Comparaison d’un mutant avec un individu WT de la même portée

Embryons stade 9-9,5 j

Les gènes observés sont

directement en 5’ de la délétion

Expression des gènes uniquement dans les mutants au stade 9-9,5j Expression précoce des gènes hoxd observés

dans les individus possédant une délétion

Effet des délétions internes sur la colinéarité temporelle

(Fig. 2 A-I)

Expression précoce des gènes hoxd 10, hoxd 11, hoxd 13

Même résultats à un stade plus précoce avant la formation du bourgeon Les délétions et donc le rapprochement des

gènes vers la partie 3’ du cluster entraînent un timing d’expression plus précoce de ces gènes

Les gènes observés ne sont pas directement en 5’ de la délétion

Effet des délétions internes sur la colinéarité spatiale

(Fig. 2 J-O)

Observation des limb bud à 10,2-10,7 jours

Expression des gènes dans une partie plus antérieure chez les mutants que chez les WT

Les délétions et donc le rapprochement des gènes vers la partie 3’ du cluster entraînent

une antériorisation de leur profil d’expression

Ant post

Effet des duplications sur les colinéarités spatiale et

temporelle(Fig. 3)

Observation de l’expression des gènes hoxd 10, 11, 12 à différents stades embryonnaires

Pas ou peu d’expressions des

gènes hoxd 11 et 12 chez les mutants à

10 jours Expression retardée des gènes en

amont de la duplication

Embryon à 10j

Embryon à 11j

Expression des gènes anormalement restreinte dans la partie postérieure

Postériorisation du profil d’expression des gènes en amont de

la duplication

Embryon à 9,5j

Même observation avec une plus petite

duplication

Les spécificités spatiale et temporelle d’activation pendant la phase précoce de

croissance du bourgeon du membre antérieur sont probablement déterminées par la position relative d’un gène hoxd à l’intérieur du cluster

Une activation précoce (plus près du 3’) antériorisation du profil d’expression

Une activation tardive (plus loin du 3’) Postériorisation du profil d’expression

Il existe donc un élément régulateur en 3’ du cluster

L’activation progressive des gène de 3’ en 5’ est fonction de la distance relative des

gènes par rapport à cet élément

Est-ce que la deuxième vague d’expression est touchée?Embryon à

12j Toujours postériorisation de l’expression (zeugopode)

2e vague d’expression non modifiée (autopode)

La modification dans le délai d’activation des gènes et dans leur localisation est maintenu au

cours de la croissance

Les mécanismes de régulation de la deuxième vague sont indépendants de ceux de la première

vague

Effet des délétions en 5’ sur la colinéarité spatiale et temporelle

(Fig. 4)

Anté

rieur

Post

érie

ur

Embryon à 10,5j

Postériorisation de l’expression quand gène est proche du 5’ du cluster

Un élément en 5’ restreint l’expression à la partie postérieure

Puisque l’expression commence en 3’, si on lève les gène en 5’ on ne devrait voir aucun changement par

rapport au WT mais…

Anté

rieur

Post

érie

ur

Embryon à 12j

Postériorisation de l’expression

Expression des gènes hoxd 4, 8 et 9 dans l’autopode

Les gènes considérés comme étant en 3’ du cluster adoptent la régulation des gènes situés

en 5’ c’est-à-dire la régulation de la 2nd vague

(Si ils ont la localisation appropriée)

Absence de promoteurs spécifiques dans ce processus de régulation

Anté

rieur

Post

érie

ur

Embryon à 9,2j

Expression prématurée

Evx2 est sous le même contrôle que la deuxième vague

Expression précoce (normalement en même temps que

2nd vague i.e. 10-11 jour)

Postériorisation

10,5j

12j Evx2 soumis à la même colinéarité d’expression

Conclusion

2 vagues d’activation des gènes hoxd

sont nécessaires pour le développement

complet du membre

Existence d’un régulateur en 3’

responsable de la colinéarité temporelle

Existence d’un régulateur en 5’

responsable de la colinéarité spatiale

(restriction)

Régulateur en 5’ activateur de la 2e

vague (5 derniers gènes du cluster)

différent de celui de la 1e vague

ConclusionColinéarité temporelle : contrôlée par ELCR (early limb control region) en 3’

Colinéarité spatiale :

Contrôlée par POST qui induit une inhibition de l’expression antérieure des gènes le plus en 5’ du cluster candidate Gli 3 Formation de la partie proximale du membre

Régulateur en 5’ GCR : active les gène de la 2e vague à 10,5j (hoxd9-13 et evx2)

Ce régulateur est non spécifique de ces gènes (active les 5 derniers du cluster (figure4)

2e vague permet la formation des parties distales (doigts)

Discussion

La 1e vague expression de SHH dans la partie postérieure du bourgeon

SHH 2e vague d’expression des gène hoxd

L’expression asymétrique des gènes hoxd 10-13 Asymétrie du membre final

Présence de deux vagues pour former les parties distales et proximales origines

phylogénétiques différentes

Mécanismes applicables aux membres postérieurs

Peut être également généralisé à tous les vertébrés ayant des membres