Control Micro Biologic o

8/17/2019 Control Micro Biologic o

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control Microbiológico de

Vigo, 8 de septiembre del 2011

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos1


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•

asociados al consumo•

impacto económico (patógenos)• Las alteraciones de alimentos también preocupan a las

industrias alimentaria (indicadores de calidad)• Sistemas APPCC es la herramienta de seguridad

• Requiere de un gran número de análisis y obtención

rá ida de resultados



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• to os ca a vez m s r p os n ustr as, a orator os

• Métodos sencillos• Métodos fiables

• Métodos reconocidos

• Métodos trazables• Métodos sensibles

• Métodos económicos



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Métodos tradicionales/oficiales:

• LargosSurgen los métodos

• Elevada manipulación• Tediosos

alternativos (rápidos y/oautomatizados)



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Métodos rápidos:

• Disminuyen uno o varios días frente a losprotocolos tradicionales

• Utilización de un equipo que realiza una o varias



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Métodos Rápidos: Consideraciones generales

CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO RÁPIDO/AUTOMATIZADO

Preciso

Rá ido roductivo

Económico

Realización simple

Reactivos comunes

epu ac n e a compa a

Buen servicio técnico


Requerimientos de espacio y utilidad óptimos


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Métodos Rápidos

Sistemas para facilitar la toma de muestras

Métodos para ayudar al procesamiento de las muestras

Sistemas de cuantificación microbiológica

Métodos para identificación y cuantificación de microorganismos

Sistemas especiales para análisis de muestras de aguas, ambientales ysuperficies

Sistemas de identificación mediante métodos molecularesMétodos inmunológicos para detección y/o cuantificación de microorganismos

Otros métodos misceláneos



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Paraayudarleaproteger su privacidad,PowerPointevitó queestaimagen externasedescargaraautomáticamente.Paradescargar y mostrar estaimagen,hagaclic en Opcionesen labarrademensajesy,acontinuación,hagaclic en Habilitar contenido externo.

Métodos rápidos para ayudar a la toma de

mues rasMUESTREADORES, APLICADORES

Muestreo dinámico

EstandarizaciónConcepto de trazabilidad



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Métodos rápidos para ayudar al procesamiento

DILUIDORES

Aumentan productividad

Trazabilidad

PREPARADORES y DISPENSADORES DE MEDIOS DE CULTIVO



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Indicadores de calidad

Recuentos



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Métodos rápidos aplicados a Indicadores

FILM HIDRATABLE: PETRIFILM: 3M

Optimizan el espacio de incubación

Manual

Láminasdeshidratadas quese rehidratan al

Algunos protocolos Express

Posibilidad de lector automático

inocular la muestra

a ac ones n ernac ona es

Recuento total

Enterobacterias

.

Mohos y levaduras

Staph. Aureus


Listeria ambiental


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Métodos rápidos aplicados a Indicadoresmicrobioló icos

SISTEMA TEMPO: bioMerieux

•Fácil preparación de muestra

•Trazabilidad

•Mismo protocolo para diferentes parámetros

•Validaciones internacionales

•Recuento Total

• n ero ac er as

•Coliformes

•E.coli

Sistema totalmenteautomatizado

•S. Aureus

•Mohos y levaduras

m n a ur za o

Lectura porfluorescencia


•Bacterias Lácticas


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Protocolo de trabajo

dilu

X g (or ml) 9X ml

ent

Sam le re aration

10-1 suspension

InoculationInoculationInoculation

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos13Reading & interpretationReading & interpretationReading & interpretation

IncubationIncubationIncubation


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+ =dilu

X g (or ml) 9X ml

ent

Sam le re arationSam le re arationSam le re aration

10-1 suspension

InoculationWIFI




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+ =dilu

X g (or ml) 9X ml

ent

Sam le re arationSam le re arationSam le re aration

10-1 suspension

InoculationInoculationInoculationWIFI


Incubation


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+ =dilu

X g (or ml) 9X ml

ent

Sam leSam leSam le re arationre arationre aration

10-1 suspension

InoculationInoculationInoculationWIFI

RESULTSREADING

Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos16Reading & interpretation



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SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC• c preparac n e mues ra

•Lectura automática

• “ - ”

•Necesaria calibración para recuento

•Esterilidad comercial (pasa/no pasa)

Recuento total

n ero ac er as

E.coli/Coliformes

Hon os levaduras

Mide los cambios que producenlos microorganismos de un

cultivo que alteran las

Staph. Aureus

Ácido Lácticas

substratos cambiando suconductividad eléctrica y estovaría la impedancia



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SISTEMAS BASADOS EN CITOMETRIA DE FLUJO

•Fácil preparación de muestra

AES: Bactiflow


•Rápido

• a : yogures, c amp s, cremas,

refrescos, zumos de frutas

Marcaje de las células,detección una una y contaje

ecuen o o a

Enterobacterias

Hon os levaduras


Salmonella


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Sembradores en espiral y lectores automáticos de coloniasDe osición automática de lamuestra líquida en la superficiede un placa rotatoria de agar

•Estandarización

•Eliminación de diluciones


•

•Trazabilidad

Lectoresautomáticos de


colonias


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SISTEMA SimPlate: Biocontrol

. Fácil de leer· Consistente y reproducible

· Rápido· c e preparar· Menos interferencia· Amplio rango de conteo· Tecnolo ía innovadora

Placa de lástico circular de 84 oci llos

Recuento total

Coliformes/E.coli

Lectura por fluorescencia

El número de positivos se convierten enMohos y levaduras

Campylobacter

va ores



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SISTEMAS BASADOS EN ATP

•Económico

•Rápido

•

•Más utilizado en control de limpieza y desinfección

Mide niveles de ATP

Lo relaciona con niveles decontaminación



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Patógenos



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Métodos rápidos aplicados a la detección dePató enos

PROTOCOLOS CORTOSSalmonella:

•Pre-enriquecimiento y placa

•Manuales

•SESAME (BIOSER)

•IBISA AES•Medios cromogénicos o semisólidos

•Validaciones internacionales•SMS (AES)

•SALMONELLA PRECIS (OXOID)•Económicos

•RAPID SALMONELLA (BIORAD)

Listeria Monocytogenes:

•Salmonella•ALOA ONE DAY (AES)

•LISTERIA PRECIS (OXOID)•

•Listeria monocytogenes•RAPID LMONO (BIORAD)

•COMPASS LISTERIA (BIORAD)


•CHROMOID LMONO (BIOMEREIUX)


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SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA:


Mét d á id li d l d t ió d


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SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA

stema o er eux

•Salmonella•Equipo automatizado• s er a spp s er a

monocytogenes

•Cam lobacter s

•Tecnología ELFA(elisa+fluorescecia) einmunoconcentración

•E.coli O157:H7•Toxina Staph aureus

•Resultados en 16-24 horas•Validaciones internacionales

•Lectura automática, no calibración,no interpretación

•Procesado de muestras: 12-30simultáneamente cada 45 minutos




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SISTEMAS BASADOS EN ELISA

Sistema TECRA (Biotrace)

SalmonellaListeria spp

Campylobacter spp•Manual

•

- +

•Resultados : 1-2 días


•Posibilidad de realizarloautomáticamente con el UNIQUE


Métodos rápidos aplicados a la detección de


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Sistema TRANSIA

BiocontrolSalmonella

Listeria Monocytogenes

Listeria spp

• Automático

•Manejo de elevados volúmenes

•Procesado de muestras: 93muestras simultáneamente

•Resultados rápidos: 1-2 días





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Rapid test (Oxoid)atera ow

RayAl (Rayal Ltd)

Rapidcheck (Bioser) •Manual

• a mues ra un e porcapilaridad hacia la zona de Ac

•Lectura habitual or una líneade color





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SISTEMAS BASADOS EN PCR




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SISTEMAS BASADOS EN Real Time PCR (BAX System: Oxoid)

•Procotolos diferentes según

Salmonella spp

matriz


Listeria sppListeria Monocytogenes

• esu a os en - oras

•Sonda Sybr Green

Campylobacter

E.coli O157:H7

Mohos y levaduras

S.aureus




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SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Applied Biosystem):

•2 tipos de kits: Taqman y Microseq

•Validaciones internacionales Salmonella spp•Resultados en 20-28 horas Salmonella entérica

Listeria spp

Listeria Monocytogenes

E.coli O157:H7

•Cronobacter sakazakii

•E. coli O157:H7•Listeria monocytogenes

•Pseudomonas aeruginosa


•Staphylococcus aureus



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SISTEMAS BASADOS EN PCR (Adia food: AES)

•Termociclador: Stratagen

Salmonella spp

Listeria spp

•Resultados en 19-21 horas Listeria Monocytogenes

E.coli O157:H7

.




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SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (iQ-CHECK: Biorad)

•Sondas: Molecular Beacons

• , ,iQ 5 y miniOpticon.

•En algunos software de interpretación deresu a os

•Validación 16140

Salmonella spp

Listeria MonocytogenesListeria spp

Campylobacter


E.coli 0157:H7



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SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Assurance GDS:

•Salmonella

•Listeria spp•Listeria monocytogenes

•E.coli O157:h7

• ga ox n

•Combina concentración de muestray e ecc n e

•Termociclador:Assurance GDS

Rotor-Gene™.



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p pPató enos

SISTEMAS DE DETECCIÓN CON FAGOS

Salmonella

E.coli 0157:H7

•Detección rápida yautomática de patógenosmediante FAGOS li ada a

+fluorescencia.

• e ecc n r p a ymanual de patógenosmediante FAGOS (lateral


w


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Food & envt.

225 ml of BPW +

41.5 +/- 1 °C

supplement (green)

18-24 h

* *Except for poultry & egg products

VIDAS UP SalmonellaVIDAS UP Salmonella


48 min48 min


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Identificación



Métodos rápidos aplicados a la identificación de


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microor anismos

IDENTIFICACIÓN CON SISTEMAS MINIATURIZADOS

•Manual

•Diferentes formatos: galerías, tubos de plástico,

•API: bioMerieux

•

•BBL Crystal: BD

• ™




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microor anismos

SISTEMAS AUTOMÁTICOS DE IDENTIFICACIÓN

Fenotípica:

•BIOLOG: AES

•

•Resultados a partir de 4 horas

•Combinan reacciones enzimáticas ybioquímicas

Genotípica: •Secuenciación del


•MICROSEQ: ABI



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VITEK, API, BIOLOG, PHOENIXCLASIFICACIÓN FILOGENÉTICAFami ly Genus Species Subspecies Strain

DNA sequencing

MicroSeq 16S rDNA sequencing

ARDRA

Riboprinter Riboprinting

-

ITS-PCR

BioRad PFGE, LFRFA, RLFP

Multilocus Isozyme

Whole cell protein profiling

ABI AFLP

RAPD APPCR

Diversilab rep-PCR


ene c erences: ore ewer

Technique Discrimination: Low High



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una de las muestras

•13 muestras en 4 horas

1. Extracción de ADN: Extracción de ADN a partir de cultivos aislados.2. Amplif icación mediante rep-PCR: Amplificación de muestras con la técnica rep-PCR y loscorrespondientes kits de identificación genética DiversiLab (DiversiLab DNA Fingerprinting kits).3. Detección: Separación de fragmentos mediante electroforesis de microfluidos en chip (DNALabChi Kits .


4. Análisis de datos: Análisis de los datos en tiempo real, con informes a los que se puede

acceder a través de un sitio web individual y seguro.

Métodos rápidos aplicados a la


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p p

ESPECTROMETRÍA DE MASAS

• Técnica analítica para determinar la composición elemental deuna muestra

• El principio de MS consiste en la ionización de compuestosquímicos para generar moléculas cargadas y medir su relaciónmasa/carga (m/r)

• - a r x ss s e aser esorp on on sa on -Time of Flight), es un tipo de espectrometría de masas quepermite el screening de proteínas directamente a partir debacterias intactasInlet SystemIonization SystemMass Analyzer Ion Detector

Sample

Data

Analysis


Under VacuumSystem

• Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time


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Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time .

the Mass Analyzer system.

2

3

Una muestra en una solución matriz absorbe energía de un haz láser. El resultados

es una ionización de la muestra.

1

Todos los iones son acelerados a la misma energía cinética, entran en el tubo yson separados de acuerdo con su masa

2




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p p


Spec[ BP=3

3 7 7 5

1648.1

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

n t e n s i t y

7 0 7 5

8 0 7 4

8 7 4 4

1 0 9 3 9

9 4 5 3

9 9 9 4

7 9 8 0

1 0 3 4 7

5 0 1 5

7 8 6 3

1 1 5 7 2

7 0 9 2

5 9 3 1

9 6 5 4

3 5 8 1

6 8 3 7

9 3 3 0

3 6 7

1 0 2 2 6

4 5 0

6 0 8

1 9 0 6


3000 5000 7000 9000 11000 13000

Mass (m/z)

0

10 1 1



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p p


Fungi, yeast and mycobacteria:

On-target extraction

addition of 1.0 µL matrix solution

rec solvent evaporationat room temperature

Target slide

No selección previa de la colonia

automated

minutos




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•VITEK MS RUO:

•Maldi Biotyper: Bruker

Po w er Io n is in g Vacu u m Neg at ivePo w er Io n is in g Vacu u m Neg at ivePo w er Io n is in g Vacu u m Neg at ive



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GRACIAS POR

SU ATENCIÓN

Ana María Fuertes Barrio

ana maria fuertes@biomerieux com


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