ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอ 3 วธกบพช 4 ชนด Comparison of three different DNA extraction methods in four kinds of plant

โดย

นายอดศกด นดกระโทก

ควบคมและอนมตโดย

............................................. วนท ............ เดอน ........................ พ.ศ. ................ ( รศ. ดร. สนธชย จนทรเปรม )

การเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอ 3 วธกบพช 4 ชนด

นายอดศกด นดกระโทก

บทคดยอ ปจจบนไดมการน าเทคนคระดบโมเลกล (molecular techniques) มาใชประโยชนกบพชในหลาย ๆ ดาน เชน การปรบปรงพนธ การคดแยกสายพนธ เปนตน การใชเทคนคเหลานสวนใหญตองเกยวของกบดเอนเอ ซงวธการสกดดเอนเอมหลายวธ มความเหมาะสมตอพชแตละชนดแตกตางกน ดงนนในการศกษาวจยในครงน จงไดท าการเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอจากพช เพอใหไดดเอนเอทมคณภาพดทสด สามารถน าไปใชไดกบเทคนคระดบโมเลกล โดยศกษาเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอ 3 วธ คอ 1.วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย 2.วธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) 3.วธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) โดยสกดดเอนเอในพช 4 ชนดคอ เจตมลเพลงขาว, ออย, เจตมลเพลงแดง และสบด า จากนนน าดเอนเอทไดมาทดสอบคณภาพ โดยการวดคาการดดกลนแสง และการเพมปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอรสม (random primer) ผลปรากฏวาในเจตมลเพลงขาวใชวธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) ไดดเอนเอทมคณภาพดทสด โดยคา OD260/OD280=1.809 ความเขมขนของ ดเอนเอเทากบ 0.513 ไมโครกรมตอไมโครลตร การเพมปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอร H-13 ไดแถบ ดเอนเอ 2 แถบ ออยใชวธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) ไดดเอนเอทมคณภาพดทสด โดยคา OD260/OD280=1.899 ความเขมขนของดเอนเอเทากบ 0.181 ไมโครกรมตอไมโครลตร การเพมปรมาณ ดเอนเอดวยไพรเมอร G-13 ไดแถบดเอนเอ 3 แถบ, H-18 ไดแถบดเอนเอ 8 แถบ, K-16 ไดแถบดเอนเอ 1 แถบ, H-13 ไดแถบดเอนเอ 4 แถบ เจตมลเพลงแดงใชวธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) ไดดเอนเอทมคณภาพดทสด โดยคา OD260/OD280=1.781 ความเขมขนของดเอนเอเทากบ 0.255 ไมโครกรมตอไมโครลตร การเพมปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอร H-18 ไดแถบดเอนเอ 2 แถบ สบด าใชวธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) ไดดเอนเอทมคณภาพดทสด โดยคา OD260/OD280=2.054 ความเขมขนของดเอนเอเทากบ 2.455 ไมโครกรมตอไมโครลตร การเพมปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอร H-13 ไดแถบดเอนเอ 5 แถบ ค าส าคญ : การสกดดเอนเอ, เจตมลเพลงขาว, ออย, เจตมลเพลงแดง, สบด า ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : รศ. ดร. สนธชย จนทรเปรม ปทพมพ : 2550 จ านวนหนา : 27

Comparison of three different DNA extraction methods in four kinds of plant

Mr.Adisak Nadkratoke

Abstract At present, molecular techniques are applied to many area in plant science such as plant improvement, varietal identification etc. DNA of plant always be the material used for such application. There are several DNA extraction methods that are suitable for different kinds of plant. The objective of this study was to determine the suitable DNA extraction method for four plant species. Those methods were simple method of plant DNA extraction, modified method of Agrawal et al. (1992) and modified method of Dellaporta et al. (1983). Four plant species were Plumbago zeylanica L., Saccharum officinarum L., Plumbago indica L., Jatropha curcas L. The extracted DNA was subjected to quality and quantity evaluation using spectrophotometry, DNA amplification using random primers. It was found that DNA of P. zeylanica L. extracted by modified method of Agrawal et al. showed the best quality with OD260/OD280 = 1.809 and concentration of 0.513 µg/µl. The DNA was amplified with H-13 primer. In S. officinarum L., DNA extracted using modified method of Dellaporta et al. showed the best quality with OD260/OD280 = 1.899, concentration of 0.181 µg/µl. The DNA could be amplified with G-13, H-18, K-16 and H-13 primers. In P. indica L., DNA extracted using modified method of Agrawal et al. showed the best quality with OD260/OD280 = 1.781, concentration of 0.255 µg/µl. The DNA could be amplified with H-18 primer. For J. curcas L., DNA extracted using modified method of Dellaporta et al. showed the best quality with OD260/OD280 = 2.054, concentration of 2.455 µg/µl. The DNA could be amplified with H-13 primer. Key word : DNA extraction, Plumbago zeylanica L., Saccharum officinarum L., Plumbago indica L., Jatropha curcas L. Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture Kamphaeng Saen, Kasetsart University Advisor : Assoc. Prof. Sontichai Chunprame, Ph.D. Year : 2007 Pages : 27

ค านยม

ปญหาพเศษเลมนส าเรจไดขอกราบขอบพระคณความชวยเหลอของ รศ. ดร. สนธชย จนทรเปรม อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ ทใหค าแนะน าตลอดระยะเวลาทท าปญหาพเศษ และยงไดกรณาตรวจแกไขปญหาพเศษจนเสรจสมบรณ และขอขอบคณพๆหองปฏบตการ A-207 ศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทใหค าแนะน าในการใชเครองมอและเทคนคตางๆ รวมถงการเตรยมสารเคมในการทดลอง ขอกราบขอบพระคณอาจารยทกทานทไดประสทธประสาทวชาจนประสบความส าเรจในการศกษา อดศกด นดกระโทก กมภาพนธ 2551

สารบญ

หนา สารบญ I สารบญตาราง II สารบญภาพ III ค าน า 1 ตรวจเอกสาร 3 อปกรณและวธการ 10 ผลการทดลอง 15 วจารณผลการทดลอง 21 สรปผลการทดลอง 22 เอกสารอางอง 23 ภาคผนวก 25

I

สารบญตาราง ตารางท หนา 1 คา OD260/OD280 และความเขมขนของดเอนเอทไดจากการสกด 17 ดวยวธตางๆ ในการวดคาดดกลนแสง 2 จ านวนแถบดเอนเอทเพมไดในแตละไพรเมอร 20

II

สารบญภาพ

ภาพท หนา 1 อเลกโตรโฟรซสของดเอนเอทไดจากการสกดดวยวธตางๆ 17 ใน 0.8% อะกาโรสเจลและยอมดวยเอธเดยมโบรไมด 2 แถบดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยไพรเมอร G-13 18 3 แถบดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยไพรเมอร H-18 18 4 แถบดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยไพรเมอร K-16 19 5 แถบดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยไพรเมอร H-13 19

III

การเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอ 3 วธกบพช 4 ชนด Comparison of three different DNA extraction methods in four kinds of plant

ค าน า

ปจจบนสภาพภมอากาศของโลกเปลยนแปลงอยางรวดเรว ท าใหพชไมสามารถปรบตวไดทน โดยเฉพาะพชปลกทมความส าคญทางเศรษฐกจ เกดปญหาในหลาย ๆ ดาน เชน ความตานทานตอโรคและแมลงลดลง ผลผลตลดลง จงจ าเปนตองหาสายพนธใหมมาทดแทน ซงการปรบปรงพนธพชดวยวธดงเดม (conventional plant breeding) ตองใชระยะเวลานานมากกวาจะไดพนธใหม ยกตวอยางเชน ออยพนธสพรรณบร 80 เปนพนธทใหผลผลตด ความตานทานโรคและแมลงด ศนยวจยพชไรสพรรณบร ท าการปรบปรงพนธออย โดยผสมขามระหวางพนธแม 85-2-352 กบพนธพอ K84-200 ตองใชระยะเวลาในการปรบปรงพนธนานกวา 11 ป เปนเวลาทนานมากเกนไป ปจจบนมการน าเทคนคระดบโมเลกล (molecular techniques) มาใชประโยชนในการปรบปรงพนธ เชน เทคนค AFLP, SSR เปนตน ท าใหใชระยะเวลาในการปรบปรงพนธลดลง การใชเทคนคเหลานสวนใหญตองเกยวของกบดเอนเอ ซงวธการสกดดเอนเอมหลายวธ มความเหมาะสมตอพชแตละชนดแตกตางกน ดงนนในการศกษาวจยในครงน จงไดท าการเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอจากพช เพอใหไดดเอนเอทมคณภาพดทสด สามารถน าไปใชไดกบเทคนคระดบโมเลกล โดยศกษาเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอ 3 วธ คอ 1.วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย 2.วธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) (Aldrich and Cullis, 1999 ; Li and Zhao, 1996) 3.วธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) (Clark, 1997) โดยสกด ดเอนเอในพช 4 ชนดคอ เจตมลเพลงขาว, ออย, เจตมลเพลงแดง และสบด า จากนนน าดเอนเอทไดมาทดสอบคณภาพ โดยการวดคาการดดกลนแสง และการเพมปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอรสม

1

วตถประสงค

เพอเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอพช 3 วธคอ 1. วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย 2. วธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) 3. วธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) โดยสกดจากพช 4 ชนดคอ เจตมลเพลงขาว, ออย, เจตมลเพลงแดงและสบด า

สถานทท าการทดลอง หองปฏบตการเทคนคระดบโมเลกล A-207 ศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม ระยะเวลาท าการทดลอง เรมท าการทดลองเดอนสงหาคม 2550 และสนสดการทดลองเดอนตลาคม 2550

2

ตรวจเอกสาร

ลกษณะทางพฤกษศาสตรของพช เจตมลเพลงขาว อาณาจกร Plantae สวน Magnoliophyta ชน Magnoliopsida อนดบ Plumbaginales วงศ Plumbaginaceae สกล Plumbago สปชส Plumbago zeylanica L. เจตมลเพลงขาวเปนไมพมเตยอายหลายป สง 1-3 เมตร กงกานมกทอดยาว ใบรปไข ยาว 3-13 เซนตเมตร ปลายใบแหลมยาว ตอนปลายเปนตง โคนใบรปลมหรอมน ใบบาง ชอดอกแบบชอกระจะเชงลด ดอกจ านวนมาก แกนกลางและกานชอดอกมตอมไรกาน (เจตมลเพลงแดงไมม) ชอดอกยาวไดประมาณ 15 เซนตเมตร กานชอยาว 1.5-2 เซนตเมตร ใบประดบรปไข ยาว 0.4-0.8 เซนตเมตร ใบประดบยอยรปแถบ ยาวประมาณ 0.2 เซนตเมตร กลบเลยง 5 กลบ ยาวประมาณ 1 เซนตเมตร มตอมหนาแนน กลบดอกสขาวหรอสฟาออน หลอดกลบดอกยาวประมาณ 2 เซนตเมตร กลบดอกรปไขกลบหรอรปขอบขนานแกมรปใบหอก ยาวประมาณ 0.7 เซนตเมตร ปลายแหลมหรอเปนตง อบเรณสน าเงน ยาวประมาณ 0.2 เซนตเมตร รงไขรปร เปน 5 เหลยม กานเกสรเพศเมยเกลยง ผลแบบแคปซล เจตมลเพลงขาวมเขตการกระจายพนธกวางในเขตรอน ในไทยสวนใหญพบทางภาคเหนอ ภาคตะวนออกและภาคตะวนตก ขนตามปาดบแลง (เจรญ, 2533) เจตมลเพลงขาวสามารถใชรกษาโรคผวหนงและผนคนได โดยน ารากมาปนใหละเอยดผสมน ามนพชเลกนอยทาบรเวณทเปน (พเยาว, 2532)

3

เจตมลเพลงแดง อาณาจกร Plantae สวน Magnoliophyta ชน Magnoliopsida อนดบ Plumbaginales วงศ Plumbaginaceae สกล Plumbago สปชส Plumbago indica L. เจตมลเพลงแดงเปนไมพมอายหลายป สง 0.5-2 เมตร กงกานมกทอดยาว ใบเดยว เรยงสลบ รปรแกมรปไข ยาว 3-13 เซนตเมตร โคนใบมนหรอกลม ปลายใบแหลม ใบบาง ดอกออกเปนชอแบบชอกระจะเชงลด ยาว 20-90 เซนตเมตร กานชอดอกยาว 1-3 เซนตเมตร มดอกจ านวนมาก ใบประดบและใบประดบยอยรปไขขนาดเลก ยาว 0.2-0.3 เซนตเมตร กลบเลยง 5 กลบ รปใบหอก ยาว 0.8-0.9 เซนตเมตร มตอมทวไป ดอกสแดงหรอมวง หลอดกลบดอกยาว 2-2.5 เซนตเมตร ปลายแยกเปน 5 แฉก รปไขกลบ ยาวประมาณ 2 เซนตเมตร ปลายกลบกลม เปนตงหนามตอนปลาย เกสรเพศผ 5 อน ตดตรงขามกลบดอก อบเรณยาวประมาณ 0.2 เซนตเมตร รงไขรปร กานเกสรเพศเมยมหลายขนาด มขนยาวทโคน เจตมลเพลงแดงมเขตการกระจายพนธกวางในเขตรอน ในประเทศไทยพบกระจายหางๆ เกอบทกภาค ขนตามปาดบแลง (เจรญ, 2533) เจตมลเพลงแดงสามารถใชเปนยาเจรญอาหารได โดยน ารากมาผสมกบผลสมอพเภก,ดปล,ขง อยางละเทา ๆ กน รบประทานกบน ารอนครงละ 2.5 กรมหรอประมาณ 1 ชอนแกง นอกจากนยงเปนยาขบประจ าเดอน โดยใชรากแหงตมกบน า 2 ถวยแกว รบประทานครงละครงถวยแกว (พเยาว, 2532) ออย อาณาจกร Plantae ชน Monocotyledones อนดบ Glumaceae วงศ Gramineae กลม Andropogoneae สกล Saccharum

4

สปชส Saccharum officinarum L. (กรมวชาการเกษตร, 2523) ออยเปนพชใบเลยงเดยว จดอยในวงศหญา พนธทใชปลกในปจจบนเกดจากการผสมขาม ระหวางพนธปลกกบพนธทเปนเครอญาตกน ออยสามารถขยายพนธแบบไมอาศยเพศโดยใชสวนของล าตน ล าตนออยม 2 สวน ไดแกสวนทอยใตดนและเหนอดน สวนทอยใตดนเรยกวาตอหรอเงา สวนทอยเหนอดนมความส าคญทางเศรษฐกจเพราะเปนแหลงสะสมน าตาล ซงในสวนนมตาขางทสามารถเจรญไปเปนล าตนใหมได ใบเกดเรยงสลบกนบนล าตนเหนอดน ตดกบขอของล าตนตรงสวนของฐานใบ ชอดอกออยเรยกวา Arrow หรอ tassel เปนแบบ panicle เกดทปลายยอดของล าตน ลกษณะชอดอกมแกนกลาง กานแขนงแรกแตกจากแกนกลาง และกานแขนงทสองแตกออกจากกานแขนงแรก กานแขนงทสองนเปนต าแหนงของกลมดอกยอย (spikelet) ทเกดเปนค ประกอบดวยกลมดอกมกาน และกลมดอกไมมกาน ขณะทกลมดอกบานเตมทฐานของกลมดอกจะมขนยาวสขาว ภายในกลมดอกทงสองแบบประกอบไปดวยดอกยอย 2 ดอก อบเกสรจะแตกออกมละอองเกสรตวผสเหลอง (ประเสรฐ, 2547) ออยเปนพชเศรษฐกจทส าคญ โดยในปพ.ศ. 2544 ประเทศไทยสามารถสงออกน าตาลและผลตภณฑจากน าตาล คดเปนมลคา 35,446 ลานบาท สวนใหญสงออกในรปของน าตาลดบ น าตาลทราย กากน าตาลดบและผลตภณฑน าตาลอนๆโดยมมลคา 20,098 10,949 2,684 และ 2,170 ลานบาท ตามล าดบ ในปเพาะปลก 2544/45 มพนทปลกออยรวม 6.320 ลานไร โดยเปนพนทปลกในภาคกลาง ภาคเหนอ ภาคตะวนออก ภาคตะวนออกเฉยงเหนอ เทากบ 2.058 1.371 0.388 และ 2.501 ลานไร คดเปนรอยละ 32.6 21.7 และ 39.6 ตามล าดบ ใหผลผลตเฉลย 9.6 9.0 9.1 และ 9.6 ตนตอไร ตามล าดบ (ประเสรฐ, 2547) สบด า อาณาจกร Plantae สวน Embryophyta ชน Spermatopsida อนดบ Malpighiales วงศ Euphorbiaceae สกล Jatropha สปชส Jatropha curcas L.

5

สบด าเปนพชน ามนชนดหนง โดยสกดน ามนจากเมลดสบด าใชทดแทนน ามนดเซล เปนพชพนเมองของทวปอเมรกาใต ชาวโปรตเกสน าเขามาปลกในประเทศไทย ในชวงปลายสมยกรงศรอยธยา เปนไมพมยนตนขนาดกลาง ความสง 2-7 เมตร อายยนไมนอยกวา 20 ป ล าตนและยอดคลายละหง แตไมมขน อยในวงศไมยางพารา เมอหกล าตน สวนยอดหรอสวนกานใบจะมยางสขาวขนคลายน านมไหลออกมา มกลนเหมนเขยว ออกดอกเปนชอกระจกทขอสวนปลายของยอด ขนาดดอกเลกสเหลองมกลน หอมออนๆ มดอกตวผจ านวนมากและดอกตวเมยจ านวนนอยอยบนตนเดยวกน ผลและเมลดมสาร hydrocyanic เมลดสบด ามสารพษเรยกวา CURCIN หากบรโภคแลวท าใหเกดอาการทองเดนเหมอนสลอด เมอตดผลแลวมสเขยวออนเกลยงเกลาเปนชอพวงมหลายผล เวลาสกแกจดมสเหลองคลายลกจนทร รปผลมลกษณะทรงกลมขนาดปานกลาง เปลอกหนาปานกลาง ผลหนงสวนมากม 3 พ โดยแตละพท าหนาทหอหมเมลดไว เมลดสด าขนาดเลกกวาเมลดละหงพนธลายขาวด าเลกนอย สตรงปลายเมลดมจดสขาวเลกๆ ตดอย เมอเกบไวนานจดนจะหดตวเหยวแหงลงขนาดของเมลดเฉลย ความยาว 1.7-1.9 เซนตเมตร หนา 0.8-0.9 เซนตเมตร น าหนก 100 เมลดประมาณ 69.8 กรม เมอแกะเปลอกนอกสด าออกจะเหนเนอในสขาว ตนสบด าเปนสมนไพรรกษาโรคไดหลายโรค เชน ใชน ายางใสปายรมฝปากรกษาโรคปากนกกระจอก รกษาแผลในปาก แกอาการปวดฟน น ามาผสมกบน านมมารดาปายลนขาวในเดกกหาย หยอดตาแดงหายไดเชนกน หรอผสมกบน าเจอจางเปนยาระบาย สวนล าตนน ามาผาสบเปนทอนแชน าอาบแกโรคซางในเดก แกโรคคนได เอาใบสบด าหอขาวสกแลวหมกขเถาใหเดกกนแกตาแฉะ หรอน ามาหออฐรอนนาบทองในหญงคลอดบตรอยไฟสมยกอน รวมทงประชาชนบางประเทศใชน ามน สบด าใสผมดวย (ช านาญ และคณะ, 2549 ; ทวศกด, 2548 ; ระพพนธ และ สขสนต, 2525) การสกดดเอนเอพชและการตรวจสอบคณภาพดเอนเอ วธการสกดดเอนเอมหลายวธ แตละวธมความเหมาะสมกบเนอเยอหรอเซลลแตละชนดและงานทตองน าไปใช คอตองการดเอนเอมากนอยเพยงใด และมความบรสทธเพยงใด เชนในการโคลนยนหรอวเคราะหดเอนเอดวยวธ Southern hybridization ตองการดเอนเอทมขนาดโมเลกลใหญ แตกหกนอย และตองบรสทธพอสมควร การสกดดเอนเอพชนยมสกดดเอนเอจากยอดออนหรอตนออน เพราะมเสนใยนอย ท าใหเซลลแตกและปลดปลอยดเอนเอออกมางายกวา (สรนทร, 2545) การตรวจสอบคณภาพและวดปรมาณดเอนเอ การตรวจสอบคณภาพและวดปรมาณดเอนเอท าไดพรอมๆ กน วธทใชโดยทวไปไดแก การวดคาการดดกลนแสงอลตราไวโอเลตโดยใช spectrophotometer การวดการเรองแสงของดเอนเอทจบกบ

6

เอธเดยมโบรไมดหลงจากแยกขนาดดเอนเอโดยวธอเลกโตรโฟรซส และการเพมปรมาณดเอนเอโดยใชไพรเมอรสม (สรนทร, 2545) วธวดการดดกลนแสง เนองจากเบสทเปนองคประกอบของกรดนวคลอกสามารถดดกลนแสงไดสงสดทความยาวคลนประมาณ 260 นาโนเมตร (สวนโปรตนจะดดแสงไดดทสดทความยาวคลนประมาณ 280 นาโนเมตร) ดงนนจงใชหาปรมาณของกรดนวคลอกได โดยสารละลายดเอนเอเขมขน 50 ไมโครกรมตอมลลลตรสามารถดดแสงไดคา absorbance ท 260 นาโนเมตร (A260 หรอ OD260) เทากบ 1 สวนสารละลายอารเอนเอหรอโอลโกนวคลโอไทปทดดแสงได OD260 = 1 มความเขมขน 40 และ 33 ไมโครกรมตอมลลลตรตามล าดบ การวดปรมาณดเอนเอโดยวธนจะใชไดดในกรณทสารละลายดเอนเอคอนขางบรสทธ ไมมอารเอนเอและโอลโกนวคลโอไทปเจอปน และตองมปรมาณมากพอทจะอานคา OD ได ซงอยในระดบไมโครกรม ปรมาณทวดไดโดยวธนจะแนนอนและยงตรวจสอบคณภาพไดดวย โดยเปรยบเทยบคา OD260 และ OD280 สารละลายดเอนเอทบรสทธจะมคาอตราสวนระหวาง OD260/OD280 ประมาณ 1.8 ถาไดคามากกวาแสดงวามอารเอนเอปน และถาคาต ากวาแสดงวามการปนเปอนของโปรตนหรอฟนอล (สรนทร, 2545) วธวดการเรองแสงรวมกบเอธเดยมโบรไมด โดยน าดเอนเอทเตรยมไดมาท าอเลกโตรโฟรซสในอะกาโรสเจล แลวยอมดวยเอธเดยมโบรไมด โมเลกลของเอธเดยมโบรไมดจะเขาไปแทรกอยในเกลยวคของดเอนเอ และเมอน าไปสองแสงอลตราไวโอเลตจะเกดการเรองแสง โดยความเขมของแสงเปนสดสวนโดยตรงกบปรมาณดเอนเอ เมอเปรยบเทยบกบดเอนเอมาตรฐานททราบปรมาณแลว จะสามารถบอกปรมาณดเอนเอตวอยางโดยประมาณได โดยปรมาณทตรวจสอบไดเปนระดบนาโนกรม ดงนนกรณทปรมาณดเอนเอมนอยไมสามารถวดคาดดกลนแสงไดจะใชวธน นอกจากนการแยกขนาดดเอนเอดวยวธอเลกโทรโฟรซสยงสามารถบอกคณภาพของดเอนเอไดดวยวามการปนเปอนจากอารเอนเอ ซงจะเหนเปนปนเคลอนทไปเรวกวาดเอนเอ และดเอนเอทไดมขนาดโมเลกลใหญขนาดไหน มการแตกหกของโมเลกลมากเพยงใด วธปฏบตท าโดยหยดดเอนเอทเตรยมไดปรมาณแนนอนลงในแผนอะกาโรสเจลเขมขน 0.8% ท าอเลกโตรโฟรซสเทยบกบดเอนเอมาตรฐานททราบขนาดและปรมาณหลายๆ ความเขมขน เมอสนสดการท า อเลกโตรโฟรซสแลวจงยอมดวยเอธเดยมโบรไมดเขมขน 0.5 ไมโครกรมตอมลลลตร น าไปสองผาน

7

ดวยแสงอลตราไวโอเลต และเปรยบเทยบการเรองแสงของแถบดเอนเอกบดเอนเอมาตรฐาน (สรนทร, 2545 ; Beckmann and Thomas, 1992 ; Walker, 1984) วธการเพมปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอรสม (random primer) เปนวธการตรวจสอบคณภาพดเอนเออกวธทสามารถตรวจสอบไดอยางมประสทธภาพ โดยใชไพรเมอรสมเพมปรมาณดเอนเอในปฏกรยาพซอาร ใชไพรเมอรขนาด 10 นวคลโอไทด ซงจะเขาไปจบกบดเอนเอเปาหมายในบรเวณทมเบสเปนคสมกน โดยไมจ าเปนตองทราบวาไพรเมอรจะเขาไปจบกบ ดเอนเอสวนใด โอกาสทจะพบล าดบเบสทเปนคสมกบไพรเมอรคอ 1 ใน 410 โดยประมาณ การเกดแถบดเอนเอเปนผลมาจากไพรเมอรเขาไปเกาะไดหลายบรเวณ ถาไพรเมอรไปเกาะกบดเอนเอ 2 บรเวณทไมไกลกนมาก โดยเกาะกบดเอนเอคนละสายในทศทางเขาหากน (5’3’) จะสามารถเพมปรมาณดเอนเอในชวงดงกลาวได แตถาดเอนมการแตกหกมาก ขนาดของดเอนเอมขนาดเลกเกนไป จะท าใหโอกาสทจะเพมปรมาณดเอนเอไดกจะนอยลง รวมถงถาดเอนเอมการปนเปอนสารตางๆ เชน โปรตน ฟนอล เปนตน ซงสารเหลานจะมผลตอการท างานของเอนไซมในปฏกรยาพซอาร ท าใหเพมปรมาณดเอนเอไดนอย หรอไมสามารถเพมปรมาณดเอนเอได (พรพนธ, 2538 ; สรนทร, 2545 ; Ausubel et al., 1999) การวเคราะหคณภาพดเอนเอใชหลกดงน ถาดเอนเอของพชชนดเดยวกน ไพรเมอรทใชชนดเดยวกน ท าปฏกรยาพรอมกน ดเอนเอจากการสกดวธใด เพมปรมาณไดจ านวนแถบดเอนเอมากกวา แสดงวาดเอนเอจากการสกดวธนนมคณภาพดกวา และถาดเอนเอจากพชเดยวกน ท าปฏกรยาพรอมกน ดเอนเอจากการสกดวธใด ไดจ านวนชนดของไพรเมอรทใหแถบดเอนเอมากกวา แสดงวาดเอนเอมคณภาพดกวา มรายงานการศกษาเปรยบเทยบการสกดดเอนดวยวธตางๆ เชน จรพนธ (2545) ท าการเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอจากใบออนมะตม (Aegle marmelos Corr.) ดวยวธการสกดดเอนเอ 4 วธการ คอ (1) วธการสกดดเอนเอของสรนทร (2) Agrawal และคณะ (1992) (3) Warner และ (4) Dellaporta และคณะ (1983) พบวา การสกดดเอนเอโดยวธการของสรนทรใหปรมาณจโนมกดเอนเอสงสด (360 ไมโครกรมตอมลลลตร) และมความบรสทธสงปราศจากการปนเปอนจากอารเอนเอ โปรตนและโพลแซคคารไรด โดยพจารณาจากคาอตราสวนเฉลยระหวาง OD260/OD280 มคาเทากบ 1.71 และคา OD230 เทากบ 0.093 รวมทงจากการตรวจสอบโดยการท าเจลอเลกโตรโฟรซส พบวาใหแถบ ดเอนเอทคมชดทสดดวย

8

เอกพจน (2546) ท าการศกษาเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอในพชวงศขง 5 ชนด จาก 2 วธคอ วธการสกดดเอนเอโดยวธ CTAB และวธการสกดดเอนเอโดยใช plant extraction buffer พบวาวธการสกดดเอนเอโดยใช plant extraction buffer ใหปรมาณความเขมขนของดเอนเอมากกวา และคณภาพทดกวาการสกดดเอนเอโดยการใช CTAB

9

อปกรณและวธการ

อปกรณ 1. ใบยอดของเจตมลเพลงขาว, ออย, เจตมลเพลงแดง และสบด า 2. อปกรณในการเตรยมสารเคม ไดแก เครองชง, หมอนงฆาเชอ, บกเกอร ฯลฯ 3. อปกรณในการสกดดเอนเอ ไดแก โกรงบดเนอเยอพช, หลอดไมโครเซนทรฟลส, เครองปนเหวยง, กรวยแกวและส าล, ไมโครปเปต 4. อปกรณในการเพมปรมาณและตรวจสอบดเอนเอ ไดแก เครองพซอาร, เครองแยกขนาดดเอนเอดวยไฟฟา, เครองวดคาการดดกลนแสง สารเคม 1. อะกาโรสเจล 2. sodium citrate 3. NaCl 4. SDS 5. EDTA 6. CTAB 7. PVP 8. Tris-HCl, pH 8.0 9. ß-mercabtoethanol 10. สารละลาย phenol : chloroform : isoamyl-alcohol (25:24:1) 11. สารละลาย chloroform : isoamyl-alcohol (24:1) 12. NaOAc (sodium acetate) 13. isopropanol 14. ไนโตรเจนเหลว 15. potasium acetate 16. PCR buffer 17. MgCl2 18. dNTP

10

19. Taq polymerase วธการ การทดลองท 1 การสกดดเอนเอพช น าใบออนของ เจตมลเพลงขาว, ออย, เจตมลเพลงแดง และสบด า มาสกดดเอนเอดวยวธการสกดดเอนเอ 3 วธดงน 1.วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย Extraction buffer 0.15M NaCl 0.15M Sodium citrate 5% SDS 0.001M EDTA วธการสกด 1. น าใบพชมาหนเปนชนเลกๆ 2. ชงใบพช 1 กรมใสในโกรง จากนนเตม extraction buffer ปรมาณ 5 มลลลตร ใสในโกรง บดใหละเอยด 3. เทใสในบกเกอร แลวน าไปอนในน าอนทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท 4. กรองสารละลายในกรวยแกวผานส าล แลวน าไปปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท 10 นาท 5. น าสารละลายใสมาเตม isopropanol ปรมาณ 5 มลลลตร ผสมใหเขากนโดยการกลบหลอดไปมา 5-6 ครง จากนนน าไปปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท 10 นาท 6. ดดสารละลายใสทง น าตะกอนทไดมาลางดวย 70% ethanol 500 ไมโครลตร 7. ตากตะกอนไวทอณหภมหอง 1 ชวโมง 8. ละลายตะกอนดเอนเอใน TE buffer 50 ไมโครลตร ทผสม 1 ไมโครลตร ของ RNase ความเขมขน 5 มลลกรมตอมลลลตร แลวบมท 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง

11

2.วธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) Extraction buffer 2% CTAB 2% PVP 1.4M NaCl 20 mM EDTA pH 8.0 100 mM Tris-HCl pH 8.0 0.2% (V/V) ß-mercabtoethanol (เตมกอนใช) วธการสกด 1. อนสารละลาย extraction buffer ในน าอนท 65 องศาเซลเซยส 2. บดพช 1 กรม ในไนโตรเจนเหลวจนละเอยด จากนนตกใสหลอด เตม extraction buffer 700 ไมโครลตร เขยาแรงๆ จากนนน าไปบมในน าอนทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง 3. เตมสารละลาย phenol : chloroform : isoamyl-alcohol (25:24:1) 700 ไมโครลตร 4. น าไปปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท 15 นาท 5. เทสารละลายใสดานบนใสหลอดใหม จากนนเตม RNase 20 ไมโครกรมตอมลลลตร ของสารละลายทมในหลอด น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท 6. ท าซ าในขอ 3 และขอ 4 7. น าสารละลายใสมาเตม chloroform : isoamyl-alcohol (24:1) ในปรมาณเทากบสารละลายทมในหลอด 8. น าไปปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท 15 นาท 9. น าสารละลายใสมาเตม NaOAc (0.3M stock pH 5.2) ปรมาตร 1/10 ของสารละลายทมในหลอด และ isopropanol ปรมาตร 6/10 ของสารละลายทมในหลอด จากนนหยดปฏกรยาท -20 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง 10. น าไปปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท 10 นาท จากนนลางตะกอนดวย 70% ethanol 11. ละลายตะกอนดเอนเอใน TE buffer 30 ไมโครลตร

12

3.วธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) Extraction buffer 50 mM Tris-HCl pH 8.0 10 mM EDTA 100 mM NaCl 1% SDS 10 mM ß-mercabtoethanol (เตมกอนใช) วธการสกด 1. หนพชใหละเอยด 1 กรมใสในหลอดไมโครเซนทรฟลส 2. เตม extraction buffer 200 ไมโครลตร บดดวยแทงแกวใหละเอยด 3. เตม extraction buffer ลงไปอก 400 ไมโครลตร แลว vortex 5 นาท น าไปบมทอณหภม 65องศาเซลเซยส นาน 10 นาท 4. เตม 5M potasium acetate 250 ไมโครลตร แลว vortex 5 นาท จากนนน าไปบมในน าแขง 20 นาท 5. น าไปปนเหวยงท 4 องศาเซลเซยส 12,000 รอบตอนาท นาน 10 นาท 6. ดดสารละลายใสดานบนใสหลอดใหม จากนนเตม isopropanol 850 ไมโครลตร กลบหลอดไปมา 5-6 ครง จากนนปนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท นาน 1 นาท 7. ดดสารละลายใสทง น าตะกอนทไดมาลางดวย 70% ethanol 500 ไมโครลตร 8. ตากตะกอนไวทอณหภมหอง 1 ชวโมง 9. ละลายตะกอนดเอนเอใน TE buffer 50 ไมโครลตร ทผสม 1 ไมโครลตร ของ RNase ความเขมขน 5 ไมโครกรมตอมลลลตร แลวบมท 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง การทดลองท 2 การตรวจสอบคณภาพของดเอนเอ 1. การตรวจสอบคณภาพดเอนเอเบองตนดวยวธการวดการเรองแสงของเอธเดยมโบรไมด น าดเอนเอพช 4 ชนดจากการสกดดเอนเอทง 3 วธ ตวอยางละ 1 ไมโครลตร มาตรวจสอบคณภาพดวย อเลกโตรโฟรซส บน 0.8% อะกาโรสเจล จากนนยอมเจลดวยเอธเดยมโบรไมด แลวถายภาพภายใตแสง uv

13

2. ตรวจสอบคณภาพและปรมาณดเอนเอดวยการวดคาการดดกลนแสง

น าดเอนเอมาตรวจสอบคณภาพและปรมาณดวยการวดคาการดดกลนแสง ทความยาวคลน 260 และ 280 นาโนเมตรดวยเครอง spectrophotometer (WPA-biowave รน Diade Array spectrophotometer) จากนนวเคราะหคา OD260/OD280 และปรมาณดเอนเอ 3. ตรวจสอบคณภาพโดยการเพมปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอรสม (random primer) น าดเอนมาเพมปรมาณดวยไพรเมอรสม 4 ชนด คอ G-13, H-18, K-16, H-13 โดยใชปรมาณสารเคมดงน(ตอ 1 ปฏกรยา) DNA template 30 นาโนกรม PCR buffer 1x MgCl2 2.5 mM dNTP 200 µM primer 0.4 µmole Taq polymerase 1 ยนต dH2O ปรมาตรทงหมด 15 ไมโครลตร ท าปฏกรยาพซอารดงน pre denaturation 94 องศาเซลเซยส 2 นาท denaturation 94 องศาเซลเซยส 1 นาท annealing 37 องศาเซลเซยส 1 นาท 30 รอบ extension 72 องศาเซลเซยส 2 นาท final extension 72 องศาเซลเซยส 5 นาท จากนนน าดเอนเอทเพมปรมาณแลวมาตรวจสอบดวยวธอเลกโตรโฟรซสบน 1.5% อะกาโรสเจล

14

ผลการทดลอง

การตรวจสอบคณภาพดเอนเอ 1. การตรวจสอบคณภาพดเอนเอเบองตนดวยวธการวดการเรองแสงของเอธเดยมโบรไมด จากการตรวจสอบพบวา ในการสกดดเอนเอดวยวธการสกดดเอนเอพชอยางงาย เกดการเรองแสงของเอธเดยมโบรไมดเปนลกษณะเสมยรยาวจากตนเจลจนถงปลายเจล สวนวธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) และวธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) มลกษณะคลายกนคอ มการเรองแสงเปนแถบทชดเจนอยดานบนของเจล มลกษณะเสมยรเลกนอยในบางพช (ภาพท 1) 2. ตรวจสอบคณภาพและปรมาณดเอนเอดวยการวดคาการดดกลนแสง การน าดเอนเอทไดจากการสกดมาวดคาการดดกลนแสง ทความยาวคลน 260 และ 280 นาโนเมตร จากนนจงวเคราะหคา OD260/ OD280 พบวาคาทไดในวธการสกดดเอนเอแตละวธใหคาทแตกตางกน โดยคาทใกลเคยง 1.8 มากทสดเมอเปรยบเทยบวธการสกดแตละวธในพชชนดเดยวกนมดงน เจตมลเพลงขาวทสกดดวยวธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) มคาเทากบ 1.809 ความเขมขนของดเอนเอเทากบ 0.513 ไมโครกรมตอไมโครลตร ออยทสกดดวยวธการสกดดเอนเอพชอยางงาย มคาเทากบ 1.782 ความเขมขนของดเอนเอเทากบ 1.720 ไมโครกรมตอไมโครลตร เจตมลเพลงแดงทสกดดวยวธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) มคาเทากบ 1.781 ความเขมขนของดเอนเอเทากบ 0.255 ไมโครกรมตอไมโครลตร สบด าทสกดดวยวธการสกดดเอนเอพชอยางงาย มคาเทากบ 1.906 ความเขมขนของดเอนเอเทากบ 4.616 ไมโครกรมตอไมโครลตร (ตารางท 1) 3. ตรวจสอบคณภาพโดยการเพมปรมาณดเอนเอดวยไพรเมอรสม (random primer) พบวาการเพมปรมาณดเอนเอทไดจากการสกดดเอนเอพชแตละวธของไพรเมอรสม ใหผลทแตกตางกน โดย วธการสกดดเอนเอพชอยางงายในพชทกชนด ไมสามารถเพมปรมาณดเอนเอไดเลยในทก ไพรเมอร (ภาพท 2, 3, 4, 5 และตารางท 2)

15

วธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) ในเจตมลเพลงขาว ไพรเมอร H-13 เพมได 2 แถบ ในออยไพรเมอร H-18 เพมได 4 แถบ ไพรเมอร H-13 เพมได 4 แถบ ในเจตมลเพลงแดงไพรเมอร H-18 เพมได 2 แถบ ในสบด าไพรเมอร H-18 เพมได 2 แถบ (ภาพท 2, 3, 4, 5 และตารางท 2) วธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) ในเจตมลเพลงขาวและเจตมลเพลงแดงไมสามารถเพมปรมาณดเอนเอไดในทกไพรเมอร ในออยไพรเมอร G-13 เพมได 3 แถบ, ไพรเมอร H-18 เพม 8 แถบ, ไพรเมอร K-16 เพมได 1 แถบ, และไพรเมอร H-13 เพมได 4 แถบ ในสบด าไพรเมอร H-13 เพมได 5 แถบ (ภาพท 2, 3, 4, 5 และตารางท 2)

16

ภาพท 1 อเลกโตรโฟรซสของดเอนเอทไดจากการสกดดวยวธตางๆ ใน 0.8% อะกาโรสเจลและยอมดวย

เอธเดยมโบรไมด 1= เจตมลเพลงขาว 2= ออย 3= เจตมลเพลงแดง 4= สบด า ตารางท 1 คา OD260/ OD280 และความเขมขนของดเอนเอทไดจากการสกดดวยวธตางๆ ในการวดคา การดดกลนแสง

วธสกดดเอนเอ ชนดพช OD260/OD280 Conc.DNA (µg/µl) วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย เจตมลเพลงขาว 1.282 0.231

ออย 1.782 1.720 เจตมลเพลงแดง 1.511 1.275 สบด า 1.906 4.616

วธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) เจตมลเพลงขาว 1.809 0.513 ออย 1.916 0.659 เจตมลเพลงแดง 1.781 0.255 สบด า 2.117 2.667

วธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) เจตมลเพลงขาว 1.968 0.872 ออย 1.899 0.181 เจตมลเพลงแดง 1.884 0.399 สบด า 2.054 2.455

50 100 ng ng

อยางงาย Agrawal Dellaporta

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

17

ภาพท 2 แถบดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยไพรเมอร G-13 1= วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย 2= วธประยกตของ Agrawal 3=วธประยกตของ Dellaporta P= positive control N= negative control M= 100 bp DNA ladder ภาพท 3 แถบดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยไพรเมอร H-18 1=วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย 2= วธประยกตของ Agrawal 3=วธประยกตของ Dellaporta P= positive control N= negative control M= 100 bp DNA ladder

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 P N M

เจตมลเพลงขาว ออย เจตมลเพลงแดง สบด า

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 P N M

เจตมลเพลงขาว ออย เจตมลเพลงแดง สบด า

18

ภาพท 4 แถบดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยไพรเมอร K-16 1= วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย 2= วธประยกตของ Agrawal 3=วธประยกตของ Dellaporta P= positive control N= negative control M= 100 bp DNA ladder

ภาพท 5 แถบดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยไพรเมอร H-13 1= วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย 2= วธประยกตของ Agrawal 3=วธประยกตของ Dellaporta P= positive control N= negative control M= 100 bp DNA ladder

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 P N M

เจตมลเพลงขาว ออย เจตมลเพลงแดง สบด า

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 P N M

เจตมลเพลงขาว ออย เจตมลเพลงแดง สบด า

19

ตารางท2 จ านวนแถบดเอนเอทเพมไดในแตละไพรเมอร

วธสกดดเอนเอ ชนดพช G-13 H-18 K-16 H-13 วธการสกดดเอนเอพชอยางงาย เจตมลเพลงขาว 0 0 0 0

ออย 0 0 0 0 เจตมลเพลงแดง 0 0 0 0 สบด า 0 0 0 0

วธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) เจตมลเพลงขาว 0 0 0 2 ออย 0 4 0 4 เจตมลเพลงแดง 0 2 0 0 สบด า 0 2 0 0

วธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) เจตมลเพลงขาว 0 0 0 0 ออย 3 8 1 4 เจตมลเพลงแดง 0 0 0 0 สบด า 0 0 0 5

20

วจารณผลการทดลอง

จากการตรวจสอบคณภาพและปรมาณดเอนเอดวยการวดคาดดกลนแสง พบวา ดเอนเอของเจตมลเพลงขาวและเจตมลเพลงแดง ทสกดโดยใชวธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) ใหคา OD260/ OD280 มคาใกลเคยง 1.8 มากทสด แสดงวาดเอนเอมการปนเปอนของอารเอนเอโปรตนและ ฟนอลนอย (สรนทร, 2545) สวนดเอนของออยและสบด าทใชวธการสกดดเอนเอพชอยางงาย ใหคา OD260/ OD280 มคาใกลเคยง 1.8 มากทสด แตเมอน าดเอนเอมาตรวจสอบคณภาพโดยการเพมปรมาณ ดเอนเอดวยไพรเมอรสม พบวาดเอนเอของเจตมลเพลงขาวและเจตมลเพลงแดงทไดจากการสกดโดย ใชวธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) สามารถเพมปรมาณดเอนเอไดมากทสด ซงสอดคลองกบการวดคาการดดกลนแสง แตดเอนเอของออยและสบด าทไดจากวธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) สามารถเพมปรมาณดเอนเอไดมากทสด ซงไมตรงกบการวดคาการดดกลนแสง สามารถอธบายขอแตกตางนไดจากผลการตรวจสอบคณภาพดเอนเอเบองตน ดวยวธการวดการเรองแสงของ เอธเดยมโบรไมด (ภาพท 1) วธการสกดดเอนเอพชอยางงายใหดเอนเอทมขนาดหลากหลาย (เกดเสมยร) เปนผลมาจากการแตกหกของดเอนเอในระหวางการสกด ท าใหไพรเมอรสมไมสามารถเพมปรมาณ ดเอนเอได ถงแมวธการสกดดเอนเอพชอยางงาย จะไดดเอนเอทมการปนเปอนของอารเอนเอโปรตนและฟนอลนอยกตาม การแตกหกของดเอนเอในวธการสกดดเอนเอพชอยางงายมมาก แตในวธประยกตของ Agrawal และคณะ (1992) และวธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) มการแตกหกของดเอนเอนอย สาเหตมาจากสารเคมทเปนสวนประกอบของ extraction buffer ในแตละวธแตกตางกน โดย extraction buffer วธการสกดดเอนเอพชอยางงายไมม mercabtoethanol เปนผลท าใหดเอนเอมการแตกหกมาก เพราะ mercabtoethanol มคณสมบตเปน antioxidant หรอ chelating agents (รชน, 2549) ซงจะรกษาสภาพเซลล ท าใหดเอนเอมการแตกหกนอย

21

สรปผลการทดลอง

การสกดดเอนเอของเจตมลเพลงขาวและเจตมลเพลงแดงใชวธการประยกตของ Agrawal และ คณะ (1992) จะไดดเอนเอทมคณภาพดทสด สวนการสกดดเอนเอของออยและสบด า ใชวธประยกตของ Dellaporta และคณะ (1983) จะไดดเอนเอทมคณภาพดทสด โดยมความบรสทธสง และสามารถน าไปใชในการเพมปรมาณโดยปฏกรยาพซอารกบไพรเมอรสม

22

เอกสารอางอง

กรมวชาการเกษตร. 2523. ออย. เอกสารกรมวชาการเกษตรเลมท 1. กรมวชาการเกษตร, กรงเทพฯ. 264 น. จรพนธ ศรทองกล. 2545. การศกษาเปรยบเทยบวธการสกดดเอนเอจากใบออนมะตม. วารสารเกษตร นเรศวร. 5(1) : 45-55. เจรญ สขพงษ. 2533. คมอแนะน าลกษณะและประโยชนของสมนไพร พรรณไมทวงการวทยาศาสตร ยอมรบ. ส านกพมพหมกจน, กรงเทพฯ. 120 น. ช านาญ ฉตรแกว, กตตเดช โพธนยม, กรก นฤทม, จรชนม ศรสวสดเลก, ชาญวทย มวงมตร, ทว เกาศร, บ ารง ไตรมนตร, ประโยชน ตนตเจรญยศ, ไพบลย ประพฤตธรรม, สมศกด ศรสมบญ และ อวบ สารถอย. 2549. สบด าพชพลงงาน. หจก. ฟนน พบบลชชง, กรงเทพฯ. 118 น. ประเสรฐ ฉตรวชรวงศ. 2547. ออย, น.272-295. ใน พชเศรษฐกจ. พมพครงท 2, ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. ทวศกด อนจตตกล. 2548. สบด าพชพลงงานสารพดประโยชน. บรษท วศระ จ ากด, กรงเทพฯ. 99 น. พเยาว เหมอนวงษญาต. 2532. คมอการใชสมนไพร. พมพครงท 4, หจก. ภาพพมพ จ ากด, กรงเทพฯ. 298 น. พรพนธ ภพรอมพนธ. 2538. เทคนคการจ าแนกพนธพชดวยวธ Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), น.39-60. ใน เอกสารประกอบการอบรมทางวชาการ เรอง การตรวจแยกสาย พนธพชดวยการใช Isozyme pattern และ RAPD. ฝายปฏบตการวจยและเรอนปลกพชทดลอง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน, นครปฐม. ระพพนธ ภาสบตร และ สขสนต สทธผลไพบลย. 2525. การใชน ามนสบด าเดนเครองยนตดเซล. งานวจยเคมพชและผลตผล กองเกษตรเคม กรมวชาการเกษตร, กรงเทพฯ. 34 น.

23

รชน ฮงประยร. 2549. บทปฏบตการซรมวทยาทางดานโรคพช. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขต ก าแพงแสน, นครปฐม. 87 น. สรนทร ปยะโชคณากล. 2545. จโนมและเครองหมายดเอนเอ ปฏบตการอารเอพดและเอเอฟแอลพ. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 115 น. เอกพจน บญรกษา. 2546. การศกษาเปรยบเทยบการสกดดเอนเอและชนดของเนอเยอเพอสกดดเอนเอ จากพชวงศขงบางชนด. ปญหาพเศษปรญญาตร. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขต ก าแพงแสน, นครปฐม. 33 น. Aldrich, K.J. and C.A. Cullis. 1999. Extraction DNA method of Agrawal et al. (1992), In RAPD

analysis in flax : Optimization of yield and reproducibility using klen Taq 1 DNA polymerase, chelex 100, and gel purification of genomic DNA. Plant Mol. Biol. Rep 11 : 128-141.

Ausubel, F.M. et al. 1999. Short protocols in molecular biology. 4th ed., John Wiley and Sons, Inc., New York. 1074 p. Beckmann, J.S. and C.O. Thomas. 1992. Plant genome : methods for genetic and physical mapping. Kluwer academic publisher, Dordrecht. 250 p. Clark, M.S. 1997. Extraction of whole Genomic DNA by the method of Dellaporta, Wood and Hicks (1983) pp. 9-11. In Plant molecular biology a laboratory manual. Springer Inc., Berlin. 529 p. Li, Y. and Y. Zhao. 1996. Plant DNA extraction with CTAB, pp. 128-130. In Practical protocols in molecular biology. Science Press, Beijing. 312 p. Walker, J.M. 1984. Methods in molecular biology v.2 nucleic acids. The Humana Press Inc., New Jersey. 375 p.

24

ภาคผนวก

25

คณสมบตของไพรเมอรสม (random primer) ไพรเมอร G-13 CTC TCC GCC A Optical Density 0.9 OD Total nmole 10.0 nmole Scale 0.025 µmoles Length 10 mer Tm 34.0 C Purification OPC Modification None GC content 70.0 % Molecular Weight 2923.9 g/mole Volume for 100 pmoles/µl 100.0 µl ไพรเมอร H-18 GAA TCG GCC A Optical Density 1.1 OD Total nmole 10.0 nmole Scale 0.025 µmoles Length 10 mer Tm 32.0 C Purification OPC Modification None GC content 60.0 % Molecular Weight 3037.0 g/mole Volume for 100 pmoles/µl 100.0 µl

26

ไพรเมอร K-16 GAG CGT CGA A Optical Density 1.2 OD Total nmole 10.0 nmole Scale 0.025 µmoles Length 10 mer Tm 32.0 C Purification OPC Modification None GC content 60.0 % Molecular Weight 3077.0 g/mole

Volume for 100 pmoles/µl 100.0 µl ไพรเมอร H-13 GAC GCC ACA C Optical Density 1.1 OD Total nmole 10.0 nmole Scale 0.025 µmoles Length 10 mer Tm 34.0 C Purification OPC Modification None GC content 70.0 % Molecular Weight 2981.9 g/mole Volume for 100 pmoles/µl 100.0 µl

27