Colture di cellule in sospensione e in adesione - · PDF fileA single idiotype of antibody to...
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Laboratorio di tecnologie abilitanti
Modulo LTA Immunologiche
• Colture di cellule in sospensione e in adesione
• Produzione di anticorpi monoclonali
• Reazione linfocitaria mista (MLR)
Anno accademico 2016/2017
Matteo Urbano
Due linee di difesa
I. adattativa
I linfociti sono responsabili delle risposte immunitarie adattative
Lymphocyte Activation T cells and B cells are morphologically
identical in the unstimulated or resting state.
Upon stimulation by antigen, they become “activated” and begin to differentiate.
Activated B cells become plasma cells. Activated T cells can become helper T
cells or cytotoxic T cells.
T and B Cell Activation
Immunita’ Specifica
Teoria della selezione clonale
Ogni organismo produce, soprattutto durante i primi anni di vita, un'enorme varietà di linfociti diversi in piccole quantità (cloni): solo quelli che vengono in contatto con antigeni specifici possono proliferare.
Le cellule B: la produzione di anticorpi monoclonali
B cells Clonal Selection
• B-lymphocyte binds antigen • Stimulates reproduction of B-cells • B-cell differentiates into memory cells and plasma cells
– Plasma cells produce soluble antibody – Memory cells display antibody on surface
Immunoglobulin Structure
• Heavy & Light Chains
• Disulfide bonds – Inter-chain – Intra-chain
CH1
VL CL
VH
CH2 CH3
Hinge Region
Carbohydrate
Disulfide bond
Immunoglobulin Fragments: Structure/Function Relationships
Ag Binding
Complement Binding Site Binding to Fc
Receptors
Classes of Antibodies
Five classes of antibodies (IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE) can be distinguished by differences in the heavy chain
Differences in the heavy chains (the tail regions) impart distinctive functional properties to the classes of antibodies
Organizzazione strutturale dei principali isotipi delle Ig umane
La produzione degli anticorpi può avvenire nei confronti di:
Ø antigeni timo dipendenti, Ag TD, antigeni proteici, componenti
virali, complessi aptene-carrier. In questo caso la produzione degli anticorpi richiede l’attivazione delle cells B da parte dei LT helper (CD4+, TH2). L’Ag viene ingerito da un fagocita (DC, MO) presentato alla cellula T helper che attiva la cell B causandone la trasformazione in plasmacellula.
Ø antigeni timo indipendenti, Ag TI, antigeni polivalenti con epitopi ripetuti (proprietà tipiche dei polisaccaridi batterici, polimeri proteici, lipopolisaccaridi, glicolipidi, acidi nucleici). Vanno direttamente sui recettori delle cellule B (immunogobulina) oppure sul recettore del sistema immunitario innato (TLR)
Antigenic Determinants (Epitopes)
The specific site of an antigen that binds to an antibody is called an antigenic determinant or epitope.
Most antigens have a variety of epitopes that generate a number of different antibodies that are called polyclonal.
A single idiotype of antibody to an antigen is termed monoclonal.
Immunizzazione
Induzione deliberata di una risposta immunitaria
IMMUNOGENO: qualsiasi sostanza in grado di scatenare una risposta immunitaria
ANTIGENE: qualsiasi sostanza che può legare uno specifico anticorpo (proteine, carboidrati, acidi nucleici, molecole organiche)
Per ottenere una risposta immunitaria forte nei confronti di antigeni proteici è fondamentale che l’antigene sia iniettato
insieme ad un adiuvante
1) Gli adiuvanti convertono gli antigeni proteici solubili in materiale particolato (più immunogenico)
2) Gli adiuvanti consentono un rilascio lento/prolungato dell’antigene
3) La maggior parte degli adiuvanti contiene componenti microbici che incrementano l’immunogenicità della preparazione,
Induzione di una potente risposta infiammatoria
Adiuvante: qualsiasi sostanza che incrementa l’immunogenicità delle sostanze ad essa mescolate
Immunizzazioni ripetute: 1) Prima in CFA;
successsive in IFA
2) Aumento titolo anticorpi
3) Aumento affinità (ipermutazione somatica)
4) Switch di classe
In 1975, Kohler and Milstein first fused lymphocytes to produce a cell line which was both immortal and a producer of specific antibodies. The two scientists were awarded the Nobel Prize for Medicine in 1984 for the development of this "hybridoma.” The value of hybridomas to the field was not truly appreciated until about 1987, when MAbs were regularly produced in rodents for diagnostics.
Activated B cells contain a mixture of antibodies directed against different epitopes.
Activated B cells have a limited lifetime when grown in culture.
How can we select a single B cell clone (monoclonal) and propagate the cell line?
B cells
B lymphocytes can mutate into tumor cells that result in a type of cancer termed myeloma.
Myeloma cells become “immortal” and will grow indefinitely in culture.
Fusion of a single activated B cell and a myeloma cell will create a hybridoma that can grow indefinitely in culture.
Hybridomas
Antibodies can be raised in mice by injection of an antigen.
Repeated injections create a pool of activated B cells.
Removal of the spleen and fusion with myeloma cells creates a pool of hybridomas.
Dilution and culture creates many monoclonal cell lines.
Monoclonal Antibodies The Mouse System
Myeloma cells, mutant Caratteristiche: • no Ab production
• HGPRT- Ipoxantina Guanina FosfoRibosil Transferasi
• TK-
Selezione degli ibridomi
E’ necessario creare condizioni di coltura in cui solo gli ibridomi siano capaci di sintetizzare il DNA
Sistema HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina)
La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di NTP sintetizzati a partire dai rispettivi monofosfati
Gli NTP si formano da:
a- sintesi De novo (via normale) b - via di salvataggio (via alternativa)
HAT H = ipoxantina L’ipoxantina è usata come sorgente esogena di purine (Adenina e Guanina), è fosforilata dall’enzima Ipoxantina Guanina Fosfo Ribosil Transferasi (HGPRT) a formare IMP che, alternativamente, può essere convertito a AMP e GMP A= aminopterina L’aminopterina blocca tutte le reazione dell’enzima diidrofosfato reduttasi (DHPR) che è coinvolto nella sintesi de novo di AMP e GMP e anche nella metilazione di UMP a formare dTMP. Di conseguenza, la cellula diventa completamente dipendente dalla via di salvataggio per produrre i trifosfati purinici e pirimidinici per la sintesi del DNA T = timidina La timidina usata come sorgente esogena, è fosforilata dalla timidina chinasi (TK) per formare TMP.
Impiego degli anticorpi monoclonali
Immunofluorescience
Cellule T:
Il rigetto dei trapianti
Autologo, trapianto da un individuo allo stesso individuo (cambio solo di sede); Singenico, tra due individui geneticamente identici (gemelli identici – monozigoti); Allogenico, tra due individui della stessa specie ma geneticamente differenti
Tipi di trapianto
MHCa
Il ruolo principale delle molecole MHC è di iniziare una risposta immunitaria presentando peptidi antigenici sulla superficie delle cellule che possano essere riconosciuti dal TCR.
Interazione MHC-TCR all’inizio di una risposta immunitaria avviene fra APC e T cells.
MHC restriction delle cellule T (Zinkernagel & Doherty 1974)
α β
CD4 T-CELL
TCR αβ CD4
CD3
9 aa peptide 15 aa
peptide
CD8 T-CELL
CD8
α β
TCR αβ
CD3 α β
ANTIGEN PRESENTING CELL
MHC CLASS II
α1 β1
β2 α2
Glycoproteins expressed on the surface of cells. MHC class I is composed of one polypeptide, non-covalently associated with β2microglobulin. MHC class II is composed of two polypeptides, referred to as α and β.
MOLECULES OF T LYMPHOCYTE RECOGNITION
CLASS I MHC β2m
α2 α1
α3
ANTIGEN PRESENTING CELL
Il TCR riconosce i peptidi antigenici associati alle molecole MHC Le cellule T riconoscono una parte dell’antigene legato non-covalentemente all’MHC sulla superficie di un’altra cellula: - le cellule T citotossiche (CTL) riconoscono i peptidi legati
alle MHC di Classe I;
- le cellule T helper (Th) riconoscono i peptidi legati alle MHC di Classe II
Class I: HLA-A, -B, -C. 1 catena pesante con 3 domni --> altissimo polimorfismo (1500 alleli) β2-microglobulina
Class II: HLA-DR, -DP, -DQ. 1 catena α e 1 catena β --> alto polimorfismo Espressione solo su APC
MHC
From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin
MHC-‐I MHC-‐II
From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin
Se è vero che il recettore dei linfociti T (TCR) riconosce un complesso formato da un peptide antigenico non-self e da una molecola MHC self...allora come fanno alcuni linfociti T a rispondere a MHC non self?
l linfociti T (attraverso il CD4 e CD8) riconoscono solo alcuni residui peptidici degli MHC, alcuni di questi residui sono simili in MHC diversi. In condizioni fisiologiche non è possibile l'incontro di un MHC non self, il problema si verifica soprattutto nei trapianti. L'organo trapiantato può infatti conservare alcune APC che presentano quindi ai linfociti T dell'organismo ricevente peptidi estranei su MHC non self che vengono quindi riconosciuti a causa della somiglianza di alcuni residui.
10% delle T cells di un individuo sono in grado di riconoscere molecole MHC di un donatore.
TRAPIANTI SOLIDI: T cell del ricevente attaccano organo donato con MHC diverso.
TRAPIANTI DI MIDOLLO: T cell del donatore riconoscono MHC del ricevente --> “tempesta” di citochine --> GVHD
ALLOREATTIVITA’
L’ALLORICONOSCIMENTO delle T cell avviene ad alta frequnza: 1/10 vs. 1/106/7 per T antigene specifiche. Alloriconoscimento • principale causa del rigetto di trapianti solidi; • principale causa del GVHD (Graft Versus Host
Desease) in trapianti di midollo.
G i o rno 0
2 o re teor ia
G i o rno 1
1) Sc omplementazi one del sie ro 2) Pr eparazione ter reni (c ompl, HAT,… ) 3) C onta cells 4) Piastr are cells da sospe nsio ne: mieloma (per fusio ne) e B16 ( per congelament o Giorno 4)
G i o rno 2
FUSI O N E
G i o rno 3
MLR p urifica tion
G i o rno 4
1) Pr eparazione soluzi oni ELISA indiret to 2) Pr eparazione soluzi oni ELISA sandw ich 3) Dis tacc o cellule in adesion e e loro congelament o
G i o rno 5
1) ELI SA indi retto 2) Sc ongelamento cell ule 3) C oating ELISA sandwi c h
G i o rno 6
ELI SA San dwich Prop osta quesiti
G i o rno 7
Analisi ELISA sandw ich Ris oluz ione quesiti