Clinical Genetics Leading the way in genetic issues

Berna Beverloo Klinische Genetica

12 jan 2016

Genetische afwijkingen bij hematologische maligniteiten;

Diagnostiek van Hematologische Maligniteiten

Morfologie Cytogenetica

Immunophenotypering Moleculaire diagnostiek

Peter Valk, afd Hematologie, Erasmus MC

http://images.google.nl/imgres?imgurl=http://www.slz.nl/hora/onderwijs/Cytologie/gramo/images/AB0085.jpg&imgrefurl=http://www.slz.nl/hora/onderwijs/Cytologie/gramo/images/AB0085.htm&h=562&w=750&sz=40&tbnid=m8kzAlvFmXBpXM:&tbnh=104&tbnw=140&hl=nl&start=47&prev=/images?q%3Dbeenmerg%26start%3D40%26svnum%3D10%26hl%3Dnl%26lr%3D%26sa%3DNhttp://images.google.nl/imgres?imgurl=http://www.consumed.nl/dagnieuws/images/beenmerg.jpg&imgrefurl=http://www.consumed.nl/lic/nieuws/actueel.php3?id%3D2360%26zoekstr%3D&h=150&w=150&sz=8&tbnid=NUyNV8MrXSglGM:&tbnh=90&tbnw=90&hl=nl&start=1&prev=/images?q%3Dbeenmerg%26svnum%3D10%26hl%3Dnl%26lr%3D%26sa%3DN

Eén loket voor de hemato-oncologische diagnostiek

Eén aanvraagformulier

Informatieboekje: wat bij welke indicatie

Klinische Genetica in Nederland

Klinisch genetische centra en hun satelliet centra: • Groningen • Utrecht • VUmc, Amsterdam • AMC, Amsterdam • Leiden • Rotterdam • Nijmegen + Twente • Maastricht + Veldhoven

Cytogenetics

prenatal cytogenetics Villi and amniotic fluid

Diagnosis before birth

postnatal cytogenetics Blood and tissue

Diagnosis after birth

tumorcytogenetics Bone marrow and tumor tissue

Diagnosis of malignant material

Acquired abnormalities Constitutional abnormalities

Cytogenetics

•Inzendende ziekenhuizen voornamelijk op basis van regio •Indicaties o.a.

•Acute Myeloide Leukemie •Acute Lymfatische Leukemie •Myelodysplastisch Syndroom •Myeloproliferative neoplasm, incl CML •Multiple Myeloma •Tumoren (met name kinderen) •Lymfomen (centrum afhankelijk)

Tumorcytogenetisch onderzoek

Overzicht indicaties Erasmus MC tumorcytogenetisch onderzoek 2010-2014

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

AM

L

ALL

CM

L

CLL

tum

or

MM

MD

S

MP

N

MD

S/M

PN

lym

foo

m

hes

bm

s

ove

rig

ho

von

95

AM

L

ALL

CM

L

md

s

mm

and

ers

AM

L

ALL

CM

L

md

s

mm

lym

f

diagnose Follow-up Recidief mrd

2010

2011

2012

2013

2014

Het chromosoom

Korte arm (petit)

Lange arm

Centromeer

Het chromosoom

Detection and identification of chromosomal rearrangements

• Conventional karyotyping (banding techniques)

• Molecular (cyto)genetics

• Fluorescent in situ hybridization (interphase and metaphase)

• Spectral Karyotyping (SKY)/M-FISH

• Array-CGH / SNP arrays

• RQ-PCR (in case of fusion genes)

• Q-PCR

• MLPA

• Southern blotting analysis

• Sequencing (Sanger vs Next Generation Seq)

Chromosomal/genetic abnormalities Numerical aberrations

• Gain of a complete chromosome

• Loss of a complete chromosome

Structural aberrations Balanced

• Translocation (exchange of terminal chromosomal segments)

• Inversion (within a chromosome)

• Insertion

Non-balanced

• Deletion (part of a chromosome, either terminal or interstitial)

• Amplification (duplication, dmin, hsr)

• Non-balanced translocation

• Gene Mutation (at basepair level)

http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/dep.gif

Deletie- er is een stuk(je) verloren

Wat is er hier aan de hand ?

Structurele chromosoomafwijkingen

http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/dep.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/dep.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/dep.gif

http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/deq.gif

Translocatie- er is een deel van een chromosoom uitgewisseld met een deel van een ander chromosoom

Wat is er hier aan de hand ?

Structurele chromosoomafwijkingen

http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/deq.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/deq.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/deq.gif

http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/inp.gif http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/inc.gif http://www.vh.org/pediatric/provider/pediatrics/ClinicalGenetics/Lesson1/Fig1.8.html

Inversie- er is een stukje van een chromosoom 180° gedraaid

Wat is er hier aan de hand ?

Wat is er hier aan de hand ?

Structurele chromosoomafwijkingen

Paracentric: within a chromosome arm

Pericentric: round the centromere

http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/inp.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/inp.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/inp.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/inc.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/inc.gifhttp://www.tokyo-med.ac.jp/genet/chm/inc.gifhttp://www.vh.org/pediatric/provider/pediatrics/ClinicalGenetics/Lesson1/Fig1.8.html

Beschrijving karyotype

Aantal chromosomen : 46 Geslachtschromosomen : 46,XX (♀), 46,XY (♂) Afwijkende chromosomen

geslachtschromosomen afwijkende autosomen in numerieke volgorde numeriek gaat voor structureel (indien zelfde # nr) afwijkingen binnen zelfde chromosoomnr:

op alfabet volgens afkorting afwijking afwijking binnen zelfde chromosoom:

van p naar q!

Afwijkingen: Add, del, der, dic, dup, ins, inv, i, mar, r, t

• Relevant for Diagnosis e.g. t(9;22)(q34;q11) in CML

• Important for prognosis AML: t(8;21)(q22;q22) good prognosis inv(16)/t(16;16) good prognosis MDS: complex karyotype poor prognosis -5/5q- or –7/7q- poor prognosis (nb revised IPSS) • Related to response to chemotherapy

• Identification of involved genes; insight in leukemogenesis and hematopoiesis resulting in possible treatment options

Recurrent chromosomal rearrangements in hematological malignancies

AML survival and cytogenetics

t(15;17)

t(8;21)

inv(16)

t(9;11)

t(6;9)

monosomy 5/7

inv(3)/t(3;3)

Grimwade and Hills, 2009

Hoe krijg je “mooie” metafase chromosomen?

Materiaal: 5 ml Li-heparine beenmerg, of bloed (met blasten)

Optioneel BrdU inbouw

1-2 dagen kweek

Kweekmedium ± groeifactoren

½ uur

Mitose blok Colcemid

Hypotoon en fixatief

12T0320

Hoe kan ik dit aantonen??

Karyotyperen

L03.1548

Eerst moeten er voor analyse geschikte metafases gezocht worden:

Metafer: geautomatiseerd metafases zoeken

RFA-gebandeerde metafase

RFA-gebandeerd karyogram

Beschrijving karyogram: karyotype

CML patient, R-bandering

CML patient, R-bandering

ALL patient, R-bandering

BM04-0148

Karyotypering

Voordelen Genoom brede analyse

Detectie van zowel numerieke als structurele afwijkingen

Problematisch

Cryptische afwijkingen (kleine inserties, translocaties tussen chromosomen waarbij uitgewisselde delen niet verschillen in bandering

Nadelen Beperkte resolutie (ca 5 Mb)

Metafasen noodzakelijk => afwijkende cellen moeten delen

Tijdrovend

Detectie en identificatie van cryptische chromosomale afwijkingen

In ca 50% van de leukemieen blijken geen of niet-specifieke afwijkingen aanwezig te zijn.

Reden:

• Afwijkende cellen niet in deling gekomen?

• Afwijking niet zichtbaar met conventionele technieken?

Resolutie: Karyotypering ~5-10Mb => FISH

Van chromosoom naar moleculaire technieken

Moleculaire cytogenetica: FISH

Moleculaire cytogenetica: FISH

Metafase FISH: FISH op gekweekte (delende) cellen lymfocyten, leukocyten (beenmerg/bloed), solide tumoren

Interfase FISH: FISH op kernen van niet/slecht delende cellen Snelle analyse beoordeling op basis van aantal signalen (eventueel fusie-signaal, of break-apart probes)

Split signal FISH: separation of signals in case of a translocation

Voorbeeld FISH: 14q32/IGH

IgH

Normaal = fusie van rood en groen signaal

Afwijkend = splitsing in een apart rood en groen signaal en variaties hiervan

Breekpunt van IgH

Splitsing IgH

Used for t(4;14), t(11;14) and t(14;16) FISH detection

no translocation translocation

14

18

14q+

14

18

Colocalisation of signals in case of a translocation

t(9;22)(q34;q11) in CML and ALL

t(9;22)(q34;q11) in CML (BCR/ABL dual fusion, Vysis)

FISH using probes for BCR/ABL

ABL

BCR

BCR-ABL

Probleem MM

Multipel Myeloom: moeizaam chromosomen onderzoek Laag percentage afwijkende cellen in beenmergaspiraat Afwijkende cellen delen niet of nauwelijks onder lab condities Resultaat: vaak een normaal karyotype, met afwijkende FISH op

interfase kernen Aantal afwijkingen zijn chromosomaal niet zichtbaar (cryptisch) Oplossing: hoger percentage plasmacellen nodig zuivering van

de plasmacellen

Zuivering plasmacellen

• Rode bloedcellen verwijderen met rode bloedcel lysis

• Zuivering met anti-CD138 kit (Stem Cell Technologies)

Molecular cytogenetics: interfase FISH

Interfase FISH: FISH results on nuclei of non or hardly dividing cells

Fast analysis (few hours or over night)

Relative low number of cells needed

Subclone detection

Numerical abnormalities determination of number of signals

Structural abnormalities use of fusion probes or break-apart probesets

C9/p53 with extra signal for centromere 9

Break apart probeset IGH@ Fusion probeset

BCR/ABL1

FISH applications

Advantage:

• Detection of microdeletions

• Breakpoint detection and refinement

• Detection of cryptic translocations and complex genome alterations

• Fast diagnostic detection on interphase nuclei

• Demonstration of small amount of aberrant cells

Disadvantage:

• Limited sensitivity

• Only answers to questions asked

• Not to many targets simultaneously

Resolutie: Karyotypering ~5-10Mb => Array ~0.15Mb

Van chromosoom naar moleculaire technieken

Type arrays

• Oligo arrays: Agilent, Nimblegen Informatie over aantal kopieën

vs.

• SNP arrays: Affymetrix, Illumina Informatie over aantal kopieën EN genotype

http://images.google.nl/imgres?imgurl=http://genomics.princeton.edu/caudylab/YeastDnaPrepLabel_files/image006.gif&imgrefurl=http://genomics.princeton.edu/caudylab/YeastDnaPrepLabel.shtml&usg=__OI_LpMGYXKAiq6koMuWjfX2jXgc=&h=301&w=419&sz=30&hl=nl&start=6&um=1&tbnid=-ZOhpsVai5AX_M:&tbnh=90&tbnw=125&prev=/images?q%3Dagilent%2Barray%26um%3D1%26hl%3Dnl%26sa%3DGhttp://images.google.nl/imgres?imgurl=http://microarray.csc.mrc.ac.uk/download.html?id%3D302&imgrefurl=http://microarray.csc.mrc.ac.uk/subsection.html?id%3D16&usg=__GB-By1AG80D9u4ODuwdd1_5LIBw=&h=134&w=225&sz=9&hl=nl&start=2&um=1&tbnid=TBEAD9qugaUWFM:&tbnh=64&tbnw=108&prev=/images?q%3Dsite:microarray.csc.mrc.ac.uk%2Bagilent%2Barray%26um%3D1%26hl%3Dnlhttp://images.google.nl/imgres?imgurl=http://microarray.csc.mrc.ac.uk/download.html?id%3D300&imgrefurl=http://microarray.csc.mrc.ac.uk/subsection.html?id%3D16&usg=__BzWemD1do5caeAWqibKn0E_Kzas=&h=410&w=420&sz=213&hl=nl&start=1&um=1&tbnid=pCc2vjxua6bEUM:&tbnh=122&tbnw=125&prev=/images?q%3Dsite:microarray.csc.mrc.ac.uk%2Bagilent%2Barray%26um%3D1%26hl%3Dnlhttp://images.google.nl/imgres?imgurl=http://www.medsci.uu.se/klinfarm/arrayplatform/chip.bmp&imgrefurl=http://www.medsci.uu.se/klinfarm/arrayplatform/applications_expression.htm&usg=__NuCtmDW5bfQ5yE7NzgimZIyInto=&h=600&w=778&sz=1369&hl=nl&start=59&um=1&tbnid=UJwKCpWvTxqBIM:&tbnh=110&tbnw=142&prev=/images?q%3Daffymetrix%2Barray%26start%3D40%26ndsp%3D20%26um%3D1%26hl%3Dnl%26sa%3DN

Platform Klinische Genetica

HumanCytoSNP-12 Array

LogR

B-allele frequency

Normaal (diploïd)

deletie duplicatie kopie-neutrale ROH

(region of homozygosity)

Lo

g r

ati

o

(in

ten

sit

eit

) B

all

el

freq

ue

nti

e

(ge

no

typ

e)

Array analyse

(aa

nta

l k

op

ieë

n)

Blad 47 van 9

13q33.2-q34 9.7 Mb 1337 probes

del 13q33.2-q34 Nexus

Whole Genome View 12D10953

Whole Genome View 12D6846

Casus

Male patient with CMML/AML (14T2369)

Karyotype:46,XY,der(5)?del(5)(q?q?)inv(5)(p?q?)[10]

Casus

Male patient with CMML/AML (14T2369)

Karyotype:46,XY,der(5)?del(5)(q?q?)inv(5)(p?q?)[10]

FISH vs SNP array

Afwijking FISH SNP array

Translocatie

Bijv t(14q32)/t(4;14)/t(14;16)

Ja Nee (alleen ongebalanceerd)

Winst van heel chromosoom

Bijv Hyperdiploidy

Ja Ja

Deleties

Biiv 17p13.1, 13q14, 1p32

ja ja

Gains

Bijv 1q21

Ja Ja

Verlies van heterozygotie Nee Ja