Clase2 [Modo de compatibilidad]

6/19/2013

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BIOTECNOLOGIA DE LOSMICROORGANISMOS

Factores químicos y físicos que afectan el crecimiento fúngico

Dra. Isabel E. Cinto

[email protected]

¿Qué entendemos por crecimiento?Aumento irreversible de biomasa (Nº de células, peso, volumen)

Requerimientos:Nutrientes: fuente de C – cualquier compuesto orgánico

fuente de N – NO3, NH4- N-orgánicominerales – micro y macronutrientesvitaminas – pueden requerirlas o no

AguaTemperaturapHLuzaireación

Factores ambientales

Cultivos

Nutrientes: Medio sintéticoMedio natural (MEA, YPG, APG, etc)Medio natural (MEA, YPG, APG, etc)

Medio líquido incubación Con agitación (SmF)Condiciones estáticas

Cultivo cerrado (batch)SemicerradoContinuo/abierto

Sustrato:Medio sólido Agarizado (colonias)

Sustrato particulado sin agua libre (SSF)

Medio natural con aguaSoporte inerte con medio de cultivo

CultivosMedio líquido Medio sólido

agarizadoestático

natural

agitación

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¿Cómo podemos estimar el crecimiento?

Medio sólido agarizado: diámetro de la colonia

Medio líquido: peso secoComponente del hongo (quitina, ergosterol, proteína)

Medio sólido natural: componente del hongo

Levaduras: conteo de Nº de célulasdensidad ópticaconteo de colonias (ufc)

Cinética de crecimiento

Cinética de crecimiento de la hifa: lineal

ΔL =kΔt Lo

ngitu

d hi

fa

Crecimiento del micelio: exponencial (ramificaciones)

tiempo

Colonia

Medio sólido agarizadoUnicamente los bordes de la colonia contribuyen al crecimiento radial

Sustrato agarizado

CR = μ w w

CR= tasa de crecimiento radial de la colonia

μ= velocidad específica de crecimiento

w= ancho periférico que soporta el crecimiento

Cinética del crecimientoMedio líquido (batch)

Fase lagAdecuación al medio

Inóculo -orígen-edad

Inóculo:-esporas-Cubitos de cultivo en medio agarizado-Micelio homogeneizado

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Fase exponencial:Fase exponencial:

Velocidad de crecimiento

dx = μ . xdt

ln x = ln x0 + μ .t

x= biomasax0= biomasa preexistenteμ = velocidad específica de cercimiento

Fase exponencialμ = μmáx = cte

x = x0 . e μ t


Fase estacionaria:Fase estacionaria:


dx = μ . x = 0dt

Fase autólisis:


dx = -k . xdt

dX = -Ys dSdt dt


-Ys = dXdS

Rendimiento de la utilización del sustrato

Ecuación de Monod

Y ahora relacionamos tasa de crecimiento con la concentración del sustrato:

Ks = representa la concentración de sustrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la máxima

Factores que afectanel crecimiento

• NutrientesNutrientes. Tipo y cantidad de: fuente de carbono

fuente de nitrógenominerales vitaminas

• Agua• Temperatura

C/N

p• pH• Luz• Aereación• Otros factores ambientales

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óptimo

Para cada factor se cumple:

mínimo máximo

Para todo factor existe un óptimo y un rango que permite el crecimiento

Al alejarse del óptimo condiciones de stress

En general el rago de crecimiento es mayor al rango de otras funciones

Metabolismo

A los productos metabólicos generados durante el catabolismo y el anabolismo que tiene lugar durante elcrecimiento (trofofase) se les denomina metabolitos primarios y su producción es paralela al crecimientocelular. Por el contrario, los productos metabólicos que se acumulan cuando no hay crecimiento sinodiferenciación celular (idiofase), se les denomina metabolitos secundarios. En general, puede decirse quelos metabolitos secundarios se producen después de que se han producido los primarios; aunque en ciertascondiciones (como en cultivo continuo) se pueden producir simultáneamente.

NUTRICIÓN CARBONADA

En hongos:

Fuente de energía: son quimiotróficos (dependen de reacciones redoxpara la obtención de energía, utilizan directa o indirectamente loscompuestos ricos en energía sintetizados por organismos fototróficos)

Fuente de carbono: son heterotróficos (utilizan materia orgánica)

Tipo de dador de hidrógeno: son organotróficos (orígen del hidrógenotambién es orgánico)


La posibilidad de utilizar una determinada fuente de carbono depende de:

1- Que existan las enzimas extracelulares capaces de degradarlo a sustanciassolubles

2- Existencia de un sistema de transporte a través de la mebrana

3- Existencia dentro de la célula de las enzimas necesarias para metabolizarlo(entónces es aprovechado como fuente de energía y fuente de esqueletoscarbonados)

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Sustancias de reserva

Glucógeno: granulos insolubles de α-glucano,polímero de D-glucosa uniones α (1-4), cada 10monómeros hay una ramificación: unión de tercerglucosa α (1-6)

Los gránulos se ven al ME y pueden constituir el10% del peso del hongo

Se sintetizan durante el período de activo crecimiento, especialmente cuando hayalta relación C/N en el medio

Se hidroliza durante la fase estacionaria o de autólisis. También durante laproducción de estructuras reproductivas.

Glucógeno: Glc α,1-4, ramificaciones α,1-6NUTRICIÓN CARBONADA

Se sintetiza a partir de UDP glucosa por glucógeno sintasa y es degradada por laen ima gl cógeno fosforilasa c ando se req iere mo ili ación de s stacias de

UDP-Glc pirofosforilasaGlc1-P UDPGlc

UTP PP

enzima glucógeno fosforilasa cuando se requiere movilización de sustacias dereservas. Ambas enzimas son reguladas por fosforilación/defosforilación

gno fosforilasaGlucógeno Glc 1-P

P

síntesis degradación

Glucógeno sintasaGlc + UDPGlc Glucógeno

UDP

desramificanteGlucógeno Glc

Ramificaciones: enzima que corta oligómerosy los une 1-6 al glucógeno (amilo –α-(1,4-1,6)-glucosiltransferasa)

En los puntos de ramificación delglucógeno actúa la enzimadesramificante



Trehalosa: disacárido no reductor formado por dosmoléculas de glucosa. El enlace α, α-1,1 conecta losdos extremos reductores de los residuos de glucosaanulando su poder reductor.

Suele acumularse en esporas y células en reposo, se degrada al reasumir elcreciemento. Tiene un rol protector contra stress ambiental (previene formación decristales con la desecación, también sería importante en la protección térmica)

Trehalosa: Glc α, 1-1


Trehalosa sintasa:

Complejo proteico con 4 subunidades

Tps1 Tre6P sintasaTps2 Tre6P fosfatasaTps3Tps3Tps4 regulatorias

2 Glc trehalasa

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Manitol: poliol (6C) muy común enChytridiomycota, Ascomycota, Basidiomycota ydeuteromycetes

Junto con la trehalosa pueden constituir hasta el15% del peso seco del hongo

Se sintetiza a partir de Fructosa

NUTRICIÓN CARBONADAManitol

síntesis

HX: hexoquinoasaMPD: manitol P-deshidrogenasaMP: manitol P-fosfatasaMDH: manitol deshidrogenasa

Metabolismo Metabolismo

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Metabolismo

GluconeogénesisAl revés de la glucólisis. Indispensable para hongos que crecen sobre sustratoscomo etanol, acetato y lípidos. Tiene que sintetizarse Glu-P para sístesis depared, reserva, etc.

PEP

pirúvico

Acetil CoA

C. Krebs

Piruvato kinasa oxalacetato PEP + CO2

ATP

PEP-carboxiquinasa

C. Krebsoxalacetato

FFK

Fru 6P

Fru 1-6 P

Fru 1-6 P Fru 6P

ATP

Fru 1,6 bifosfatasa

Metabolismo

Cuando hay gluconeogénesisse activa el ciclo del glioxilato:permite la entrada de Acetil CoAproducto de la degradación delípidos por ejemplo

Metabolismo

Ciclo del glioxilato

•Presente en bacterias, hongos y plantas.

•Es una variación del ciclo de TCA•Es una variación del ciclo de TCA

•Sirve para la concersión neta de AcetilCoA en succinato, para que éste pueda lugoser convertido en oxoacetato, que será convertido por PEP carboxiquinasa en PEP.PEP puede entrar a la gluconeogénesis.

•De esta manera organismos que poseen este ciclo pueden usar acetato (en la formade AcetilCoA) y los compuestos que derivan a acetato como ácidos grasos yamoniácidos, como fuiente para generar glucosa. En los microorganismos aeróbicosno existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetatono existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato.

•Confinado a una organela especial: el glioxisoma

•El ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que permite elfuncionamiento normal del ciclo TCA

•Produce compuestos de 4 carbonos a partir de acetato.

Metabolismo


1- Isocitrato liasa

2- Malato sintasa

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Metabolismo


Metabolismo

Fermentación: alcohólica (levaduras/hongos filamentosos)láctica (Oomycota/Zygomycota)

Aerobio facultativo:Crece en anaerobiosis o aerobiosis usando oxígeno en respiración ocompuestos orgánicos en fermentación como aceptor de electrones.

Usan oxígeno preferentemente por la mayor energía que produce la respiración.

En 1857 Pasteur observó que a bajas concentraciones de azúcar la aireacióninducía mayor producción de biomasa en las levaduras y menor producción dealcohol. Infirió que la fermentación estaba inhibida por la respración, Lainhibición de la fermentación por oxígeno es lo que se conoce como Efectoinhibición de la fermentación por oxígeno es lo que se conoce como EfectoPasteur.

En Sacchaomyces cerevisiae la inhibición solo ocurre cuando la concentraciónde glucosa es menor a 2g/L. Si es mayor hay fermentación aún en condicionesaeróbias. Este fenómeno fue descubierto por Crabtree en 1929 y se lo conocecomo Efecto Crabtree.

Metabolismo

Fermentación: alcohólica (levaduras/hongos filamentosos)láctica (Oomycota/Zygomycota)

Sacchaomyces cerevisiae es aerobio facultativo, pero particular, ya que norequiere anaerobiosos para fermentar. Un exeso de axúcar reprime las enzimasrespiratorias. En condiciones aerobias sólo un 3% de la glucosa es respirada,con galactosa un 29%.

Fermentación alcohólica

piruvato decarboxilasa alcohol deshidrogenasaPirúvico acetaldehido etanol

+ CO2NADPH NADP

Utilización de azúcares

Hay hongos que pueden crecer igual de bien utilizando glucosa, fructosa omanosa como fuente de carbono. Puede variar la forma de la curva (distintafase lag por ejemplo).g j )

Generalmente con galactosa el crecimiento es inferior comparado con otrashexosas

Muchos hongos también pueden utilizar arabinosa y xilosa, presentes en lashemicelulosas vegetales

La lactosa sólo puede ser aprovechada por aquellos hongos que tienen β-galactosidasa (lactasa)

La maltosa puede ser hidrolizada intracelularmente, hay en la membranauna maltosa permeasa.

La sacarosa se hidroliza extracelularmente por acció de una invertasa osacarasa a glucosa y fructosa que son transportadas al interior celular.

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Utilización de azúcares

Además del tipo de fuente importa la concentración.

Concentraciones por encima de una concentración crítica pueden llevar a laacumulación de metabolitos tóxicos, reducción de pH debido a laacumulación de ácidos orgánicos, agotamiento de otros nutrientes,problemas de stress osmótico (Glc > 20% p/v)

Los requerimientos pueden no ser iguales para el crecimiento vegetativoque para la fructificación (cantdad y calidad)que para la fructificación (cantdad y calidad)

Importa también la relación C/N


CAzucares simples favorecen crecimiento vegetativo y diferenciación asexualCDisacáridos y polisacárido favorecen desarrollo sexual

NUTRICIÓN CARBONADA NUTRICIÓN CARBONADAFuentes complejas:

-Tejidos vegetales: Madera (chips viruta aserrín)-Tejidos vegetales: Madera (chips, viruta, aserrín)Hojas (restos de poda) RastrojosPajasSalvadoGranosOtros

-Derivados de vegetales: Papel, cartóng pBagazosPulpasMelazaOtros residuos agroindustrialesResiduos domiciliariosOtros

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Pared vegetal

- Difusión simple- Difusión facilitada - Transporte activo

Sistemas: constitutivos,inducibles, reprimibles

Incorporación de azúcares

azúcaresp

baja afinidadalta afinidad

Incorporación de azúcaresProcesos de transporte de solutos en hongos a través de membrana:

Difusión: desplazamiento neto de moléculas a favor de un gradiente de concentración electroquímica.

Difusión simple o pasiva: flujo neto desde zona de > concentración a una de < concentración, a través de la membrana celular. A una temperatura dada la velocidad depende de la magnitud del gradiente de concentración (Δc) y la difusión cesa al igualarse las concentraciones a ambos lados de la membrana.

Difusión facilitada: proteínas transmembrana transportadoras, expone sitio de unión al sustrato alternativamentes a ambos lados de la membrana por cambios conformacionales. La cinética de transporte se asemeja a la de las reacciones enzimaticas: presenta cinética de saturación especificidad por sustrato fenómenosenzimaticas: presenta cinética de saturación, especificidad por sustrato, fenómenos de competiciópn y sensibilidad a inhibidores.

Los canales ionicos y carriers pueden funcionar con y sin energía metabólica. Si funcionan sin energía la fuerza impulsora la da el gradiente de concentración electroquímica del soluto

Con gasto de energía: transporte activo, acoplado al metabolismo, en contra de gradiente electroquímico

Incorporación de azúcares

Hay 2 formas de transporte activo dependiendo del modo de acoplar la energíametabólica (primario y secundario) estudiado en levaduras.

Transporte activo primario: carrier con 2 actividades catalíticas: hidrolizante de ATPy translocadora de iones. Se llaman ATPasas de transporte o bomba de iones.Translocan solo pequeños iones.

Transporte activo secundario: la bomba de protones genera un gradientel t í i d t i l d t t ti d ielectroquímico de protones que impulsa procesos de transporte activo secundario no

acoplados directamente a la energía metabólica. Su fuerza de impulso es el gradientede protones, hay un co-transporte con los protones

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Regulación

Glucosa es la fuente favorita

Centro del metabolismo (gicolisis PPP reser as paredes)Centro del metabolismo (gicolisis, PPP, reservas, paredes)

¿Cómo se asegura? Hay represión catabólica (glucosa y otros azúcares fácilmente hidrolizables reprimen el uso de otras fuentes)

Represión transcripcional (de enzimas que degradan otras fuentes, de transportadores)

Inactivación activación de enzimasInactivación, activación de enzimas

Proteólisis

Represión catabólica - S. cerevisiae

+ glucosa enzimas glucólisissíntesis transportadores de glucosap gcapacidad de utilizar otras fuentes de Cenzimas rel. con aerobiosis (Krebs, CR)gluconeogénesisciclo del glioxilato

Malato sintasa – ciclo del glioxilatoFructosa bifosfatasa – gluconeogénesisIsocitrato liasa. Ciclo del glioxilatoCitocromo oxidasa – Cadena respiratoriaMalato deshidrogenasa – ciclo de KrebsGlutamato deshidrogenasa – metabolismo del N

Ejemplos de enzimas que se inhiben con Glc

S. cerevisiaecurva diáuxica

Cels. desreprimidasrespiranEl crecimiento diaúxico es un tipo de

Cels. reprimidasfermentan

respiranpcrecimiento microbiano bifásico que tienelugar cuando hay presente dos sustratosdiferentes que pueden ser utilizadoscomo fuente de carbono. El metabolismodel organismo es selectivo para uno delos sustratos (utiliza la fuente de carbonoque permite el crecimiento más rápido) ycuando la agota, comienza a metabolizarel otro sustrato, esta vez, con una faseexponencial mas suave.

Represión catabólica en hongos filamentososAspergillus nidulans

+ glucosa incorporación otras fuentesgluconeogénesisciclo del glioxilatosíntesis de enzimas degradadoras de polisacáridossíntesis de penicilina

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NUTRICIÓN NITROGENADA

Nitrógeno (12-16% de la biomasa fúngica seca)

Hongos lo requieren para

Aminoácidos para proteínas (16% del N)Purinas y pririmidinas para ácidos nucleicosGlucosamida para quitinaVarias vitaminas

F tFuentesAminoácidos. Amonio, nitrato

Medio debe tener 10 veces mas C que NRelación C/N > o = 10 garantizará alto contenido proteícoRelación C/N en exceso. Favorecerá la acumulación de alcohol, metabolitos secundarios derivados de AcO, lipidos o polisacárdos extracelulares


Fuentes de N:

N2 NO3- NO2

- NH4+ N-orgánico

I + + + + +

II + + + +

(Robbins, 1937)

III + +

IV +


NO3- los que usan esta fuente

t bié i Ntambién usan amonio y Norgánico. Muchosbasidiomycetes no lo utilizan,tampoco las levaduras. Suelosricos en nitratos por acción debacterias nitrificantes y adiciónde fertilizantes. El nitrato seadiciona al medio en forma desales inorgánicas: NaNO3sales inorgánicas: NaNO3,KNO3·, NH4NO3·. Lo utilizan apH alcalino porque a pH ácidose forma ácido nitroso (HNO2)tóxico


NH4+ se adiciona como sulfato, cloruro,

acetato, tartrato, fosfato, etc. Sales orgánicas o, , , ginorgánicas. Es la fuente favorita de N y en suprecsencia la utilización de otras fuentes esreprimida

N orgánico. Todos pueden usarlo. Unospocos requieren esta fuente de N. No todoslos aminoácidos son igualmente efectivos.Hidrolizados enzimáticos, por ejemplo

i á id t i t t bcasaminoácidos, triptona, peptona son buenafuente de aminoácidos, salvo triptofano quese destruye con hidrólisis ácida

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Hongos en el Ciclo del N:

* AmonificaciónM Orgánica N NH +M. Orgánica N NH4

* NitrificaciónNH4

+ NO2-

NO3-

En conds. de alto N

* DesnitrificaciónNO3

- N2O (óxido nitroso)NO2

-

Fusarium oxysporum, algunas levaduras.En conds. O2 limitante

Regulación

Como en el caso del C, fuentes de N fácilmente utilizables reprimen la incorporación y el uso de otras fuentes: represión catabólica del N

Amonio, glutaminaSíntesis nitrato y nitrito reductasaSíntesis de proteasasSíntesis de entradas de Aas

Vitaminas

Son compuestos orgánicos que actúan como coenzimas y producen efecto enconcentraciones muy pequeñas.En muchos casos no son de requerimiento absoluto pero favorecen el

Tiamina

crecimiento o la diferenciación

piridoxina imidazol

Vitaminas

Organismos protótrofos : no requieren vitaminas

auxótrofos : requieren alguna vitaminaauxótrofos : requieren alguna vitamina

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Vitaminas

Los requerimientos varían mucho entre distintas especies y aún entre cepas

No hay relaciones taxonómicas ni ecológicas aunque muchos saprobios desuelo son protótrofos.

Las vitaminas dentro de la célula son sintetizadas y destruidas. A veces sufalta puede ser superada por un producto de la reacción o un precursor,

A veces son liberadas al medio de cultivo. En la naturaleza permiten elcrecimiento de otro organismo auxótrofo.

El crecimiento depende de la concentración, pero altas concentracionespueden ser inhibitorias.pueden ser inhibitorias.

Los hongos no requieren de la vitamina C, ni las liposolubles (A,D,E, K)

Minerales esenciales

Stress por metales pesados

Cu, Zn, Fe, Ni, Pb, Ag, Cd, Hg

Son tóxicos, forman complejos con moléculas que tienen N y/o S (Ej: proteínas)Los hongos pueden sufrir stress por insuficiencia oLos hongos pueden sufrir stress por insuficiencia o exceso de ellos.

Stress por metales pesados

Estrategias para evitar los efectos tóxicos:

1- Evitado: Reducir la entrada a la célula

Síntesis de polisacáridos extracelulares que forman una matriz muscilaginosa enla que quedan embebidos estos metales

Secreción de oxalato, que al formar sales precipita

Producción de melaninas (polímeros fenólicos) eficientes absorventes de Cu, Zn,Fe, Pb

2- Secuestro: Reducir la prescencia de iones libres en el citosol.

Los iones entran a la célula pero en el interior son compartimentalizados envacolas o se sintetizan moléculas capaces de ligarlos.

Metaloproteínas: proteínas ligadoras de metales, de bajo PM ricas en cisteína.

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Temperatura

Luz

Longitud de onda

UVC UVB UVA infrarrojo

280 320 380 500 600 700

Tiempo

Crecimiento vegetativo competencia para responder

280 320 380 500 600 700 nm

efectos hongos

Crecimiento vegetativo competencia para responderal estímulo

Etapas fotoinhibición / etapas fotoestimulaciónFotoperíodoLuz continua

Fotoindiferentesrequerimiento absoluto

F t i d ió

Reproducción

Fotoinducción estimulatorio

Fotinhibición

Efecto morfogénico:iniciación

Inducción distintas etapas

Número

Morfología

Tamaño

Pigmentación

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Agua

actividad agua:

aw = ρρ 0

HR = 100 ρρ0

aw = HR100

ρ = Presión de vapor del agua en la soluciónρ0=Presión de vapor del agua pura

Ψ= − RT ln ρρ0

Potencial agua

pH

Externo: permeabilidad membranasSolubilidad de salesSolubilidad de sales

Interno: actividades enzimáticasComponentes celulares

Homeostasis: ATPasa regulación de vías metabólicas que usan o liberan protones

Ácidos débiles pueden ingresar y bajar el pH afectando distintas funciones celulares y hasta causar la muerte celular.

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pH

pH del medio cambia durante el crecimiento

Primero aumenta la actividad respiratoria, se libera CO2 y baja el pH

Si se incorpora cationes NH4+ libera H+ baja pHSi se incorpora aniones NO3- incorpora H+ sube pH

Se debe ajustar iniciamente el pH del medio

Aireación[ O2 ] dimorfismo Mucor rouxii

[CO ] peritecios Chaetimium globosum[CO2] peritecios Chaetimium globosumconidiación Neurospora crassaexpansión del píleo basidiomicetes

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