Citric Cycle Krebs
of 5
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-
7/25/2019 Citric Cycle Krebs
1/5
XX. THE
FORMATION
OF CITRIC AND
a-KETOGLUTARIC
ACIDS IN THE
MAMMALIAN
BODY
BY HAN S AD OLF KREBS,
ERNEST
SALVIN
AN D
WILLIAM
ARTHUR JOHNSON
From t h e
D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y ,
U n i v e r 8 i t y
o f
S h e f f i e l d
R e c e i v e d
1
D e c e m b e r
1 9 3 7 )
FROM e x p e r i m e n t s
r e p o r t e d
i n a p r e v i o u s
p a p e r [ K r e b s
J o h n s o n ,
1 9 3 7 ]
we
c o n c l u d e d
t h a t c a r b o h y d r a t e
i s
o x i d i z e d i n a n i m a l
t i s s u e s t h r o u g h
t h e
f o l l o w i n g
s e r i e s
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O x a l o a c e t i c
a c i d + c a r b o h y d r a t e
d e r i v a t i v e
\
( p y r u v i c
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l - M a l i c
a c i d
C i t r i c
a c i d
t
F u m a r i c a c i d a - K e t o g l u t a r i c a c i d
S u c c i n i c
a c i d
T h e e v i d e n c e
i n
s u p p o r t
o f
t h i s s c h e m e ,
t h e
c i t r i c a c i d c y c l e
,
w a s d e r i v e d
f r o m
w o r k o n
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I n
t h e
p r e s e n t
p a p e r
e x p e r i m e n t s
w i l l
b e r e p o r t e d
w h i c h s u p p l e m e n t
t h e
p r e v i o u s
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o n
t h e i n t a c t
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w i l l b e
s h o w n
t h a t c o n s i d e r a b l e
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a n d
o c - k e t o g l u t a r i c
a c i d s
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i n
t h e
u r i n e
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r a b b i t s
a n d
r a t s
a f t e r
i n t r a v e n o u s
i n j e c t i o n
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s u c c i n i c ,
f u m a r i c ,
1 - ) - m a l i c
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o c - - k e t o g l u t a r i c
a n d
s u c c i n i c a c i d s
a r e e x c r e t e d
i f c i t r i c a c i d i s
i n j e c t e d .
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p o s s i b l e
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s t r a t e
t h e o c c u r r e n c e
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c i t r i c a c i d
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t h e
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w e r e
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b y
a
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S m i t h
[ 1 9 3 7 ]
who
i n j e c t e d
2 1
d i f f e r e n t
s u b s t a n c e s
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i n t o
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t h e
e x c r e t i o n
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c i t r i c
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o n l y
s u c c i n i c , f u m a r i c ,
1 ( - ) - m a l i c
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t h e
c i t r i c
a c i d
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e x p e r i m e n t s
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e x t e n d
t h e
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t h e
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t i s s u e s .
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s u c c i n i c ,
f u m a r i c ,
m a l i c
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a n d
t h e
e f f e c t
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two
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T h e
f i r s t
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c i t r i c
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a c - k e t o g l u t a r i c
a c i d s
t h r o u g h
t h e
c i t r i c
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c y c l e ,
w h e r e a s m a l o n i c
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a c t s
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T h e
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o f c i t r i c
a n d
o c - k e t o g l u t a r i c
a c i d s a r e
n e c e s s a r i l y
n o t
q u a n t i t a t i v e
a n d
t h e
e v i d e n c e i s t h e r e f o r e
o n l y
o f
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q u a l i t a t i v e
n a t u r e .
T h e
q u e s t i o n
t o
w h a t
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o x i d a t i o n s
a r e
b r o u g h t
a b o u t
t h r o u g h
t h e c i t r i c a c i d
c y c l e
c a n
a s
y e t
n o t
b e
d e c i d e d
b y
w o r k
o n
t h e
i n t a c t
n o r m a l
o r g a n i s m ,
b u t
o n l y
b y
e x p e r i m e n t s
o n i s o l a t e d
t i s s u e s .
E x p e r i m e n t a l
p r o c e d u r e
R a b b i t s
w e i g h i n g
a b o u t
2
k g .
w e r e u s e d f o r
m o s t
e x p e r i m e n t s .
T h e s o l u t i o n
was
i n f u s e d
i n t o
an e a r v e i n
w i t h t h e
s l o w
p e r f u s i o n
a p p a r a t u s
o f B u r n
D a l e
[ 1 9 2 5 ] .
T h e
a n i m a l
was
k e p t
i n a
m e t a b o l i s m c a g e
a n d
t h e
u r i n e was
c o l l e c t e d
B i o c h e m .
1 9 3 8
x x x i i
1 1 3 )
8
-
7/25/2019 Citric Cycle Krebs
2/5
H . A .
KREBS,
E .
SALVIN
AND W. A .
JOHNSON
i n f l a s k s
c o n t a i n i n g
a
f e w
m l . 2 0
H 2 S O 4
a s
a n t i s e p t i c .
A s
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1 0 0
m l .
0-2M
s o l u t i o n s o f t h e s u b s t r a t e
w e r e
i n f u s e d .
T w o - t h i r d s o f t h e a c i d
e q u i v a l e n t s
w e r e
n e u t r a l i z e d
w i t h
N a O H ,
u n l e s s
o t h e r w i s e
s t a t e d . T h e
a c i d
s o l u t i o n s
p r e v e n t
d e v e l o p m e n t
o f t h e a l k a l o s i s
a r i s i n g
f r o m
t h e
o x i d a t i o n o f
t h e
i n f u s e d
s o d i u m
s a l t s
o f
c o m b u s t i b l e
a c i d s . T h e r a t e o f
i n f u s i o n w a s
1 - 2
m l .
p e r
m i n .
N o s e r i o u s
i l l - e f f e c t s
w e r e o b s e r v e d d u r i n g
o r a f t e r
t h e
i n f u s i o n
e x c e p t
i n
t h e
c a s e o f
c i t r i c
a c i d .
C i t r a t e
a n d
c i t r i c
a c i d ,
a s
i s
w e l l
k n o w n ,
a r e h i g h l y
t o x i c
i f i n j e c t e d
i n t r a v e n o u s l y
[ S a l a n t
W i s e ,
1 9 1 6 ] .
We
o b s e r v e d
d y s p n o e a
a n d c o n v u l s i o n s
a f t e r
i n j e c t i o n
o f
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1 0 m l . 0 - 2 M
s o d i u m
c i t r a t e . T h e t o x i c
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w a s a b o l i s h e d
b y
c a l c i u m a n d w e h a v e
t h e r e f o r e
u s e d
a
m i x t u r e
o f d i s o d i u m
c i t r a t e
a n d
a c i d
c a l c i u m
c i t r a t e f o r
t h e
i n f u s i o n .
A
f e w
e x p e r i m e n t s
w e r e
p e r f o r m e d
o n
r a t s
t o
w h i c h
t h e
s u b s t a n c e s
w e r e
a d m i n i s t e r e d
s u b c u t a n e o u s l y .
A l l d e t e r m i n a t i o n s
w e r e
c a r r i e d
o u t o n 2 4
h r .
s p e c i m e n s
o f
u r i n e .
C i t r i c
a c i d
w a s
d e t e r m i n e d
a c c o r d i n g
t o
P u c h e r
e t
a l
[ 1 9 3 6 ] .
o c - K e t o g l u t a r i c
a c i d
w a s
e s t i m a t e d
b y t h e
m e t h o d
o f K r e b s [ 1 9 3 8 ] . S p e c i a l
c a r e
w a s t a k e n t o
d e s t r o y
i n t e r f e r i n g
s u b s t a n c e s
s u c h
a s
o x a l o a c e t i c a c i d
b e f o r e
t h e d e t e r m i n a t i o n
o f
c i t r i c
a c i d
[ s e e
K r e b s
J o h n s o n ,
1 9 3 7 ] .
S u c c i n i c
a c i d
w a s
d e t e r m i n e d
i n
t h e
f o l l o w i n g
w a y :
t h e
u r i n e
w a s
d e p r o t e i n i z e d
w i t h
t u n g s t i c
a c i d a n d
o c - k e t o g l u t a r i c
a c i d
w a s r e m o v e d f r o m
t h e s o l u t i o n
a s
d i n i t r o p h e n y l h y d r a z o n e ,
a s
d e s c r i b e d
i n
t h e
p r e c e d i n g
p a p e r .
T h e
a q u e o u s
p h a s e
w a s
t h e n f r e e d f r o m e t h e r
a n d t r e a t e d
e x h a u s t i v e l y
w i t h
p e r m a n g a n a t e .
T h e
v o l u m e
o f t h e
s o l u t i o n
w a s
m e a s u r e d ,
t h e
M n O 2
f o r m e d w a s
f i l t e r e d
o f f
a n d
s u c c i n i c
a c i d
w a s
e x t r a c t e d
f r o m
a n
a l i q u o t
o f t h e i f i t r a t e
a n d
d e t e r m i n e d
m a n o m e t r i c a l l y
[ K r e b s ,
1 9 3 7 ] .
T h e
s u c c i n i c
a c i d f o u n d t h u s i n c l u d e s t h e
s u c c i n i c a c i d
f o r m e d
b y
o x i d a t i o n
w i t h
p e r m a n g a n a t e .
T h e t o t a l
q u a n t i t y
o f
s u c c i n i c
a c i d
f o u n d
i n
n o r m a l
u r i n e
i s
t o o
s m a l l
t o a l l o w o n e t o
d i s t i n g u i s h
b e t w e e n
p r e f o r m e d
s u c c i n i c
a c i d
a n d
s u c c i n i c
a c i d
f o r m e d
b y
o x i d a t i o n .
R e m u l t s
E a c h
t y p e
o f
e x p e r i m e n t
w a s
c a r r i e d o u t t w o
o r
t h r e e
t i m e s
w i t h u n i f o r m
r e s u l t s .
T y p i c a l r e s u l t s a r e
r e c o r d e d
i n
T a b l e s
I a n d I I
a n d
F i g s .
1
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2 .
I t
w i l l
b e
s e e n t h a t c i t r i c a n d
o - k e t o g l u t a r i c
a c i d s
a p p e a r
i n
t h e
u r i n e
i n
c o n -
s i d e r a b l e
q u a n t i t i e s
a f t e r t h e i n j e c t i o n s . A s s u m i n g t h a t
t h e
a c i d s
a r i s e
f r o m
t h e
i n j e c t e d
C 4 - d i c a r b o x y l i c
a c i d s
t h r o u g h
t h e c i t r i c
a c i d c y c l e
w e
c a l c u l a t e
t h e
f o l l o w i n g
y i e l d s :
C i t r i c
a n d
o c - k e t o g l u t a r i c
a c i d s
f o u n d
A c i d i n j e c t e d M i c r o m o l s . M i c r o m o l s . Y i e l d
F u m a r i c
2 0 , 0 0 0
6 9 4 3 . 5
O x a l o a c e t i c
2 0 , 0 0 0
8 8 6
4 . 4
I -
) - M a l i c
2 0 , 0 0 0
4 8 4
2 . 4
S u c c i n i c
2 0 , 0 0 0 1 5 4
0 - 8
I f
c i t r i c
a c i d i s
i n j e c t e d ,
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s m a l l
f r a c t i o n
a p p e a r s
u n c h a n g e d
i n
t h e
u r i n e
[ s e e
O s t b e r g ,
1 9 3 1 ] ,
f o r
i n s t a n c e
13 i n t h e e x p e r i m e n t
r e c o r d e d
i n T a b l e
I .
T h u s
o n l y
a
s m a l l f r a c t i o n
o f c i t r i c a c i d
p r e s e n t i n t h e b o d y
e s c a p e s
o x i d a t i o n
a n d
i s
p a s s e d
i n t o
t h e
u r i n e ;
i t
i s
t h e r e f o r e
j u s t i f i a b l e
t o
a s s u m e
t h a t
v e r y
much
m o r e
c i t r i c
a n d
o - k e t o g l u t a r i c
a c i d s
a r e
a c t u a l l y
f o r m e d
i n t h e b o d y
a f t e r
t h e
i n j e c t i o n
t h a n
a r e
f o u n d
i n
o u r
e x p e r i m e n t s .
M a l o n i c
a c i d i s
k n o w n t o
b e
e x c r e t e d
u n c h a n g e d ;
i t
i s
n o t
m e t a b o l i z e d .
T h e
w o r k o n i s o l a t e d
e n z y m e
s y s t e m s
s h o w s
t h a t t h e a c i d i s
a n
e n z y m e
p o i s o n
[ Q u a s t e l
W o o l d r i d g e ,
1 9 2 9 ] .
M a l o n a t e
i n h i b i t s i n
t h e
f i r s t
p l a c e
s u c c i n i c
d e h y d r o g e n a s e
a n d
w e
f i n d
a c c o r d i n g l y
a
l a r g e
o u t p u t
o f
s u c c i n i c
a c i d
a f t e r
1 1 4
-
7/25/2019 Citric Cycle Krebs
3/5
1
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o
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4 1 )
.4
k
0
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0
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a c i d
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F i g .
1 .
C i t r i c ,
o c - k e t o g l u t a r i c
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s u c c i n i c
a c i d s
i n
t h e u r i n e o f r a b b i t s a f t e r
i n t r a v e n o u s
i n j e c t i o n
o f
f u m a r i c ,
m a l o n i c ,
o x a l o a c e t i c ,
c i t r i c a n d
1
-
) - m a l i c
a c i d s .
4 0 0 -
~ ~ ~ ~ ~ ~
o e
3 0 0 0
3U
00|
1 0 0 S I[ .
I -
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C i t r i c
a c i d
E
=
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a c i d
2
=
S u c c i n i c
a c i d
F i g .
2 .
C i t r i c ,
o c - k e t o g l u t a r i c
a n d
s u c c i n i c
i d s
i n
t h e u r i n e o f
r a t s
a f t e r
s u b o u t a n e o u s
i n j e c t i o n
o f
m a l e i c ,
m a l o n i c
a n d
o x a l o a c e t i a
a c i d s .
8
-2
-
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4/5
1 1 6 H . A .
KREBS, E . SALVIN AND
W.
A .
JOHNSON
T a b l e I .
E x p e r i m e n t s
o n r a b b i t s
W t . 1 9 0 0 - 2 0 0 0 g . ; t h e i d s i n j e c t e d w e r e p a r t l y n e u t r a l i z e d s e e t e x t ) e x c e p t
m a l o n i c a c i d
w h i c h
w a s i n j e c t e d a s n e u t r a l N a s a l t ;
c i t r i c
a c i d
w a s
a s o l u t i o n o f 3 - 8 g .
a n h y d r o u s
c i t r i c a c i d ,
1
g . C a C O 3 ,
0 - 8 g .
NaOH
i n 1 0 0 m l .
E x c r e t e d
( m i c r o m o l s . )
i n
2 4
h r .
R a b b i t
n o . Day
I
1
2
3
4
5
6
1 1
1 2
I I 1
2
5
I I I 1
2
S o l u t i o n
i n j e c t e d
9 6
m l . M/ 5
f u m a r i c
a c i d
N i l
1 0 0
m l . M/ 5
f u m a r i c
a c i d
M/10
m a l o n a t e
N i l
N i l
1 0 0
m l . M/ 5 n e u t r a l m a l o n a t e
1 0 0 m l .
o x a l o a c e t i c a c i d
N i l
1 0 0
m l .
c i t r i c
a c i d
N i l
1 0 0 m l . M/ 5 s u c c i n i c
a c i d
1 0 0 m l .
M/ 5
I
-
) - m a l i c
a c i d
N i l
C i t r i c
a c i d
3 0 0
2 6
3 5 5
2 5
1 7
4 9
6 1 5
2 0 8
2 3 1 0 )
2 5 - 5
8 4
2 0 1
7 7
a - K e t o -
g l u t a r i c
a c i d
3 9 4
1 8
4 8 7
3 1
1 8
1 6 1
2 7 1
7 2 - 2
4 4 0
1 2
7 0
2 7 3
2 5
S u c c i n i c
a c i d
1 1 6
3 2
5 5 4
4 0
2 5
2 1 0
9 9
5 9
5 2
2
6 3 0 0 )
5 9
3 9
T a b l e
I I . E x p e r i m e n t s
o n
r a t s
F o u r
r a t s
u s e d f o r e a c h
e x p e r i m e n t .
W t . i n
E x p .
I :
1 7 8 , 1 8 4 ,
2 2 1 a n d 2 2 8
g .
E x p .
n o .
Day
I
1
2
3
4
5
6
I I
1
2
S o l u t i o n
i n j e c t e d p e r
r a t )
N i l
2
m l . M
N a - m a l o n a t e
N i l
N i l
2
m l .
M
N a
o x a l o a c e t a t e
N i l
0 - 5 M N a m a l e a t e
N i l
2 1 8 , 2 6 0 , 2 2 5 a n d 2 0 7
g . ;
i n
E x p .
I I :
M i c r o m o l s . e x c r e t e d
i n 2 4
h r .
o c - K e t o -
C i t r i c g l u t a r i c
S u c c i n i c
a c i d a c i d a c i d
1 - 3
5 1 - 4
2 - 2
9 . 7
5 . 3
3 8 2
6 0 - 0
1 7
4 . 9
1 2 0 9 6 - 5
1 2 - 8
5 . 4
3 2 4
8 - 8
1 2 - 4
3 0 - 0
8 - 0
2 0 - 5
8 - 7
i n j e c t i o n
o f m a l o n a t e .
I t i n c r e a s e s
t o o ,
t o
some
e x t e n t ,
t h e e x c r e t i o n o f c i t r i c
a n d
o c - k e t o g l u t a r i c
a c i d s .
T h e
m a g n i t u d e
o f t h i s s i d e
e f f e c t
s e e m s
t o
v a r y
i n
d i f f e r e n t
s p e c i e s .
G r e v i l l e
[ 1 9 3 6 ]
a n d
W e i l - M a l h e r b e
[ 1 9 3 7 ]
h a v e
r e c e n t l y
s u g g e s t e d
t h a t
s u c c i n i c
d e h y d r o g e n a s e
may b e
p r o t e c t e d
f r o m
m a l o n a t e i n
t h e
s t r u c t u r a l l y
i n t a c t
t i s s u e . O u r e x p e r i m e n t s s h o w , h o w e v e r ,
a n
i n h i b i t i o n
o f
s u c c i n i c
d e h y d r o g e n a s e
i n
t h e
i n t a c t
b o d y .
M a l e i c
a c i d
c a u s e s an
i n c r e a s e d c i t r i c a c i d
e x c r e t i o n
i n O r t e n
S m i t h ' s
a n d o u r
e x p e r i m e n t s
( T a b l e
I I ) .
I t i s
p r o b a b l e
t h a t
m a l e i c
a c i d ,
t o o ,
i s
a n
e n z y m e
p o i s o n , b u t we
c a n n o t
e x c l u d e t h e
p o s s i b i l i t y
t h a t
i t a c t s a s
a
p r e c u r s o r
l i k e
f u m a r i c
a c i d .
T h u n b e r g [ 1 9 2 0 ]
a n d
L a k i
[ 1 9 3 5 ] r e p o r t e d
t h a t
m a l e i c
a c i d
i s
m e t a b o l i z e d
i n a n i m a l
t i s s u e s .
SUMMARY
1 . C i t r i c
a n d
a - k e t o g l u t a r i c
a c i d s a p p e a r i n
t h e
u r i n e
o f
r a b b i t s
a n d
r a t s
a f t e r
i n j e c t i o n
o f
s u c c i n i c ,
f u m a r i c ,
1 - ) - m a l i c
o r
o x a l o a c e t i c
a c i d s .
T h i s
i s
c o n s i d e r e d
t o
b e
e v i d e n c e i n
s u p p o r t
o f
t h e
c i t r i c a c i d
c y c l e .
-
7/25/2019 Citric Cycle Krebs
5/5
CITRIC
AND KETOGLUTARIC
ACID
FORMATION
2 .
M a l o n a t e ,
i n j e c t e d i n t o
r a b b i t s o r
r a t s ,
c a u s e s
a n e x c r e t i o n
o f s u c c i n i c
a c i d a n d ,
t o
a l e s s e r
e x t e n t ,
o f
c i t r i c
a n d
o c - k e t o g l u t a r i c
a c i d s .
S i n c e
m a l o n a t e
i s
n o t
m e t a b o l i z e d i n a n i m a l t i s s u e s i t s
e f f e c t
m u s t b e
d u e t o t h e
i n h i b i t i o n o f
t h e
e n z y m e s
c o n c e r n e d
w i t h t h e
b r e a k d o w n o f
s u c c i n i c ,
c i t r i c
a n d
c x - k e t o g l u t a r i c
a c i d s .
REFERENCES
B u r n D a l e 1 9 2 5 ) . J .
P h y s i o l . 5 9 , 1 6 4 .
G r e v i l l e
1 9 3 6 ) .
B i o c h e m .
J .
3 0 ,
8 7 7 .
K r e b s 1 9 3 7 ) . B i o c h e m .
J . 3 1 , 2 0 9 5 .
1 9 3 8 ) . B i o c h e m .
J .
3 2 i n
t h e
P r e s s ) .
_ _ _ _
J o h n s o n 1 9 3 7 ) .
E n z y m o l o g i a ,
4 , 1 4 8 .
L a k i
1 9 3 5 ) .
H o p p e - S e y l . Z .
2 3 6 , 3 5 .
O r t e n
S m i t h 1 9 3 7 ) .
J .
b i o l .
C h e m .
1 1 7 ,
5 5 5 .
O s t b e r g 1 9 3 1 ) . S k a n d . A r c h . P h y 8 i o l .
6 2 , 8 1 .
P u c h e r ,
S h e r m a n
V i c k e r y
1 9 3 6 ) .
J .
b i o l .
C h e m .
1 1 3 , 2 3 5 .
Q u a s t e l
W o o l d r i d g e 1 9 2 9 ) . B i o c h e m .
J . 2 2 ,
6 8 9 .
S a l a n t
W i s e 1 9 1 6 ) . J .
b i o l .
C h e m . 2 8 ,
2 7 .
T h u n b e r g 1 9 2 0 ) .
S k a n d .
A r c h .
P h y s i o l . 4 0 , 1 .
W e i l - M a l h e r b e
1 9 3 7 ) .
B i o c h e m . J .
3 1 ,
2 8 9 .
N o t e
a d d e d
4
J a n u a r y ,
1 9 3 8 .
B r e u s c h h a s
r e c e n t l y q u e s t i o n e d
t h e e x i s t e n c e
o f t h e
c i t r i c a c i d
c y c l e
i n m u s c l e t i s s u e
[ H o p p e - S e y l .
Z .
2 5 0 ,
2 6 2 ] .
We
a r e ,
h o w e v e r ,
u n a b l e t o
a c c e p t
h i s
a r g u m e n t s
a n d
s h a l l
d i s c u s s t h e m
i n f u l l i n a
s u b s e q u e n t p a p e r .
1 1 7
