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Biocáncer 1, 2004

PROLIFERACION TUMORAL

Pedro C. Lara Jiménez (1), Domingo Navarro Bosch (2) y Marta Lloret Sáez Bravo (1)

(1) Servicio de Oncología RadioterápicaHospital General de Gran Canaria “Dr. Negrín”

(2) Laboratorio de FisiologíaCentro de Ciencias de la SaludUniversidad de Las Palmas de Gran Canaria

Instituto Canario de Investigación del Cáncer (ICIC)

ÍNDICE:

1. CINÉTICA CELULARCiclo celular

Apoptosis Cuantificación de la proliferación y de la apoptosis

2. CINÉTICA TUMORALCompartimentos celularesParámetros de cinéticaModelos de crecimiento

3. CRECIMIENTO TUMORAL: Heterogeneidad tumoral y metastatización

4. BIBLIOGRAFÍA

1. CINÉTICA CELULAR

1.1 Ciclo celular

Se denomina ciclo celular a la sucesión de eventos que tienen como resultado la

duplicación del material genético y la segregación en dos copias que dotarán a las dos células hijas. El

ciclo celular se divide en cuatro fases: G1,S,G2 y M (Figura 1).

La fase G1 ( "Gap" o intervalo) sigue a una división celular y es previo a la replicación del DNA.

Su duración es de unas 6 horas. En esta fase se produce el crecimiento plástico de la célula,

incrementando su tamaño, y desarrollando una situación de síntesis continua de sus estructuras. En este

momento, las células toman su decisión de dividirse y por tanto de progresar a lo largo del ciclo celular

o bien entrar en estados alternativos como la diferenciación o la quiescencia celular (Fase G0). En este

Pedro Carlos Lara Jiménez et al.

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Figura 1

punto denominado START o punto de restricción R, la célula debe salir de G1 y entrar en fase S, para

iniciar la replicación del DNA. La decisión de continuar con el ciclo celular, depende de que las

condiciones propias y ambientales sean adecuadas (nutrientes, factores de crecimiento, inhibidores,

contacto célula a célula, etc). En la fase S (Síntesis) se duplica el DNA y tiene una duración de 6 a 8

horas. Así, cada cromosoma pasa a tener dos moléculas de DNA de cadena doble (cromátidas), la

original y la copia. En la fase G2 las células se preparan para la división celular. Tiene una duración de

3-4 horas. Al final de la misma, se sitúa un segundo punto de decisión, previo al comienzo de la mitosis,

el punto de control G2-M. Su función es asegurarse de que el DNA no contiene errores y está preparado

para segregarse en la mitosis. Una vez superado este control, la célula entra en mitosis (M) que se

subdivide en 4 fases. Previamente, los cromosomas sufren un fenómeno de condensación y se empieza

a formar el huso mitótico a través de la organización de los microtúbulos en dos cuerpos polares. En la

profase desaparece la membrana nuclear, uniéndose los cromosomas a los microtúbulos en la zona

central de la célula (metafase). Hacia el final de esta fase, se define otro punto de control (M), que

permitirá continuar con la mitosis, solo si la disposición de los cromosomas en el huso mitótico es la

adecuada. En la anafase, las cromátidas se separan y migran hacia los polos celulares. Una vez estos son

alcanzados (telofase), la célula se divide por la zona central dando lugar a dos nuevas células.

Una gran variedad de proteínas, controla y coordina el ciclo celular en células eucariotas. Las

principales son las quinasas dependientes de ciclina (Cyclin-Dependent Kinases "CDKs"), que consisten

en dos subunidades mayores, una catalítica y otra substrato (ciclina). Existen varios tipos de subunidades

catalíticas, cuya actividad quinasa depende de su asociación con las ciclinas. Esta actividad quinasa,

permite fosforilar proteínas, lo que se traduce en cambios en la actividad o estructura de las mismas.

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Existe también una gran variedad de ciclinas, que son necesarias en diferentes momentos del ciclo

celular, fluctuando por tanto sus niveles en las distintas fases. Así algunas están elevadas en fase

G1(ciclinas D y E), otras en G2/M o ciclinas mitóticas (A y B). Estas variaciones en la formación de

complejos CDK-ciclina, es la reponsable de cambios en la actividad de ciertas proteínas, que promueven

la progresión del ciclo celular. Así las ciclinas G1 se unen a CDKs durante G1 permitiendo el inicio de la

fase S, mientras que las ciclinas mitóticas se unen a CDKs durante la fase G2, favoreciendo la entrada

en mitosis.

La regulación de los diversos puntos de control es compleja. El proceso central en la regulación

de este "restriction checkpoint"(punto de control de restricción, R), es la fosforilación o defosforilación

de la proteína codificada por el gen retinoblastoma (Rb). Cuando Rb está hipofosforilada, inhibe a E2F,

evitando que éste induzca la expresión de genes que regulan la síntesis de DNA. La fosforilación de Rb

conlleva alteraciones, que impiden su unión y por tanto la inhibición de E2F, quedando esta libre para

promover la síntesis de DNA.

El punto de restricción R se regula por diversas CDKs, reguladas a su vez por inhibidores (CDKIs)

y otros moduladores. p21 CIP/WAF1, p27KIP1 y p57KIP2 inhiben tanto los complejos ciclina D-CDK4/6

como a los complejos ciclina E-CDK2 y ciclina A-CDK2 . p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c y p19INK4d,

interfieren de forma más selectiva sobre los complejos ciclina D-CDK4/6.

La síntesis de ciclina D es inducida por factores de crecimiento y disminuida por inhibidores de

la proliferación. La formación del complejo ciclina D-CDK4/6 provoca la fosforilación de Rb (completada

posteriormente por ciclina E-CDK2), liberando a E2F. Además el complejo ciclina D-CDK4/6, secuestra

los inhibidores de CDK2 (p21 CIP/WAF1, p27KIP1), lo que reduce el efecto inhibidor de estos CKIs sobre

ciclina E-CDK2, incrementando la capacidad de fosforilación de CDK2 sobre Rb.

Es evidente que alteraciones que conlleven altos niveles de ciclinas (D,E), sobreactivación de

CDK4/6 ó 2 o pérdidas de inhibidores de quinasas dependientres de ciclinas(CDKIs) como p16INK4a,

favorecerán la progresión del ciclo celular mediante, la supresión de este punto de control. Otras

alteraciones en relación con Rb que causarían este fenómeno, serían el secuestro de la proteína por

oncoproteínas virales o la pérdida (delección) del propio gen.

Otro gen central en la regulación de este punto de restricción es el gen p53. Así, ante la

presencia de un daño en el DNA, p53 se acumula induciendo la expresión de p21 CIP/WAF1, lo que

conlleva el bloqueo de este punto de control R a través de la inhibición de los complejos ciclina D-CDK4/6

y complejos con CDK2. Una vez reparado el daño, p53 reinicia el ciclo mediante la sobreexpresión de

MDM2. Si el daño no es reparado, p53 induce apoptosis o muerte celular programada, entre otros

induciendo al gen proapoptótico Bax.

Delecciones, mutaciones en el gen p53, secuestro proteico (infección HPV) etc, supondrían por

tanto alteraciones de la progresión celular similares a las descritas previamente.

En la fase S, el complejo ciclina A-CDK2 induce cambios en la estructura del DNA, controlando algunos

aspectos de la síntesis de DNA.

Pedro Carlos Lara Jiménez et al.

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Otro de los puntos de control es el llamado G2/M, cuya función principal es asegurar la integridad

del DNA, evitando la transmisión de mutaciones debidas a alteraciones cromosómicas. Su regulación está

controlada por la ciclina B y la quinasa Cdc2/CDK1. Los complejos ciclina B1-Cdc2/CDK1 son activados

y translocados desde el citoplasma al núcleo favoreciendo la mitosis. La degradación de la ciclina B en

la transición metafase-anafase, provoca la inactivación de Cdc2/CDK1 y la finalización de la mitosis. Las

células tumorales, suelen tener alterado este punto de control.

El punto de control M, evita los errores en la formación del huso acromático y de la placa

ecuatorial y asegura el adecuado reparto de material genético entre las dos células hijas.

Todos estos puntos de control, permiten que la ordenada progresión a través del ciclo celular,

se produzca cuando la integridad del material genético está asegurada, permitiendo además la influencia

de señales externas. La activación de estos controles y la subsequente detención del ciclo celular,

permite evitar la progresión de células con daños en el DNA. Estos daños pueden ser causados por

factores externos (drogas,radiaciones etc,) o por causas propias de la célula (reordenamientos genéticos,

DNA parcialmente degradado por acción de nucleasas, acortamiento de los telómeros ("envejecimiento

celular"). La progresión de células con daños graves, dará lugar a la inestabilidad genética y la

adquisición por parte de la célula de características oncogénicas.

En general la proliferación celular está sometida a la presencia de factores externos (factores

de crecimiento, interacciones con otras células, nutrientes, etc). Los factores de crecimiento son

generalmente proteínas, que actúan mediante uniones de alta afinidad a estructuras moleculares

especificas presentes en la membrana celular, llamadas receptores. Estos factores de crecimiento pueden

ser inductores (en su gran mayoría) o supresores (TGFb) de la proliferación celular, a través de la

promoción de la diferenciación celular, la movilidad y la adhesión celular entre otros.

Los factores de crecimiento producidos por las células, actúan sobre otros elementos celulares por

mecanismo endocrino (células situadas a distancia), mecanismo paracrino (células adyacentes) o por

mecanismo autocrino (sobre sí misma). De forma sucinta, una vez unido el factor de crecimiento a su

receptor, se inicia una cascada de procesos bioquímicos denominada sistema de transducción de señales,

que permite la llegada de esta señal proliferativa hasta el núcleo, donde, por ejemplo, por inducción de

la expresión de Ciclina D, se favorece la proliferación celular.

Los receptores de factores de crecimiento tienen 3 zonas o dominios importantes.

S extracelular, que permite la unión con el ligando (factor de crecimiento), lo que induce

la dimerización del receptor.

S transmembranal, que sirve de anclaje en la membrana

Proliferación Tumoral

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Fragmentos de ADN heterogéneosFragmentos homogéneos de ADN

Ruptura de organelas intracelulares. Organelas intracelulares no alteradas

Aumento del volumen y ruptura celularEncogimiento y fragmentación celular

Reacción inflamatoriaNo inflamación

Accidental, no programada, no selectivaProgramada genéticamente y selectiva

NecrosisNecrosisApoptosisApoptosis

Fragmentos de ADN heterogéneosFragmentos homogéneos de ADN

Ruptura de organelas intracelulares. Organelas intracelulares no alteradas

Aumento del volumen y ruptura celularEncogimiento y fragmentación celular

Reacción inflamatoriaNo inflamación

Accidental, no programada, no selectivaProgramada genéticamente y selectiva

NecrosisNecrosisApoptosisApoptosis

Tabla 1. Características diferenciales de la apoptosis y la necrosis

S citoplasmático, que tiene capacidad quinasa, fosforilando aminoacidos propios

(mayoritariamente de tirosina, tirosin-quinasas) autofosforilándose o transfosforilándose,

e induciendo nuevas fosforilaciones en proteínas que se unen a sus residuos de tirosina

fosforilados. Estas proteínas tienen a su vez actividad quinasa, consiguiendose la

transmisión de la señal (amplificada y diversificada) hasta el núcleo, a través de la

activación sucesiva y posterior translocación nuclear de algunas de estas

proteinquinasas. Este sistema de transducción de señales, induce la expresión de

mediadores de la proliferación celular.

1.2 Apoptosis

Debe existir un balance entre proliferación y muerte celular, de forma que el tejido no

crezca indefinidamente. Este tipo de muerte celular, se debe a la decisión de la propia célula de morir,

también llamada apoptosis, muerte genéticamente programada, o "suicidio celular". Es por tanto un

mecanismo de indudable importancia, en el modelado de nuestro organismo (periodo embrionario) y en

el mantenimiento adecuado de nuestras funciones. Este proceso se debe a la activación de mecanismos

específicos regulados por decenas de genes. De forma sucinta, la presencia de un daño en el DNA induce

la sobreexpresión de p53, que detiene el ciclo celular. Si el daño no es reparado, p53 induce la expresión

de Bax, un gen de la familia de BCL-2 con la que comparte gran parte de su estructura, y con la que

puede forma heterodímeros. Si Bax predomina, la célula entrará en apoptosis. Si BCL-2 predomina, la

célula entrará de nuevo en ciclo, portando graves defectos en su DNA, que puede comportar la

adquisición de capacidades oncogénicas. La regulación de este fenómeno es mucho más compleja, pero

se mantiene una estructura fina de genes inductores e inhibidores de la apoptosis. La característica

fundamental de la apoptosis es la rotura del DNA en fragmentos homogéneos de aproximadamente 180

pares de bases.

La muerte celular debida a deprivación de nutrientes, agentes tóxicos etc, tienen unas

características distintas y se denomina necrosis.

Pedro Carlos Lara Jiménez et al.

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Pérez, Tesis 1998

MAMA

Figura 2

1.3 Cuantificación de la proliferación y de la apoptosis

La estimación de la capacidad proliferativa de los tumores y de la expresión del

fenómeno apoptótico, no es una cuestión baladí. Existe una correlación entre apoptosis y proliferación

en tejidos sanos, pero también en tumores (Figura 2). Una mayor tasa de proliferación se ha asociado

con peor pronóstico en la mayoría de los tumores, y una peor respuesta a los tratamientos oncológicos

con quimioterapia y radioterapia. Así mismo, el porcentaje basal de células apoptóticas o la capacidad

de inducir la muerte celular por diversos tratamientos, han demostrado un relevante papel pronóstico

y predictivo de respuesta a tratamientos oncológicos.

Existen diversas técnicas para estimar la extensión de la expresión de estos fenómenos en los

tumores, algunas de las cuales describimos de forma resumida. Así, en laminillas diagnósticas, teñidas

con hematoxilina eosina, puede realizarse el recuento de mitosis y células apoptóticas, lo que permitirá

información aproximada de acerca de estos fenómenos en un paciente concreto. (Figura 3).

Sin embargo, las células proliferativas, no siempre están en mitosis, y por otra parte hay células

apoptóticas, en las que aún no se han hecho visibles los cambios morfológicos que requieren su

diagnóstico de visu. De esta forma se utilizan técnicas de inmunohistoquímica, que en principio

permitirían mejorar estos aspectos de detección, a la vez que podrían hacer mas objetiva su evaluación.

Proliferación Tumoral

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Figura 3

Figura 4

La inmunotinción con Ki67 permite detectar todas las células en ciclo celular, por lo que podría ser una

buena medida de la fracción de crecimiento (Figura 4). Los ensayos TUNEL, que marcan la incorporación

de bases nitrogenadas en el DNA fragmentado permitirían detectar precozmente la apoptosis.

Pedro Carlos Lara Jiménez et al.

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Células estériles

Células en fase G0

Células proliferantes

Células muertas

Fig 5: Compartimentos celulares de un tejido

Células estériles

Células en fase G0

Células proliferantes

Células muertas

Fig

Células en fase G0

Células proliferantes

Células muertas

Fig

Sin embargo, estas técnicas de inmunohistoquímica permiten la evaluación de un número

limitado de células. La utilización de citometría de flujo favorece el análisis de miles de células en

espacios de tiempo corto. Tanto la proliferación, estimada a partir del porcentaje de células en fase S,

como la apoptosis estimada mediante la tinción con yoduro de propidio y annexina V, son técnicas

adecuadas de medida. Es posible realizar técnicas mas complejas de biología molecular o hibridación in

situ.

2. CINÉTICA TUMORAL

2.1 Compartimentos celulares:

S Fracción de crecimiento. Es el porcentaje de células proliferativas, en ciclo

celular. Representa por tanto, la proporción de células del tumor que contribuye

al crecimiento del mismo. El tamaño de la fracción de crecimiento varía en un

mismo tumor, en función de las condiciones ambientales, acceso a nutrientes,

oxigenación, etc. Estas condiciones están directamente realacionadas entre

otros aspectos, con el volumen tumoral y por ende la distancia a los capilares

nutricios. Así el tamaño de la fracción de crecimiento es inversamente

proporcional al volumen tumoral.

S Fracción de pérdida celular. Es el porcentaje de células que pierde el tumor.

Entre las causas se encuentran la muerte celular, bien por apoptosis o necrosis

(falta de nutrientes y oxigenación) y la mestatatización. Efectivamente la

presencia de un microambiente tumoral hostil, asociado a la presencia de

Proliferación Tumoral

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subclones tumorales con capacidad de mestatatización provocan la pérdida

celular hacia otros órganos. La fracción de pérdida celular se incrementa de

forma proporcional con el volumen tumoral.

S Fracción de células quiescentes. Es el porcentaje de células que se

encuentran en fase G0, y que pueden ser reclutadas para entrar en ciclo celular,

si las circunstancias ambientales o la presencia de fuertes estímulos

proliferativos, así lo demandan.

S Fracción de células estériles o diferenciadas. Es el porcentaje de células

que no contribuyen al crecimiento tumoral.

2.2 Parámetros de cinética celular:

S Tiempo de ciclo: es el tiempo que tarda una célula en completar un ciclo

completo, desde una mitosis a la siguiente. El tiempo de ciclo, muestra grandes

variaciones de unas poblaciones celulares a otras.

S Tiempo de duplicación: es el tiempo que tarda un tumor en duplicar su

volumen. Este tiempo de duplicación, no es el mismo para todos los tumores,

ni se mantiene estable durante toda la vida del tumor. Así cuando, el volumen

tumoral es pequeño, la accesibilidad a los nutrientes y al oxigeno, supondrán

unas mejores condiciones ambientales, por lo que la fracción de crecimiento

será grande y la fracción de pérdida celular y de quiescencia será pequeña.

Como consecuencia, el tiempo que tardará el tumor en duplicar su tamaño, será

corto. Sin embargo cuando el tumor ha incrementado su volumen, el

microambiente tumoral, será peor, debido a la falta de nutrientes y oxigenación

en grandes regiones del mismo, por lo que la fracción de crecimiento será

menor y las fracciones de pérdida celular y quiescencia serán mayores. Como

consecuencia su tiempo de duplicación será mas largo.

2.3 Modelos de crecimiento

Gran parte de la vida de un tumor, discurre de forma subclínica. Así clásicamente se ha

definido un "umbral de detección clínica" por debajo del cual la enfermedad tumoral, aunque presente

no es detectable por la exploración clínica o las pruebas diagnósticas. De forma teórica, es necesaria la

presencia de 109 células en el tumor, lo que correspondería a un centímetro de diámetro, para traspasar

Pedro Carlos Lara Jiménez et al.

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109

Figura 6

109

Figura 7

este umbral. Existen dos modelos de crecimiento, el exponencial y el gompertziano. 109 células es el

umbral de detección clínica.

S En el modelo exponencial: la fracción de crecimiento y el tiempo de

duplicación permanecen constantes. (Figura 6).

S En el modelo gompertziano: Los parámetros anteriores varían con el

volumen del tumor y el microambiente tumoral, es decir, que los tumores

pequeños crecen más rápido, pero al aumentar el tamaño, la fracción de

crecimiento disminuye (por muerte celular, falta de "alimento", de O2....).

(Figura 7).

Proliferación Tumoral

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109

Figura 8

Metastasis

109

Figura 9

3. CRECIMIENTO TUMORAL

Los tumores son heterogéneos. Si bien su origen es monoclonal (un tumor procede de una

misma célula), la constante promoción celular, permite la aparición de mutaciones, que sobrepasando

los mecanismos de control, originan subclones celulares, con diferente carga genética y expresión

fenotípica, constituyendose un tumor clínico de caracter policlonal. Estas subpoblaciones tienen

diferentes características: afinidad, capacidad de metastatización, expresión de fenotipo receptorial para

hormonas o factores de crecimiento, sensibilidad o resistencia a fármacos. Esta heterogeneidad tumoral

es una de las principales limitaciones en el diagnóstico, estimación del pronóstico y efectividad de los

tratamientos de los cánceres en la práctica clínica diaria.(Figura 8).

El fenómeno que define la malignidad de un tumor es la aparición metástasis. El proceso de la

mestatatización se inicia temprano, en la etapa de crecimiento subclínico de la enfermedad. No todos

los subclones que componen un tumor tienen igual tendencia a la metastatización. Esta heterogeneidad

tumoral, limitará, como ya hemos descrito, la posibilidad de control tumoral por tratamientos oncológicos

e impedirá la estimación pronóstica exacta para cada paciente concreto (Figura 9).

4. BIBLIOGRAFÍA

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y práctica de oncología (5ª edición). Lippincott-Raven. Philadelphia, 1997; 121-134.4. Liang P, Pardee AB.Analysing differential gene expression in cancer. Nat Rev Cancer. 2003 Nov;3(11):869-76.5. Perez S.Rivero L, Rey A, Santana C, Lara P Apoptosis en cáncer de mama operable. Relación con los receptores

hormonales, ki67,p53 y sobreexpresión de cerb-2 En Dorta J, Diaz-Chico BN, Blasco,Gutierrez A Ed;Oncología Molecular2002, pp211-217

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