Catalisi Enzimatica/Biotrasformazioni in Chimica Verde....anatomia e fisiologia ... Gli egizi...

Catalisi Enzimatica/Biotrasformazioni

in Chimica Verde.Prof. Attilio Citterio

Dipartimento CMIC “Giulio Natta”

https://iscamapweb.chem.polimi.it/citterio/it/education/course-topics/

Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione

Corso 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

https://iscamapweb.chem.polimi.it/citterio/it/education/course-topics/

Attilio Citterio

Definizioni.

• Biochimica

Lo studio della chimica dei sistemi viventi

Lo studio delle molecole biologiche1. Come funzionano

2. Le loro strutture 3D

3. Come le loro funzioni si combinano per produrre un sistema vivente.

• Bioingegneria

Un ampio settore che può includere le ingegnerie elettrica, meccanica, industriale, ambientale e chimica che operano su sistemi medici e agricoli (ingegneria biologica ha lo stesso significato).

• Ingegneria Biomedica

Come l’ingegneria biochimica si applica comunemente al settore medico.

Attilio Citterio

Definizioni (2).

• Ingegneria Biochimica

L’uso per scopi pratici di organismi viventi o di prodotti di sistemi biologici

Ingegneria di processi che usano dei biocatalizzatori, materie prime bio-organiche e/o bio-assorbenti usando i principi dell’Ingegneria Chimica

• Biotecnologia

Ogni tecnica che usa organismi viventi o sostanze da essi prodotte per fare o modificare un prodotto, per migliorare piante o animali, o per sviluppare microorganismi per specifici usi

Comunemente implica l’uso o lo sviluppo di metodi di manipolazione genetica per obiettivi d’interesse (ingegneria genetica o tecnologia del DNA ricombinante).

L’uso di cellule o di componenti di animali, piante e microbi, per produrre sostanze o processi utili.

Attilio CitterioAttilio Citterio

Definizioni (3).

Enzimi,

Prodotti dagli organismi viventi, sono composti di natura proteica con

proprietà catalitiche. Questi catalizzatori sono sia efficienti che altamente

specifici per una particolare reazione chimica che implica la sintesi, la

degradazione o l’alterazione di un composto. In queste reazioni, in cui le

molecole sono ridotte, ossidate, trasposte o assemblate, sono spesso

coinvolti dei cofattori. Alcuni enzimi sono modificati covalentemente per

fosforilazione, glicosilazione ed altri processi.

CPOsubtilisin phytase

Promuove la proteolisi di

legami peptidici.

La cloroperossidasi catalizza molte

ossidazioni di substrati organici

Catalizza l'idrolisi dell'acido

Fitico (mio-inositolo esafosfato)


Definizioni (4).

• Co-fattori

composti non-proteici che si legano a una proteina e sono richiesti per

l’attività biologica della proteina. I cofattori si possono considerare

"molecole di supporto" che assistono nelle trasformazioni biochimiche.

I cofattori sono sia organici che inorganici. Si classificano in dipendenza

della forza di legame con l’enzima, con quelli debolmente legati detti

coenzimi e quelli saldamente legati detti gruppi prostetici. Un enzima

inattivo, senza cofattore è detto un apoenzima, mentre l’enzima completo

con il cofattore è detto oloenzima.

I coenzimi servono come trasportatori transienti di specifici gruppi

funzionali

Derivano spesso da

vitamine (nutrienti

organici essenziali in

piccole quantità nella

dieta).

Substrato

Coenzima

Cofattore

(composto non proteico)

attivatore

Apoenzima

(porzione proteica)

inattivo

Oloenzima

(enzima completo)

attivo

Attilio Citterio

Cofattori e Coenzimi.

• Alcuni enzimi richiedono cofattori. Molto spesso ioni

metallici.

• Coenzimi

Molecole organiche

Solubili

Gruppi prostetici

• Apoenzimi vs. Oloenzimi.

Cys

Cys

Cys

Cys

S S

S S

Fe Fe

S

S

[ 2Fe-2S ]

S

S

SS

Cys

Cys

Cys

Cys

[ 4Fe-4S ]

S

S

S

S

Fe

Fe

Fe

Fe

Attilio Citterio

Alcuni Cofattori.

Acido Lipoico


Caratteristiche di Coenzimi Comuni.

Coenzima Reazione mediata Fonte vitamina Malattia associata

Biocitina Carbossilazione Biotina a

Coenzima A Trasferimento di Acile Pantotenato a

Coenzimi Cobalamina Alchilazione Cobalamina (B12) Anemia Perniciosa

Coenzimi Flavinici Ossido-riduzione Riboflavina (B2) a

Acido Lipoico Trasferimento di Acile - a

Coenzimi Nicotinammide Ossido-riduzione Nicotinammide

(niacina)

Pellagra

Piridossal fosfato Trasferimento gruppo

Ammino

Piridossina (B6) a

Tetraidrofolato Trasferimento di gruppo a

1-carbonio

Acido Folico Anemia

megaloblastica

Tiamina pirofosfato Trasferimento di Aldeide Tiamina (B1) Beriberi

A Nessun nome specifico per la malattia umana, essendo rara o non osservata.


Biotecnologia.

• La manipolazione di geni è detta ingegneria genetica o tecnologia a DNA ricombinante.

• L’ingegneria genetica implica il prelievo di uno o più geni dalla porzione di DNA di un organismo e poi sia:

Trasferirli in un altro organismo, o

Rimetterli nello stesso organismo originale in combinazioni differenti

• Settori coinvolti

biologia cellulare/molecolare

microbiologia

genetica

anatomia e fisiologia

biochimica

ingegneria

“computer science”

• Tipi di Biotecnologie• Ricombinante, proteine R , DNA R.

• Organismi Geneticamente Modificati

(GMO)

• Anticorpi (anticorpi monoclonali)

• Transgenica

• Terapia genica, Immunoterapia

• Rischi e vantaggi del biotech


Applicazioni delle Biotecnologie.

• Piante alimentari e organismi resistenti ai virus

• Mezzi diagnostici per rivelare malattie genetiche e malattie acquisite

• Terapie che usano i geni per curare le malattie

• Vaccini ricombinanti per prevenire le malattie.

• Composti chimici

semplici o complessi

(per esempio proteine)

via over-espressione

genica.

• Ausilio nel risolvere

problemi ambientali.

evoluzione del mais.


Obiettivi della Biotecnologia.

• Comprendere meglio i processi dell’eredità e dell’espressione genica;

• Fornire una migliore comprensione e trattamento di varie malattie,

particolarmente quelle dovute a disordini genetici;

• Generare ritorni economici, inclusi il miglioramento genetico di piante

e animali per l’agricoltura e la produzione efficiente di molecole

biologiche utili.

Esempi:

Riso ingegnerizzato per rafforzamento con Vitamina A

Mais ingegnerizzato per resistere all’attacco di funghi

Piante ingegnerizzate per resistere alla siccità

Processo di bio-dilavamento che recupera metalli da depositi che

non sono adeguati per il recupero a causa del loro basso

contenuto.


Sviluppo della Biotecnologia.

• Biotecnologia Antica - storia connessa al cibo-casa; Include la

domesticazione

Le popolazioni paleolitiche iniziano a stanziarsi e sviluppare società

agricole circa 10,000 anni fa (siti agricoli in Asia, Europa e America)

I primi coltivatori in medio oriente coltivavano grano, orzo e anche segale

7,000 anni fa, dei pastori si spostavano nel Sahara con pecore, capre,

bestiame e cercavano/usavano selci per preparare cibi

I primi agricoltori arrivarono in Egitto 6,000 anni fa con bestiame, pecore,

capre e sementi quali orzo, farro e ceci

Cibi fermentati - 1500 BC (lieviti – succhi di frutta, vino, birra, pane, alcool;.

Gli egizi usavano il lievito 1500 BC. Il lievito da birra ind. risale al 1915-20)

• Biotecnologia Classica - costruita sull’antica biotecnologia; produzione di cibi

e medicine promossa da Fermentazione

• Biotecnologia Moderna - manipola le informazioni

genetiche in organismi; Ingegneria Genetica


Fermentazione.

• Processo microbico in cui avvengono trasformazioni di composti organici controllate da enzimi.

• La fermentazione è stata praticata da molto tempo e ha prodotto cibi quali il pane, il vino e la birra;

• 4000 - 9000 B.C. – La fermentazione del latte produsse lo Yogurt;

• 5000-9000 B.C. – Elaborazione del latte in Cina a produrre formaggio

• La pasta fermentata fu scoperta per caso quando dell’impasto non fu cotto immediatamente

• La moderna fabbricazione dei formaggi implica:

inoculazione del latte con batteri produttori di acido lattico aggiunta di enzimi quali il caglio per precipitare la caseina riscaldamento separazione del siero dalla cagliata essicazione della cagliata salatura pressatura della cagliata maturazione.


Bevande Fermentate.

• La produzione della birra inizia già

prima del 6000-5000 B.C.;

• Gli egizi ~5000 B.C facevano il vino

dall’uva;

• Malto d’orzo – Lievito di birra trovato

in antiche urne di terracotta;

• Monasteri - maggiori produttori di

birra;

• 1680 - Leeuwenhoek osserva il

lievito al microscopio;

• Tra il 1866 e il 1876 - Pasteur

stabilisce che I lieviti e altri microbi

sono responsabili della

fermentazione.


Biotech Classica.

• Descrive lo sviluppo che la fermentazione ha avuto dai tempi antiche ai giorni nostri.

• Alta Fermentazione – sviluppata per prima, il lievito sta sopra

• 1833 - Fermentazione sommersa (o bassa) – il lievito sta sul fondo

• 1886 – Apparecchiature per fermentazioni realizzate da E.C. Hansen e ancora oggi usate

• I Guerra Mondiale – Fermentazione di solventi organici per esplosivi (glicerina)

• II Guerra Mondiale – bioreattori/fermentatori:

Antibiotici

Colesterolo – Steroidi

Amminoacidi

Grandi quantità di aceto si producono con

l’Acetobacter su substrati di trucioli di legno

Succo di frutta

fermentato

grata di

legno

ingresso aria

per ossidazione

serpentine di

raffreddamento

uscita del

prodotto

camera di

raccolta per

l'aceto finito

trucioli di

legno (coperti

con uno strato di

Acetbacter)

scarico


Biotech Classica (2).

• Negli anni 1950, il colesterolo fu convertito in cortisone e ormoni

sessuali per idrossilazione microbica (inserimento di un gruppo -OH);

• Dalla metà degli anni 1950, si producono amminoacidi e altri

metaboliti primari (necessari alla crescita cellulare), ma anche enzimi

e vitamine;

• Dagli anni 1960, si cominciarono a usare i microbi come fonti di

proteine e altre molecole dette metaboliti secondari (non necessari

alla crescita cellulare).

Oggi per questa via si producono molti prodotti:

Composti farmaceutici quali gli antibiotici

Amminoacidi

Molti composti chimici, ormoni e pigmenti

Enzimi con un’ampia varietà di usi

Biomassa per consumo commerciale e animale (quali proteine).


La Vecchia Biotech Incontra la Nuova.

• La fermentazione e l’ingegneria genetica sono state usate nella produzione di cibi fin dagli anni 1980

• Organismi geneticamente ingegnerizzati sono coltivati in fermentatori e sono modificati per produrre grandi quantità di enzimi utili, che vengono estratti e purificati

• Si usano enzimi nella produzione del latte, formaggio, birra, vino, dolciumi, vitamine e integratori minerali

• L’ingegneria genetica è stata usata per aumentare la quantità e purezza di enzimi, per migliorare la funzione di un enzima e per fornire un metodo più conveniente per produrre enzimi.

La Chimosina, usata per produrre formaggio, è una delle prime prodotte

1590 - Zacharias Janssen - Prime due lenti per microscopio (30)

1665 - Robert Hooke - “Cellulae” (Piccole Camere) del sughero

1676 - Anthony van Leeuwenhoek – (200) «animalculi» (in stagni)

1684 – «» protozoi e funghi


Basi della Moderna Biotecnologia.

• 1838, Matthias Schleiden, stabilì che tutti i tessuti delle piante sono composti

da cellule e che ogni pianta deriva da una singola cellula

• 1839, Theodor Schwann arrivò a una conclusione simile per gli animali

• 1858, Rudolf Virchow, concluse che tutte le cellule derivano da cellule e la

cellula è l’unità base della vita

• Prima della teoria cellulare si credeva nel vitalismo: l’organismo intero, non

sue singole parti, possedevano la vita

• Dall’inizio degli anni 1880, i microscopi, le tecnologie di conservazione dei

tessuti e le colorazioni permisero agli scienziati di capire meglio la struttura e

le funzioni delle cellule

• 1928 - Fred Griffith effettuò esperimenti usando lo Streptococcus pneumonia

Due ceppi: Liscio (S) - Virulento (gelatinoso) e Ruvido (R) - Meno Virulento

Iniettando l’R e l’S (pastorizzato) – il gatto moriva e conteneva batteri S

Non sicuro di cosa cambiava R in S, egli indicò ciò col termine “Principio di

Trasformazione”.


Principio di Trasformazione.

Estratti

Batterio

Liscio

capsulato

infettivo

Cellule infettate

uccise dal calore;

fatto un estratto

Gli estratti trattati con batteri

Infettivi, rugosi non capsulati

Trattato con

desossiribonucleasi

(spezza il DNA)

Trattato con

ribonucleasi

(spezza l’RNA)

Trattato con

proteinasi (spezza

le proteine)

Nessuna cellula

trasformata nella

forma capsulata,

infettiva

Alcune cellule

trasformate nella

forma capsulata,

infettiva

Alcune cellule

trasformate nella

forma capsulata,

infettiva


1952 – Alfred Hershey e Martha Chase.

• Usano il batteriofago T2, un virus che infetta i batteri

• Radio marcano il batteriofago con S35 (Proteina) e P32 (DNA)

• Infettano le cellule batteriche e centrifugano per rimuovere le

particelle del fago

• L’analisi mostrò del DNA marcato all’interno dei batteri e che questo

era materiale genetico.

infezionecellula batterica

marcatura interna

alla cellulala marcatura

rimane se il virus

viene rimosso

particelle di virus

con proteina

marcata

particelle di virus

con DNA

marcato

cellula batterica

infezione marcatura fuori

dalla cellula

la marcatura è

rimossa se il virus

viene rimosso


1953 - Watson e Crick.

• Determinazione della struttura del

DNA

• Rosalind Franklin e Maurice Wilkins

forniscono i dati di diffrazione ai

raggi X

• Erwin Chargaff determina i rapporti

delle basi azotate nel DNA

• 1953 - modello della replicazione

del DNA

• Le basi del DNA sono fatte di purina e pirimidina

• A accoppia con T e G accoppia con C

• 1962 - Premio Nobel.


I Primi Esperimenti di DNA Ricombinante

e la Tecnica Elettroforetica.

• Nel 1971 degli scienziati manipolano il DNA e lo inseriscono in batteri.

• Nel 1972 degli scienziati legano due molecole di DNA da diverse fonti usando l’endonucleasi EcoRI (per tagliare) e la DNA ligasi (per legare)

• H. Boyer successivamente nei Laboratori di Cold Spring Harbor scoprì una nuova tecnica detta gel elettroforesi per separare i frammenti di DNA

Si applica una corrente e le molecole cariche negative del DNA migrano verso il polo positivo e si separano in funzione della loro dimensione

Soluzione tampone Gel


La Rivoluzione Biotech: Individuazione del Codice.

• Nel 1961, Nirenberg e Mattei

fecero il primo tentativo di

individuare il codice genetico,

usando l’RNA messaggero (m-

RNA) sintetico.

• Nirenberg e Leder, usando le

sequenze di codoni specifici del

RNA, svilupparono un saggio di

legame che consentì loro di

determinare quale tripletta di

codoni esprime un amminoacido.

Prima

Base

Seconda Base Terza

Base

U C A G

U

fenilalanina serina tirosina cisteina U

fenilalanina serina tirosina cisteina C

leucina serina stop stop A

leucina serina stop triptofano G

C

leucina prolina istidina arginina U

leucina prolina istidina arginina C

leucina prolina istidina arginina A

leucina prolina istidina arginina G

A

isoleucina treonina asparagine serina U

isoleucina treonina asparagina serina C

isoleucina treonina asparagina arginina A

(inizio)

metioninatreonina asparagina arginina G

G

valina alanina aspartato glicina U

valina alanina aspartato glicina C

valina alanina aspartato glicina A

valina alanina aspartato glicina G


Il Codice Genetico Standard.

translation start codon

translation stop codon

hydrophobic amino acids

hydrophilic non charged

amino acids

negatively charged amino acids

positively charged amino acids

cysteine

C G

G

C

UUU

UUC

UUA

UUG

Phe

Phe

Leu

Leu

F

F

L

L

CUU

CUC

CUA

CUG

Leu

Leu

Leu

Leu

L

L

L

L

CCU

CCC

CCA

CCG

Pro

Pro

Pro

Pro

P

P

P

P

UCU

UCC

UCA

UCG

Ser

Ser

Ser

Ser

S

S

S

S

UAU

UAC

UAA

UAG

Tyr

Tyr

Stop

Stop

Y

Y

CAUCAC

CAACAG

His

His

Gln

Gln

H

H

Q

Q

ACU

ACC

ACA

ACG

Thr

Thr

Thr

Thr

H

H

Q

Q

AUUAUC

AUA

Ile

Ile

Ile

I

I

I

AUG Met M

GUU

GUC

GUA

GUG

Val

Val

Val

Val

V

V

V

V

GCU

GCC

GCA

GCG

Ala

Ala

Ala

Ala

A

A

A

A

GAU

GAC

GAA

GAG

Asp

Asp

Glu

Glu

D

D

E

E

GGU

GGC

GGA

GGG

Gly

Gly

Gly

Gly

G

G

G

G

AAU

AAC

AAA

AAG

Asn

Asn

Lys

Lys

N

N

K

K

AGU

AGC

AGA

AGG

Ser

Ser

Arg

Arg

S

S

R

R

G

A

C

U

G

A

C

U

G

A

C

U

G

A

C

U

CGU

CGC

CGA

CGG

Arg

Arg

Arg

Arg

R

R

R

R

UGU

UGC

UAG

Cys

Cys

Stop

C

C

UGG Trp WUGA StopU

U A

A


Il primo Clonaggio del DNA e ……

• Boyer, Helling Cohen, e Chang legarono dei frammenti di DNA in un vettore, e trasformarono una cellula dell’E. coli

• Cohen e Chang trovarono che era possibile mettere del DNA batterico in una specie batterica non correlata

• Nel 1980 Boyer e Cohen ottennero un brevetto sui metodi fondamentali di clonaggio e trasformazione del DNA.

La tecnologia del DNA ricombinante aprì dibattiti tra gli scienziati, teologi, media, avvocati e altri

Negli anni 1980 si concluse che la tecnologia non ha causato alcun disastro e non porta minacce alla salute umana e all’ambiente.

Nel 1997 si clona la pecora “Dolly” a Edimburgo.

Taglio con EcoRI

GAATTC

CTTAAG

GAATTC

CTTAAG

Taglio con EcoRI

AATTC

G

G

CTTAA

Congiunzione terminali

del vettore e DNA estraneo

Chiusura della lacuna nel plasmide

chimerico con DNA Ligasi

CG

DNA ligasiCG


Sviluppo Industriale del Biotech.

Si costituiscono le prime compagnie biotech:

1976 - Genentech

1978 - Biogen

1980 - Amgen

1981 - Immunex

1981 - Chiron

1981 – Genzyme

I 160 farmaci e vaccini biotech approvati hanno aiutato più di 325

milioni di persone in tutto il mondo.

Attualmente sono in studi clinici più di 350 farmaci e vaccini biotech

per combattere oltre 200 malattie.

La Biotecnologia è responsabile di centinaia di test diagnostici, inclusi

i test su HIV e i test di gravidanza, mappatura del DNA …


I Progressi Continuano.

• Però, si sono addensate preoccupazioni sia sulle applicazioni che sulle implicazioni etiche :

Esperimenti di terapia genica hanno sollevato la questione dell’eugenetica (selezione umana artificiale) come pure dell’analisi di malattie attualmente senza una cura

Sono stati sviluppati cloni animali, e ciò ha accresciuto la paura che si possa passare alla clonazione umana

In agricoltura, sussistono preoccupazioni sul contenimento genico e la creazione di “super infestanti” (piante resistenti a erbicidi e/o pesticidi)

Oggi, le paure sono focalizzate sui cibi geneticamente ingegnerizzati in commercio e ha portato alla rapida crescita dell’industria dei cibi organici.

• Molte malattie geneticamente modificate, insetti, e piante resistenti agli erbicidi sono in attesa di approvazione alla commercializzazione

• Si sono identificati i geni coinvolti in alcune malattie

• Si sono sviluppati nuovi trattamenti medici

• Si è anche sviluppata la “fitomedicina” molecolare, in cui si usano piante per produrre farmaci (biofarmaci).


Dimensioni in Biotecnologia.

Nanometri Micrometri Millimetri Metri

Piccole

molecole

Atomi

Aggregazioni

Macro

molecole Cellule Organismi pluricellulari

Legame C-C

Glucosio

Emoglobina

Ribosoma

Mitocondri

BatteriGlobuli

rossi

C. elegans Uomo moderno

Bumblebee

10-10 m 10-9 m 10-8 m 10-7 m 10-6 m 10-5 m 10-4 m 10-3 m 10-2 m 10-1 m 100 m

1 nm 10 nm 100 nm 1 μm 10 μm 100 μm 1 mm 10 mm 100 mm 1 m


Virus.

• proteine implicate nella sintesi

del DNA, RNA e di proteine

• regolazione genetica

• cancro e controllo della

proliferazione cellulare

• trasporto di proteine e organelli

all’interno delle cellule

• infezione e immunità

• possibili approcci alla terapia

genica.


Batteri.

• proteine implicate nella sintesi

di DNA, RNA e di proteine,

metabolismo

• regolazione genetica

• bersagli per nuovi antibiotici

• ciclo cellulare

• comunicazione cellulare


Lieviti.

E.g. Saccharomyces cerevisiae

• controllo del ciclo cellulare e

della divisione cellulare

• secrezione di proteine e

biogenesi di membrane

• funzione del citoscheletro

• differenziazione cellulare

• invecchiamento

• regolazione genica e struttura

dei cromosomi


Vermi.

E.g. Caenorhabditis elegans

• sviluppo del piano corpale

• linee cellulari

• formazione e funzione del

sistema nervoso

• controllo della morte cellulare

programmata

• proliferazione cellulare e geni

del cancro

• invecchiamento

• comportamento

• regolazione genica e struttura

dei cromosomi


Moscerino della Frutta.

Drosophila melanogaster

• sviluppo del corpo

• generazione di linee cellulari

differenziate

• formazione del sistema nervoso,

cuore e muscolatura

• morte cellulare programmata

• controllo genetico del

comportamento

• geni del cancro e controllo della

proliferazione cellulare

• controllo della polarizzazione

cellulare

• effetti di farmaci, alcool e

pesticidi.


Pesci – e.g. Zebrafish.

• sviluppo del tessuto corporeo

vertebrato


cervello e del sistema nervoso

• difetti di nascita

• cancro.


Topo.

• sviluppo dei tessuti corporei

• funzione del sistema

immunitario nei mammiferi


cervello e del sistema nervoso

• modelli di cancro ed altre

malattie dell’uomo

• regolazione genica e

ereditarietà

• malattie infettive.


Geni Omeotici.

• L’ordine dei

geni omeotici

è lo stesso;

• L’ordine dei geni

corrisponde ad

analoghe regioni

del corpo.


Piante.

• Sviluppo e differenziazione

dei tessuti

• genetica della biologia

cellulare

• applicazioni in agricoltura

• fisiologia

• regolazione genica

• immunità

• malattie contagiose.


Specifiche del Genoma.

Hepatite B virus 1 4 3215

E. coli batterio 1 4,394 4,639,221

S. cerevisiae lievito 16 6,183 12,000,000

D. melanogaster moscerino 4 14,000 140,000,000

C. elegans nematodo 6 19,000 90,000,000

A. thaliana pianta 5 25,000 125,000,000

M. musculus topo 20 35,000 3,000,000,000

H. sapiens uomo 23 35,000 3,000,000,000

Organismo Tipo # Cromo- # Geni Dimensione Genoma

somi (bp)


Specifiche del Genoma (2) .

Organismo Uomo Arabidopsis (pianta) C. elegans (verme)

Geni ~32,000 25,706 18,266

Organismo Drosophila (moscerino) Saccaromices (lievito)

Geni 13,338 ~6000

Metabolismo

Replicazione/modifica DNA

Trascrizione/traslazione

Comunicazione intracellulare

Comunicazione intercellulare

Organiz./degradazione proteine

Trasporto

Proteine multifunzione

Citoscheletro/struttura

Difesa e immunità

Funzioni miste

Sconosciuto


Una Tipica Modifica Genetica.

Batterio

Cromosoma

batterico

Plasmide

DNA ricombinante

(plasmide)

Batterio

modificato

Il gene è inserito

nel plasmide.

Il plasmide è acquisito da una

cellula come un batterio.

Le cellule con il gene

d'interesse sono clonate.

O L'obiettivo è di fare

copie del gene. L'obiettivo è di fare

prodotti proteici del gene.

Gene di

interesse

Si isola un vettore,

quale un plasmide.

Si rompe in frammenti

il DNA con un enzima.

DNA contenente il genedi interesse.


Tipi di Sistemi d’Espressione.

Batteri

Insetti

Lieviti

Linee di cellule di mammiferi

Transgenica

Animale

Pianta


Batteri.

Vantaggi

1. Genetica semplice e ben

caratterizzata

2. Rapida crescita cellulare

(raddoppia in 20-30 minuti)

3. Facili da crescere in mezzi di

cultura non costosi

4. Fermentazione facile

nell'ampliamento di scala

5. Alti livelli di espressione

Svantaggi

1. Mancanza di glicosilazione e

altre modifiche post-

traslazionali

2. La rottura delle cellule

provoca problemi più

complessi di purificazione

3. Formazione di corpi di

inclusione; è necessario

solubilizzare e ricostruire

4. Presenza di endotossine e

proteine delle cellule ospiti


Lieviti (e.g. S. cerevisiae, P. pastoris).

Vantaggi

Genetica ben conosciuta

Rapida crescita cellulare

(raddoppia in 90 min)

Mezzi culturali poco costosi

Fornisce e facilita la

formazione di legami

disolfuro

Relativamente pochi

problemi di purificazione

Svantaggi

Le proteine possono essere

glicosilate e organizzate in

modo non corretto

La over-glicosilazione è un

rischio

Altre modifiche post-

traslazionali sono limitate

Generalmente livelli di

espressione inferiori a quelli

dei sistemi batterici


Cellule di Insetti (Baculovirus vector).

Vantaggi

Disponibili sistemi di

secrezione

Attivate le modifiche post-

traslazionali richieste per le

proteine eucariotiche superiori

Alta espressione

I vettori Baculovirus non sono

patogeni per l’uomo

Svantaggi

Lenta crescita cellulare

Mezzi di cultura costosi

Possibilità di modifiche

post-traslazionali non

identiche a quelle dei

sistemi superiori

Sensibile a forze di taglio


Cellule di Mammiferi.

Vantaggi

Glicosilazione di tipo

complesso

Altre modifiche post-

traslazionali

Disponibili sistemi secretori

Svantaggi

Lenta crescita cellulare

(raddoppia in 18-24 ore)

Bassa densità cellulare finale

Mezzi di cultura costosi

Sensibile a forze di taglio

Produzione di vaccini, enzimi, ormoni, MAbs, proteine native o

modificate, proteine di fusione

CHO

NSO

Cellule umane – preoccupazione: potenziali trasportatori di malattie


Differenti Tipi di Cellule.

Procariote

Nessun vero nucleo

Nessun organello legato

alla membrana

Piccole dimensioni

Cromosoma circolare

Cellule singole

Eucariote

Nucleo con membrana

Organelli intracellulari

Può contenere

cromosomi multipli

lineari

Generalmente cellule

più grosse

Si possono organizzare

in organismi

multicellulari


Cellule Procariote.

E. Coli

RibosomaProteine

mRNA tRNA DNA

Lipopolisaccaride

Fosfolipide

Lipoproteina

Peptidoglicano


Cellule Eucariote.

Membrana nucleare

Nucleo

Nucleolo

Cromatina

Centrioli

Apparato

di Golgi

Vacuolo

Ribosomi

liberi

endoplasmaticoReticolo

Membrana cellulare

Mitocondrio

Lisosoma

endoplasmaticoReticolo ruvido

Reticolo liscio endoplasmatico


Metabolismo Cellulare.


Metabolismo Cellulare (Ciclo Acido Citrico, CTA).

È utile pensare all’ossidazione metabolica dei substrati come a un processo a 3 stadi:

il carbonio è incorporato nell’acetil-CoA

il carbonio viene quindi ossidato a CO2, agenti ridotti di trasferimento elettronico e una piccola quantità di ATP

gli agenti ridotti di trasferimento elettronico sono riossidati fornendo energia per la sintesi di ulteriore ATP (fosforilazione ossidativa)

L’attività del ciclo TCA è favorita da bassi rapporti NADH/NAD+


Promesse del Biotech in Campo Medico.

DNA proteine

Alcuni farmaci sono così complessi che si possono sintetizzare solo in

sistemi viventi.


Promesse del Biotech in Campo Vegetale.

• Riso “giallo”

• Rilevazione di Mine

Riso giallo con

il riso bianco

standard.

A livello mondiale, 7% dei bambini presentano deficienza

da vitamina A; molti vivono in regioni in cui il riso è un

alimento della dieta.

Mina

• Proteina transgenica

brevettata, inserita in piante

• In presenza di metalli

provenienti dalla mina:

• La pianta vira dal verde

al rosso

• Tecnologia sviluppata da

Aresa Biodetection


Prodotti della Microbiologia.

Cellule

Cellule

lievito

Bio-conversione

Prodotto

(per esempio,

Bioconversione steroidi)

Cellule

Substrato

Composti chimici

(per es. acido

citrico)

Prodotti da cellule

Enzimi (per

esempio,

glucosio

isomerasi)

Antibiotici

(per esempio,

penicillina)

Alcol

(etanolo)

Additivi per

cibi (per

esempio,

amminoacidi)


Prodotti Industriali e i Microorganismi

che li Producono.

• Le proprietà di un utile microbo industriale includono:

– Produce spore o si può facilmente inoculare

– Cresce rapidamente su ampia scala in mezzi a basso costo

– Produce rapidamente il prodotto desiderato

– Non è patogeno

– E’ soggetto a manipolazione genetica

• I prodotti microbici di interesse industriale includono:

– Cellule microbiche

– Enzimi

– Antibiotici, steroidi, alcaloidi

– Additivi per cibi

– Composti chimici di base

• Composti a basso costo prodotti in bulk

• Includono etanolo, acido citrico, acid lattico e vari altri.


Produzione e Scala.

• Il Fermentatore è una apparecchiatura

dove avviene il processo microbiologico

• Qualsiasi reazione su larga scala si

indica come fermentazione

– Per lo più sono processi aerobici

• Dimensioni dei fermentatori: 5 -

500,000 litri

• Fermentatori aerobici / anaerobici

• I fermentatori su grande scala sono

quasi sempre in acciaio

- Giranti e spruzzatori

alimentano l'O2


Produzione dell'Aceto.

1/2 O2 H2O

Citocromo o

Protone forza motrice

ATP2 H 2 H

UQ UQH2 UQH2UQ

CH3CH2OH

Etanolo

CH3CHO

Acetaldeide

CH3COOH

Acido aceticoAlcol

deidrogenasi

Aldeide

deidrogenasi


Produzione dell'Aceto (2).

Sfiato

Tubi di

ricircolo

Pompa

Grata di legno

Camera di

raccolta

Materiale di

partenza

Ingresso aria

ossidazione

Serpentine di

Raffreddamento

Prelievo

prodotto

Trucioli

di legno


Innovazione nei Sistemi di Produzione di Enzimi.

Piattaforme

SVILUPPO DI PROCESSO

ProdottoValutazione

su 10 L

Ampliamento

di scala

> 100.000L

Molecola

di interesse

Aspergillus

Trichoderma

B. substilis

Streptomyces

B. licheniformis

test iniziali:

Definite piattaforme

per una rapida scelta

di sistemi ospiti ottimali

Mezzi per analisi

dei ceppi:

DNA arrays

Sequenza Genoma

Secrezione

Stabilità prodotto

Miglioramento

Ceppi:

siRNA

HTS

FACS

Modifiche genetiche


Antibiotici.

Richiedono un

preciso controllo

dei nutrienti

Si può modificare il

prodotto finale per

dare una varietà di

derivati (per es.

penicilline

semisintetiche)

Lattosio

Penicillina

Cellule

Ammoniaca

Carica

azoto

Carica

glucosio

Tempo di fermentazione (h)

Bio

ma

ss

a (

g/L

), c

arb

oid

rato

,

Am

mo

nia

ca

, p

en

icil

lin

a (

g/L

×1

0)


Via Biosintetica della Penicillina.

Acido L-Amminoadipico L-Cisteina L-Valina

Acil-trasferasiCefalosporine

Penicillina G

IPN sintasi

iso-penicillina N

ACV sintasi

ACV-Tripeptide


Produzione Industriale delle Penicilline.

Fermentazione

della PenicillinaAggiunta

precursore I

Aggiunta

precursore

III

Trattamento

chimico o

enzimatico

della penicillina G

Aggiunta

catene laterali

per via chimica

Penicillina III

biosintetica

Penicillina II

biosintetica

Penicillina I

biosintetica

Penicilline naturali

(per esempio,

penicillina G)Penicilline semisintetiche

(per esempio, ampicillina,

amoxicillina, meticillina)

Acido 6-amminopenicillanico

Aggiunta

precursore II


Meccanismi di Regolazione.

Regola

l'attività

enzimatica

No prodotto

Enzima B

Regola la sintesi dell'enzima

Alla traslazione Alla trascrizione

no mRNA

No enzima

Dogma Centrale

Substrato Prodotto

Enzima A

Traslazione

Trascrizione


Modificazione dell'Espressione Genica.

Consente la sovrapproduzione di un prodotto, produzione di più di un

prodotto da parte dello stesso organismo, o la sintesi di prodotti

modificati.

Architettura del percorso

analisi, progettazione e modifica del percorso biochimico per

migliorare l'efficienza del processo;

Ingegnerizzazione del percorso metabolica

Alterazione intenzionale del percorso metabolico per inattivazione

di specifici geni;

Ingegnerizzazione del controllo metabolico

alterazione dei meccanismi di controllo di specifici geni.


Sistemi Esperti in Biotecnologia

Flusso

Informazioni

Controlli

in linea


Biotecnologia:

Struttura Produttiva di un Impianto Pilota

Personale del bioprocesso

Personale dei Servizi Centrali

Materie prime

Intermedi e prodotti bulk

Controllate, non classificate

Aree classificate

(stanze sterili)

Corridoi di uscita (“sporchi”)

Spazi per servizi (“grigi”)

Biotrasformazioni.(trasformazione di un composto chimico in un altro mediante

l'uso di un biocatalizzatore)

Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione

Corso 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry


Biotrasformazioni e Bioprocessi.

materie

prime

organiche

Bio-trasformazione

Preparazione

Biocatalizzatore

Isolamento

Isolamento

prodottoSottoprodotti

scartimutagenesi

bioingegneria

“il processo con cui un materiale è convertito in un altro usando

agenti biologici (cioè, organismi viventi, microbi o enzimi). Esso

combina chimica, ingegneria, microbiologia e biochimica”.


Enzimi: Fonti e Usi.

A. I microrganismi si usano per produrre i catalizzatori naturali come gli enzimi

B. Gli enzimi per uso industriale si purificano dai microorganismi

C. L'enzima seleziona uno specifico substrato al suo sito attivo

D. L'enzima catalizza la reazione chimica con cui si formano i prodotti

E. Quindi si separano i prodotti dalla superficie dell'enzima


Efficacia Catalitica di Alcuni Enzimi.

Enzima Velocità di reazione

non enzimatica (s-1)

Velocità di reazione

enzimatica (s-1)

Aumento di

velocità

Anidrasi Carbonica 1.3 × 10-1 1 × 106 7.7 × 106

Chorismato mutasi 2.6 × 10-5 50 1.9 × 106

Trioso fosfato

isomerasi

4.3 × 10-6 4300 1.0 × 109

Carbossipeptidasi 3.0 × 10-9 578 1.9 × 1011

AMP nucleosidasi 1.0 × 10-11 60 6.0 × 1012

Stafilococco nucleasi 1.7 × 10-13 93 5.6 × 1014

Fonte: Radzicka, A.; Wolenden R. Science, 267, 91 (1995).


Purificazione e Funzioni degli Enzimi.

Purificazione:

• Certamente una buona

opzione per vari enzimi;

• Processi costosi;

• Ancora non pratici se sono

richiesti dei cofattori (p.es.

reazioni redox).

Funzione:

• Riconoscimento dei substrati;

• Catalisi (abbassamento di Eatt

o Satt);

• Selettività.

Specificità di substrato:

• Complementarietà geometrica;

• Complementarietà elettronica;

• Adattamento indotto.


Stereo-specificità.


Da dove Ottenere gli Enzimi:

Cosa dire sull’uso di animali superiori?

• La società in generale è meno spaventata dalle forme

macroscopiche della vita che dai membri del mondo

microscopico

• L’uomo ha usato animali da molto tempo per

biotrasformazioni

• Molte problematiche etiche e ambientali associate

• Spesso costoso.


… e sull’uso delle Piante?

• Grande diversità e capacità metabolica.

• Minori problemi etici e ambientali associati.

• Probabilmente non costosi

• Molti vecchi e nuovi lavori si riferiscono a cellule di piante

in sospensione

• Del tutto simile all’uso di microorganismi ma in pratica più

complicato

Crescita lenta

Frequente contaminazione

Si richiedono attrezzature speciali

Incredibilmente costoso.


Parti di Piante come Reagenti Chimici.

I problemi si possono superare se si usa la “pianta stessa”

(o una parte di essa) al posto di lavorare con una cultura

cellulare:

Le cellule stanno già crescendo

Non sono richieste attrezzature speciali

Nessuna contaminazione

I cofattori sono già presenti

Pochi problemi ambientali

Costi molto contenuti.

Attilio Citterio

Numero IUB e Classificazione degli Enzimi.

Principali Classi e Sottoclassi Principali Classi e Sottoclassi1: Ossidoriduttasi

1.1: agisce sul gruppo CH-OH dei datori

1.2: agisce sul gruppo aldeide o cheto dei datori

1.3: agisce sul gruppo CH-CH dei datori

1.4: agisce sul gruppo CH-NH2 dei datori

1.5: agisce sul gruppo C-NH dei datori

1.6: agisce su NADH (ridotto) o NADPH come

datore di H‾

1.7: agisce su altri composti azotati cone datore

1.8: agisce sul gruppi solforati come datore

1.9: agisce sul gruppo eme come datore

1.10: agisce su difenoli e sostanze correlate come

datore

1.11: agisce su H2O2 come accettore di elettroni

1.12: agisce su H2 come datore

1.13: agisce su singoli datori con incorporazione

di ossigeno (ossigenasi)

1.14: agisce su datori abbinati con incorporazione

di ossigeno in un datore (idrolasi).

2: Transferasi

2.1: trasferimento di gruppo a un-carbonio

2.2: trasferimento di aldeide o chetone

2.3: aciltrasferasi

2.4: glicosiltrasferasi

2.5: trasferimento di altri gruppi alchilici

2.6: trasferimento di gruppi azotati

2.7: trasferimento di gruppi fosforati

2.8: trasferimento di gruppi solforati

3: Idrolasi

3.1: idrolisi di legami esterei

3.2: idrolisi di legami glicosilici

3.3: idrolisi di legami eterei

3.4: idrolisi di legami peptidici

3.5: idrolisi di legami C-N diversi da peptidici

3.6: idrolisi di legame acido-anidride

3.7: idrolisi di legami C-C

3.8: idrolisi di legami C-alogenuro

3.9: idrolisi di legami P-N

4: Liasi

4.1: lisi di legami C-C

4.2: lisi di legami C-O

4.3: lisi di legami C-N

4.4: lisi di legami C-S

4.5: lisi di legami C-alogenuro

4.99: altri

5: Isomerasi

5.1: racemizzazione ed epimerizzazione

5.2: isomerizzazione cis-trans

5.3: ossidoriduzione intramolecolari, quali aldeide-

chetone, cheto-enolo, migraz. di dopio legame

5.4: trasferimento intramolecolare di gruppo

5.99: altre isomerizzazioni

6: Ligasi

6.1: formazione di legami C-O

6.2: formazione di legami C-S

6.3: formazione di legami C-N

6.4: formazione di legami C-C


Classificazione degli Enzimi

in Base al Tipo di Reazione.

CLASSI DI ENZIMI Tipo di REAZIONE CATALIZZATA

____________________________________________________

1. Ossidoriduttasi Reazioni di ossido-riduzione

2. Transferasi Trasferimento di gruppi funzionali

3. Idrolasi Reazioni idrolitiche (H2O) o solvolitiche

4. Liasi Eliminazione di gruppi (per es. formazione di

doppi legami)

5. Isomerasi Reazioni di isomerizzazione

6. Ligasi Formazione di legami accoppiata a

idrolisi del trifosfato ATP

____________________________________________________

Attilio Citterio

I Quattro Maggiori Tipi di Reazioni di Ossidazione

Biologica Catalizzate da Ossidoriduttasi.

Deidrogenasi Rimuove due atomi di H dal substrato

e trasferisce questo ad un altro

composto organico. L’accettore di H,

A, è un coenzima.

SH2 + A a S + AH2

Ossidasi Rimuove due atomi di H dal substrato

e utilizza O2 o H2O2 come accettore di

H.

SH2 + ½O2 a S + H2O

SH2 + H2O2 a S + 2H2O

Tipo di

ossidazione

Descrizione Schema di Reazione ed Esempi

Attilio Citterio

I Quattro Maggiori Tipi di Reazioni di Ossidazione

Biologica Catalizzate da Ossidoriduttasi (2).

Diossigenasi Aggiunge due atomi di O al substrato S + O2 a SO2

Monoossigenasi Aggiunge un atomo di O al substrato.

A è un coenzima.

S + AH2 + O2 a SO + A + H2O

Tipo di

ossidazione

Descrizione Schema di Reazione ed Esempi

Attilio Citterio

Reazioni di Eliminazione e Riarrangiamento

Successive all’Ossidazione.

A. Demetilazione: Metil etere ad alcol

B. Demetilazione: Metil ammina ad ammina

C. Formazione dell’anello fenil metilendiossi

Attilio Citterio


Successive all’Ossidazione (2).

D. Apertura dell’anello aromatico (mono-ossigenasi)

E. Apertura dell’anello aromatico (di-ossigenasi)

F. Ossidazione dell’anello aromatico: NIH shift (shift d’idruro; R = gruppo alchilico)

Attilio Citterio


Successive all’Ossidazione (3).

G. Ossidazione in para dell’anello aromatico.

H. Decarbossilazione ossidativa di acidi carbossilici aromatici.

Attilio Citterio

Formazione di Legami C-C per Spostamento SN2 di un

Nucleofilo Stabile su un Agente Elettrofilo Alchilante.

A. Metilazione di alcol o ammina con S-adenosil-L-metionina come agente alchilante:

B. Glicosilazione di un alcol con glicosil fosfato come agente alchilante:

Attilio Citterio

Formazione di Legami C-C per Spostamento SN2 di un

Nucleofilo Stabile su un Agente Elettrofilo Alchilante.

Nota: Una serie comune di reazioni per spostamento SN2 è :

• fosforilazione di gruppo R-OH R-OPP-, seguita da

• spostamento SN2 di OPP- da parte di un nucleofilo.

C. Alchilazione di carbanione stabilizzato con acetil-coA come agente alchilante:

D. Spostamento SN2 di pirofosfato.


Enzimi in Biotecnologia.

Enzimi nella produzione di alimenti e bevande

Industria casearia

Industria della birra

Industria del vino e dei succhi

Industria dell’alcool

Industria delle proteine

Industria della carne

Industria da forno

Industria degli oli e grassi

Enzimi come catalizzatori industriali

Industria della lavorazione dell’amido

Industria degli antibiotici

Industria della Chimica Fine


Enzimi in Biotecnologia (2).

Enzimi come prodotti finali

Industria dei detergenti

Industria degli agenti di pulizia

Industria farmaceutica

Industria dell’alimentazione animale

Applicazioni analitiche

Enzimi come ausiliari di processo

Industria Tessile

Industria del cuoio

Industria della carta

Industria dello zucchero

Industria del caffè


Fattori Importanti nell’Uso di Enzimi.

• Possibili reazioni non realizzabili mediante la chimica

tradizionale

• Specificità di reazione inclusa la specificità di substrato, la

specificità di posizionale e la stereo specificità

• Consente condizioni di processo più blande, quali temperatura,

pH, sterilità, ecc.

• Riduce il numero di fasi di processo richieste

• Elimina la necessità di usare solventi organici nelle lavorazioni

• L’immobilizzazione dell’enzima ne permette il riuso o l’uso in

continuo

• L’uso di enzimi in combinazione con altri stadi chimici

• Ingegneria genetica per migliorare gli enzimi.


Metodi di Immobilizzazione di Enzimi.

E EE

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E EE

E E

E

E

E

E E E

E+ E+

----

Metodi Chimici Metodi Fisici

Legami covalenti

Reticolazione

Intramolecolare

(reticolazione

intersubunità)

Reticolazione

Intramolecolare

Copolimerizzazione di

enzimi modificati con

monomero insaturo in gel

tridimensionali

Intrappolamento in

gel polimerici

Adsorbimento

Intrappolamento in

fibre

Microincapsulazione

Intrappolamento in

film polimerici e

membrane

semipermeabili

Adsorbimento

elettrostaticoIntrappolamento in

liposomi

Intrappolamento in

fibre cave


Mercato Industriale degli Enzimi.

Vendite annuali: 1.6 miliardi di dollari:

Lavorazione cibi ed amido 45%

Detergenti 34%

Tessili 11%

Cuoio 3%

Carta 1.2%

Prodotti di reazioni enzimatiche:

Sciroppi ad alto tenore di fruttosio 1 miliardo di $

Aspartame 850 milioni di $

Acrilammide 300 milioni di $


Nuovi Enzimi e Reazioni Enzimatiche.

CPOsubtilisina fitasi

laccasiCaLB HNlasi


Idrolasi: Produzione di Glucosio da Amido.

_______________________________________________________________

Liquefazione Saccarificazione DE Glucosio

_______________________________________________________________

Acido Acido 92 85

Acido Glucoamilasi 95 91

Acido/α-amilasi Glucoamilasi 96 92

α-Amilasi/cottura ad alta Glucoamilasi 97 93

pressione/ α-amilasi

α-Amilasi (termostabile) Glucoamilasi 97 94

α-Amilasi (termostabile) Glucoamilasi 97-98.5 95-97.5

_______________________________________________________________


Produzione di Concentrati di Fruttosio da Amido.

Melassa di Glucosio DE 95-96

Impasto di amido (30-35% DS, pH 6.0-6.5, Ca2+ 50 ppm)

Liquefazionea-Amilasi termostabileGelatinizzazione (105°C, 5 min)Destrinizzazione (95°C, 2h)

Amido Liquefatto DE 10-15

SaccarificazioneGlucoamilasi(60°C, pH 4.0-4.5, 24-72 h)

IsomerizzazioneGlucosio isomerasi(pH 7.5-8.0, 55-60°C, 5 mM Mg2+)

Melassa ad alto contenuto di Fruttosio (42%)

Glucosio isomerasi


Vantaggi nell’Uso della Pullulanasi nel

Processo di Saccarificazione dell’Amido.

• Aumento delle rese di glucosio (~ 2%) con glucoamilasi

• Aumento delle rese di maltosio (~ 20-25%) con β-amilasi

• Riduzione del tempo di saccarificazione (a 48 h)

• Aumento della concentrazione del substrato (a 40%, DS)

• Riduzione nell’uso di glucoamilasi (fino al 50%)


Amminolisi di Esteri.

Steverink(1995), Hacking (1999), Wegman(2001)

R

O

Nu

Ser

R O

ONuH

Nu = OH, OR, NH2 , RNH, OOH, ecc.

Amminolisi Enzimatica

NH2

O

lipasi, 40oC

NH3/t-BuOH

OEt

O

R R

• sintesi verde di ammidi

• Enantio-selettiva con

esteri di amminoacidi

Processo BASF

NH2 LipasiNH2

ee > 99% (S)

+

OO

O

NHO

O

ee > 99% (R)

NaOH

glicol-acqua

(2:1), 150oC

ee > 99% (S)

NH2

> 3000 t/anno


Risoluzione Facilitata in Ingresso e Uscita.

ArCH2COX+

H2O

ee > 99%

ee > 99%pen acilasi

pH 10-11

pen acilasi

pH 7

L.van Langen(2001), R.Madeira Lau(2003), H.Ismail(2007)

Risoluzione Cnetica Dinamica

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120time (h)

% y

ield

(am

ide

)

Risoluzione cinetica

Risoluzione cinetica

dinamica

H. Ismail (2007)

- Resa 88 % (4 giorni)

- Prodotto ee 98 % .

O

O

CaLB, 50oC, 96h

Nano

Pd


Sintesi Enzimatica delle Penicilline:

Acido 6-Amminopenicillanico (6-APA).

Penicillina:

Scoperta da Fleming nel 1932

19% del mercato mondiale degli antibiotici.

Alta azione inibitoria sulla sintesi delle pareti cellulari di batteri

Ampio spettro di attività antibatterica

Bassa tossicità

Straordinaria efficacia verso vari ceppi batterici.

L’eccessivo uso ha portato allo sviluppo di patogeni resistenti.

6-APA:

Materia prima per la produzione di nuove penicilline semisintetiche (amoxycillina e ampicillina)

Minori effetti collaterali e diminuita tossicità

Maggiore selettività verso i patogeni

Più ampio spettro antimicrobico

Migliori proprietà farmacologiche.


Deacilazione Chimica ed Enzimatica di

Penicilline a 6-APA.

Penicillina V o G (6-APA)

Penicillina acilasi

Alcalina[Enzimatica]

[Chimica]

[R = Ph o PhO]

PiridinaMe3SiCl

PCl5ROHH2O


Acido 6-Amminopenicillanico.

Metodo Chimico:

Uso di composti pericolosi - piridina, pentacloruro di fosforo, nitrosil cloruro

Metodo Enzimatico:

Regio- e stereo-specifico

Condizioni di reazione più blande (pH 7.5, 37 °C)

Il processo enzimatico è del 10% meno costoso

Enzimi:

Penicillina G acilasi (PGA) - Escherichia coli, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae

Penicillina V acilasi (PVA) - Beijerinckia indica var. Penicillium,Fusarium sp., Pseudomonasacidovorans

Enzima immobilizzato:

vita, 500-2880 ore


Modifica Enzimatica di Penicilline in 6-APA e

Penicilline Semisintetiche.

Penicillina V o G(6-APA)

Penicillina acilasi[Acilazione] Acido

Penicilline Semisintetiche

Penicillina acilasi

Alcalino[Deacilazione]


Sintesi Enzimatica dell’Acrilammide.

Materia prima monomerica per la produzione di polimeri sintetici

Ottenuta per idratazione della funzione nitrilica dell’acrilonitrile

Mercato mondiale, 200,000 t/anno.

Processo Chimico:

Reazione dell’acrilonitrile con acqua in presenza di H2SO4 (90 °C) o catalizzatore metallico (80-140 °C)

Formazione di scarti tossici (HCN)

La reazione si deve bloccare per prevenire la conversione dell’acrilammide in acido acrilico.

Processo Enzimatico:

Resa: 99.9%

Kg di prodotto / g cellule

Non si produce acido acrilico

Numero minore di stadi di processo

Molto più ambientalmente compatibile

Nitto Chemical Industry: 6,000 t/anno L’enzima attivo è la nitrile idrolasi presente nelle cellule intere di Rhodococcus rhodochrous, immobilizzate su gel di poli(propenammide).


Confronto tra le Sintesi Chimiche e

Biochimiche dell’Acrilammide.

Processo microbiologico

Acrilonitrile

Catalizzatore spento

Acqua

ProdottoAcrilammid

e

DecolorazioneSeparazionecatalizzatore

Idratazione

Coltivazione eimmobilizzazionedel microrganismo

Processo catalizzato (Cu)

Acrilonitrilenon reagito

Rimozione del Cu2+

Decolorazione

ProdottoAcrilammid

e

ConcentrazioneRimozione del Cu2+

DecolorazioneSeparazionecatalizzatoreIdratazioneRimozione

di O2

Recupero epreparazione

del catalizzatore

Acrilonitrile

Acqua

Reazioni della nitrile idratasi e amidasi

CH2=CH-CONH2

H2OH2O

CH2=CH-CN CH2=CH-COOHNitrile idratasi Amidasi


Biocatalisi e Acrilammide.

Poli(propenammide) acqua conPoliacrilammide colorante verde

Mescolamento Gel risultante

Matrice per separazione di

macromolecole biologiche


Sintesi dell'Aspartame (Estere Metilico L-Asp-L-Phe).

L’Aspartame è un dolcificante dipeptidico formato dalla condensazione

dell’estere metilico della fenilalanina con l’acido aspartico Molto usato nei cibi e nelle bevande

200 volte più dolce del saccarosio

Vendite annuali: 200 milioni di libbre, 850 milioni di $.

Metodo Chimico:

Bisogna proteggere il gruppo amminico dell’acido aspartico per

prevenirne la reazione con un’altra molecola di acido aspartico e

dare sottoprodotti

Si deve usare il singolo enantiomero corretto di ogni reagente per

avere la corretta stereochimica dell’aspartame (il beta-aspartame

è amaro).

Metodo Enzimatico:

La Termolisina promuove la reazione solo alla funzionalità alfa

Condizioni blande, pH 6-8, 40 °C

Cbz. = benzilossicarbonile.


Bioproduzione dell’Aspartame.

H2O

termolisina

estere metilico D,L-fenilalanina

Cbz-aspartame

+

Acido N-Cbz-aspartico

Cbz = benzilossicarbonile

(PhCH2OCO-)


L-Carnitina.

• Inibitore della Tiroide

Agente dimagrante

Supplemento dietetico per atleti

Si usa solo un enantiomero del composto

Disponibili due strade biocatalitiche:

Saccharomyces cerevisiae

Rhizobiaceae

L-Carnitina


Sintesi della Carnitina.

(1)

riduttasi

estere ottilico dell’acido g-cloroacetoacetico

estere ottilico dell’acido(R)-g-cloro-b-idrossibutanoico

L-carnitina

idrossilasi

L-carnitinag-butirrobetaina

(2)


Sintesi Alternative del Naproxen.

Naproxen


Sintesi del Calcio Antagonista Diltiazem.


Sintesi Ambientalmente Compatibile del

Catecolo dal Glucosio vs. dal Benzene.

(a) propilene, catalizzatore solido H3PO4, 200-260°C, 400-600 psi.

(b) O2, 80-130°C quindi SO2, 60-100°C.

(c) Ti-Silicalite, 70-80°CDraths and Frost, 1995

(d) E. coli AB2834/pKD136/pKD9.069A, 37°C.


Eliminazione dell’Amaro dagli Idrolizzati Proteici.

• Trattamento con carboni attivi

• Estrazione con alcool

• Precipitazione isoelettrica

• Separazione cromatografica

• Mascheramento dell’amaro

• Idrolisi enzimatica dei peptidi amari

con amminopeptidasi

con proteasi alcalina/neutra

con carbossipeptidasi

• Reazioni di condensazione usando proteasi


Mannitolo.

• Additivo alimentare (usato nel chewing gum)

• Riduce la tendenza alla cristallizzazione dello zucchero e si usa come tale per aumentare la conservazione delle derrate

• Formulazioni farmaceutiche di compresse masticabili e polveri granulari

• Previene l’assorbimento dell’umidità dall’aria, mostra eccellenti proprietà alla compressione meccanica, non interagisce con i componenti attivi, e il suo leggero dolce maschera il sapore sgradevole di molti farmaci

• Il mannitolo esanitrato è un ben noto vasodilatore, usato nel trattamento dell’ipertensione

• Il complesso dell’acido borico con il mannitolo si usa nella produzione dei condensatori elettrolitici a secco

• E’ un poliolo ampiamente usato per la produzione di resine e tensioattivi

• Ha una limitata solubilità in acqua (solo 18% w/w a 25 °C)

• In soluzioni alcaline, è un potente sequestrante di ioni metallici

• E’ dolce circa la metà del saccarosio

• Si prepara per idrogenazione catalitica del D-fruttosio.


Via di Conversione Etero-fermentativa del

Fruttosio a Mannitolo.

2 Fruttosio

2 Mannitolo

Fruttosio

NADPH + H+

Lattato

ADP

NADP+

Acetato

CO2

Gliceraldeide - 3-P

Glucosio – 6-P

Piruvato

NAD+

ATP

2 ADP

2 ATP

Acetil - P

NADPH + H+

NADP+

6 - Fosfogluconato

Ribulosio – 5-P

Xilulosio – 5-P

NAD+

NADH + H+

NADH + H+

Fruttosio – 6-P

ADP

ATP

D-Fruttosio Mannitolo

Mannitolo 2-deidrogenasi

NAD(P)H NAD(P)


Produzione del Mannitolo dal Fruttosio per

Fermentazione batch a pH controllato.

Fruttosio

(g/L)

150

200

250

300

A 37oC, 130 rpm, pH Iniziale 6.5, pH controllato a 5.0, recipiente da 500 ml con 300 ml di mezzo.

Tempo

(h)

Mannitolo

(g/g)

Acido lattico

(g/g)

Acido Acetico

(g/g)

15

40

64

136

0.720.00

0.69±0.03

0.70±0.02

0.66±0.03

0.17±0.00

0.17±0.00

0.16±0.00

0.15±0.01

0.12±0.00

0.13±0.00

0.12±0.00

0.11±0.00


Co-Ulilizzazione del Fruttosio e Glucosio

(2:1) e Produzione del Mannitolo.

00

50

100

24 3612

Fruttosio

Glucosio

Mannitolo

Acido lattico

Acido acetico

37 CpH 5.0

O

48

Tempo (h)

Substr

ato

o P

rodotto (

g/L

)


Produzione del Mannitolo per Fermentazione

(Alimentata a Batch) a pH Controllato.

Fruttosio usato:

300 g/L

(concentrazione

finale)

00

50

100

150

200

24

Fruttosio

Mannitolo

Acido acetico

Acidolattico

37 CpH 5.0

O

72 9648Tempo (h)

Su

bstr

ato

o P

rod

otto

(g

/L)


Confronto tra Fermentazione e

Idrogenazione Catalitica.

FERMENTAZIONE:

• Tutto il fruttosio convertito in

mannitolo

• Co-prodotti: acido lattico e acido

acetico pari a metà del mannitolo

• Il glucosio è la fonte di idrogeno

nella idrogenazione

• Una fonte di azoto è essenziale

per la crescita

• Elettrodialisi per rimuovere gli

acidi organici

• Uso di substrati meno puri non

pone problemi

IDROGENAZIONE:

• Solo metà del fruttosio è

convertito in mannitolo

• Co-prodotto: sorbitolo in grande

eccesso (3)

• E’ necessario idrogeno gas molto

puro

• Essenziale il catalizzatore di

Nichel

• Resine a scambio ionico per

togliere gli ioni nichel

• Necessari substrati molto puri

per prevenire la disattivazione del

catalizzatore


Rigenerazione del Cofattore.

• Chimica

• Fotochimica

• Elettrochimica

• Biologica

• Enzimatica


Rigenerazione del Cofattore

(per la Conversione di D-Fruttosio in Mannitolo).

Mannitolo Deidrogenasi

Na-FormiatoCO2 + H2O

Formiato Deidrogenasi

Glucosio + H2OAcido GluconicoGlucosio Deidrogenasi

Oppure:

D-Fruttosio Mannitolo

NADH NAD+


Reazioni di Ossidazione Biocatalitiche.

I processi di Ossidazione Biologica non sono molto indagati (≠p.es. idrolasi)

1. mancanza di disponibilità commerciale e 2. considerati complessi (richiedono attrezzature/conoscenze

microbiologiche, adeguamenti, ‘cofattori’ non-enzimatici e proteine essenziali redox).

Lipasi

Esterasi

ProteasiNitrilasi

Altre Idrolasi

Ossido-riduttasi (cellule intere)

(enzimi isolati)

Ossigenasi

Liasi trasferasi Isomerasi


Esempi di Reazioni di Ossidazione

Biocatalitiche Disponibili.

Idrossilazioni

Ossidazione di alcoli

Ossidazioni di Baeyer-Villiger

Flavina Monoossigenasi (FMO)

Citocromi P450

Alcool Deidrogenasi



Biocatalitiche Disponibili (2).

Ossidazioni di eteroatomi

Varie ossidasi, inc. P450, diossigenasi, FMO

P450,cloroperossidasi

Epossidazioni

Amminoacido ossidasi

Ossidazione di amminoacidi



Biocatalitiche Disponibili (3).

Diidrossilazioni

Diossigenasi

Dealchilazioni

Perossidasi

Formazione di perossidi


Idrossilazione.

• Catalizzata dai Citocromi P450 (ossidasi contenenti l’EME

implicate nei processi di detossicazione cellulare).

• Si usano più frequentemente cellule intere in quanto:

I P450 tendono a legarsi alla membrana cellulare (perciò sono

intrattabili)

L’attività dipende da ‘cofattori’ non-proteici E normalmente da

proteine ausiliarie di tipo redox.


Idrossilazione (2).

Tipi di citocromi P450 (da Roberts G.A., Grogan, G., Greter, A.

Flitsch, S.L. e Turner N.J. J. Bacteriol. (2002) 184, 3898-3908.

FADFAD

EmeEmeFeS

NAD(P)H NAD(P)+

Classe IClasse II

NADPH NADP+

FMN/

ENDOPLASMICRETICULUM

NADPH NADP+

Classe III Classe IV

NADPH NADP+

FAD EmeFMN/HO2C NH2

FMN Eme NH2

FeS CO2H


Idrossilazione (3).

• Idrossilazione di steroidi [e.g. Peterson et al. J. Am. Chem. Soc. 74,

5933-5936 (1952)]

• L’applicazione commerciale della idrossilazione in 11a del progesterone

ha eliminato metà dei passaggi della sintesi dell’idrocortisone

• Esiste un biocatalizzatore per l’idrossilazione selettiva di CIASCUNA

posizione sul nucleo steroideo

• Nessun equivalente abiotico dimostra ugual selettività.

Progesterone 11a-Idrossi-Progesterone


Idrossilazione (4).

L’idrossilazione della (S)-nicotina da parte del A. oxydans (Lonza)

implicata nella produzione dell’epibatidina.

Schmid, A., Dordick, J.S., Hauer, B., Kiener, A., Wubbolts, M e Witholt, B., Nature

(2001) 409, 258-268.


Idrossilazione (5).


Ossidazioni di Alcoli.

TEMPO

“O” = NaOCl, m-CPBA, oxone (+ Br -)

van Bekkum et al , Synthesis, 1996, 1153

OH H

O

+ 0.5 O2

TEMPO (5m%)

Cu(II) / bipy (5m%)

Base / MeCN / H2O

Gamez

Cu(II) / PIPO / O2

• No solvente

• No Br-

• NaOCl

• Riciclabile

• Materia prima

economica

Chimassorb 944

Dijksman (2001)

RCH2OHO22

H2O

laccasi

laccasicox

.N

O

RCHON

O

+

Laccasi : una ossidasi multirame

Li (2004), Matijosyte de Vries/Hagen

OH

H

R1

R2

+ “O”

R2

R1

O + H2O

CH2Cl2 / H2O


Ossidazioni di Baeyer-Villiger.

Flavina Monoossigenasi (FMO)

Inserimento di un atomo di ossigeno adiacente al gruppo carbonilico catalizzato dalle Baeyer-Villiger Monoossigenasi (BVMO).

BVMO necessita di:

• Un cofattore flavinico• Un cofattore nicotinamide nucleotide• O2


Ossidazioni di Baeyer-Villiger (2).

Però, A. calcoaceticus è un patogeno ACDP di Classe II

Levitt, M.S., Newton, R.F., Roberts, S.M. and Willetts, A.J., J. Chem. Soc, Chem. Commun., (1990) 619-620.



1. Uso dell’enzima isolato

Approccio costoso (NADPH da Catalogo Sigma £ 500/g!)

Seelbach K., Riebel B., Hummel W., Kula M.R., Tishkov V.I., Egorov A.M., Wandrey C., Kragl U., Tetrahedron Lett., (1996) 37, 1377-1380.



2. Uso di organismo ingegnerizzato; BVMO espresso nel lievito ‘progettato’ o in Escherichia coli di Classe I

Wang, S., Chen, G. Kayser, M.M., Iwaki, H., Lau, P.C.K. and Hasagawa, Y.Can. J. Chem., (2002) 80, 613-621


Amminoacido Ossidasi – Racemizzazione di

Amminoacidi.

Amminoacido ossidasi

Catalizza la deamminazione ossidativa di amminoacidi a a-chetoacidi

Richiede ossigeno molecolare e una flavina come cofattore

Sono commercialmente disponibili con selettività sia ‘D’ che ‘L’

Si possono usare sia come enzimi isolati, che espressi in sistemi

cellulari completi


Amminoacido Ossidasi – DeRacemizzazione

di Amminoacidi.

Chemoenzymatic deracemisation of amino acids. After Hafner, E.W. and Wellner, D., Proc. Natl. Acad. Sci., 1971, 68, 987.


Amminoacido Ossidasi – Deracemizzazione

di Amminoacidi

Beard T.M. e Turner N. J., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (2002) 246-247

Deracemizzazione dell’acido D,L-piperazin-2-carbossilico(un componente dell’inibitore della protease HIV Crixivan)


Reazioni di Riduzione con “Daucus carota”.

• Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900.

• Maczka, W. K.; Mironowicz, A. Tetrahedron: Asymmetry 2002, 13, 2299.

• Bruni, R.; Fantin, g.; Medici, A.; Pedrini, P.; Sachetti, G. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 3377.

• Baldassarre, F.; Bertoni, G.; Chiappe, C.; Marioni, F. J. Mol. Cat. B: Enzymatic 2000, 11, 55.

• Chadha, A.; Manohar, M.; Soundararajan, T.; Lokeswari, T. S. Tetrahedron: Asymmetry 1996, 7, 1571.


Riduzioni con Lievito di Birra.

• stereoselettivo

• sostenibile

• facile da fare

• prezzi ragionevoli

• Il “Baker’s Yeast” è il solo microorganismo

che si può comprare in una panetteria.

• Non richiede condizioni asettiche e

neppure un laboratorio microbiologico.

• Non richiede l’aiuto di un microbiologo.

• Di fatto non è necessario conoscere per

nulla la microbiologia.


Limiti nell’uso del Lievito (BY).

• Nel sistema ci sono molti enzimi differenti, per cui non si

possono escludere reazioni collaterali.

• Il lievito BY commerciale non è puro e frequentemente

porta a risultati inattesi.

• L’isolamento del prodotto è talvolta complicato.

• Ci può essere un impatto ambientale implicato nella

preparazione del BY.


Procedura Semplice.


Effetto dei Sostituenti.

0

20

40

60

80

100

H Cl Br F NO2 Me MeO HO

PE

RC

EN

TU

AL

E

Resa ee

Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900.


Effetto del Nucleo Aromatico.

0

20

40

60

80

100

Naph MeO-Naph Furile Benzofuranile

Pe

rce

ntu

ale

Resa ee

Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900.


Effetto del Nucleo Aromatico (2)

0

20

40

60

80

100

Tetralone 2-tetralone 6-MeO-1-tetralone

Indanone

Pe

rce

ntu

ale

Resa ee


Altri Composti Carbonilici.

0

20

40

60

80

100

Tetralone 2-tetralone 6-MeO-1-tetralone

Pe

rce

ntu

ale

Resa ee


Fattore E = Kg Scarti reali

Kg di Prodotto

E = 10 g / 70 x 10-3 g = 143

100 mg 70 mg

Fattore EMY = Kg Scarti NBio*

Kg di Prodotto

* NBio = scarti che non si possono smaltire o riciclare in sicurezza

EMY = 70 x 10-3g / 70 x 10-3 (+10)g

= da 1 a 0.007

Efficienza: Fattori E e EMY in Biotrasformazioni.


Tempi di Reazione e Rapporti.

45

72

89

62 61

0

20

40

60

80

100

acetofenone chetoniciclici

chetonialifatici

chetoesteri azidochetoniTem

po

di re

azio

ne m

ed

io (

ore

)

45

24

6 3

0

20

40

60

80

100

100/1 1000/1 5000/1 10000/1

Tem

po

di

reazio

ne m

ed

io (

ore

)

Rapporto carota/

substrato


Usi Non-Convenzionali di Enzimi in Mezzi Non acquosi.

Liofilizzazione

SaliAcqua

(Solubile)

“Anidro”

Solvente Organico

(Insolubile)


Substrato

Prodotti

Consentite temperature

superiori

Più alte concentrazione di

vapori

Superiore

stabilità/durabilità

Limitato cineticamente, non

limitato dal trasporto

interfase

Verificato in esterificazioni,

vari test in corso

Uso non-convenzionale di Enzimi: Stato-Dry.


Adattare il Catalizzatore Enzima al Processo Ideale.

Processo Nightmare

Cataliz-

zatore

Sviluppare il processo per

assestare il catalizzatoreAdattare il catalizzatore

al processo ottimale

Sviluppo

Processo Auspicabile

Catalizzatore

Adattato

Evoluzione Diretta


Mescolamento del DNA: Evoluzione nella

Linea più Veloce.

Nuovi Geni

gene A

gene B

gene C

gene D

Ripetere

Selezione HTP

Genidalla Natura

Librerie di Nuovi Geni

Miscelazione DNA TM


Green Synthesis of Lipitor Intermediate (Codexis).

KRED = cheto reduttasi ; GDH = glucosio deidrogenasi

HHDH = aloidrina dealogenasi (nucleofilo non-naturale)

Presidential Green Chemistry Challenge Award 2006

Nature Biotechnol. 2007, 25, 338-334


Miglioramento Prestazioni per Evoluzione Orientata: dal

lab al processo commerciale per miscelazione geni.

1. KRED + GDH

97%~80%>90%Resa Isolata

0.7 g/L10 g/L<1 g/LAlimentaz. Enzima

~1 min.>1 hTempo di separaz. fasi

540 g/L·giorno80 g/L·giorno>240 g/L·giornoProduttività Volumetrica

8 h24 h<16 hTempo di Reazione

180 g/L80 g/L160 g/LAlimentaz. Substrato

Prestazione FinalePrestazione InizialeProg. ProcessoParametro

92%~60%>90%Resa Isolata

1.2 g/L130 g/L<1.2 g/LAlimentaz. Enzima

670 g/L·giorno7 g/L·giorno>180 g/L·giornoProduttività Volumetrica

5 h72 h<16 hTempo di Reazione

140 g/L20 g/L120 g/LAlimentaz. Substrato

Prestazione FinalePrestazione InizialeProg. ProcessoParameter2. HHDH


Svantaggi degli Enzimi (e Soluzione).

• Basse stabilità operativa e durata di conservazione

• Macchinoso recupero e ri-uso

(operazione batch vs. continua)

• Contaminazione del Prodotto

Soluzione : Immobilizzazione


Aggregati di Enzimi Reticolati (CLEA).

Enzima in soluzione

precipitante

CLEASaggregato

Connettore X

come connettori X si usa la glutaraldeide o la polialdeide del destrano

• Consente il riciclo per filtrazione

• Maggiore produttività

• Non richiede enzimi ad alta purezza

• Procedura semplice e / ben applicabile

• Stabilità rispetto alla denaturazione

CLEAS attivi in:

- scCO2 (M. Poliakoff)

- Liquidi ionici (Sheldon)

Sorgedrager (2006), Janssen (2006 )


Esempli di CLEAzione Riuscita.

Idrolasi

• Pen. acilasi (2)

• Lipasi (7)

• Esterasi (3)

• Proteasi (3)

• Nitrilasi (2)

• Amminoacilasi

• Fitasi

• Galattosidasi

• OPH

Ossidoriduttasi

• ADH

• FDH

• Glucosio ossidasi

• Galattosio ossidasi

• Laccasi

• Catalasi

• Cloroperossidasi

Liasi

•R- & S- HnLiasi

• PDC

• DERA

• Nitrile idratasi

Cao, Lopez-Serrano, Mateo, Perez, van Langen, Sorgedrager

Janssen, Bode, van Pelt, Chmura, Matijosyte, Aksu-Kanbak,


Processi Catalitici in Cascata

Resa 97% / > ee 99%Resa 99% / ee 95%Catalizzatore:

Rh(monophos) su TUD-1

Simons (2007)

Kotlewska

H2O2 H

OH

lipase

PS- I(O2CR)2

PS- I

RCOOH

RCO2OH

OH2O


Cascata Trienzimatica con un Triple-Decker combi CLEA.

HCN /(S)-HnL

Conv. 96% / ee >99%

NLasi

Pen G amidasi

Chmura, Stolz


Conclusioni

• Le Reazioni Biocatalitiche continuano ad essere studiate con grande interesse perché: In molti casi, non esistono reazioni equivalenti

‘abiotiche’ di selettività confrontabile

Le caratteristiche generali delle Reazioni Biocatalizzate le fanno percepire come vie ‘più sostenibili’ per molti composti.

• Ostacoli Percezione dell’uso di sistemi microbici/ biochimici

dalla comunità organica

Percezioni dell’uso di organismi/reagenti GM nella produzione di materiali per il consumo umano


Aree di Ricerca di Bioprocessi

• Produzione di combustibili e composti chimici

• Trattamento biologico di combustibili fossili

• Biotrattamento & bioremediation

• Biologia applicata

• Sintesi Organica.

Capacità

• Ing. BioChim. - nuovi reattori, separazioni, modellizzazioni

e integrazione di sistemi

• Biocatalizzatori multi-fase e non acquosi

• Sviluppo di ceppi microbici e bioprospezione

• Infrastrutture per ricerche di bioprocessi.

Aree correlate - Separazioni (indotte da campi elettrici)

- Biomimetici (adsorbenti, catalisi, materiali).


Biotrattamenti e Bioremediation di Scarti.

• Biofiltrazione e Biosolubilità di VOC (alcani, NOx, TCE)

• Agenti Chim-Bio

• Biocatalisi non acquosa (‘anidra’) per vapori pericolosi (CWA, VOC)

• Bioadsorbimento di metalli pesanti (U, Cd) con biopolimeri

• Rimozione e trattamento del mercurio

• Bioremediation usando enzimi termofili non acquosi (solventi clorurati)

• Biodegradazione dei PCB

• Biodegradazione dei BTEX e combustibili

• Over espressione microbica di enzimi degradativi e produzione di

GEM

• Biodegradazione dei pesticidi e farmaci.


Riferimenti sulla Biotecnologia

• B. R. Glick, C. L. Patten: Molecular Biotechnology: Principles and

Applications of Recombinant DNA 5th Ed. ASM Press (2017)

• V. S. Bisaria, A. Kondo Ed. Bioprocessing of Renewable Resources

to Commodity Bioproducts, 2014 (ISBN: 9781118175835)

• Werpy T, Petersen G. Top Value Added Chemicals From Biomass.

Volume I (2004): Results of Screening for Potential Candidates from

Sugars and Synthesis Gas PNNL Laboratory and National Renewable

Energy Laboratory (NREL), Vol.II (2007)

• Ahmann D, Dorgan J. Bioengineering for Pollution Prevention through

Development of Biobased Energy and Materials: State of the Science

Report U.S. EPA Agency, Jan. 2007. EPA/600/R-01/028.

• Gary Walsh, Biopharmaceuticals : Biochemistry and Biotechnology

2003 (ISBN: 978-0-470-84327-7)

• M. Shuler, F. Kargi: Bioprocess Engineering - Basic concepts,

Prentice Hall; 2 Ed. (2001)

Catalisi Enzimatica/Biotrasformazioni in Chimica Verde....anatomia e fisiologia ... Gli egizi...

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