CAT Critically Appraised Topic

Pseudotrombocytopenie

AUTHOR: Sarah Resseler SUPERVISOR: Caroline Brusselmans SEARCH/METHODOLOGY VERIFIED BY: Johan Frans DATE: 12/06/2007 EXPIRY DATE: 12/06/2009 CLINICAL BOTTOM LINE Clinici van alle medische specialismen worden frequent geconfronteerd met trombopenie. De symptomatologie kan zeer verschillend zijn afhankelijk van de onderliggende oorzaak welke niet altijd gemakkelijk te achterhalen is. Sinds de introductie van hematologische analysers moet men daarenboven ook rekening houden met de mogelijkheid van een onterecht lage plaatjestelling zoals dat het geval is bij pseudotrombopenie ten gevolge van het gebruik van EDTA als anticoagulans. EDTA-geïnduceerde pseudotrombopenie is een frequente oorzaak van een verlaagd aantal plaatjes door de vorming van bloedplaatjesaggregaten in aanwezigheid van EDTA. De herkenning ervan is belangrijk zodat men de patiënt niet ten onrechte aan verdere (dure) onderzoeken gaat blootstellen of eventueel zelfs gaat behandelen. EDTA-afhankelijke pseudotrombopenie is de belangrijkste oorzaak is van een onderschatting van het reële bloedplaatjesaantal, maar er zijn nog andere oorzaken van onjuiste plaatjestellingen die resulteren in een onderschatting maar eventueel ook in een overschatting van het reële aantal bloedplaatjes. Het is dus ook zeer belangrijk dat men de beperkingen van de gebruikte analyser kent en tracht onjuiste resultaten te herkennen en corrigeren. CLINICAL/DIAGNOSTIC SCENARIO Bloedplaatjes worden gevormd door fragmentatie van het cytoplasma van megakaryocyten. Ze circuleren in het bloed als kleine discoïde cellen met een gemiddelde overlevingsduur van 10 dagen waarna ze verwijderd worden uit de circulatie door het monocyten-macrofagen/reticolu-endotheliaal systeem. De hematopoïetische groeifactor trombopoïetine is een belangrijke regulator in de productie van bloedplaatjes, en wordt in de lever geproduceerd. Onder normale omstandigheden bevindt ongeveer een derde van de circulerende bloedplaatjes zich ter hoogte van de milt. Trombocyten hebben een essentiële rol in hemostase en belangrijke kwantitatieve of kwalitatieve afwijkingen kunnen dan ook aanleiding geven tot mucocutane bloedingen. Jongere plaatjes zijn groter, bevatten RNA en vertonen een grotere hemostatische activiteit (4). In de meeste laboratoria, en ook in UZ Leuven, bevindt een normale bloedplaatjestelling zich tussen de 150 000 en 450 000/µL. Trombocytopenie wordt gedefinieerd als een telling lager dan 150 000/µL maar er bestaan geen algemeen gehanteerde definities van milde, matige of ernstige trombopenie(5). In UZ Leuven rapporteren wij een bloedplaatjesaantal tussen 100 000 en 150 000/µL als een lichte trombopenie, tussen 50 000 en 100 000 als matig en beneden

1

de 50 000/µL als een ernstige trombopenie of microscopisch onder de vorm van gradaties respectievelijk 1-, 2- en 3-. Clinici van alle disciplines worden frequent geconfronteerd met trombopenie, als toevallige vondst bij een asymptomatische patiënt bij het aanvragen van een routine complet of bij patiënten met bloedingssymptomen, typisch mucosaal (gingivaal, epistaxis,…) of cutaan (petechieën, ecchymosen,…). Een verlaagd plaatjesaantal bij een asymptomatische patiënt is een regelmatig gegeven sinds het uitvoeren van automatische celtellingen. Binnen deze groep patiënten is in de jaren zestig ook het bestaan van pseudotrombopenie aan het licht gekomen. Een praktische benadering in de evaluatie van verworven trombopenie en een overzicht van de mogelijke oorzaken Trombocytopenie kan men vermoeden op basis van bloedingssymptomen of kan men ontdekken bij het uitvoeren van een routine complet bij een asymptomatische patiënt. Spontane bloedingen treden frequent op bij plaatjestellingen van 10-50x109/L, en kunnen zeer ernstig zijn bij plaatjes <10x109/L. Bij plaatjesaantallen tussen 50-100x109/L is er meestal geen verhoogde bloedingsneiging. De onderliggende oorzaak van een verlaagd aantal bloedplaatjes kan eerder onbelangrijk zijn (zoals pseudotrombopenie) of van levensbedreigende aard. Een algoritme voor de evaluatie van trombopenie en een overzicht van de meest voorkomende oorzaken kan toelaten de levensbedreigende van de minder ernstige oorzaken te onderscheiden. De pathofysiologische mechanismen van trombocytopenie kunnen in drie groepen worden ingedeeld:

- verminderde productie ter hoogte van het beenmerg - verhoogde perifere afbraak - toegenomen pooling van de bloedplaatjes ter hoogt van de milt.

Bij de aanwezigheid van een geïsoleerde trombopenie zonder bloedingssymptomen moet de clinicus steeds bedacht zijn op de mogelijkheid van een pseudotrombopenie en dit steeds uitsluiten vooraleer verdere stappen te ondernemen. Volgens de National Guideline Clearinghouse moet men de eerste maal dat een trombopenie wordt gedetecteerd bij een patiënt (<100x109/L), op ditzelfde staal de aanwezigheid van bloedplaatjesaggregaten nagaan (1). De aanwezigheid van bloedplaatjesaggregaten op een perifeer bloeduitstrijkje en eventueel een normale plaatjestelling bij afname in een citraattube bevestigt EDTA-afhankelijke pseudotrombopenie als oorzaak. Bij bevestiging van de trombopenie moet men dit verder investigeren en de oorzaak trachten te achterhalen. Afhankelijk van de leeftijd van de patiënt is er een zekere variatie in de meest voorkomende oorzaken van verworven trombocytopenie. De klinische achtergrond is hierbij ook zeer belangrijk, is de patiënt ambulant of acuut ziek, eventueel een zwangere vrouw, de aanwezigheid van een gekende aandoening (bv. leverlijden). De eerste belangrijke stap in de investigatie van een nieuwe trombopenie is een nauwkeurig onderzoek van het perifeer bloeduitstrijkje, niet alleen om de mogelijkheid van een pseudotrombopenie uit te sluiten maar ook om specifieke afwijkingen op te sporen die richtinggevend zijn in de evaluatie van trombopenie. Zo kunnen er tekens van hemolyse zijn, aanwezigheid van fragmentocyten en/of sferocyten, of eventueel andere tekens die de mogelijkheid van een primaire hematologische aandoening suggereren zoals blasten, macrocytose, erythroblasten (Bijlage2+3). Hieronder volgt een kort overzicht van de meest voorkomende oorzaken van verworven trombopenie. Congenitale trombocytopenie en ook trombocytopenie geassocieerd met zwangerschap laten we hier verder buiten beschouwing (Bijlage1+2+3).

2

IDIOPATHISCHE TROMBOCYTOPENISCHE PURPURA ITP wordt beschouwd als een relatief frequente aandoening bij volwassenen. Een Deense studie vermeldt een incidentie van 2.68 per 100 000 bij volwassenen, de incidentie in de Verenigde Staten en Groot-Brittanië bedraagt 5.8-6.6 per 100 000 per jaar(2,11). Hoewel ITP binnen alle leeftijdscategorieën voorkomt, zijn patiënten met ITP vaak jonge, volwassen vrouwen. ITP is een auto-immuunaandoening veroorzaakt door de aanwezigheid van anti-plaatjes antilichamen, meestal IgG gericht tegen plaatjesantigenen ter hoogte van GP IIb/IIIa en GPIb/IX complexen, resulterend in een verhoogde afbraak van bloedplaatjes. De afbraak van bloedplaatjes vindt voornamelijk plaats ter hoogte van de milt. Bij volwassenen kent ITP een insidieus begin, en de symptomatologie kan sterk variëren afhankelijk van de plaatjestelling. Er is sprake van een geïsoleerde trombopenie (geen anemie of leukopenie) zonder andere klinische afwijkingen, nog aanwezigheid van atypische bevindingen in het perifeer bloeduitstrijkje. De diagnose berust op de exclusie van andere oorzaken van trombopenie. Over het feit of een beenmergonderzoek al dan niet geïndiceerd, is heerst nog enige discussie, de American Society of Haematology heeft daarover nog geen consensus bereikt, wel stellen zij voor een beenmergonderzoek uit te voeren bij patiënten ouder dan 60 jaar en bij patiënten waarbij men een splenectomie overweegt (6). Volgens een Chinese retrospectieve studie is een beenmergonderzoek geïndiceerd bij patiënten ouder dan 60 jaar, bij atypische bevindingen, bij zwakke respons op de primaire therapie en bij patiënten waar men een splenectomie overweegt (12). DRUG-INDUCED TROMBOCYTOPENIE Een zeer groot aantal geneesmiddelen kan geassocieerd zijn met trombopenie; frequente zijn quinine, quinidine, rifampicine, trimethoprim/sulfamethoxazole, linezolide. Cytotoxische chemotherapie en ethanol veroorzaken trombocytopenie door directe inhibitie van de megakaryocyten. De meeste andere geneesmiddelen veroorzaken plaatjesafbraak via een immuungemedieerd mechanisme. Er worden antilichamen gevormd tegen bloedplaatjes bij binding van het geneesmiddel aan het membraan van de bloedplaatjes, waardoor bepaalde aminozuur- of koolhydraatsequenties die normaal verborgen liggen open komen te liggen en antigene eigenschappen verwerven (5,6). Heparine-geïnduceerde trombopenie (HIT) is een belangrijke oorzaak van trombopenie bij gehospitaliseerde patiënten. Er zijn twee vormen van HIT beschreven. HIT type 1 is een matige, transiënte trombopenie die optreedt binnen twee à drie dagen na starten met heparine. De trombopenie verdwijnt spontaan, zelfs indien men de behandeling met heparine niet onderbreekt. Type 2 HIT is minder frequent, 0.5 tot 3% van patiënten behandeld met niet-gefractioneerd heparine, en wordt veroorzaakt door antilichamen gericht tegen heparine gebonden aan plaatjes factor 4. Het complex gevormd door deze drie moleculen kan plaatjesactivatie veroorzaken, waardoor er een tromboserisico ontstaat ondanks lage plaatjesaantallen (5,6). SEPSIS/INFECTIE Bij patiënten met sepsis kan een variërende graad van trombopenie geassocieerd zijn. Meestal is het onderliggende mechanisme multifactorieel, aspecifieke immunologische destructie van bloedplaatjes, verhoogd verbruik, onderdrukking van de productie, medicatie. Trombocytopenie kan ook geassocieerd zijn met specifieke infecties zoals bepaalde virussen (o.a. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, HIV) (5,6).

3

TROMBOTISCHE TROMBOCYTOPENISCHE PURPURA-HEMOLYTISCH UREMISCH SYNDROOM (TTP-HUS) TTP-HUS is een eerder zeldzame oorzaak van trombopenie, maar potentieel levensbedreigend. De diagnose is een klinische diagnose en wordt gekarakteriseerd door een klassieke pentade van microangiopathische hemolytische anemie, trombocytopenie, fluctuerende neurologische tekens, nierinsufficiëntie en koorts. De trombopenie kan zeer ernstig zijn (mediaan 20x109/L), er zijn tekens van hemolyse (verhoogd LDH, bilirubine, fragmentocyten). De coagulatieparameters zijn meestal normaal en de directe Coombs is negatief. Er is sprake van accumulatie van grote multimeren van von Willebrand factor door een verworven of aangeboren deficiëntie van een protease, het ADAMTS13. Hierdoor treedt er spontane aggregatie op van bloedplaatjes en vorming van stolsels in de microcirculatie (hersenen en nieren) (2,5,6). DIFFUSE INTRAVASALE COAGULATIE (DIC) DIC is een complicatie van heel wat verschillende aandoeningen, frequente oorzaken zijn obstetrische complicaties, maligniteiten, trauma, bacteriële sepsis. De trombocytopenie is het resultaat van activatie van de stollingscascade, aanleiding gevend tot de vorming van kleine trombi waardoor rode bloedcellen in de circulatie beschadigd worden. Naast trombocytopenie ziet men dus ook fragmentocyten, verlengde PT en aPTT, verlaagd fibrinogeen en de aanwezigheid van fibrine degradatieprodukten ten gevolge van secundaire fibrinolyse (5). SPLENOMEGALIE Aangezien onder normale omstandigheden ongeveer een derde van de bloedplaatjes gesequestreerd is in de milt, zal deze fractie toenemen bij splenomegalie resulterend in trombocytopenie. Geïsoleerde splenomegalie is zeer zeldzaam en bij de meeste patiënten zijn er ook andere klinische manifestaties van een onderliggende ziekte aanwezig. De meest frequente oorzaken van splenomegalie zijn portale hypertensie secundair aan leverlijden en myeloproliferatieve of lymfoproliferatieve aandoeningen met infiltratie van de milt. De trombocytopenie is meestal matig diep, zelden minder dan 40x109/L (5). Daar een eerste belangrijke stap in de diagnose van trombopenie het uitsluiten van een pseudotrombopenie is, is de bedoeling van deze CAT trachten een beeld te krijgen van de betrouwbaarheid van de automatische telling van bloedplaatjes, met bijzondere aandacht voor het fenomeen pseudotrombopenie, en verder een overzicht te geven van de mogelijke pitfalls waar men zich van bewust moet zijn. QUESTION(S) 1) Hoe betrouwbaar zijn de automatische tellingen van bloedplaatjes en welke mogelijke

valkuilen zijn er bekend? 2) Is de huidige test voor het opsporen van pseudotrombopenie geschikt en wordt deze

optimaal aangevraagd door de clinici? SEARCH TERMS 1) MeSH Database (PubMed): MeSH term: “platelet count”, “thrombocytopenia”, “EDTA”,

Other key words: pseudothrombocytopenia, haematology analysers, spurious platelet count, optical platelet count, impedance platelet count

4

2) PubMed Clinical Queries (from 1966; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi): Systematic Reviews, Clinical Queries using Research Methodology Filters (diagnosis + specific, diagnosis + sensitive, prognosis + specific)

3) Pubmed (Medline; from 1966), SUMSearch (http://sumsearch.uthscsa.edu/), National Guideline Clearinghouse (http://www.ngc.org/).

4) UpToDate Online version 14.2 (2005) RELEVANT EVIDENCE/REFERENCES 1) Guidelines and Recommendations (most recent topics on top)

- 2006: National Guideline Clearinghouse: Thrombocytopenia.(1)

- 2003: British Committee for Standards in Haematology: Guidelines on the diagnosis and management of the thrombotic microangiopathic haemolytic anaemias.(2)

- 2003: British Society for Haematology: Guidelines for the investigation and

management of idiopathic thrombocytopenic purpura in adults, children and in pregnancy.(3)

2) Reviews

- George NJ. Platelets. Lancet 2000;355:1531-39.(4) - Sekhon SS, Roy V. Thrombocytopenia in adults: a practical approach to evaluation

and management. South Med J 2006; 99(5):491-98.(5)

- George NJ, Woolf SH, Raskob GE, Wasser JS, Aledort LM, Ballem PJ, Blanchette VS et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: a practice guideline developed by explicit methods for the American Society of Haematology. Blood 1996;88(1):3-40.(6)

- Drachman JG. Inherited thrombocytopenia: when a low platelet count does not

mean ITP. Blood 2004;103(2):390-398.(7)

- Zandecki M, Genevieve F, Gerard J, Godon A. Spurious counts and spurious results on haematology analysers: a review. Part I: platelets. Int J Lab Hematol 2007;29(1):4-20.(8)

- Kunz D. Possibilities and limitations of automated platelet counting procedures in

the thrombocytopenic range. Semin Thromb Hemost 2001;27(3):229-35.(9)

- Berkman N, Michaeli Y, Or R, Eldor A. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: a clinical study of 18 patients and a review of the literature. Am J Hematol 1991;36(3):195-201.(10)

3) Original Articles

5

- Frederiksen H, Schmidt K. The incidence of idiopathic thrombocytopenic purpura in adults increases with age. Blood 1999;94(3):909-913.(11)

- Mak YK, Yu PH, Chan CH, Chu YC. The management of isolated

thrombocytopenia in Chinese adults: does bone marrow examination have a role at presentation? Clin Lab Haem 2000;22(6): 355-358.(12)

- Sandhaus LM, Osei ES, Agrawal NN, Dillman CA, Meyerson HJ. Platelet

counting by the Coulter LH 750, Sysmex XE 2100, and Advia 120: a comparative analysis using the RBC/platelet ratio reference method. Am J Clin Pathol 2002;118:235-241.(13)

- Harrison P, Ault KA, Chapman S, Charie L, Davis B, Fujimoto K, Houwen B,

Kunicka J, Lacombe F, Machin S, Raynor R, van Hove L, van Assendelft OW. An interlaboratory study of a candidate reference method for platelet counting. Am J Clin Pathol 2001;115:448-459.(14)

- Segal HC, Briggs C, Kunka S, Casbard A, Harrison P, Machin SJ, Murphy MF.

Accuracy of platelet counting haematology analysers in severe thrombocytopenia and potential impact on platelet transfusion. Br J Haematol 2005;128:520-525.(15)

- International Council for Standardization in Haematology Expert Panel on

Cytometry and International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting. Am J Clin Pathol 2001;115:460-464.(16)

- Gowland E, Kay HE, Spillman JC, Williamson JR. Agglutination of platelets by a

serum factor in the presence of EDTA. J Clin Pathol 1969;22(4):460-464.(17)

- Cohen AM, Cycowitz Z, Mittelman M, Lewinski UH, Gardyn J. The incidence of pseudothrombocytopenia in automatic blood analyzers. Haematologia 2000;30(2):117-121.(18)

- Shreiner DP, Bell WR. Pseudothrombocytopenia: manifestation of a new type of

platelet agglutinin. Blood 1973;42(4):541-9.(19)

- Fiorin F, Steffan A, Pradella P, Bizzaro N, Potenza R, De Angelis V. IgG platelet antibodies in EDTA-dependent pseudothrombocytopenia bind to platelet membrane glycoprotein IIb. Am J Clin Pathol 1998;110(2):178-183.(20)

- Bizzaro N. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: a clinical and

epidemiological study of 112 cases with a 10-year follow-up. Am J Hematol 1995;50(2):103-109.(21)

- Sakurai S, Shiojima I, Tanigawa T, Nakahara K. Aminoglycosides prevent and

dissociate the aggregation of platelets in patients with EDTA-dependent pseudothrombocytopenia. Br J Haematol 1997;99(4):817-823.(22)

- Pegels JG, Bruynes EC, Engelfriet CP, von dem Borne AE.

Pseudothrombocytopenia: an immunologic study on platelet antibodies dependent on ethylene diamine tetra-acetate. Blood 1982;59(1):157-161.(23)

6

- Casonato A, Bertomoro A, Pontara E, Dannhauser D, Lazzaro AR, Girolami A.

EDTA dependent pseudothrombocytopenia caused by antibodies against the cytoadhesive receptor of platelet gpIIB-IIIA. J Clin Pathol 1994;47(7):625-630.(24)

- Zucker MB, Borrelli J. Reversible alterations in platelet morphology produced by

anticoagulants and by cold. Blood 1954;9(6):602-608.(25)

- Mori M, Kudo H, Yoshitake S, Ito K, Shinguu C, Noguchi T. Transient EDTA-dependent pseudothrombocytopenia in a patient with sepsis. Intensive Care Med 2000;26(2):218-220.(26)

- Silvestri F, Virgolini L, Savignano C, Zaja F, Velisig M, Baccarani M. Incidence

and diagnosis of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia in a consecutive outpatient population referred for isolated thrombocytopenia. Vox Sang 1995;68(1):35-39.(27)

- Bragagni G, Bianconcini G, Brogna R, Zoli G. Pseudothrombocytopenia : clinical

comment on 37 cases. Minerva Med 2001;92(1) :13-17. [Article in Italian].(28)

- Bartels PC, Schoorl M, Lombarts AJ. Screening for EDTA-dependent deviations in platelet counts and abnormalities in platelet distribution histograms in pseudothrombocytopenia. Scand J Clin Lab Invest 1997;57(7):629-636.(29)

- Garcia Suarez J, Merino JL, Rodriguez M, Velasco A, Moreno MC.

Pseudothrombocytopenia: incidence, causes and methods of detection. Sangre (Barc.) 1991;36(3):197-200. [Article in Spanish].(30)

- Vicari A, Banfi G, Bonini PA. EDTA-dependent pseudothrombocytopaenia : a 12-

month epidemiological study. Scand J Clin Lab Invest 1988;48(6):537-542.(31)

- Onder O, Weinstein A, Hoyer LW. Pseudothrombocytopenia caused by platelet agglutinins that are reactive in blood anticoagulated with chelating agents. Blood 1980;56(2):177-182.(32)

- Lazo-Langner A, Piedras J, Romero-Lagarza P, Lome-Maldonado C, Sanchez-

Guerrero J, Lopez-Karpovitch. Platelet satellitism, spurious neutropenia and cutaneous vasculitis: casual or causal association? Am J Hematol 2002;70(3):246-249.(33)

- Espanol I, Muniz-Diaz E, Domingo-Claros A. The irreplaceable image: platelet

satellitism to granulated lymphocytes. Haematologica 2000;85(12):1322.(34)

- Racchi O, Rapezzi D. Megathrombocytes and spurious thrombocytopenia. Eur J Haematol 2001;66(2):140-141.(35)

- Kakkar N, Garg G. Cytoplasmatic fragments of leukaemic cells masquerading as

platelets in an automated haematology analyser. J Clin Pathol 2005;58(2):224.(36)

7

- van der Meer W, MacKenzie MA, Dinnissen JW, de Keijzer MH. Pseudoplatelets: a retrospective study of their incidence and interference with platelet counting. J Clin Pathol 2003;56(10):772-774.(37)

- Kakkar N. Spurious rise in the automated platelet count because of bacteria. J Clin

Pathol 2004;57(10):1096-1097.(38)

- Latif S, Veillon DM, Brown D, Kaltenbach J, Curry S, Linscott AJ, Oberle A, Cotelingam JD. Spurious automated platelet count. Enumeration of yeast forms as platelets by the cell-DYN 4000. Am J Clin Pathol 2003;120(6):882-885.(39)

- Crabbe G, Van Poucke M, Cantinieaux B. Artefactually-normal automated platelet

counts due to malaria-infected RBC. Clin Lab Haem 2002;24(3):179-182.(40)

- Cantero M, Conejo JR, Jiménez A. Interference from lipemia in cell count by hematology analysers. Clin Chem 1996;42(6 Pt1):987-988.(41)

- Kabutomori O, Iwatani Y, Kabutomori M. Effects of hypertriglyceridemia on

platelet counts in automated hematologic analysis. Ann Intern Med 1999;130(5):452.(42)

- Fohlen-Walter A, Jacob C, Lecompte T, Lesesve JF. Laboratory identification of

cryoglobulinemia from automated blood cell counts, fresh blood samples, and blood films. Am J Clin Pathol 2002;117(4):606-614.(43)

4) Reference Works, Handbooks and Databases

- Kjeldsberg C, ed. Practical Diagnosis of Hematologic Disorders.3rd ed. Chicago, Illinois: ASCP Press; 2000, p739-750: ‘Thrombocytopenia’.(44)

- Lee GR, ed. Wintrobe’s Clinical Hematology. 10th ed. Baltimore: Williams &

Wilkins;1999, p1579-1582: ‘Thrombocytopenia: pathophysiology and classification’.(45)

5) Posters, “grey literature”, presentations

- Proceedings of the Sysmex European Symposium 2003. Machin SJ, Briggs C. Platelet counts in severely thrombopenic samples.(46)

- Diagnostische en therapeutische gids 2002. Verhaeghe R, Bossuyt X, Peetermans

W. K.U.Leuven Universitaire Ziekenhuizen.(47)

APPRAISAL 1. Automatische telling van bloedplaatjes Sinds de hematologische analysers de manuele technieken voor celtellingen eind jaren zestig vervangen hebben, zijn er meldingen van inaccurate celtellingen. Verbeteringen in de hardware en software van de analysers hebben aanleiding gegeven tot een betere analyse van abnormale resultaten. Een grafische weergave van de resultaten en het inbouwen van interne

8

vlaggen laten toe analytische fouten beter te detecteren. Ondanks belangrijke verbeteringen blijft het rapporteren van accurate plaatjesaantallen moeilijkheden stellen voor de hematologische laboratoria. Factoren die hiertoe bijdragen kunnen enerzijds analytische factoren zijn, zoals technische beperkingen voor het elimineren van cellulaire en andere interferenties in de plaatjestelling. Anderzijds kunnen pre-analytische factoren, te wijten aan de conditie van de patiënt of aan staalcondities zoals aggregatie van bloedplaatjes in aanwezigheid van EDTA, een rol spelen (8,13). Het is dus zeer belangrijk dat men er zich van bewust is dat, ondanks inspanningen van firma’s om de performantie van hun toestel te verbeteren, op elke hematologische analyser verkeerde celtellingen kunnen optreden en dat men op de hoogte is van de aard van deze valse resultaten daar deze verschillend zijn afhankelijk van de gebruikte analyser. Overzicht van de methoden voor telling van bloedplaatjes a. Microscopische telling Gedurende lange tijd gebeurde de telling van bloedplaatjes manueel met behulp van een fase contrast microscoop en een telkamer. Dit is echter een zeer tijdrovende techniek en wordt sinds de introductie van geautomatiseerde celapparatuur niet meer gebruikt. Tot een aantal jaren geleden was deze methode wel nog de referentiemethode voor plaatjestelling en werd deze gebruikt voor de calibratie van hematologische analysers maar, aangezien deze methode niet alleen zeer arbeidsintensief is maar er ook een belangrijke imprecisie is bij de evaluatie van zeer lage plaatjesaantallen, is er een nieuwe referentiemethode vooropgesteld namelijk flowcytometrische telling van bloedplaatjes (14). b. Elektronische telling: impedantiemethode De geanalyseerde partikels zijn gesuspendeerd in een elektrolytenoplossing die doorheen een nauwe opening passeert tussen twee compartimenten, waarvan één een positieve elektrode bevat en de andere een negatieve. Telkens wanneer er een cel passeert is er een toename van de elektrische weerstand die geregistreerd wordt als een pulse. Elke pulse komt overeen met één cel en de grootte van het signaal is proportioneel met de grootte van de cel. Rode bloedcellen en bloedplaatjes worden in hetzelfde kanaal geanalyseerd en op basis van hun celvolume van elkaar onderscheiden. Elk bloedplaatje produceert dus een signaal proportioneel met zijn volume en zo wordt er een volume distributie histogram gegenereerd. Er wordt een lage en een hoge discriminatiewaarde volgens volume ingesteld, de lage meestal op 2fL en de hoge op 30fL (het gemiddelde bloedplaatjesvolume varieert van 6 tot 10fL). De lage grens moet kleine partikels die geen bloedplaatjes zijn excluderen en de hoge grens discrimineert tussen bloedplaatjes en zeer kleine rode bloedcellen en fragmentocyten. Een belangrijke beperking van de impedantiemethode is dat er geen onderscheid gemaakt kan worden tussen bloedplaatjes en andere partikels of die wel nog binnen deze volumerange vallen (reuzebloedplaatjes versus fragmentocyten/microcytaire rode bloedcellen). Een log-normale curve wordt gegenereerd waarbij alle partikels onder de curve beschouwd worden als bloedplaatjes (8). c. Elektronische telling: optische methode Met behulp van een lichtbron wordt er monochromatisch licht uitgezonden naar de meetkamer waar de cellen passeren. Als een cel getroffen wordt door een lichtbundel gaat hij het licht verstrooien, dit verstrooide licht wordt opgevangen door fotodetectoren. Afhankelijk van de celgrootte en interne structuur gaat de cel het licht in verschillende richtingen verstrooien. De voorwaartse lichtverstrooiing is een indicatie voor de grootte van de cellen, de zijwaartse lichtverstrooiing voor de interne complexiteit (8). De superioriteit van de

9

impedantiemethode versus de optische methode voor de elektronische telling van bloedplaatjes is nog steeds een punt van discussie met tegenstrijdige resultaten in de literatuur met betrekking tot de meest accurate en precieze methode (13,15). Om dit probleem te vermijden combineren sommige hematologische analysers meerdere technieken voor de telling van bloedplaatjes. Zo combineert de Sysmex XE 2100 de impedantiemethode en een optische telling met behulp van fluorescentie voor de plaatjestelling en zal een computeralgoritme de beste telling doorgeven. Zo zal indien er interferenties werden gedetecteerd met de impedantiemethode, bijvoorbeeld fragmentocyten, de optische telling gerapporteerd worden en omgekeerd, bij een abnormale distributie van de bloedplaatjes met de optische methode, de impedantietelling. d. Flowcytometrie Sinds een aantal jaren is een immunologische telling van bloedplaatjes met behulp van flowcytometrie voorgesteld als nieuwe referentiemethode voor de telling van bloedplaatjes door het International Council for Standardization in Haematology (ICSH) en het International Society of Laboratory Hematology (ISLH) (9,13,14,16). Dit is een indirecte methode waarbij de RBC/PLT-ratio bepaald wordt en de plaatjes berekend worden. Bloedplaatjes worden gelabeld (fluorescentie) met een specifiek monoklonaal antilichaam, meestal worden anti-CD41 en anti-CD61 gebruikt, en flowcytometrisch bepaald. Zo kan men de RBC/PLT ratio berekenen uit de scattergrammen (celvolume of forward scatter versus granulariteit of side scatter en fluorescentie versus celvolume) en samen met een accurate telling van de rode bloedcellen bekomt men dan een indirecte plaatjestelling. Deze methode is voldoende accuraat om sinds enkele jaren als nieuwe referentiemethode voor de plaatjestelling te zijn aanvaard en kan dus gebruikt worden voor de calibratie van automatische celtellers. Betrouwbaarheid van de automatische telling van bloedplaatjes Situaties die aanleiding geven tot een vals verlaagd aantal bloedplaatjes

1. Pseudotrombopenie door het gebruik van EDTA als anticoagulans

Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-afhankelijke pseudotrombopenie is een in vitro fenomeen veroorzaakt door specifieke proteïnen die enkel reageren met bloedplaatjes als ze aanwezig zijn in een afnamebuis met EDTA als anticoagulans en aanleiding geven tot de vorming van bloedplaatjesaggregaten. De eerste twee gevallen van pseudotrombopenie werden in 1969 beschreven door Gowland et al. Microscopisch zagen zij talrijke trombocytenaggregaten in het perifeer bloeduitstrijkje van een vrouw met een verlaagd aantal bloedplaatjes. Herhaling van de telling onmiddellijk na bloedafname zonder toevoeging van een anticoagulans toonde een normaal aantal bloedplaatjes. Bloedplaatjestellingen op bloed afgenomen in tubes met citraat en heparine als anticoagulantia toonden een progressieve daling van het aantal bloedplaatjes in functie van de tijd, maar deze was niet meer uitgesproken dan bij de ‘normale’ individuen. Bijgevolg identificeerden zij EDTA-afhankelijke aggregatie van bloedplaatjes als de oorzaak van het verlaagde aantal bloedplaatjes bij deze patiënte (17). Van de verschillende oorzaken voor vals verlaagde plaatjesaantallen is de vorming van bloedplaatjesaggregaten in aanwezigheid van EDTA de meest frequente. De hematologische analysers tellen de bloedplaatjes van deze aggregaten niet mee, wat aanleiding kan geven tot zeer lage plaatjesaantallen (tot 20 000/µL) terwijl de

10

accurate telling binnen de normale grenzen valt (8,17,18). Dit fenomeen kan soms ook optreden bij het gebruik van andere anticoagulantia (heparine, citraat). In een studie van Bizzaro werd bij 19 van de 112 patiënten met EDTA-afhankelijke pseudotrombopenie oog aggregaatvorming waargenomen indien bloed werd afgenomen met citraat als anticoagulans (16.9%). De bloedplaatjesaggregaten kunnen van dezelfde grootte zijn als witte bloedcellen en worden eventueel door de hematologische analysers meegeteld als witte bloedcellen en kan dan naast pseudotrombopenie ook aanleiding geven tot pseudoleukocytose. Om onnodige investigaties zoals een beenmergpunctie of onnodige behandelingen met corticosteroïden of eventueel bloedplaatjestransfusies te voorkomen, is het uiterst belangrijk dit fenomeen te herkennen (8,22). Er zijn zelfs meldingen van splenectomie bij patiënten met EDTA-pseudotrombocytopenie waarbij de verkeerde diagnose van idiopathische trombocytopenische purpura (ITP) werd gesteld (23). PATHOFYSIOLOGIE Studies hebben aangetoond dat EDTA-pseudotrombopenie veroorzaakt wordt door de aanwezigheid van antiplaatjes auto-antilichamen die antigenen herkennen aanwezig op de bloedplaatjesmembranen, maar het volledige mechanisme is nog niet opgehelderd. Een eerste belangrijke ontdekking betreffende het mechanisme van aggregatie van bloedplaatjes in aanwezigheid van EDTA was dat het serum of plasma van deze patiënten ook agglutinatie van EDTA-plaatjes veroorzaakt van bijna alle normale individuen, behalve bij patiënten met de ziekte van Glanzmann. Dit suggereert dat de fibrinogeenreceptor Glycoproteïne-IIb-IIIa-complex (GPIIb-IIIa) betrokken is bij EDTA-afhankelijke pseudotrombopenie (8,23,24). De meest waarschijnlijke verklaring tot nu toe is dat de betrokken antigenen normaal verborgen liggen in het GPIIb-IIIa complex (cryptantigenen) en enkel door de gecombineerde effecten van EDTA en lage temperaturen vrijkomen. Immers in aanwezigheid van EDTA verliezen bloedplaatjes hun discoïde vorm en nemen een sferische vorm aan (21,25). Meer specifiek zou het betrokken epitoop gelokaliseerd zijn op het membraan glycoproteïne IIb (20). De minimale EDTA-concentratie die plaatjesaggregatie kan veroorzaken is veel lager dan de concentratie noodzakelijk om stolling te voorkomen, en agglutinatie is ook onafhankelijk van het aanwezige kation. Er zijn ook meldingen van plaatjesagglutinatie bij het gebruik van citraat als anticoagulans, hoewel dit slechts een minderheid is. Men kan alleszins besluiten dat de betrokken antilichamen een antigene determinant herkennen op het GPIIb-IIIa complex, waarvan de expressie afhankelijk is van de aanwezigheid van calcium-chelerende anticoagulantia (20,23). De agglutininen kunnen IgG, IgM of IgA zijn en zijn meestal koude agglutininen met maximale activiteit op kamertemperatuur of lager, maar sommigen zijn temperatuuronafhankelijk of reageren beter op 37°C. Meest frequent zijn IgG antilichamen die reageren op kamertemperatuur, waarbij er een progressieve daling is van de bloedplaatjes in EDTA-bloed over verloop van tijd (10,20). Deze bevindingen zijn echter niet eenduidig. Over de temperatuur- en tijdafhankelijke vorming van bloedplaatjesaggregaten is men het eens maar de aard van de antilichamen verschilt tussen de diverse studies. Samenvattend kan men stellen dat de antilichamen meestal IgG of IgM zijn, zelden IgA, en indien het fenomeen ook optreedt op 37°C er bijna altijd sprake is van IgM antilichamen (21). De pathofysiologie van de productie van deze auto-antilichamen is tot nu toe nog niet gekend. Volgens sommige gegevens zijn het natuurlijke antilichamen daar er geen bewijzen zijn dat EDTA-pseudotrombopenie gecorreleerd zou zijn met bepaalde

11

ziekten, bepaalde situaties zoals zwangerschap of met de inname van bepaalde geneesmiddelen en men pseudotrombopenie heeft kunnen aantonen zowel bij gezonde personen als bij patiënten met diverse ziektebeelden (21). Anderen daarentegen hebben aangetoond dat EDTA-pseudotrombopenie meer frequent voorkomt bij ernstig zieke en gehospitaliseerde patiënten (immunologische, neoplastische en leveraandoeningen), en hebben eerder voorkeur voor een verworven aard van de antilichamen (10,28). Er zijn casussen beschreven van transiënte pseudotrombopenie in associatie met een acute ziektetoestand zoals het ontwikkelen van een sepsis, acute hepatitis, acute myeloïde leukemie waarbij dit fenomeen niet meer aangetoond kon worden na herstel (26). PREVALENTIE Een prevalentie van 0.07-0.20% werd gerapporteerd (8,22,29), voor gehospitaliseerde patiënten zou de incidentie 0.1-2.0% zijn (30,31). Zowel de groep van Cohen et al en van Silvestri et al zijn nagegaan wat de incidentie is van pseudotrombocytopenie bij patiënten verwezen voor investigatie van een geïsoleerde trombocytopenie. Bij tot 17% van de patiënten verwezen voor een geïsoleerde trombopenie zou er sprake zijn van een EDTA geïnduceerde pseudotrombopenie, en dit was voor beide onderzoeksgroepen de tweede belangrijkste oorzaak van trombopenie in deze setting (7,18,27). DIAGNOSE Agglutinatie van bloedplaatjes treedt reeds op binnen enkele minuten na bloedafname in een EDTA-tube en is meer uitgesproken als het staal bewaard wordt op kamertemperatuur. De aggregaten zijn variabel in grootte gaande van vier tot vijf plaatjes, maar vaak tot honderd plaatjes en meer. Deze bloedplaatjesaggregaten zijn resistent aan het reagens dat gebruikt wordt om de rode bloedcellen te lyseren, zodat hematologische celtellers die een witte bloedcel scattergram genereren ze als een wolk weergeven. De aggregaten worden echter niet als een populatie witte bloedcellen geïdentificeerd zodat het instrument een vlag gaat geven zoals bloedplaatjesaggregaten of reuzebloedplaatjes. Het alarm komt dus voort uit problemen met het uitvoeren van een WBC differentiatie en niet zozeer ten gevolge van moeilijkheden met het analyseren van de bloedplaatjes. Met andere woorden bloedplaatjesaggregaten worden meestal gedetecteerd op hematologische analysers die de verschillende populaties witte bloedcellen analyseren voor het uitvoeren van een differentiatie, terwijl analysers die geen WBC differentiatie uitvoeren de aggregaten vaak missen. Bartels et al hebben aangetoond dat als screeningstest voor pseudotrombopenie het opsporen van specifieke afwijkingen in het WBC scattergram en histogram gegenereerd door de Sysmex NE-800 meer bruikbaar zijn dan vlaggen voor aggregaten, platelet distribution width (PDW) en mean platelet volume (MPV), met een sensitiviteit van 90% en een specificiteit van 100%. Bevestiging van EDTA-geïnduceerde pseudotrombopenie gebeurde door microscopische evaluatie van het bloeduitstrijkje. Voor het automatisch vlaggen voor bloedplaatjesaggregaten door de analyser (Sysmex NE-800) vonden ze een sensitiviteit van 63% en een specificiteit van 100%. Het kritisch bekijken van de scattergrammen en histogrammen is echter wel zeer tijdrovend en operatordependent (29). De definitieve diagnose van EDTA-afhankelijke pseudotrombopenie wordt echter best microscopisch bevestigd door het opsporen van bloedplaatjesaggregaten op een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald-Giemsa.

12

Op welke manier kan men bij EDTA-afhankelijke pseudotrombopenie een betrouwbare plaatjestelling weergeven? De vorming van bloedplaatjesaggregaten is een tijdsafhankelijk fenomeen, op tijdstip 0 worden er normale plaatjesaantallen geteld, dan is er bij bewaring op kamertemperatuur een progressieve daling van de plaatjes over verloop van tijd met aanwezigheid van aggregaten na 60 minuten bij alle patiënten en meer uitgesproken na 4 uur. Indien de stalen bewaard werden op 37°C was deze daling vaak minder uitgesproken en soms zelfs afwezig. Eens agglutinatie opgetreden is op kamertemperatuur kan deze niet meer ongedaan gemaakt worden door het staal te verwarmen, er is integendeel soms zelfs een toename van aggregaatvorming (8,10,27). Een accurate bloedplaatjestelling bij patiënten met pseudotrombocytopenie kan men bekomen door bloed af te nemen en te bepalen op 37°C, hoewel ook bij afname en bepaling op 37°C nog aggregaatvorming voorkomt (21). Een alternatief is de uitvoering van plaatjestelling op bloed afgenomen in een buis met citraat als anticoagulans, maar ook in dit geval kan er agglutinatie van bloedplaatjes optreden. Deze citraat-afhankelijke antilichamen zijn bij deze patiënten waarschijnlijk dezelfde antilichamen die verantwoordelijk zijn voor aggregatie in aanwezigheid van EDTA, en dit zijn bijna altijd IgM antilichamen. Dit bevestigt dat de betrokken agglutininen een heterogene groep vormen. De agglutinatie die zowel optreedt in aanwezigheid van citraat als EDTA wordt geïnduceerd door calciumdepletie (21,32). Er zijn verschillende andere anticoagulantia voorgesteld om aggregatie te vermijden evenals toevoegen van aminoglycosiden (kanamycine) die zowel de aggregaten zouden dissociëren als de vorming ervan voorkomen (22). De meest betrouwbare tellingen bekomt men door onmiddellijk na de bloedafname de analyse uit te voeren zodat er geen tijd is voor de vorming van bloedplaatjesaggregaten. Hoe betrouwbaar is het vlaggen voor de aanwezigheid van bloedplaatjesaggregaten op de Sysmex XE 2100? Een studie van Sandhaus et al met betrekking tot de efficiëntie van een aantal hematologische analysers voor het genereren van een vlag bij aanwezigheid van bloedplaatjesaggregaten toonde een (hoogste) sensitiviteit van 67% en een (slechtste) specificiteit van 84% aan voor de Sysmex XE 2100 bij de fabrieksinstellingen in vergelijking met twee andere analysers (Advia 120, Coulter LH 750). Men kan de instellingen voor het afvlaggen van stalen bij vermoeden van aggregaten aanpassen, maar een verbetering van de specificiteit zal dan ten koste gaan van de sensitiviteit. Een vlag werd als terecht positief beschouwd als er op een perifeer bloeduitstrijkje opvallende bloedplaatjesaggregaten aanwezig waren. De Sysmex XE 2100 genereert twee vlaggen voor pseudotrombopenie door de aanwezigheid van bloedplaatjesaggregaten. Het IMI (Immature Myeloid Information)-kanaal is zeer gevoelig voor de detectie van aggregaten, en bij vermoeden van de aanwezigheid van aggregaten wordt er een vlag gegenereerd. De tweede mogelijkheid is indien er sprake is van een geïsoleerde trombopenie met een normaal hemoglobine en een normaal aantal witte bloedcellen. Er wordt dan aangegeven microscopisch de aanwezigheid van aggregaten uit te sluiten. Pseudotrombopenie in Gasthuisberg (aanvraagformulier 3001 nr.121) In UZ Gasthuisberg is er een test ter beschikking voor het opsporen van pseudotrombopenie. Deze test vereist de afname van bloed in drie verschillende tubes een EDTA tube, een citraattube en een heparine tube. Er gebeurt een automatische

13

telling (optische methode) van de bloedplaatjes van de drie verschillende tubes en er worden drie perifeer bloeduitstrijkjes microscopisch beoordeeld op de aanwezigheid van bloedplaatjesaggregaten. Verder worden de drie cellijnen morfologisch beoordeeld en wordt er een witte bloedcellen differentiatie weergegeven zoals bij een cytologisch onderzoek perifeer bloed. Wij ontvingen het afgelopen jaar (05/2006-04/2007) 292 aanvragen voor pseudotrombopenie. Bij 8 (2.7%) patiënten kon pseudotrombopenie aangetoond worden. Een normaal bloedplaatjesaantal (150-450x109/L) was aanwezig bij 34 van de aanvragen, in 3 van de 292 gevallen was er zelfs sprake van een trombocytose in plaats van een trombopenie (12.7% onterechte aanvragen). Bij 4 patiënten was er enkel sprake van trombopenie indien het bloed afgenomen was in een EDTA-tube, bij 4 patiënten was er trombopenie en waren er al dan niet microscopisch aggregaten aantoonbaar zowel bij afname met EDTA, citraat als heparine als anticoagulans (Tabel 1). Er volgde bij 2 van de 8 patiënten een tweede (overbodige) aanvraag voor pseudotrombopenie binnen de week na de eerste aanvraag. Bij 5 van de 8 patiënten waar microscopisch aggregaten gezien werden, werd er geen vlag gegenereerd door de Sysmex voor pseudotrombopenie, bij de overige drie was er wel een terechte vlag. Bij 44 van de 292 aanvragen voor pseudotrombopenie genereerde de Sysmex ten onrechte een vlag voor pseudotrombopenie. Daarenboven kan er enige verwarring ontstaan wat betreft de microscopische aanwezigheid van aggregaten. EDTA blijft het beste anticoagulans voor de automatische telling van bloedplaatjes, heparine is het minst geschikt. Bij 137 van de 283 overige aanvragen werden er aggregaten gezien op de bloeduitstrijkjes bij afname op heparine waarbij er geen aggregaten aanwezig waren op EDTA. Voor 18 stalen afgenomen op citraat werden er aggregaten gerapporteerd in afwezigheid van aggregaten op EDTA.

Tabel 1: Gegevens van de 9 patiënten met pseudotrombopenie Aantal bloedplaatjes (x10*9/L) Aanwezigheid van aggregaten EDTA Citraat Heparine EDTA Citraat Heparine

1 98 212 223 meerdere enkele meerdere 2 71 153 169 meerdere enkele afwezig 3 126 104 104 enkele afwezig meerdere 4 106 138 142 meerdere meerdere meerdere 5 64 136 ? meerdere enkele ? 6 138 198 198 meerdere meerdere meerdere 7 43 213 209 meerdere enkele enkele 8 81 98 92 meerdere ? meerdere

2. Andere oorzaken van pseudotrombopenie

SATELLITISME ROND WITTE BLOEDCELLEN Dit is een in vitro fenomeen waarbij de bloedplaatjes in aanwezigheid van EDTA vasthechten aan de neutrofiele granulocyten, zelden zijn andere cellen betrokken, en microscopisch zichtbaar zijn als een krans rondom de WBC. Dit is een zeldzaam fenomeen, 1/12 000 (21), en kan voorkomen in associatie met bepaalde ziekten zoals auto-immuun aandoeningen, maar is meestal niet gerelateerd aan een specifieke

14

ziektetoestand. De pathofysiologie en klinische betekenis van dit fenomeen zijn nog onduidelijk (8,33,34). Er is een matige afname van de plaatjestelling bij satellitisme (van 50 tot 100x109/L), en dit resulteert slechts in sommige gevallen in trombopenie. De veranderingen die optreden zijn tijdsafhankelijk, satellitisme treedt op binnen enkele minuten na staalafname, gevolgd door een progressieve migratie van de bloedplaatjes naar één pool van de neutrofielen na 1 tot 3 uren, en eventueel kunnen na 4 tot 6 uren bloedplaatjesaggregaten loskomen van de neutrofielen. Dus afhankelijk van de tijdsduur tussen staalafname en microscopische beoordeling van het uitstrijkje kunnen zowel satellitisme van bloedplaatjes als bloedplaatjesaggregaten waargenomen worden. MACRO/REUZETROMBOCYTEN Aangezien in normale situaties maar zeker in diverse pathologische situaties er enkele bloedplaatjes met een groter volume aanwezig kunnen zijn, kunnen hematologische analysers partikels tot 30 à 36 fL als bloedplaatjes beschouwen. Doch afhankelijk van de analyser en het bloedstaal kunnen grotere bloedplaatjes (>30-40 fL) gemist worden bij de telling, daar deze buiten de bovenste grens van hematologische analysers vallen. Indien de reuzetrombocyten een volume aannemen dat het volume van RBC benadert en dus de bovenste treshold overstijgen, kan er een onderschatting van het plaatjesaantal zijn. Reuzetrombocyten kunnen in beperkte aantallen aanwezig zijn in het perifeer bloed van gezonde personen (tot circa 10%). In omstandigheden gekenmerkt door een verhoogde afbraak van bloedplaatjes waardoor er een stimulatie is van de trombopoïese, zoals bij ITP, maar ook bij primaire stoornissen in de haematopoïese, zoals myeloproliferatieve of myelodysplastische syndromen, of in kader van genetische afwijkingen kunnen reuzebloedplaatjes voorkomen. Indien ze in belangrijke aantallen aanwezig zijn kan dit aanleiding geven tot een belangrijke onderschatting van de automatische plaatjestelling (8,35). PRE-ANALYTISCHE OORZAKEN Er zijn een aantal pre-analytische factoren die kunnen bijdragen aan onjuiste bloedplaatjestellingen. Dilutie van het staal door afname distaal van een infuus of afname via de infuuslijn kan aanleiding geven tot een pseudotrombopenie. Overvulling van de tube kan aanleiding geven tot vals verlaagde plaatjestellingen doordat er dan geen adequate menging van het bloed met het anticoagulans mogelijk is. Een vertraagd contact tussen het bloed en het anticoagulans, of een moeilijke bloedafname, kan aanleiding geven tot coagulatie van het bloed en vorming van aggregaten. Indien dit het geval is kunnen er macroscopisch stolsels weergenomen worden (8).

Situaties die aanleiding geven tot een vals verhoogd aantal bloedplaatjes

1. Fragmentocyten

De automatische telling van rode bloedcellen en bloedplaatjes gebeurt in hetzelfde kanaal, differentiatie gebeurt op basis van partikelgrootte daar deze bij normale individuen duidelijk verschillend is.

15

Aanwezigheid van rode bloedcellen met een zeer laag volume kan aanleiding geven tot vals verhoogde plaatjesaantallen, zoals dit het geval is bij een ernstige microcytaire ferriprieve anemie of microangiopathische hemolyse met aanwezigheid van talrijke fragmentocyten. Het bloedplaatjeshistogram is afwijkend met een excess aan kleine partikels. Hematologische analysers die bij de telling van de bloedplaatjes rekening houden met het volume van de partikels in combinatie met bijvoorbeeld een fluorescerende kleuring van de bloedplaatjes zoals op de Sysmex, laten meestal een accurate verdeling tussen bloedplaatjes, grotere bloedplaatjes, kleine rode bloedcellen en fragmentocyten toe. De Sysmex XE2100 genereert twee mogelijke vlaggen bij de impedantietelling, pseudotrombocytose tgv rode bloedcel fragmenten of pseudotrombocytose tgv extreme microcytose, en zal automatisch het reticulocytenkanaal openen zodat er een optische telling gebeurt van de bloedplaatjes na RNA-kleuring. Op die manier worden mogelijke interferenties uitgeschakeld/sterk geminimaliseerd.

2. Cytoplasmafragmenten van gekernde cellen Fragmenten van het cytoplasma van abnormale cellen zoals lymfoomcellen en leukemische blasten zijn omwille van hun grootte en vorm soms moeilijk te onderscheiden van bloedplaatjes. Vals verhoogde plaatjestellingen door de aanwezigheid van deze zogenaamde pseudoplaatjes zijn gerapporteerd bij patiënten met hairy cell leukemie, acute leukemie en andere lymfomen. Het rapporteren van vals verhoogde plaatjestellingen bij deze groep patiënten kan belangrijke klinische gevolgen hebben daar een potentieel levensbedreigende trombopenie op die manier gemaskeerd wordt (8,36,37). In een retrospectieve studie van van der Meer et al werd de incidentie van deze pseudoplaatjes nagegaan bij patiënten met acute leukemie. Bij 43 van de 169 patiënten (25.4%) werden microscopisch pseudoplaatjes gedetecteerd, en bij 7 patiënten (4.1%) was het gecorrigeerde bloedplaatjesaantal lager dan 15x109/L terwijl de gemiddelde automatische telling 39x109/L bedroeg waardoor er een herclassificatie was van het bloedingsrisico (belangrijk bloedingsrisico) (37).

3. Micro-organismen Bacteriën kunnen aanleiding geven tot een vals verhoogd bloedplaatjesaantal. Massieve aanwezigheid van bacteriën kan aanleiding geven tot een abnormaal bloedplaatjes histogram met een shift naar kleinere volumes, meestal echter enkel in eerder extreme klinische situaties en in situaties waarbij de bacteriën microscopisch zichtbaar zijn op het perifeer bloeduitstrijkje. Een andere situatie waarbij bacteriën aanleiding kunnen geven tot vals verhoogde bloedplaatjestellingen is gerelateerd aan bacteriële overgroei in een bloedstaal van een geïnfecteerde patiënt ten gevolge van een vertraging tussen staalafname en de uitvoering van de analyse. Dit onderstreept het belang van pre-analytische variabelen (8,38). Ook fungi kunnen omwille van hun grootte moeilijk onderscheiden worden van bloedplaatjes door de hematologische analysers. Zo is er een casus beschreven van een patiënt met een Candida glabrata sepsis waarbij de automatische bloedplaatjestelling een trombocytose aangaf terwijl er sprake was van een trombocytopenie (39). Er is ook éénmaal een interferentie met de automatische plaatjestellingen beschreven door rode bloedcellen geïnfecteerd met Plasmodium falciparum trofozoïeten, zowel

16

met de impedantiemethode als de optische, met een overschatting van het reële bloedplaatjesaantal tot gevolg (40).

4. Lipiden Bij patiënten met hyperchylomicronemie, in stalen afgenomen direct na de maaltijd of na parenterale voeding, kunnen aanwezige lipiden in vitro kleine druppeltjes vormen die de telling van de bloedplaatjes kunnen verstoren. Ze interfereren met de automatische telling van de bloedplaatjes door hun grootte en door lichtverstrooiing. Deze interferentie is meer uitgesproken indien gebruik wordt gemaakt van de optische methode dan met de impedantiemethode. Bij patiënten met normale plaatjestellingen is deze toename (2-40x109/L) niet belangrijk, maar bij patiënten met verlaagde bloedplaatjesaantallen moet hier zeker rekening mee worden gehouden, in het bijzonder bij patiënten met leukemie die behandeld worden met L-asparaginase dat lipidenstoornissen kan veroorzaken (8,41,42).

5. Cryoglobulinen Cryoglobulinen zijn circulerende immuunglobulinen of immuunglobulinecomplexen gekenmerkt door reversibele precipitatie bij afkoeling. Deze precipitaten kunnen afhankelijk van hun grootte interfereren met de automatische telling van witte bloedcellen en/of bloedplaatjes en op die manier aanleiding geven tot pseudoleukocytose en/of pseudotrombocytose (8,43).

Accuraatheid van automatische bloedplaatjestellingen bij ernstige trombopenie Een predispositie tot bloedingen in trombocytopenische patiënten is een belangrijke klinische risicofactor, en voornamelijk cerebrale bloedingen dragen in belangrijke mate bij tot de mortaliteit van patiënten met een diepe trombopenie. Het bloedplaatjestransfusiebeleid verschilt tussen individuele landen, maar over het algemeen streeft men naar profylactisch transfunderen eerder dan respons op een hemorragische episode. Recente studies hebben aangetoond dat de transfusiegrens van 20x109/L voor profylactische plaatjestransfusies zonder klinische gevolgen verlaagd kan worden tot 10x109/L en zelfs 5x109/L. Het is echter wel van uiterst belang dat men op de hoogte is van de beperkingen van de hematologische analysers wat betreft plaatjestellingen in deze uitgesproken trombocytopene range. Diagnostische en therapeutische gids: Indicaties voor toediening van bloedplaatjesconcentraten: 1. Therapeutisch bij bloedingen tgv trombocytopenie of trombocytopathie. 2. Profylactisch bij:

• trombocytopenie bij patiënten onder cytostatica • trombocytopenie bij heelkundige patiënten • neonatale trombocytopenie tgv foeto-maternele incompatibiliteit.

3. Bloedplaatjestransfusie kan aangewezen zijn bij patiënten na extracorporele circulatie en na massieve transfusies (bv na polytrauma).

In principe wordt aangenomen dat bij stabiele patiënten bloedplaatjestransfusies niet geïndiceerd zijn bij een bloedplaatjesaantal >20 000/µL en dat in die omstandigheden er preventief geen bloedplaatjes dienen toegediend te worden. Bij ingrepen en dergelijke wordt vaak een grenswaarde van 50 000/µL gehanteerd.

17

Hematologische analysers leveren potentieel inaccurate resultaten van de plaatjestellingen bij uitgesproken trombocytopenie. Er is vaak sprake van een overschatting van de plaatjestelling door de analysers gebruikt in de routine in vergelijking met de internationale referentiemethode (flowcytometrie). Klinisch zou dit kunnen resulteren in een onder-transfusie van bloedplaatjes afhankelijk van de transfusiegrens die men hanteert (9,15). Binnen de patiëntenpopulatie met uitgesproken trombopenie is de frequentie van mogelijke interferenties die de accuraatheid van de automatische plaatjestelling kunnen beïnvloeden hoger. Deze berusten op de aanwezigheid partikels die niet voldoende onderscheiden kunnen worden van bloedplaatjes, zoals fragmenten van witte bloedcellen (lymfoomcellen, leukemische cellen), fragmentocyten, bacteriën, aggregaten van lipiden of proteïnen. Het meetellen van deze partikels als bloedplaatjes kan resulteren in een overschatting van het bloedplaatjesaantal. Deze beperkingen worden voornamelijk gezien bij automatische tellingen met behulp van de impedantiemethode, maar hoewel er studies zijn die suggereren dat optische tellingen meer accurate resultaten geven zijn er ook studies die dit weerleggen (13,15). Vaak zijn er geen commerciële controlematerialen ter beschikking die deze problematische range includeren; de controles voor lage bloedplaatjestellingen variëren meestal van 50 tot 70x109/L. Dit geldt ook voor de stalen voor externe kwaliteitscontrole. Er is zeker behoefte aan de ontwikkeling van geschikte materialen voor externe kwaliteitscontrole ter verbetering van de calibratie van analysers voor de telling van uitgesproken trombocytopenische stalen (15).

COMMENTS Hematologische analysers leveren snelle en betrouwbare resultaten in de meeste omstandigheden. Toch moet men zich bewust zijn van het feit dat in bepaalde omstandigheden deze resultaten mogelijk verkeerd kunnen zijn, en er in het geval van plaatjes zowel een overschatting als een onderschatting kan zijn van het reële aantal. In deze gevallen blijft er nog steeds een zeer belangrijke rol weggelegd voor de microscopische beoordeling van perifeer bloeduitstrijkjes. TO DO/ACTIONS EDTA-afhankelijke pseudotrombopenie is zeker één van de meest frequente oorzaken van vals verlaagde bloedplaatjestellingen op hematologische analysers, en moet bijgevolg steeds uitgesloten worden bij de evaluatie van een patiënt met pseudotrombopenie. Een alarm of vlag gegenereerd door de analyser is niet voldoende specifiek, en bij nieuwe patiënten met verlaagde automatische plaatjestellingen dient zeker pseudotrombopenie uitgesloten te worden door microscopische investigatie van het perifeer bloeduitstrijkje. Hierbij zou een eerste stap zijn de analyse niet uit te voeren indien het bloedplaatjesaantal binnen de referentiewaarden valt. Om de diagnose van EDTA-afhankelijke pseudotrombopenie te stellen is het echter niet nodig bloed af te nemen in de drie verschillende tubes (EDTA, citraat, heparine) zoals dat momenteel gebeurt. Aanwezigheid van bloedplaatjesaggregaten bij een verlaagd plaatjesaantal afgenomen op EDTA is voldoende om de diagnose te stellen. Een meer betrouwbare telling kan men dan bekomen door gebruik van een ander anticoagulans zoals citraat. In enkele gevallen ziet men

18

echter ook pseudotrombopenie bij afname op citraat, dus de aanwezigheid van bloedplaatjesaggregaten zou ook hier best uitgesloten worden bij verlaagde plaatjesaantallen. Voorstel 1: We zouden de uitvoering van de test kunnen veranderen en enkel de bloedplaatjes tellen en microscopisch beoordelen afgenomen in een EDTA-tube, zoals de test fragmentocytenbepaling nu gebeurt voor de rode bloedcellen. Hierbij krijgt de clinicus dus enkel als antwoord pseudotrombopenie of reële trombopenie. Een belangrijk nadeel van deze manier van werken zou zijn dat indien er geen pseudotrombopenie is (97% van de aanvragen van het afgelopen jaar), de clinicus geen informatie heeft met betrekking tot de rest van het perifeer bloeduitstrijkje (bv aanwezigheid van fragmentocyten), en men in de meeste gevallen vermoedelijk alsnog in tweede instantie een cytologisch onderzoek zal aanvragen. Dit is dus geen goed voorstel. Voorstel 2: Een ander voorstel zou zijn om bij aanvraag pseudotrombopenie een cytologisch onderzoek perifeer bloed uit te voeren, waarbij steeds de drie cellijnen morfologisch beoordeeld worden. Het verschil met de huidige aanvraag pseudotrombopenie is dan dat er geen telling van de bloedplaatjes gebeurt op citraat en heparine, maar verder gebeurt er dus evenzeer een differentiatie van de witte bloedcellen en een volledige morfologische beoordeling. Indien er dan sprake is van een pseudotrombopenie door de aanwezigheid van aggregaten op EDTA wordt er in de bespreking van het cytologisch onderzoek perifeer bloed gesuggereerd een plaatjestelling op citraat (en heparine) te laten gebeuren, waarbij er alsnog een bloeduitstrijkje gemaakt kan worden om ook hier de aanwezigheid van aggregaten uit te sluiten.

19

ATTACHMENTS Bijlage 1: Overzicht van de oorzaken van trombocytopenie (National Guideline Clearinghouse).

Decreased production

• Inborn causes - Pancytopenias and thrombocytopenias - Bone marrow infiltrates - Rubella - Maternal use of thiazide diuretics during pregnancy

• Acquired causes

- Aplastic anaemia - Bone marrow infiltrates (carcinoma, leukaemia, myelofibrosis,

myelodysplasia, tuberculosis) - Ionizing radiation, other causes of myelosuppression - Drugs (trimethoprim-sulfamethoxazole, gold, thiazide diuretics,

alcohol, oestrogens, interferons) - Deficiency of vitamins and other essential trace elements or nutrients

(B12, folate, iron) - Viral infections (in Henoch-Schonlein purpura, the thrombocyte count

is normal) - Uraemia - Heavy drinking - Pregnancy

Increased consumption

• Inborn causes - Non-immunological (haemolytic disease of the newborn, prematurity,

maternal pre-eclampsia, renal vein thrombosis, infections) - Immunological (drug-induced, isoimmune neonatal thrombocytopenia,

maternal idiopathic thrombocytopenia purpura [ITP])

• Acquired causes - Non-immunological (infections, disseminated intravascular

coagulation, thrombotic thrombocytopenic purpura, haemolytic-uraemic syndrome, drug-induced over-consumption of platelets)

- Immunological (drug-induced, in connection with anaphylaxis, following blood transfusion, chronic and acute ITP)

Platelet sequestration

• Hypersplenism and hypothermia

Loss of platelets

• Haemorrhage and haemoperfusion

20

Bijlage 2: Algoritme voor de evaluatie van trombocytopenie (Sekhon SS et al, Thrombocytopenia in adults: a practical approach to evaluation and management.)

21

Bijlage 3: Algoritme voor de investigatie van geïsoleerde trombopenie in een gezonde persoon (George JN. Platelets. The Lancet 2000)

22