CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI
Materia de Articulación CEBI-E5
BIOCATÁLISIS APLICADA
Docente a cargo: Dra. Cristina dos Santos [email protected]
CEBI- E5-4 :Métodos de estabilización/Biocatalizadores en medio no convencionales.
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES
Se pueden estabilizar biocatalizadoresEn solución : ➢ Soluciones concentradas de enzimas ➢ Pureza no muy alta➢ Con presencia de cofactores metálicos o en
soluciones reguladoras ➢ Con agentes cosmotrópicos
En fase sólida ➢ Liofilización➢ Secado por aspersión Eliminación de agua
para aumentar la estabilidad
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES FASE SÓLIDALiofilización
Método de deshidratación en el que se elimina el agua por congelación del producto húmedo y posterior sublimación del hielo en condiciones de vacío.
Ventajas• Se obtienen productos de redisolución rápida • La forma y características del producto final son esencialmente las originales • Proceso idóneo para sustancias termolábiles • Los constituyentes oxidables están protegidos • Contenido muy bajo de humedad final • Compatible con la elaboración en medio aséptico Desventajas • Alto costo de instalaciones y equipos • Elevado gasto energético • Operación de larga duración
Utilizado en industria farmacéutica y médica:SuerosAntígenos, antibióticos, vitaminasEnzimas Extractos animales, vegetalesConservación de semillas, flores, frutosIndustria alimentaria
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES FASE SÓLIDASecado por aspersión
Método de deshidratación en el que se elimina el agua al entrar en contacto con aire caliente
Ventajas• Se obtienen productos de redisolución rápida, amorfos • Bajo costo de instalaciones y equipos • Contenido bajo de humedad final • Compatible con la elaboración en medio aséptico • Puede hacerse de forma continua y estérilDesventajas • Producto variable en calidad si no se controlan las variables del proceso• Proceso no idóneo para sustancias termolábiles • Requiere aire caliente en gran cantidad• Requiere de una matriz o material encapsulante
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES FASE SÓLIDASecado por aspersión
Utilizado probióticos (lactobacilos)- Vitaminas- Enzimas - Extractos animales, vegetales
SECADO POR ASPERSIÓN
Mejora:✓ Estabilidad✓ Costos Transporte✓ Sabor✓ Textura✓ Vida útil✓ Propiedades de
dispersabilidad
Alimentos
Farmaceútica
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES FASE SÓLIDAAspersión( congelación spray) + Liofilización
Este tipo de granulación
con congelación en spray y la
posterior liofilización o
criodesecación.
Se consigue el control de la densidad
de los gránulos, alta homogeneidad,
menor grado de oxidación.
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES
Se pueden estabilizar biocatalizadoresMétodos químicos➢ Modificaciones químicas/conjugación con macromoléculas➢ Inmovilización químicas
Métodos Físicos➢ Inmovilización Física➢ Solventes diferentes agua➢ Encapsulación
Métodos de ingeniería genética➢ Diseño racional➢ Evolución dirigida➢ Expresión de enzimas de organismos termófilos
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESModificaciones químicas/conjugación con macromoléculas
¿Por qué se modifican enzimas?• Para estudios estudios estructurales, conformacionales, mecanismos enzimáticos. Analizar correlaciones estructura- función •Para mejoramiento y aumento de la estabilidad en diferentes condiciones de reacción y almacenamiento
¿Cómo se modifica químicamente enzimas?
➢ Modificando grupos funcionales superficiales sin entrecruzamiento➢ Provocando entrecruzamientos inter o intramoleculares
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESModificaciones químicas/conjugación con macromoléculasEjemplos
Grupos funcional modificado
Reacción o reactivo Enzima modificada
N terminal de Lisina Acilación Quimotripsina
Carboxilo de ácidos aspártico o glutámico
Carbodiimida Beta-glucosidasa
Imidazol Histidina Bromoacético Beta-glucosidasa
CarboiimidasActivan ácidos… dan ésteres o amidas
Modificaciones químicas/conjugación con macromoléculas
Modificación química para mejorar estabilidad de Tripsina
Aumenta estabilidad térmicade la tripsina de 45 a 60 °C.
Mayor resistencia a la degradación a pH 9
.
Utilizando una proteasa de Streptoverticillum
Sp. Grupo amino de la CD reacciona con residuos glutámico de tripsina
AMINA: propilen, butilen o etilediaminaCiclodextrina tosilada +
Ots =
Proteasa (tosil-asa
TRIPSINA BOVINA
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESModificaciones químicas/conjugación con macromoléculas
Modificaciones con PEG
Se utiliza en enzimasterapeúticas ,
disminuyendo la inmunogenicidad y
aumentando la vida útil en el organismo
.
Aumenta la solubilidad en agua por la hidrofilicidad de PEG
Disminuye el acceso de enzimas proteolítica o anticuerpos
Aumenta tamaño y reduce la filtración en riñon
ENZIMA
PEG 10000 n=195-265
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES
Modificación con PEG
La modificación química con PEG es el primer paso para otras modificaciones de la
enzima que afectan la solubilidad en agua o en
solventes orgánicos.
Es importante el grado de sustitución ya que afecta la
entrada de gruposfuncionales más voluminosos
.
ACTIVACIÓN
SUSTITUCIÓN CON OTROS GRUPOS
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES
APLICACIÓN: Modificación con PEG de enzimas terapeúticas
Sustitución con PEG esimportantes en:
-aumento del tiempo de retención- protección contra la degradación en células y tejidos de enzimas, proteínasy pequeñas moléculas, liposomas y nanopartículasutilizadas en terapia.
.
Tratamiento antitumoralUtilizando enzimas que degradan aminoácidos específicos emanera de inhibir crecimiento celular. La Arginina no es esencialen humanos pero su deficit inhibe crecimiento de células. Laarginina deiminasa (ADI) y la arginasa (ARG),se utilizan comoantitumorales.
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES
Se pueden estabilizar biocatalizadoresMétodos químicos➢ Modificaciones químicas/conjugación con macromoléculas➢ Inmovilización químicas
Métodos Físicos➢ Inmovilización Física➢ Encapsulación➢ Solventes diferentes agua
Métodos de ingeniería genética➢ Diseño racional➢ Evolución dirigida➢ Expresión de enzimas de organismos termófilos
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
VENTAJAS▪ Recuperación del biocatalizador del medio de
reacción▪ Reducción de la inhibición por el medio o por
productos▪ Aumento de la concentración del
biocatalizador y de la productividad enzimática
▪ Facilidad de recuperación y purificación de los productos.
▪ La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación del biocatalizador inmovilizado.
▪ Se puede elegir entre una gran variedad de diseños.
▪ Ideal en procesos continuos!!
DESVENTAJASo Puede perderse actividad enzimática con la
inmovilización.o Sistema enzima soporte es heterogéneo,
pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con diferentes uniones al soporte.
o A veces, se pueden originar contactos proteína-proteína indeseados.
o Puede aumentar el costo del proceso comparado con la enzima nativa.
o El intervalo de pH, afinidad por sustrato, actividad enzimática de trabajo puede ser distinto al del biocatalizador nativo.
o Puede haber problemas difusivos es un sistema heterogéneo, enzima fase sólida y sustrato/medio fase líquida
MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES
Unión COVALENTE ADSORCIÓNADSORCIÓN
ENTRECRUZAMIENTO
ATRAPAMIENTO
ENCAPSULACIÓN
INMOVILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES
MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES
1. Inmovilización química por enlaces covalentes
▪ La interacción entre el biocatalizador y el soporte es mediante enlaces covalentes pero NO entre moléculas
de enzima.
▪ El tipo soporte determina tipo inmovilización.
SOPORTE
Activación para obtener grupos funcionales reactivos
Grupo Funcional Soporte
-CONH2 Poliacrilamida
-COOH Carboximetilcelulosa
-NH2
-OHPoliestireno, NylonCelulosa, agarosa, sephadex
-Si(OH)3 Vidrio poroso
ENZIMA
Unión a través de cadenas laterales de los aade la enzima
-NH2 Lisina-OH Serina-OH-Ph , Tirosina-COOH Asp.,Glutam.
-SH Cisteína-N (imidazol) Histidina
IMPORTANTE centro activo no debe ser afectado x los reactivos de la inmovilización.Protección el CA con un análogo del sustrato.
MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES1.Inmovilización química por enlaces covalentes. Método acil-azida (Soporte con grupos ácidos)
1. Se activan los grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas en
dos etapas
2. Idém antes se utiliza grupos reactivos superficiales de la enzima (N-terminal y aminos de Lys, SH de
Cys, OH de Tyr, imidazol de Hys)
MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES1.Inmovilización química por enlaces covalentes. Método azo (grupos básicos en soporte)
1. Se activan los grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas.
2. Después se utiliza grupos reactivos superficiales de la enzima (N-terminal y aminos de Lys, SH de
Cys, OH de Tyr, imidazol de Hys)
▪ Es adecuado para enzimas aisladas, es una inmovilización selectiva (con Tyr, en ej. ).
▪ Se evita la agregación de proteínas.
▪ Aumenta la resistencia a cambios pH y temperatura
MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES
2. Inmovilización química por entrecruzamiento
Formación de enlaces covalentes INTERMOLECULARES (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte.
VENTAJA :Cantidades altas de ENZIMA inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura
DESVENTAJA: pérdida de actividad por problemas estéricos y difusionales del sustrato
MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES
2. Inmovilización química por entrecruzamiento con glutaraldehído MÉTODO DE CO-
RETICULADOPara evitar pérdida deActividad EnzimáticaEntrecruzar agregando unaproteína sin actividad y ricaen lisina.Ej. Albúmina bovina
MÉTODO ENTRECRUZAMIENTO
CON CRISTALIZACIÓN (CLECs)Cristalizan enzimas y luego sereticulan cono glutaraldehído
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
3. Inmovilización Física por atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa.
▪ Formación de polímero altamente entrecruzado en presencia de la enzima. Esta queda atrapada en la matriz polimérica formada.
▪ Importante control de condiciones de la polimerización para que NO se altere la enzima.
▪ Ventaja: Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas. Aplicación general
▪ Nanoencapsulación en medios mesoporosos
▪ Desventaja: Pérdidas de enzima con el régimen de trabajo.
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
4. Inmovilización por encapsulación
MICROENCAPSULACIÓN (1-100µm) dentro de membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de sustratos y productos y no de proteína. Desventaja : elevadas concentraciones iniciales de enzima (10mg/L)
ENCAPSULACIÓN POR GELACIÓN IÓNICA: cápsulas de alginato en soluciones de Ca (II)
Con bicapas lipídicas se puede obtener:MISCELAS REVERSAS fase continua : ORG/fase dispersa agua
LIPOSOMAS fase continua : agua/fase dispersa ORG
Catalasasoxidoreductasas
MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES
5. Inmovilización por Adsorción
Interacción física NO ESPECÍFICA entre la ENZIMA y el SOPORTE ( interacciones de van der Waals, puente H, hidrofóbicas, iónicas)
Ventaja: método muy sencillo, general, costo moderado.
Desventaja: estabilidad limitada, control riguroso de condiciones de trabajo para evitar desorción de la Enzima
MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES
5. Inmovilización por Adsorción-Resinas
LIPOZYME CAL-B( Novozymes) lipasa de Candida antárctica producida en Aspergillus oryzae inmovilizada en resinas intercambio iónico
Lewatit 2431 (Bayer-Resina macroporosa ácida). No gel, esferas grandes muchos espacio. Alquilación fenol y olefinas, esteficación , eterificación condensación de moléculas grandes.
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
EFECTOS SOBRE LA ESTABILIDAD de la ENZIMA
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas diferentes a E en solución ➢ Cambios conformacionales: puede rigidizarse la estructura por las uniones al soporte,
mayor resistencia a la desactivación térmica o química.
➢ Mayor protección de ataque de proteasas
➢ Efectos material de soporte, mayor fuerza iónica ( menor efecto oxígeno) ➢ Menor agregación molecular
➢ Efecto soporte, mayor control de pH enmicroentorno de la enzima➢ Mayor estabilidad en solventes no acuosospor el carácter hidrofílico del soporte
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
EFECTOS SOBRE LA CINÉTICA DE LA ENZIMA
Las propiedades cinéticas de las enzimas inmovilizadas son diferentes a las de las enzimas en solución porque:
➢ La inmovilización puede inactivar la enzima si se afectan los AA del sitio activo, si existen impedimentos estéricos
➢ Cambios en la afinidad por el sustrato
➢ Problemas difusionales
➢ Cambios pH. Por ejemplo, enzima unida a un soporte con q negativa (v.g. CM-sephadex) será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente (v.g. DEAE-sephadex). Entonces AE DEPENDE DE SOPORTE!!!
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
APLICACIONES ANALÍTICAS
BIOSENSORES
BIORREACTORES
APLICACIONES INDUSTRIALES
-ALIMENTOS
-QUÍMICA
FARMACEÚTICA
APLICACIONES MÉDICAS
Tratamientos con enzimas inmovilizadas
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
ALIMENTOS : PRODUCCIÓN LECHE SIN LACTOSA
ALGINATO El alginato está formado por dos tipos de monosacáridos, el ácido gulurónicoy el ácido manurónicoEn presencia de Ca2+ forma geles irreversibles a pH maor a 3,5.
LECHE con lactosa
La enzima lactasa inmovilizada convierte lactosa a glucosa y galactosa en un proceso continuo
Cápsulas de alginatocon lactasa inmovilizada
LECHE sin lactosa
Aplicaciones inmovilización de enzimas
ALIMENTOS: PRODUCCIÓN JARABES ALTA FRUCTOSA
Amilasasinmovilizadas
Glucosa isomerasainmovilizada
Aplicaciones inmovilización de enzimas
PRODUCCIÓN DE AROMAS: ÉSTERES
pH óptimo 6.5 tanto para la lipasainmovilizada como la libre, pero la inmovilizada retiene actividad máxima a más alta temperatura 55 – 60°C
LIPASA CATALIZA LA FORMACIÓN DE ÉSTERES , butirato de etilo
Lipasa de Candida rugosa inmovilizada en Eupergit®C85% eficiencia
Aplicaciones inmovilización de enzimas
PRODUCCIÓN DE AROMAS: ÉSTERES, TERPENOIDES
Microorganismos pueden sintetizar alcoholes, ésteres, lactonasy terpenosGeotrichum candidum y las levaduras Hansenula y Pichiaproducen alcoholes y ésteres; la Trichoderma viride produce la lactona gentil-6-alfa pirina, que tiene un olor a coco; algunas especies de Ceratocystis, Penicillium, Aspergillus, Sacharomices y Pseudomonas sintetizan terpenos volátiles.
Ventaja de que estas biotrasformaciones son estereoespecíficas.
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
APLICACIONES: BIOSENSORES
ELEMENTO DE RECONOCIMIENTO ESPECÍFICO
TRANSDUCTOR
ELECTRÓNICA
BIOSENSORES ENZIMÁTICOS
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
APLICACIONES: BIOSENSORES
BIOSENSORES ENZIMÁTICOS
Para cuantificación de sustratos Glucosa usando biosensor de glucosa oxidasa
Para cuantificación de inhibidores Para pesticidas carbámicos con acetilcolinesterasa
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
APLICACIONES: BIOSENSORES
BIOSENSORES ENZIMÁTICOS
Para cuantificación de sustratos Glucosa usando biosensor de glucosa oxidasa
Para cuantificación de inhibidores Para pesticidas carbámicos con acetilcolinesterasa
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES
Se pueden estabilizar biocatalizadoresMétodos químicos➢ Modificaciones químicas/conjugación con macromoléculas➢ Inmovilización químicas
Métodos Físicos➢ Inmovilización Física➢ Encapsulación➢ Solventes diferentes agua
Métodos de ingeniería genética➢ Diseño racional➢ Evolución dirigida➢ Expresión de enzimas de organismos termófilos
ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESBIOCATALIZADORES MODIFICADOS
INGENIERÍA GENÉTICA
CLONACIÓN
PCR amplifica un gen determinado
MUTAGÉNESIS
Producir un ADN con diferencias en las bases del original.
Puede hacerse con agentes químicos o radiación.
OMG organismos modificados
Aplicaciones de la ingeniería genética
➢ Fármacos, como la insulina y la hormona del crecimiento humano, en bacterias
recombinantes y animales transgénicos, aumentando la velocidad y el rendimiento en la producción de los mismos
➢ Enzimas más activas para disolver manchas, como las que se usan en los detergentes en polvo, mayormente por medio de microorganismos recombinantes (transgénicos) que crecen en biorreactores.
➢ Aumenta la velocidad de producción de enzimas para la industria alimenticia, como las empleadas en la elaboración del queso y en la obtención de jugos de fruta, entre otras.
➢ En biocatálisis, la obtención de diferentes isoenzimas puras con diferentes selectividades y enzimas con diferentes características deseadas
BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOS
BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOS
➢ Bacillus, como p. ej. B. subtilis y B. licheniformis.
➢ Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería).
➢ Aspergillus niger y A. oryzae.
➢ Lactobacillus y estreptococos lácticos.
Para usar un microorganismo que produzca enzimas de consumohumano se debe usar un microorganismo “GRAS” (generallyaknowledged as secure).Existen unos 50 microorganismos GRAS aprobados para la industria
alimentaria por ejemplo
BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOS
ENZIMAS RECOMBINANTES LIPOLASA® Novoenzyme, es la primera enzima recombinante aprobada para detergentes. El gen de la lipasa fue aislado del hongo filamentoso Humícolay transferido a Aspergillus.oryzae
Cutinasa de Fusarium que degrada ácidos grasos de expresa en la levadura S.cerevisiae
Quimosina recombinante (rennina,EE.UU y Gran Bretaña, 90% de los quesos duros), sustituyendo a la escasa quimosina de terneros y a la biotecnológica tradicional obtenida de hongos (Rhizomucor, Endothiaparasitica). La quimosina recombinante se obtiene en Kluyveromyces lactis y Aspergillus niger manipulados.
Otras aplicaciones X mutagénesis dirigida sobre genes clonados ya existentes para generar productos con propiedades nuevas. Algunas moléculas –entre ellas, muchos antibióticos– se sintetizan en células mediante rutas bioquímicas que emplean una serie de enzimas, las cuales pueden ser modificadas genéticamente para producir formas modificadas de antibióticos.
BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOS
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
Subtilisina, proteasa de B.
licheniformis que elimina manchasde sangre y de comida, se hamejorado con ingeniería genéticapara que tenga actividad de catalasay resista pH alcalinos y altastemperaturas
BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOSENZIMAS RECOMBINANTES : produccíón somatrotopinaAplicación en veterinaria
• Se aisla de la vaca el ARNmde la somatotrofina bovina
• Con transcriptasa inversa se transforan en cADN
• Se clona en un vector bacteriano de E. coli
• Se produce en cultivo de células la STB recombinante
Somatotropina bovina recombinante pare estimular la producción de leche de vacas (aprobada por la FDA en 1994 para Monsanto, con el nombre comercial de Prosilac, pero no en la UE).