CARACTERIZAÇÃO DA INFECÇÃO PLACENTÁRIA PELO ZIKA...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS EMANUELLA MENESES VENCESLAU CARACTERIZAÇÃO DA INFECÇÃO PLACENTÁRIA PELO ZIKA VÍRUS CHARACTERIZATION OF PLACENTAL INFECTION BY ZIKA VIRUS CAMPINAS 2019
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
EMANUELLA MENESES VENCESLAU
CARACTERIZAÇÃO DA INFECÇÃO PLACENTÁRIA PELO ZIKA VÍRUS
CHARACTERIZATION OF PLACENTAL INFECTION BY ZIKA VIRUS
CAMPINAS
2019
EMANUELLA MENESES VENCESLAU
CARACTERIZAÇÃO DA INFECÇÃO PLACENTÁRIA PELO ZIKA VÍRUS
CHARACTERIZATION OF PLACENTAL INFECTION BY ZIKA VIRUS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para obtenção do título de doutora em Ciências da Saúde
na área Saúde Materna e Perinatal.
Thesis presented to the Post-Graduate Program in
Tocoginecology of the Faculty of Medical Sciences at the
Campinas State University as part of the requisites required to
obtain the title of PhD in Health Sciences in the Maternal and
Perinatal Health area.
ORIENTADOR: ELIANA MARTORANO AMARAL
COORIENTADOR: MARIA LAURA COSTA DO NASCIMENTO
ESTE ARQUIVO CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA EMANUELLA MENESES VENCESLAU
ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ELIANA MARTORANO AMARAL
E CO-ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARIA LAURA COSTA DO NASCIMENTO
CAMPINAS
2019
Ficha Catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Rosana Evangelista Poderoso – CRB 6652
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Characterization of placental infection by Zika virus.
Palavras-chave em inglês: Zika virus
Zika vírus infection
Placenta
Pregnancy
Área de concentração: Saúde Materna e Perinatal
Titulação: Doutora em Ciências da Saúde
Banca Examinadora: Eliana Martorano Amaral (Orientadora)
Adriana Gomes Luz
Aluisio Augusto Cotrim Segurado
Elyzabeth Avvad Portari
Rafael Elias Marques Pereira Silva
Data de defesa: 30-07-2019
Programa de Pós-Graduação: Tocoginecologia
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-4358-9452 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/4692611479939727
Venceslau, Emanuella Meneses, 1988-
V552C Caracterização da infecção placentária pelo Zika vírus / Emanuella Meneses Venceslau. – Campinas, SP: [s.n.], 2019.
Orientador: Eliana Martorano Amaral. Co-orientador: Maria Laura Costa do Nascimento.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas. 1. Zika vírus. 2. Infecção por Zika. 3. Placenta. 4. Gestação. I. Amaral, Eliana Martorano, 1960- II. Nascimento, Maria Laura Costa do, 1979-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO EMANUELLA MENESES VENCESLAU
ORIENTADOR: ELIANA MARTORANO AMARAL
COORIENTADOR: MARIA LAURA COSTA DO NASCIMENTO
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. MARIA LAURA COSTA DO NASCIMENTO
2. PROFA. DRA. ADRIANA GOMES LUZ
3. PROFA. DRA. ELYZABETH AVVAD PORTARI
4. PROF. DR. RAFAEL ELIAS MARQUES PEREIRA SILVA
5. PROF. DR. ALUISIO AUGUSTO COTRIM SEGURADO
Programa de Pós-Graduação em Tocoginecologia da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa na
FCM.
DATA DA DEFESA: 30/07/2019
Dedicatória
Dedico este trabalho primeiramente a Deus, por me conceder existir e ser tão agraciada com minha família e amigos. Por ouvir minhas preces acalentando sempre o meu coração. Ao meu marido Marcelo Augusto dos Santos que me incentivou a tentar fazer o Doutorado na UNICAMP, apesar de eu achar que não seria aprovada. Obrigada por ter sido meu alicerce emocional e base de estímulo sempre que precisei. Aos meus pais Everaldo Passos Venceslau e Ilda Meneses Venceslau que, apesar do momento de separação após minha aprovação no Doutorado quando saí de casa e de meu Estado para morar em outra região, me apoiaram e me ajudaram sem medir esforços. Vocês são ótimos! Ao meu irmão Emanuell Meneses Venceslau (in memorian) que sempre esteve presente em meus pensamentos e que com certeza foi o principal ator desta história, que me deu forças para buscar a minha felicidade. Você foi, é, e sempre será, muito especial em minha vida. Aos meus avós Egídio Teles de Meneses e Alzira Maria Meneses, que sempre foram meus segundos pais, agora passando por um período crítico da vida, e que, com certeza, se fossem mais jovens, estariam mais presentes. Obrigada por superarem a distância, o Amor vence fronteiras. Aos meus quatro filhos de quatro patas, Sophie, Suzy, Shakira e Berlin que sempre entenderam minha ausência diária e me recebiam de volta sempre com muita alegra e carinho. Vocês foram essenciais para manutenção de meu equilíbrio emocional. Mamãe ama muito cada um de vocês! À minha orientadora Eliana Amaral, que mesmo sem me conhecer, me recebeu e aceitou me orientar. Nossos primeiros planos não deram certo, mas creio que tudo aconteceu conforme tinha de ser. Sem o seu aceite, nada disso seria possível. À minha co-orientadora Maria Laura Costa do Nascimento por todas as horas dispensadas para os esclarecimentos e por toda dedicação embutida nesta Tese. Ao meu co-orientador (não oficial) José Luiz Proença Modena por todas as reuniões que me estimularam a prosseguir apesar das dificuldades, pelos ensinamentos em virologia e por ser um grande exemplo de professor. Aos Professores Dra. Albina, Dr. Arthur e Dr. Silvio que dedicaram seu tempo para analisarem as inúmeras reações de Imunohistoquímica durante a etapa de padronização das mesmas, além de cederem seus laboratórios. Aos professores Egberto Turato, Fernanda Surita, José Guilherme Cecatti, Luiz Bahamondes, Luiz Baccaro, Luiz Brito, Rodolfo Pacagnella, Sophie Derchain, responsáveis por ministrar matérias maravilhosas que contribuíram muito para o meu crescimento como aluna e docente, vocês foram sensacionais.
Aos alunos de Iniciação Científica Ana Paula Samogin e Guilherme de Moraes Nobrega que trabalharam junto comigo e apresentaram trabalho no Congresso de Virologia, ganhando menção honrosa. Aos colegas de laboratório pelos esclarecimentos, momentos de descontração e acolhimento como membro da Família LEVE – Laboratório de Estudos em Vírus Emergentes: Aline, Ana Lúcia, Daniel, Julia, Gabriela, Guilherme Milanez, Karina, Mariene, Matheus, Pierina e Stefanie. A todos que participaram em algum momento desta etapa de vida, contribuindo com ensinamentos e gentilezas, Adilson, Aretuza, Claudia, José Paulo, Rodolfo, Melissa. Muito obrigada do fundo do meu coração a todos vocês!
Agradecimentos
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento
88882.329828/2019.
Além de apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de São Paulo
(FAPESP) - Código de Financiamento 2016/00194-8 e do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - Código de Financiamento
409605/2016-6.
RESUMO
Introdução: A infecção por Zika vírus (ZIKV) pode ter efeitos devastadores durante a
gestação com transmissão vertical, resultando na Síndrome Zika Congênita. No
momento trata-se da única infecção por flavivírus com desenvolvimento de síndrome
congênita via transplacentária. Assim, o estudo da infecção placentária é essencial
para o entendimento da fisiopatologia da doença. Objetivos: Realizar uma revisão de
literatura sobre o acometimento placentário nos casos de infecção por ZIKV em
humanos e descrever a infecção placentária por ZIKV em mulheres com
manifestações febris exantemáticas na gestação. Métodos: Foi realizada uma revisão
integrativa da literatura, sem restrição de ano inicial até junho de 2019, com busca em
qualquer língua, nas plataformas EMBASE, PUBMED e SCIELO dos termos de
pesquisa: “placenta” AND “zika virus”. Os critérios de inclusão foram relatos de
achados placentários em humanos, com exclusão de estudos experimentais, revisões
ou editoriais. Para o estudo observacional, de coorte, prospectivo, foram incluídas 77
gestantes apresentando sintomatologia suspeita de ZIKV nos anos de 2016 e 2017.
Soro e urina foram obtidos. A coleta da placenta foi realizada de maneira sistemática
em 17 casos, incluindo amostras de membrana amniótica, placa coriônica, vilosidade
coriônica, placa basal e cordão umbilical, para posterior extração de RNA, realização
de RT-qPCR para ZIKV, quantificação viral, análise morfológica e anatomopatológica.
Resultados: Na revisão de literatura um total de 436 estudos foram inicialmente
obtidos, com 32 estudos incluídos para a análise final, dos quais 18 são relatos de
casos, dez séries de casos e quatro coortes. Os achados anatomopatológicos
placentários foram descritos como leves e inespecíficos, incluindo placentite crônica
(tipo TORCH), vilosite crônica, células de Hofbauer aumentadas, fibrose periférica e
células mononucleares variáveis, imaturidade vilosa, fibrose estromal, calcificação,
vascularidade aumentada, deciduíte linfocítica e necrose focal do sinciciotrofoblasto.
No segundo estudo, sete das 77 gestantes apresentaram positividade para ZIKV em
testes sorológicos e/ou moleculares por RT-qPCR em amostras de soro e/ou urina.
Das 17 placentas analisadas, 14 foram positivas por RT-qPCR para ZIKV, sendo cinco
no cordão umbilical, sete na membrana amniótica, oito na placa coriônica, 13 nas
vilosidades coriônicas e sete na placa basal. Na análise anatomopatológica os
achados mais encontrados foram hipóxia, inflamação, seguido de má-perfusão
vascular materna e hemorragia feto materna. Os achados mais encontrados na
análise morfológica foram aumento de celularidade, vilosite e calcificação. A
quantificação viral na fase aguda na urina variou de 101 a 103 FFU eq/ml e nas
diferentes regiões placentárias variou de 103 a 108 FFU eq/g. Conclusões: Os
achados patológicos placentários são, em sua maioria, leves e inespecíficos,
possivelmente com um papel importante de células de Hofbauer. O ZIKV pode infectar
diferentes regiões da placenta, mostrando que a coleta sistematizada e
armazenamento adequado do tecido placentário são fundamentais para o diagnóstico
de ZIKV e que este tecido pode ser um local para a persistência viral durante a
gravidez.
Palavras-chave: Zika vírus, infecção por Zika vírus, placenta, gestação.
ABSTRACT
Introduction: Zika virus infection (ZIKV) can have devastating effects during
pregnancy with vertical transmission, resulting in Congenital Zika Syndrome, even
though the infection occurs in the second or third trimester of pregnancy. At the
moment, it is the only flavivirus infection with the development of transplacental
congenital syndrome. Thus, the study of placental infection is essential for
understanding the pathophysiology of the disease. Objectives: To perform a review
of the literature on placental involvement in cases of ZIKV infection in humans and to
describe ZIKV placental infection in women with exanthematous febrile manifestations
during pregnancy. Methods: A integrative literature review was carried out, without
restriction of the initial year and until June 2019 with search in any language in
EMBASE, PUBMED and SCIELO databases of the search terms: "placenta" AND "zika
virus". The inclusion criteria were placental findings in humans, excluding experimental
studies, reviews or editorials. For the observational, cohort, prospective study, 77
pregnant women with suspected ZIKV symptomatology were included in the years
2016 and 2017. Serum and urine were obtained. The collection of placenta was
performed in a systematic way including samples from amniotic membrane, chorionic
plate, chorionic villus, basal plate and umbilical cord, for subsequent RNA extraction,
PCR for ZIKV, viral quantification, morphological and anatomopathological analysis.
Results: In the literature review a total of 436 studies were initially obtained; with 36
studies included for the final analysis, of which 18 case reports, ten case series and
four cohorts. Placental anatomopathological findings were described as mild and non-
specific, including chronic placentitis (TORCH type), chronic villi, Hofbauer cells
increased, peripheral fibrosis, variable mononuclear cells, villous immaturity, stromal
fibrosis, calcification, increased vascularity, lymphocytic deciduitis and focal
syncytiotrophoblast necrosis. In the second study, seven of the 77 pregnant women
presented positive for ZIKV in serological and / or molecular tests by RT-qPCR in
serum and / or urine samples. Of the 17 placentas analyzed, 14 were positive by RT-
qPCR for ZIKV, five in the umbilical cord, seven in the amniotic membrane, eight in the
chorionic plaque, 13 in the chorionic villi and seven in the basal plaque. In the
anatomopathological analysis, the most frequent findings were hypoxia, inflammation,
followed by maternal vascular malformation and maternal fetal hemorrhage. The most
found findings in the morphological analysis were increased cellularity, villi and
calcification. Viral quantification in the acute phase in the urine ranged from 101 to 103
FFU eq/ml and in the different placental regions ranged from 103 to 108 FFU eq/g.
Conclusions: The placental pathological findings are mostly mild and non-specific,
possibly with an important role for Hofbauer cells. ZIKV can infect different regions of
the placenta, showing that the systematized collection and adequate storage of
placental tissue is fundamental for the diagnosis of ZIKV and that this tissue may be a
local for viral persistence during pregnancy.
Key words: Zika virus, Zika vírus infection, placenta, pregnancy.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Fluxograma dos estudos incluídos..............................................................................42
Resumo dos achados placentários de estudos selecionados....................................43
Esquema para amostragem sistemática da placenta..................................................74
Fluxograma com mulheres incluídas na coorte considerada, teste diagnóstico e
acompanhamento.......................................................................................................75
Avaliação representativa dos achados placentários, hematoxilina/eosina.................76
Carga viral do ZIKV em diferentes amostras clínicas das pacientes analisadas ........77
Correlação entre carga viral na urina e diferentes amostras clínicas...........................78
LISTA DE TABELAS
Características dos estudos incluídos.........................................................................44
Características sociodemográficas, clínicas, obstétricas e desfechos materno-fetais
de mulheres com seguimento e parto no hospital da Universidade Estadual de
Campinas, por suspeita de infecção pelo ZIKV, entre o grupo com amostragem
placentária sistemática (17) e sem (32). .....................................................................68
Resultados da detecção por RT-qPCR (n=17) por região placentária........................69
Resultados dos achados anatomopatológicos e análise hematoxilina-eosina da
amostragem sistemática da placenta .........................................................................70
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
cm Centímetros CZS Congenital Zika Syndrome CU Cordão umbilical
DP Desvio padrão FFPE Formalin fixed formalina embedded
HCs Hofbauer cells IB Instituto de Biologia IG Idade gestacional
IgM Imunoglobulina M
IHC Imunohistoquímica
ISH In situ hybridization
MA Membrana amniótica
μl Microlitros
μg Microgramas
ml Milititros
mm Micrometros
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
nm Nanômetros
PB Placa basal
PC Placa coriônica
RCF Restrição de crescimento fetal
RL Laboratório de referência
RN Recém-nascido
RNA Ácido ribonucleico
rpm Rotações por minuto
RT-qPCR Reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa em tempo
real
ZIKV Zika vírus
VC Vilosidade coriônica
Sumário
1INTRODUÇÃO................................................................................................................161.1Aspectosgerais....................................................................................................................161.2SíndromeZikacongênita.....................................................................................................171.2Placenta..............................................................................................................................18
2OBJETIVOS.....................................................................................................................21
3MÉTODOS......................................................................................................................223.1RevisãodeLiteratura...........................................................................................................223.2Estudodecoorte.................................................................................................................23
3.2.1 Desenho do estudo..........................................................................................................233.2.2 Coleta de amostras e procedimentos laboratoriais.....................................................233.2.3 Coletas de placenta e anexos pelo protocolo Biobanco Caism/Unicamp...............243.2.4 Extração de RNA para detecção de ZIKV....................................................................253.2.5 Detecção do ZIKV por PCR............................................................................................26
3.3ConsideraçõesÉticas............................................................................................................26
4RESULTADOS.................................................................................................................274.1Artigo1:CharacterizationofplacentalinfectionbyZikavirusinhumans:reviewofliterature.................................................................................................................................................284.2Artigo2:AdequateplacentalsamplingmattersforthediagnosisandcharacterizationofplacentalinfectionbyZikavirus................................................................................................48
5DISCUSSÃO....................................................................................................................76
6CONCLUSÕES.................................................................................................................81
7REFERÊNCIAS.................................................................................................................82
ANEXOS............................................................................................................................89Anexo1-ProtocoloassistencialdoMinistériodaSaúdeparadiagnósticoporRT-PCR...............89Anexo2-ProtocolodeColetadePlacentas................................................................................90Anexo3-TCLE-Biobanco.........................................................................................................100Anexo4-ParecerConsubstanciadodoCEPprojetoArboviroses..............................................102Anexo5-TCLE-ProjetoArboviroses.........................................................................................109Anexo6-ParecerConsubstanciadodoCEPBiobanco...............................................................112Anexo7-ProtocoloassistencialdoCAISM-UNICAMP,paracasossuspeitosdearboviroses.....116Anexo8-Confirmaçãodesubmissão-Artigo1.........................................................................117Anexo9-Confirmaçãodesubmissão-Artigo2.........................................................................118
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1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos gerais
O zika vírus (ZIKV) foi isolado pela primeira vez de um macaco na floresta Zika
de Uganda, em 1947 (Dick et al., 1952). Durante meio século, o vírus foi descrito como
responsável por infecções humanas na África e na Ásia, quando, em 2007, ocorreu
uma epidemia de febre de Zika nas ilhas de Yap, Micronésia (Duffy et al., 2009). Em
2013, uma grande epidemia foi relatada na Polinésia Francesa, concomitante com
uma epidemia de dengue causada pelos sorotipos 1 e 3. Desde 2007, o ZIKV tem sido
considerado emergente (Cao-Lormeau et al., 2013, Ioos et al., 2014).
Nos seres humanos, além da transmissão pelo mosquito, o ZIKV pode ser
transmitido através do contato sexual (D'Ortenzio et al., 2016, Turmel et al., 2016). O
RNA viral do ZIKV foi encontrado no sêmen após o diagnóstico inicial de infecção
(Nicastri et al., 2016) e nas secreções vaginais femininas (Davidson et al., 2016;
Prisant et al., 2016). A transmissão via sangue também é possível (Driggers et al.,
2016). Porém, a via de transmissão que recebeu a maior atenção em humanos foi a
transmissão vertical devido ao súbito aumento de casos de microcefalia no Brasil
(Reis, 2015).
Em outubro de 2014, ocorreu, no Rio Grande do Norte, um surto de uma doença
febril exantemática desconhecida. Nos meses que se seguiram, houve muitos casos
que se manifestaram por febre baixa ou ausente, exantema maculopapular, prurido,
artralgia, edema de membros inferiores, com duração entre quatro e sete dias (Freitas
et al., 2016). Em maio de 2015, em 15 amostras de 45 pacientes da Bahia e do Rio
Grande do Norte analisadas por RT-PCR, foi confirmada a presença de ZIKV, um
arbovírus que não tinha circulação comprovada em nosso país (Campos et al, 2015).
Até dezembro deste ano, a transmissão de ZIKV foi confirmada em vários outros locais
no Brasil e países das Américas – Colômbia, Guatemala, El Salvador, Suriname,
Honduras, Panamá, Venezuela, México e Paraguai – nos quais a transmissão
provavelmente esteve associada ao vetor A. aegypti (Donalisio et al, 2017).
Em 30 de novembro de 2015, 1.248 casos de microcefalia, incluindo sete
óbitos, foram relatados em 14 estados do Brasil (COES, 2015). Em dezembro de 2016,
foram confirmados 2.289 casos de microcefalia, com 189 óbitos, em 749 municípios
distribuídos em todos os estados brasileiros (SAGE, 2017). Muitos estudos têm
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discutido como o vírus pode atravessar a placenta, alterar a resposta fetal,
desenvolvimento e interrupção de funções celulares específicas, causando
malformações fetais. O RNA do ZIKV foi detectado em amostras de líquido amniótico
de mulheres grávidas cujos fetos foram diagnosticados com microcefalia (De Araújo
et al., 2016).
Em 2019, até a semana epidemiológica 9 (30/12/2018 a 02/03/2019), haviam
sido registrados 2.062 casos prováveis de Zika no Brasil, com incidência de 1,0
caso/100 mil habitantes. Nesse Boletim Epidemiológico, a região Norte tinha o maior
número de casos prováveis (912 casos; 44,2%), seguida pelas regiões Sudeste (584
casos; 28,3 %), Nordeste (343 casos; 16,6 %), Centro-Oeste (176 casos, 8,5%), e Sul
(47 casos, 2,3%). Em relação às gestantes, haviam sido registrados 270 casos
prováveis, sendo 50 confirmados por critério clínico-epidemiológico ou laboratorial
(Brasil, 2019).
No entanto, como as arboviroses tem transmissão e sintomas similares, como
febre e exantema, acompanhados ou não de artropatia, entre outros menos
observados, não se pode garantir que todos os casos relatados seriam de ZIKV.
Assim, a vigilância de casos pode estar incluindo, junto aos casos de ZIKV verdadeiro,
infecção por outras arboviroses. Também o diagnóstico laboratorial de ZIKV pode
confundir com outros flavivírus (Collins e Waggoner, 2019).
O tratamento dos pacientes infectados com ZIKV, incluindo as gestantes, é
restrito. Não há terapia antiviral específica e o recomendado é o tratamento de
suporte, com hidratação, analgésicos, antipiréticos, evitando-se o uso de aspirina.
Além disso, não há vacina, e a prevenção primária consiste na redução da exposição
ao mosquito (Paho, 2015).
1.2 Síndrome Zika congênita
A infecção por ZIKV pode ter efeitos devastadores durante a gestação com
possíveis danos ao cérebro fetal, caracterizando a Síndrome Zika Congênita (Brasil et
al., 2016). Identificaram-se resultados fetais adversos em qualquer período da
gravidez, mas a infecção do primeiro trimestre parece apresentar maior risco
(Cauchemez et al., 2016, Honein et al., 2017). A transmissão ocorre através da
placenta (Boeuf et al., 2016).
Ao exame físico de recém-nascidos com síndrome congênita do ZIKV (CZS),
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chama atenção a microcefalia, geralmente grave, com importante desproporção
craniofacial. Outras dismorfias, como acentuada protuberância óssea occipital,
fontanelas fechadas ao nascer, excesso de pele e/ou dobras de pele no escalpo, além
de hérnia umbilical são frequentemente observadas. Entre as anormalidades
neurológicas, destacam-se a hipertonia global grave com hiperreflexia, irritabilidade,
hiperexcitabilidade, choro excessivo, distúrbio de deglutição, além de respostas
auditivas e visuais comprometidas. Algumas crianças apresentam crises convulsivas
já no período neonatal, com aumento da frequência durante o seguimento, sendo a
ocorrência de crises epilépticas mais evidentes a partir dos três meses de idade e os
espasmos epilépticos o tipo mais comum (Eickmann et al., 2016). O impacto da
epidemia do ZIKV na saúde humana ainda não é completamente compreendido, com
efeitos a curto prazo e com possíveis consequências a longo prazo, mesmo naqueles
sem sinais visíveis no momento do nascimento (Cao et al., 2017).
1.2 Placenta
A placenta é um órgão materno-fetal complexo que medeia as trocas de
nutrientes e outras substâncias entre a mãe e o feto. Além disso, promove uma
imunomodulação local que faz com que o sistema imunológico da mãe não reconheça
o embrião em formação como estranho e ao mesmo tempo seja eficiente no combate
a demais estímulos antigênicos, para proteger mãe e feto contra infecções. Boa parte
das funções da placenta depende da sua estratificação, formando uma barreira
biológica, denominada barreira hemato-placentária (Burton e Jauniaux, 2015, Nelson
et al., 2015).
A placenta origina-se precocemente no desenvolvimento embrionário, a partir
da porção externa do blastocisto, chamada trofoectodermo. Os trofoblastos se
desenvolvem, formando duas camadas celulares, uma externa e multinucleada,
chamada sinciciotrofoblasto e outra interna, com celulas uni-nucleadas, o
citotrofoblasto. Estas células trofoblásticas permitem a implantação na parede uterina
(chamada decídua) e desenvolvimento placentário e formam as vilosidades
placentárias, com ramificações que propiciam maior área de troca com o sangue
materno (Burton e Jauniaux, 2015).
Ao final da gestação, a placenta se apresenta como um órgão discoide, em
média com 22cm de diâmetro, 2,5cm de espessura e 500g de peso. A face fetal
representa a membrana coriônica, onde o cordão umbilical se insere. A face materna,
19
aderida ao útero, é chamada de membrana basal e constitui-se pela ramificação das
vilosidades, formando lóbulos (10-40 cotilédones), os quais possuem ao centro
artérias espiraladas modificadas. Durante a gestação, as arteríolas espiraladas de
origem uterina, tem a sua parede transformada- processo de remodelação, com
substituição da parede muscular por tecido fibrinóide e invasão de trofoblasto extra-
viloso, o que amplia o lúmen vascular, diminui a resistência e favorece as trocas
(Burton e Jauniaux, 2015).
Uma peculiaridade da infecção pelo ZIKV que o distingue de outros Flavivírus
(Dengue, Encefalite de Saint Louis, Rocio, Oeste do Nilo, Cacipacore, Ilheus,
Bussuquara e Iguape) é a sua capacidade de ser transmitida verticalmente das mães
para os seus fetos através da placenta (Adibi et al., 2016). Entretanto, esse órgão
possui diversos microambientes, com diferentes estruturas placentárias (materno ou
fetais). O ZIKV é capaz de infectar algumas células imunes chamadas células de
Hofbauer (HCs) e troflobastos, num processo que parece ser dependente da
expressão controlada de intérferon do tipo I e III (Yockey et al., 2018). Entretanto,
esses achados derivam de modelos animais ou modelos ex-vivo, utilizando explants
de placentas (Jurado et al, 2016; Noronha et al, 2016; Tabata et al, 2016). Estudos
recentes que investigam como o ZIKV atinge, em gestantes, o espaço intrauterino e
infecta o feto, demonstram amplo tropismo celular de ZIKV na placenta humana,
incluindo infecção de trofoblastos placentários, células endoteliais, fibroblastos e
macrófagos fetais conhecidos como HCs no espaço interviloso (Aagaard et al., 2017;
El Costa et al., 2016; Jurado et al., 2016; Quicke et al., 2016; Tabata et al., 2016).
As descrições de casos ou série de casos sugerem importante papel de HCs
na fisiopatologia da infecção vertical por ZIKV. Um estudo avaliou a placenta de uma
gravidez complicada pela infecção por ZIKV e demonstrou que a infecção pareceu
induzir a proliferação de HCs (Rosenberg et al., 2017). Outro estudo em tecido
humano infectado encontrou RNA viral em vilosidades coriônicas de mais de três
quartos das mulheres que eram positivas para RNA de ZIKV durante a gravidez e/ou
tiveram resultados de gravidez adversos. O RNA de ZIKV na placenta foi
predominantemente localizado nas HCs, indicando que estas células podem
desempenhar um papel na transferência do ZIKV para o cérebro fetal, particularmente
durante a gravidez precoce (Bhatnagar et al., 2017). Embora a importância da
infecção por ZIKV em HCs ainda não esteja clara, especula-se que a infecção destas
células pode promover a transmissão vertical e patogênese da infecção congênita por
20
ZIKV (Simoni et al., 2017).
Foi confirmada a presença do vírus por RT-PCR e imunohistoquímica (IHC) no
tecido cerebral de quatro recém-nascidos com microcefalia e/ou malformações graves
cerebrais que evoluíram para o óbito após o nascimento e também nas placentas de
fetos abortados na 12a semana de gestação (Martines et al., 2015). Acrescem-se a
essas evidências a identificacão do genoma do ZIKV em células da placenta em um
aborto na oitava semana, por meio de técnicas de RT-PCR em tempo real, reforçando
o potencial de transmissão placentária, mesmo precoce (PAHO & WHO, 2016).
Também se identificou o genoma viral no cérebro e na placenta de um feto na 32a
semana e que apresentou múltiplas lesões cerebrais e retardo de crescimento
intrauterino detectados a partir da 29a semana de gestação (Mlakar et al., 2016).
No entanto, as alterações patológicas placentárias induzidas pelo ZIKV ainda
são pouco descritas. Quando presentes, parecem ser leves e inespecíficas, incluindo
placentite crônica, vilosite crônica, aumento das HCs, depósitos irregulares de fibrina
e aumento de células mononucleares no estroma dos vilos. Imaturidade vilosa,
edema, hipervascularização, fibrose estromal, calcificação e necrose focal de
sinciciotrofoblastos também podem estar presentes (Noronha et al., 2016; Miranda-
Filho et al., 2016; Martines et al., 2016; Ritter et al., 2017). A imunohistoquímica de
marcação do antígeno viral em HCs, endotélio e leucócitos maternos foi mostrada
apenas em placentas no primeiro trimestre, apesar do RNA viral ser detectável no
tecido placentário mesmo em gestações a termo (Noronha et al., 2016; Martines et al.,
2016a; Bhatnagar et al., 2016). Placentas de segundo ou terceiro trimestre negativas
por IHC e positivas por RT-PCR para RNA de ZIKV podem ter calcificações e
deposição de fibrina perivilosa (Chan et al., 2016; Bhatnagar et al., 2016).
21
2 OBJETIVOS
2.1 Geral: Ampliar o conhecimento sobre o acometimento da placenta em
casos de infecção por Zika vírus em humanos e descrever o diagnóstico da
infecção nas diferentes camadas placentárias.
2.2 Específicos:
• Realizar uma revisão de literatura sobre o acometimento placentário nos
casos de infecção por Zika vírus em humanos;
• Descrever a infecção placentária por Zika vírus, com avaliação
morfológica, além de localização e quantificação viral nas diferentes
camadas placentárias.
22
3 MÉTODOS
Para cada objetivo específico foi utilizada uma metodologia específica.
3.1 Revisão de Literatura
Foi realizada uma revisão integrativa da literatura para identificar estudos que
avaliaram achados placentários em humanos com infecção pelo ZIKV durante a
gravidez. Inicialmente foi realizada uma revisão sem restrição de idioma e de tempo
inicial e até junho/2019, com busca na plataforma EMBASE, PUBMED e SCIELO.
Foram usados os seguintes termos: “Medical Subject Heading” (MeSH): “placenta”
AND “zika virus”. Os critérios de inclusão foram: descrição de achados placentários
em humanos, com exclusão dos estudos experimentais, revisões, editoriais e notas.
O presente estudo seguiu as recomendações da Declaração de Itens de Relatórios
Preferenciais para Revisões Sistemáticas e Meta-Análises (PRISMA).
Na primeira etapa desta revisão, dois revisores independentes (JPG e EMV)
realizaram uma avaliação de título de todos os estudos inicialmente identificados. Na
segunda etapa, os demais estudos foram avaliados considerando seus resumos por
esses dois revisores para definir inclusão. Discordâncias entre os dois revisores foram
resolvidas por um terceiro revisor sênior (MLC).
Após seleção final dos estudos para esta revisão, cada estudo foi avaliado na
íntegra e as seguintes características consideradas: autor, ano de publicação,
desenho do estudo, número de participantes, número de amostras placentárias,
trimestre de início dos sintomas da infecção por ZIKV, resultados perinatais e
principais achados na análise histológica. Esses resultados foram armazenados em
uma planilha do Microsoft Excel, para avaliação descritiva.
23
3.2 Estudo de coorte
3.2.1 Desenho do estudo
Estudo observacional, de coorte, prospectivo, onde foram incluídas 61
gestantes, que deram entrada no Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher –
CAISM, a partir de fevereiro de 2016 até janeiro de 2018 apresentando suspeita ou
confirmação de infecção por ZIKV, com qualquer um dos conjuntos de sintomas:
• Exantema maculopapular pruriginoso associado ou não a: hiperemia
conjuntival sem secreção e sem prurido, febre, poliartralgia e edema
periarticular;
• Febre de início súbito (≥38,5º C) e artralgia ou artrite intensa com início agudo
não explicadas por outras condições;
• Febre sem etiologia definida associada à mialgia, cefaleia, prostração e dor
retro orbitária;
• Identificação de microcefalia fetal através de exame ultrassonográfico.
Todas as gestantes incluídas com sintomas agudos foram testadas para HIV,
Hepatite B, Hepatite C, Sífilis, Toxoplasma, Citomegalovírus, Rubéola e
Mononucleose infecciosa e foram seguidas até o parto.
3.2.2 Coleta de amostras e procedimentos laboratoriais Coleta de soro, urina e placenta – protocolo Ministério da Saúde
O estudo foi realizado no Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher
(CAISM), da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Trata-se de uma
referência regional na assistência à saúde da mulher e do recém-nascido de alta
complexidade, inclusive para casos de emergência, atendendo exclusivamente
através do Sistema único de Saúde (SUS). É um hospital que presta assistência
multiprofissional e interdisciplinar, além de promover o ensino, a pesquisa e a
extensão, considerado a maior unidade hospitalar de atenção à saúde da mulher do
interior do Estado de São Paulo. Realiza cerca de 250 partos/ mês e possui
atendimento de pré-natal especializado, inclusive para casos de infecção.
Durante a epidemia de ZIKV em 2015/2016, foi preparado um programa de
atendimento multidisciplinar de todos os casos suspeitos de arboviroses na gravidez
24
para a região de Campinas, com realização de exames laboratoriais no momento da
suspeita de infecção aguda, exames de imagem (ultrassonografia) seriado e nova
coleta laboratorial no parto, conforme protocolos do Ministério da Saúde (Anexo 1). A
essas mulheres também foi oferecida a participação no protocolo de pesquisa.
Soro e urina foram obtidos das mulheres durante a gestação no momento em
que elas apresentaram sintomas compatíveis com a infecção por arbovírus. Soro
também foi coletado das gestantes com suspeita de infecção pelo ZIKV, durante o
parto, conforme recomendações do Ministério da Saúde, adotado como protocolo
assistencial local. A coleta de urina foi feita em frasco coletor universal estéril,
enquanto que três alíquotas de 5 ml de sangue periférico foram coletadas em tubos
sem anticoagulante para separação de soro. Um tubo de sangue e um de urina foram
encaminhados em até seis horas em gelo, ao Laboratório de Estudos de Vírus
Emergentes (LEVE) da Unicamp para detecção por RT-qPCR, por método TaqMan
com sondas específicas para anelamento em genoma viral de ZIKV. Outros dois
frascos de sangue foram encaminhados em até 24 horas ao Instituto Adolfo Lutz para
detecção sorológica e/ou RT-qPCR de ZIKV. O soro foi obtido por centrifugação a
3000rpm por 10 minutos.
Todas as placentas foram inicialmente pesadas, fotografadas, tanto a partir da
face materna como fetal, e as fotos foram utilizadas para calcular seus volumes, pelo
método de translocação de volume. Foi realizada coleta de amostras placentárias
como parte do protocolo assistencial segundo recomendação do Ministério da Saúde,
incluindo três fragmentos de 1,0 por 1,0cm, sem especificações, sendo armazenados
em geladeira até transporte em tubo seco, em gelo, para Instituto Adolfo Lutz,
laboratório de referência (RL) para detecção de arbovírus no Estado de São Paulo.
Esta coleta era realizada por técnica de enfermagem, enfermeira ou médico residente
para casos com suspeita de arbovirose e parto na instituição.
3.2.3 Coletas de placenta e anexos pelo protocolo Biobanco Caism/Unicamp
A coleta placentária específica para o presente estudo, visando caracterização
e localização viral, seguiu o protocolo específico de coleta de placentas para o
Biobanco do Caism/Unicamp (Anexo 2), com assinatura de consentimento informado
para Biobanco (Anexo 3). A coleta de material foi realizada com o menor tempo
possível após o parto e de maneira sistemática, de modo a conseguir uma
amostragem de todas as regiões, em quatro pontos equidistantes da placenta,
25
adicionando-se amostras de cordão umbilical, membrana amniótica, placa coriônica,
vilosidade coriônica e placa basal (Burton et al, 2014).
As coletas foram iniciadas a partir da placa basal, escolhendo quatro regiões
equidistantes do ponto de inserção do cordão umbilical e borda placentária, evitando-
se áreas de visível calcificação, infarto ou hematoma. Foram seccionados quatro
fragmentos com cerca de 1,5x1,5cm, com cerca de 5mm de espessura, que foram
então divididos em dois fragmentos, um com 1,0x1,0cm e outro 0,5x0,5cm. O
fragmento de 1cm2 foi fixado em solução com 10% de formaldeído, enquanto os
fragmentos menores de 0,25cm2 foram subdivididos em pelo menos quatro
fragmentos e congelados em nitrogênio líquido com posterior armazenamento em -
80oC. Para acurada representatividade, os fragmentos originados dessa última
subdivisão foram adicionados num único tubo para extração de RNA. O mesmo
procedimento foi realizado para as demais regiões da placenta, incluindo a membrana
amniótica, vilosidade coriônica e placa coriônica. Para as amostras de cordão
umbilical, coletamos dois fragmentos na sua completa espessura, um fragmento de
aproximadamente 1cm foi fixado em formaldeído 10%, enquanto fragmentos menores
congelados para posterior extração. Todo material foi armazenado no Biobanco
institucional do Caism. Dezessete casos foram submetidos a esta coleta.
3.2.4 Extração de RNA para detecção de ZIKV
Para extração do RNA, um tubo contendo os quatro fragmentos de cada região
placentária, estocados no Biobanco do Caism, foram encaminhados ao Laboratório
de Estudo de Vírus Emergentes para extração de RNA e detecção de ZIKV. Para
tanto, o material foi pesado e macerado em beads de cristais de zircônia no MagNA
Lyser instrument (Roche Life Science) em 1ml de TRIzol Plus (Invitrogen). A
purificação foi feita pelo PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen), seguindo protocolo
sugerido pelo fabricante, para posterior detecção de ZIKV por RT-qPCR.
Para determinar se a diferença na taxa de detecção de ZIKV era devida ao
processo de coleta de amostras de placentas ou aos protocolos de extração de RNA,
os tecidos coletados foram também submetidos a extração de RNA usando o RNeasy
Mini Kit (Qiagen), abordagem utilizada pelo RL.
Além disso, o RNA foi obtido de 140 μl de soro e urina obtidos durante a fase
aguda da doença e/ou momento do parto após extração com o QIAamp Viral RNA
Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Todas as amostras de RNA foram quantificadas
26
pela análise da absorbância em 260/280nm em espectrofotômetro Nanodrop One
(Thermo) e armazenadas até o uso à -80°C.
3.2.5 Detecção do ZIKV por PCR
A detecção de ZIKV por RT-qPCR foi realizada seguindo protocolo previamente
publicado (Lanciotti et al., 2007). Brevemente, as condições de ciclagem foram: 45°C
por 1 min (RT step); 95°C por 5 min e 45 ciclos a 95°C por 15 s e 60°C por 1 min.
Primers e sondas para ZIKV foram usadas nas concentrações finais de 400 nM e 200
nM, respectivamente. Todas as reações foram realizadas com o kit TaqMan Fast vírus
1-Step Mastermix (Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific) ou Taqman
GoTaqÒ Probe 1-Step RT-qPCR System (Promega), em um equipamento
Quantistudio 3 (Thermo) em reações com 12 μL de volume final, usando 7 μL de RNA
molde (aproximadamente 1 μg). Reações de RT-qPCR com valores de cycle threshold
(Ct) maiores que 40 ciclos foram considerados negativos.
3.3 Considerações Éticas
O projeto de pesquisa de acompanhamento clínico (Arboviroses em gestantes
e crianças) foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual
de Campinas, CAAE: 64253416.9.0000.5404 (CEP- Anexo 4). Todos os participantes
assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE - Anexo 5) autorizando
a pesquisa, além da coleta e armazenamento das amostras clínicas. Todas as
amostras foram armazenadas no Biobanco Institucional do CAISM-UNICAMP,
conforme aprovação prévia (Anexo 6), CAAE: 60863516.2.0000.5404.
27
4 RESULTADOS
Os resultados serão apresentados em dois artigos científicos:
Artigo 1- Characterization of placental infection by Zika virus, in humans: review of
literature.
Enviado para a revista Placenta (Anexo 8)
Artigo 2- Adequate placental sampling matters for the diagnosis and characterization
of placental infection by Zika virus.
Enviado para a revista Frontiers in Microbiology (anexo 9)
28
4.1 Artigo 1: Characterization of placental infection by Zika virus in humans:
review of literature
Venceslau EM1, Guida JPS1, Amaral E1, Modena JLP2, Costa ML1.
1 Department of Obstetrics & Gynecology, School of Medical Sciences, University of
Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brazil. 2Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of
Biology, University of Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brazil.
Corresponding Author Maria Laura Costa Department of Obstetrics and Gynecology University of Campinas Brazil [email protected]
29
Abstract
Introduction: The precise mechanisms of Zika virus (ZIKV) placental infection and
maternal-fetal transmission during pregnancy is unclear. The study of placentas from
Zika suspected cases is recommended as part of the optimum healthcare.
Histopathologic examination of the placenta, ZIKV RNA testing, may confirm fetal
infection. Objective: The aim of this review is to present a systematic evaluation of
reported human placental findings on ZIKV infection. Methods: We reviewed
EMBASE, PUBMED and SCIELO databases until June, 2019, any language. Inclusion
criteria of the studies were reporting of placental findings in humans. Experimental
studies, reviews, notes or editorials were excluded. Search terms used were:
“placenta” AND “zika virus”, and followed recommendations of the Preferred Reporting
Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA) Statement. Data included
for each study: author, year of publication, study design, number of participants,
number of placental samples, onset of symptoms, perinatal outcomes and main
findings on histological analysis. Results: A total of 436 studies were initially retrieved
in our search; with 32 studies included for the final analysis, of which 18 case reports,
10 case series and 4 four cohorts. Placental pathologic findings were described as mild
and nonspecific, including chronic placentitis, chronic villitis, increased Hofbauer cells,
irregular fibrin deposits and increased mononuclear cells in the villus stroma. Villous
immaturity, edema, hypervascularization, stromal fibrosis, calcification and focal
necrosis of syncytiotrophoblasts. Conclusion: Zika infection presents similar features
to other TORCH infections, with a significant role of Hofbauer cells. Characterizing
placental infection is key for understanding mechanisms of congenital diseases.
Key words: Zika virus, ZIKV, placenta, Hofbauer cells, TORCH
30
Introduction
Zika virus (ZIKV) is a flavivirus much similar to other arboviruses of relevance,
such as dengue, West Nile, yellow fever, and Japanese encephalitis viruses. ZIKV is
transmitted mostly by Aedes aegypti mosquitoes, and was first recognized in humans
in Uganda in 1952, with two main previous outbreaks, in Yap, Micronesia, in 2007 and
French Polynesia in 2013 [1,2]. ZIKV may also be transmitted to humans according to
other routes non-vector reliant, such as blood transfusion, sexual transmission, or
maternal-fetal transmission [3].
Brazil was the setting for the most significant and recent outbreak of ZIKV, with
major relevance not only due to the total number of cases reported (over two hundred
thousand), but also because of its severity and association to fetal malformations [4].
The fetal consequences were further defined as Congenital Zika Syndrome (CZS), a
spectrum of congenital defects (not only microcephaly) [5]. These conditions are
reminiscent of the ones caused by “TORCH” acronym stands for: Toxoplasma gondii
infection, Other (Treponema pallidium, Listeria monocytogenes, parvovirus B-19,
human immuno deficiency virus (HIV), amongst others), Rubella, Cytomegalovirus
(CMV), and Herpesviruses (HSV) 1 and 2. Recent data has suggested the inclusion of
Zika among the group “others” in the acronym or even a more direct inclusion such as
TORCHZ [6].
The precise mechanisms of placental infection and maternal-fetal transmission
during pregnancy, not only in ZIKV, but other TORCH infections (acronym for
Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, rubella virus, cytomegalovirus (CMV) and
herpes simplex virus (HSV) is unclear. Described routes include: ascending infection,
direct crossing or infection of syncytiotrophoblasts (SYN), infection of extravillous
trophoblasts through maternal microvasculature and trafficking of and/or signaling from
maternal immune cells [6].
The syncytiotrophoblast (SYN) layer is the outer layer of the placental villus, of
multinucleated, terminally differentiated cells in direct contact with the maternal blood.
The extravillous trophoblasts (EVTs) anchor cells to the uterine wall. Both of these are
differentiate from the cytotrophoblast layer (CTB) throughout pregnancy [7]. Hofbauer
cells (HCs) are placental macrophages of fetal origin, existent in the chorionic villus
31
across gestation [8]. HCs have been associated to Zika infection, with description of
hyperplasia of such cells in the placenta [9].
The study of placentas from ZIKV suspected cases is recommended, as part of
the optimum healthcare for these women and newborn. ZIKV RNA testing (via RT-
qPCR) may confirm fetal infection, since viral detection in the serum is timely sensitive
and might miss the window of ZIKV detection [4]. Placental pathologic findings in ZIKV
infection are mostly described as nonspecific and mild, TORCH type [10], with few
reports yet.
The aim of this review is to present an integrative evaluation of reported
placental findings in human studies on ZIKV infection during pregnancy.
Methods
We performed a review of literature to identify studies that assessed placental
findings in human with ZIKV infection during pregnancy. The time end-point of this
review was June/2019, including publications of EMBASE, PUBMED, and SCIELO
databases, any language. We used the following Medical Subject Heading (MeSH)
search terms: “placenta” AND “zika virus”. Inclusion criteria of the studies was reporting
of placental findings in humans, while studies that did not report placental findings,
experimental studies, reviews, notes or editorials were excluded. The current study
followed all recommendations of the Preferred Reporting Items for Systematic Reviews
and Meta-Analyses (PRISMA) Statement.
In the first step of this review, two independent reviewers (JPG and EMV)
performed a title screening of all studies identified in the database search; in the
second step, the remaining studies were evaluated considering their abstracts by two
independent reviewers (JPG and EMV) and further full text, for inclusion. Discordances
between the primary reviewers were solved by a third senior reviewer (MLC).
After final selection of studies that were included in this review, each study was
evaluated and the following characteristics for each study were obtained: author, year
of publication, study design, number of participants, number of placental samples,
onset of Zika infection symptoms, perinatal outcomes and main findings on histological
analysis. Those results were stored in a Microsoft Excel spreadsheet and further
organized in a table with detailed description of data.
32
Results
A total of 436 articles were retrieved in the databases search, of those, 193 were
delated duplicated articles and 115 were excluded after title screening. The remaining
128 studies were evaluated and 96 were excluded (27 reviews, 45 experimental
studies, 8 editorials, 6 notes, 5 conceptual articles and 5 articles with no data on
placental findings); 32 studies, of which 18 case reports, 10 case series and 4 cohorts,
were included for analysis. Figure 1 shows the inclusion flowchart for this study.
Majority of studies included placental testing for ZIKV with RT-PCR as part as
diagnostic procedures and part presented detailed data on abnormal morphological
findings and immunohistochemistry (IHC) studies (Figure 2).
Table 1 summarizes the main findings on the selected studies, published from
2016 (first reports on the subject) to June/2019, containing results of 1244 women with
ZIKV infection during pregnancy. Majority of women presented symptoms in the first
trimester of pregnancy. Different methods for ZIKV infection diagnosis were performed.
Placental pathologic findings were described as mild and nonspecific, including chronic
placentitis (TORCH type), chronic villitis, increased HCs, variable perivilous fibrin and
mononuclear cells, villous immaturity, stromal fibrosis and calcification, increased
vascularity and also lymphocytic deciduitis and focal syncytiotrophoblast necrosis [10-
13].
Most of the detailed cases represented first trimester infection, with symptomatic
disease, leading to significant cases of abortions, stillbirth or neonatal death [9-18].
ZIKV was found to induce fetal disease and/or adverse pregnancy outcomes well
beyond the first trimester, even late during pregnancy [19,20].
Among reported studies, the largest case series considered [18,21] aimed in
ZIKV-specific RT-PCR amplification products from placenta with no details on IHC
findings. Nevertheless, a few studies have presented interesting immunohistochemical
(IHC) results, with evidence of ZIKV infection in HCs, within the placental villi
[12,13,18].
33
Discussion
This review evaluated studies that reported placental findings among women
with ZIKV infection during pregnancy. Placental pathologic findings are mostly mild and
nonspecific, suggesting an important role for HCs within the villi. These findings are
consistent with effects of other viruses in the placenta, such as human cytomegalovirus
(CMV) [47,48], leading to pro-inflammatory responses, impaired remodeling of spiral
arteries in the decidua and cell death; ultimately compromising suitable utero-placental
blood-flow [49]. The amount of placental inflammation is associated to the severity of
fetal findings [50].
There are few other virus known to infect the placenta during maternal infection,
with fetal transmission, causing congenital disease or newborn infection at delivery:
rubella virus, varicella-zoster virus, parvovirus B-19, CMV, hepatitis, human deficiency
virus and herpes simplex virus [49].
This review points towards important role of HCs, which are of fetal origin,
monocytic derived, and part of the normal component of the stroma of the chorionic
villi, shown to appear very early on gestation. HCs have been described as alternatively
activated macrophages [9, 22] responsible for phagocytosis of fluids and apoptotic
materials, antigen presentation, and perhaps an angiogenic role in early placental
vasculogenesis, placental water balance, and endocrine function. Hyperplasia of HCs
have been previously reported in other maternal-fetal infections, such as TORCH and
its proliferation within the chorionic villous stroma also confirmed [9, 23, 24].
The placenta is an important virus reservoir, that can confirm the diagnosis
when infection was not confirmed during the acute phase, due to limitations on
adequate and timely sample collection, which is a serious concern in ZIKV infection
[4]. Nevertheless, absence of identified virus in the placenta does not guarantee
absence in the fetus.
There is a worldwide variation regarding antenatal screening availability and
management options for women with fetal congenital abnormalities. And it is illegal or
highly restricted to obtain an induced abortion in most Latin American countries,
including Brazil [29]. Both factors help explain the sparsity of tissue samples from
earlier gestational ages reported in the literature.
34
One finding from the literature that must be addressed is the existence of
placental tissue that tested positive for ZIKV infection in apparently unaffected
neonates [29].
But many questions arise as to whether certain infants were protected by an
effective immune response, whether placentas protect against ZIKV more effectively
during later gestation, whether more advanced stages of organogenesis are immune
to ZIKV-related disturbances, and whether these neonates will continue to appear
normal throughout childhood development. These questions need to be addressed
through long-term follow-up of infants and through experimental studies involving
animal models and in vitro work. There are reports that could not determine early
childhood development impairment, however with low number of cases and limited
testing (anthropometric indicators for children’s developmental status: weight for age,
height for age, weight for height, and head circumference for age) [51]. And also
reports that suggest severe neurodevelopmental delay (measured by brain imaging,
complete eye examinations, Bayley Scales of Infant and Toddler Development, and
assessment of brain-stem auditory evoked response), in a cohort follow-up of children
from Brazil, who were exposed to ZIKV in utero, during the 2016 outbreak [52].
Characterizing placental infection is key for understanding severity of disease
and fetal malformations. Missed opportunities of such evaluation are evident when
considering the limited number of studies included in this review. However, it is very
important to address the need for adequate sampling and evaluation of placental
findings during an outbreak, among suspected and confirmed cases of ZIKV infection.
For that, specific evaluation on different placental layers and combined studies on RNA
detection and IHC findings are fundamental.
Finantial support
This work was supported by FAPESP (São Paulo Research Foundation) -
#2016 / 00194-8 and National Council for Scientific and Technological Development
(CNPq) - 409605 / 2016-6. MLC has CNPq support: # 409605/2016-6. EMV has a
scholarship by CAPES (Higher Education Personnel Improvement Coordination) -
#88882.329828 / 2019).
35
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Figure 1: Flowchart of included studies.
PUBMED: 164 EMBASE: 270 SCIELO: 2
Deleted duplicate articles: 193
Reading titles: 243
Excluded after reading of titles : 115
Abstracts reading: 128
Excluded articles = 96Exclusion criteria:
Reviews = 27Experimental studies = 45Editorial letter = 8Note: 6Conceptual paper = 5Absence of information on placenta = 5
Cohorts: 4 Case reports: 18 Case series: 10
41
Figure 2: Summary of placental findings from selected studies
*Total does not add 32, since the same study can have more than one description of placental findings n=number of identified studies IHC: Immunohistochemistry; ISH: In situ hybridization; PCR: Polymerase chain reaction.
32 articles
n=25 PCR testingn=12 Morphological analyzes n=12 IHC analyzes
Antigens in chorionic villi; Expression of local
pro-inflammatory cytokines such as IFN-?and TNF-?, and RANTES/CCL5 and VEGFR2;
High level of CD3, CD4 and CD8 T lymphocytes;
High expression of the apoptosis inhibitor, Bcl-2,
observed in the syncytiotrophoblasts;
Immunopositivity in HCs; Immunopositivity in histiocytes; Immunopositivity in glial cells.
Calcification; Chronic lymphocytic deciduitis;
Chronic placentitis; Delayed villous maturation;
Edema; Fibrosis;
Hemorrhage; Hyperplasia in villous HCs; Increase in perivillous fibrin
deposit; Inflammation;
Necrosis; Patchy villous hyper cellularity;
Perivascular inflammatory infiltrates;
Severe damage to maternal decidua and chorionic villi;
Villous immaturity.
175 placentas ZIKV+ 884 placentas ZIKV-
n=1 Ultrassound
Calcification
n=3 ISH analyses
ZIKV in amniotic epithelium
Detailed retrieved
information with each method
Placental findings*
42
Table 1 – Characteristics of included studies
Author, year Type
of
study
Participant
s /
placentas
sampled
Onset of symptoms
(trimester)
Perinatal Outcomes Main findings on placental evaluation and overall findings
1st 2nd 3rd N/A
A B C D
Driggers, 2016 (36)
Case report
1/1 1 - - - - - 1 - High viral load found in placenta, fetal membranes and
umbilical cord by RT-PCR.
ZIKV RNA in Amniotic fluid, fetal brain, liver, lung and spleen.
Martines, 2016 (11)
Case report
4 / 4 2 - 2 - 2 - - 2 Placenta with fibrosis, calcification, and deposits of fibrin.
Material consistent with third trimester gestation = RT-PCR
negative.
Two abortions, one had dense and heterogeneous chorionic
villitis with calcification, sclerosis, edema, increased
perivillous fibrin deposition, and patchy lymphohistiocytic
intervillositis and the other had minute fragments of placental. Both placental RT-PCR positive for ZIKV.
Martines, 2016 (12)
Case series
5 / 2 1 - - 4 2 - 2 1 RT-PCR ZIKV positive in all samples.
IHC: ZIKV antigens in chorionic villi of a first trimester
placenta.
De Oliveira Melo, 2016 (21)
Case series
11 / 11 9 1 - 1 - - 3 8 PCR ZIKV performed in nine placentas, two positives.
Mlakar, 2016 (31)
Case report
1/1 1 - - - - 1 - - Ultrasound scan performed at 29 weeks showed microcephaly with brain and placental calcification.
RT-PCR ZIKV positive in fetal brain tissue
Noronha, 2016 (13)
Case report
5 / 3 3 - 1 1 1 - - 4 RT-PCR ZIKV positive in all samples. Main pathological
findings: chronic placentitis, hyperplasia in villous HCs.
IHC with the 4G2 anti-flavivirus monoclonal antibody
analysis showed: immunopositivity in HCs and some
histiocytes in intervillous spaces, diffusely distributed immunopositivity in some glial cells.
43
Sarno, 2016 (25)
Case report
1 / 1 - - - - - - 1 - RT-PCR ZIKV negative in placental sample.
van der Eijk, 2016 (14)
Case report
1 / 1 1 - - - 1 - - - Placental Histopathological and IHC investigation: no
inflammation markers.
RT-PCR ZIKV positive in the amniotic fluid, fetal and placental tissue. In situ hybridization (ISH) only found ZIKV in amniotic epithelium.
Acosta-Reyes, 2017 (15)
Case report
2 / 2 1 1 - - 1 - - - Placental ZIKV RT-PCR positive in one case.
Histological analysis: increase in perivillous fibrin deposit,
chronic lymphocytic deciduitis in both cases.
Bhatnagar, 2017 (18)
Case series
44 / 44 H 19 24 - 1 11 3 3 27 ZIKV RT-PCR positive in 32 placental samples.
ISH positive in 16 of the cases positives by RT-PCR.
Chen, 2017 (17)
Case report
1 / 1 - 1 - - - - - 1 RT-PCR ZIKV negative in placental sample.
Mattar, 2017 (26)
Case report
1/1 - 1 - - - - - 1 RT-PCR ZIKV positive in placental sample.
ZIKV not found in umbilical cord or serum.
Rabelo, 2017 (27)
Case report
1/1 - - - 1 - - - 1 IHC revealed presence of ZIKV antigens.
Severe damage to maternal decidua and chorionic villitis,
with large areas of fibrinoid necrosis and perivascular
inflammatory infiltrates. Dense and heterogenous
calcification observed.
Reagan-Steiner, 2017 (28)
Case series
627/627 131
153
- 343
81 - - 546
Of 546, 60 placental sample RT-PCR ZIKV positives.
In 81 samples of pregnancy losses, 18 placental sample RT-
PCR ZIKV positives.
IHC performed in 91 placentas from livebirths and 7 had
evidences of ZIKV infection.
Ritter, 2017 (10)
Case reportE
4 / 2 2 - - 2 1 - 1 -F One sample, histological analysis showed: patchy villous
hypercellularity, focal perivillous fibrin deposition,
increased HCs and focal calcification.
44
Rosenberg, 2017 (9)
Case report
1 / 1 1 - - - - 1 - - RT-PCR ZIKV positive in the placenta and fetal brain.
Placenta demonstrated focally stromal edema, hydropic
chorionic villi with hyperplasia and focal proliferation of
HCs. prominent hypercellularity of the villous stroma.
IHC with inflammatory markers (CD163 and CD8) found in
HCs.
ISH positive for ZIKV demonstrated scattered, strongly positive staining cells within the villous stroma of the chorionic villi, which were presumably HCs.
Schaub, 2017 (16)
Case series
8 / 8 6I - - - 3 - - 1F RT-PCR ZIKV positive in three samples.
Schwartz, 2017 (40)
Case series
12/12 - - - 12 - - - 12 Placentas from fetuses with congenital ZIKV infection didn’t
present placental inflammation.
IHC: special stains reveal proliferation and prominent
hyperplasia of HCs, in the chorionic villi of infected
placentas. ZIKV infection present in HCs from second and
third trimester placentas.
De Noronha, 2018 (35)
Case series
24/24 5 8 6 5 1 - - 23 Villous immaturity was the main histological finding.
IHC: Hyperplasia of HCs observed in the third trimester in
placental tissues. HCs were the only ZIKV-positive fetal
cells found in placentas that persisted until birth.
33% of women infected during pregnancy gave birth to babies with congenital anomalies.
No pattern correlating the gestational stage in the infection, the positivity of HCs in the placenta due to IHC and the presence of congenital malformations at birth.
Esquivel, 2018 (37)
Cohort
3/6 1 2 1 - - - - 3 Patient 1: Placental PCR negative, but both twins PCR
positive.
Patient 2: Both placentas and twins PCR positive at birth.
Patient 3: One twin and associated placenta PCR-positive,
the second twin and placenta PCR negative.
45
All six placentas with villous immaturity and other placental
histopathologic findings distinct in each placental pair.
These results suggest that each twin should be evaluated individually for Zika infection as ZIKV may not transmit equally to each fetus.
Mayin, 2018 (38)
Cohort
29/29 2 22 1 4 - - - 29 PCR ZIKV positive in 25 placentas.
Ten placental pathological findings: delayed villous
maturation, chronic deciduitis, stromal fibrosis and HC
hyperplasia.
Mletzko, 2018 (45)
Cohort
301/121 - - - 300
180
- - 121
RT-PCR ZIKV negative in all placentas and tissues from
spontaneous abortions.
Rabelo, 2018 (39)
Case report
1/1 1 - - - 1 - - - Histological analyses of the placenta and fetal organs revealed different types of tissue abnormalities: inflammation,
hemorrhage, edema and necrosis in placenta, as well as
tissue disorganization in the fetus.
IHC: Increased cellularity (HCs and TCD8+ lymphocytes),
expression of local pro-inflammatory cytokines such as
IFN-γ and TNF-α, and other markers, such as RANTES/CCL5
and VEGFR2, supported placental inflammation and
dysfunction.
Sasseti, 2018 (46)
Case report
1/1 1 - - - - - - 1 RT-PCR ZIKV negative in Placenta and blood.
RT-PCR positive in the newborn urine sample collected on day 1 after birth.
Turley, 2018 (41)
Case series
4/4 - - - 4 - - - 4 All 4 cases demonstrated positive placental testing by
multiple modalities.
IHC: tissues were stained against E glycoprotein of the ZIKV
envelope with 4G2 monoclonal antibody revealing strong
but localized signal in the chorionic villus parenchyma and
villous lumen.
PCR amplicons of the ZIKV genome were amplified by RT-
PCR from placenta in all cases. Bioanalyzer assessment of RT-
46
PCR product confirmed the highest amounts of ZIKV in placenta and verified amplicon size.
Wongsurawat 2018 (42)
Case report
1/1 1 - - - 1 - - - PCR ZIKV positive in the placenta and brain.
Felix, 2019 (43) Case report
2/2 2 - - - - - - 2 PCR ZIKV negative in placenta fragments, blood and urine.
ZIKV serology performed only showed presence of IgG antibodies of maternal origin.
Merriam, 2019 (44)
Cohort
70/70 - - - 70 - 4 - 63 PCR positive in 1 placenta.
PCR positive in urine and serum in five and nine women respectively, and two women had both positive urine and serum PCR.
Rodo, 2019 (30)
Case series
72/72 16 41 14 - - - - - RT-PCR ZIKV positive for 10 placentas.
Sorological assay positive for the other 62 women.
2 cases of central nervous system anomalies and 1 miscarriage, all in women with first trimester infection.
Santos, 2019 (32)
Case report
1/1 1 - - - - - - 1 Deciduit present on maternal surface of the placenta, with a
prevalence of lymphocytes associated with vasculitis.
IHC: HCs found in placental tissue, specific-ZIKV protein
found in placental cells.
IHC with high level of CD3 T lymphocytes present in
addition to CD4 and CD8 cells. High expression of the
apoptosis inhibitor, Bcl-2, observed in the
syncytiotrophoblasts.
Seferovic, 2019 (33)
Case series
4/4 2 2 - - - - - 4 RT-PCR ZIKV performed on placenta, membrane and cord
samples.
ZIKV was detected in all placental specimens in cases 1, 2 and 3 (affected by CZS), but not by case 4 (unaffected).
ZIKV detected in the membranes and cord of cases 2 and 3, but not in cases 1 and 4.
Histological and IHC examination of placentas reveals
evidence of ZIKV infection and active in cases 1, 2 and 3.
47
ISH positive in cases 1, 2 and 3.
Yarrington, 2019 (34)
Case report
1/1 - - - - - - - 1 RT-PCR ZIKV positive in placental sample.
Evaluation for other causes of microcephaly negative.
A – Abortion; B – Termination; C – Stillbirth; D – Liveborn; E - Case reports + Review of literature; F - Data not detailed on all considered cases; G – Asymptomatic case; H - 8 cases of children with microcephaly, without placental samples; I – two cases were asymptomatics.
48
4.2 Artigo 2: Adequate placental sampling matters for the diagnosis and characterization of placental infection by Zika virus Venceslau EM1, Guida JPS1, Nobrega GM2, Samogim AP2, Parise PL2, Japecanga RR1, Toledo-Teixeira DA2, Consonni SR2, Souza A3, Antolini-Tavares A3, Altemani A1, Passini Jr R1, Amaral E1, Proença-Modena JL2*, Costa ML1* and The Zika-Unicamp Network# 1 Department of Obstetrics & Gynecology, School of Medical Sciences, University of Campinas
(UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brazil. 2 Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology,
University of Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brazil. 3 Department of Pathological Anatomy, School of Medical Sciences, University of Campinas
(UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brazil.
*equally contributed as last authors
# A comprehensive list of consortium members appears at the end of the paper
Corresponding Authors: Maria Laura Costa, Department of Obstetrics and Gynecology, University of Campinas,
Brazil. E-mail: [email protected]
José Luiz Proenca-Modena, Department of Genetics, Evolution, Microbiology and
Immunology, University of Campinas, Brazil. E-mail: [email protected]
Zika-Unicamp Network: Glaucia Maria Pastore4, Helaine Maria Besteti Pires Mayer-Milanez1, Carolina C. Ribeiro-do-Valle1, Roseli Calil1, João Renato Bennini Junior1, Giuliane Jesus Lajos1, Maria Luiza Moretti5, Mariangela Ribeiro Resende5, Márcia Teixeira Garcia5, Rodrigo Nogueira Angerami5, Kleber Yotsumoto Fertrin5, Marcos Tadeu Nolasco da Silva6, Ana Carolina Coan7, Maria Francisca Colella-Santos8, Andrea Paula Bruno von Zuben9, André Ricardo Ribas Freitas9, Marco Aurélio Ramirez Vinolo2, Rodrigo Ramos Catharino10, Clarice Weis Arns2, Matheus Martini2, Ana Lucia Rodrigues Soledade2 & Évellyn Ribeiro de Morais2. 4Faculty of Food Engineering, Unicamp, Brazil. 5Clinical Pathology Department, Schoolof Medical Sciences, Unicamp, Brazil. 6Pediatric Immunology, Center for Investigation in Pediatrics, Faculty of Medical Sciences, Unicamp, Brazil. 7Neurology Department, Faculty of Medical Sciences, Unicamp, Brazil. 8Department of Human Development and Rehabilitation, Faculty of Medical Sciences, Unicamp, Brazil. 9Campinas Department of Public Health Surveillance, Campinas, Brazil. 10School of Pharmaceutical Sciences, University of Campinas, Campinas, Brazil.
49
ABSTRACT The detection of Zika virus (ZIKV) in immunoprivileged anatomical sites, potential sites for viral
persistence, may guide the confirmation of undefined cases of ZIKV infection, and also bring
light to unknown pathways of viral transmission. Thus, this study aimed to characterize ZIKV
infection in stratified, standardized placental samples in women with exanthematic febrile
manifestations during pregnancy and compare findings to the standard investigation protocol
by official health agencies. For this, a prospective cohort study was conducted in a period of
24 months (2016/2017). Serum and urine were obtained at the time of clinical case
identification. Placental sampling was performed as standard investigation protocol (3 samples
of 1.0cm sent to a reference laboratory) and in a systematic way at various regions (chorionic
plate, chorionic villi, basal plate), as well as amniotic membrane, and umbilical cord, for
subsequent ZIKV identification and quantification. Histological preparation with
Hematoxylin/Eosin staining for morphological evaluation was performed to clinical information.
Seventy-seven women were included in the cohort, 49 had childbirth in the institution, and
placentas from seventeen cases were systematically collected. Of the 17 placentas analyzed,
14 were positive by RT-qPCR for ZIKV, five in the umbilical cord, seven in the amniotic
membrane, seven in the chorionic plate, 13 in the chorionic villi and seven in the basal plate,
in comparison with none reported by the reference laboratory. The most common
morphological and anatomopathological findings were increased cellularity, villitis,
calcification, hypoxia, inflammation, maternal vascular malperfusion and maternal fetal
hemorrhage. Seven women presented positive testing for ZIKV in serological and/or molecular
tests during gestation in urine, in comparison with six reported by the reference laboratory.
While viral quantification in urine ranged from 101 to 103 FFU eq/ml, the different placental
regions ranged from 103 to 108 FFU eq/g. Thus, ZIKV can infect different regions of the
placenta and umbilical cord, of infected pregnant women, showing that the systematic
collection and adequate storage of the placenta is fundamental for the diagnosis of ZIKV. The
detection of ZIKV in the placenta after several months of initial symptoms, suggests that this
tissue may be a site for viral persistence during pregnancy.
Key words: Zika virus, placenta, viral persistence, pregnancy, systematic sampling, qRT-
PCR.
.
50
INTRODUCTION The introduction of the Zika virus (ZIKV) in Brazil between 2013 and 2014
revealed previously unknown clinical-pathogenic aspects, with great repercussion in
the world medical community. ZIKV, previously described as a virus associated with
the development of self-limited acute exanthematous and febrile disease, with rare
case reports of suspected neurologic sequelae, such as Guillain–Barré syndrome, was
suddenly shown to cause severe clinical complications (Oehler et al., 2014).
Particularly in pregnant women, it could lead to fetal malformations, further
detailed as congenital Zika virus syndrome (CZS). This syndrome is characterized by
a unique pattern of fetal changes, with microcephaly being the most striking, even if
present only in part of the affected newborns (Petersen et al., 2016, van der Eijk et al.,
2016; Rasmussen et al., 2016; Brasil, 2017b). Clinical consequences of CZS include
the presence of pronounced brain damage and intracerebral calcification, cortical
reduction, atrophy, cerebellar hypoplasia, arthrogryposis, ocular lesions and
neurogenic bladder (Chimelli et al., 2017, Costa Monteiro et al., 2018, Honein et al.,
2017). In Brazil, from November 8, 2015 to December 29, 2018, 2.865 cases of
newborns and children with growth alterations and microcephaly caused by Zika
infection during pregnancy were reported, not counting those who died (Brazil, 2019).
ZIKV are enveloped viruses, with a positive-sense single-stranded RNA
genome belonging to the Flaviviridae family (Simmonds et al., 2017) transmitted mainly
by arthropod bites, such as the Aedes aegypti mosquito in an urban environment, or
less frequently by sexual intercourse, transfusion or vertically, from the mother to the
fetus, during pregnancy or during childbirth (D’Ortenzio et al., 2016, Driggers et al.,
2016, Turmel et al., 2016).
Acute ZIKV infection is often asymptomatic, what makes it difficult to confirm the
infection in pregnant women with fetal alterations and without reports of febrile
exanthematous disease during the acute phase. Also, the serological tests available
on the market have high cross-reactivity with other arboviruses, such as dengue and
yellow fever. In addition, the window for detection of viral RNA in blood and urine is
relatively short, even in symptomatic patients, making the laboratory diagnosis
particularly difficult in a significant proportion of infected patients (Xavier, 2017). Thus,
detection of ZIKV in immunoprivileged anatomical sites, which could be sites of viral
persistence, may be of paramount importance for epidemiological surveillance
programs and for the confirmation of undefined cases of ZIKV infection.
51
The placenta is a maternal-fetal organ that enables nutrition and controlled
exchange of substances between the mother and the fetus. In addition, this organ
induces a local immunotolerance, which allows the mother not to reject the fetus during
development (Burton and Jauniaux, 2015, Nelson et al., 2015). Basically, the layers of
trophoblast, syncytiotrophoblast and fetal endothelium in the chorionic villi act as a
blood-placental barrier and promote local immunotolerance, in part due to the action
of syncycines (Mi et al., 2000, Frendo et al., 2003). This immunotolerance and the
large flow of blood and maternal circulating immune cells make the placenta a site for
viral persistence, especially of known congenital infections, such as rubella virus
(Klase et al., 2016).
It has been demonstrated that ZIKV can be detected in Hofbauer cells (placental
fetal macrophages), trophoblasts and placental endothelial cells of pregnant women at
the time of delivery, even in pregnant women who were infected in the first trimester of
pregnancy (Besnard et al., 2014). Thus, the placenta is a site of persistence of ZIKV
during pregnancy. However, the extent, degree of uniformity and regions of this
infection are not fully understood.
Currently in Brazil, the laboratory diagnosis of the presence of ZIKV in placental
tissue is done by reference laboratories of the Unified Health System (SUS) network,
using real-time polymerase chain reaction after reverse transcriptase reaction (RT-
qPCR) from placental biopsies of 1.0x1.0 cm, without any other requirement detail
(Brazil, 2015). In addition, protocols for sampling and placental storage differ across
the world (Wolfe et al., 2014).
Thus, in this study we evaluated the results and importance of a stratified,
standardized sampling and storage composed of four biopsies containing different
placental layers, collected equidistant from the umbilical cord insertion, for an accurate
diagnosis of ZIKV in placentas of women with exanthematous febrile manifestations
during pregnancy. All the data obtained were compared with the results of ZIKV in the
placenta of these same pregnant women provided by the reference laboratory for
detection of ZIKV. The present study further characterizes viral load and provide
morphological analysis.
METHODS
In the present prospective cohort study, from February 2016 to January 2018,
77 pregnant women were referred to the Women’s Hospital at the University of
52
Campinas presenting symptoms that suggested arbovirus infection. These symptoms
included maculopapular rash associated or not with conjunctival hyperemia without
secretion and without pruritus, fever, polyarthralgia and periarticular edema. In
addition, women who presented with sudden onset fever (≥38.5º C) and arthralgia or
acute arthritis with unexplained acute onset by other conditions, women with fever with
no defined etiology associated with myalgia, headache, prostration and retroorbital
pain and those with identification of fetal microcephaly by ultrasonographic
examination were also included. All pregnant women included were followed until
childbirth and were tested also for HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, Syphilis, Toxoplasma,
Cytomegalovirus, Rubella, and Infectious Mononucleosis. Positive pregnant women
for one of these pathogens were excluded from the study.
Serum and urine sampling
Serum and urine were obtained from all women during gestation at the time they
had symptoms compatible with arbovirus infection. Serum was also collected from all
pregnant women during childbirth. Urine collection was done in a sterile universal
collection vial, while three aliquots of 5 ml of peripheral blood were collected in tubes
without anticoagulant for serum separation. One tube of blood and one urine were sent
on ice to the Laboratory of Emerging Virus Studies (LEVE) of Unicamp for RT-qPCR
by TaqMan method with probes specific for annealing in ZIKV viral genome. Two other
blood bottles were sent to the Adolfo Lutz Institute, a reference laboratory (RL) for
arbovirus detection in the State of São Paulo, for up to 24 hours for serological and/or
RT-qPCR detection of ZIKV. Serum was obtained by centrifugation at 3000rpm for 10
minutes.
Placenta sampling
The collection of placental material was performed in a systematic manner, with
the shortest interval after delivery, in order to obtain a comprehensive sampling of four
fragments equidistant to cord insertion containing all regions of this tissue (Figure 1),
avoiding areas of visible calcification, infarct or hematoma. Sampling was initiated from
the basal plate, through chorionic villus and chorionic plate, as well as umbilical cord,
and amniotic membrane (Burton et al, 2014).
Four fragments with about 1.5x1.5cm were cut, about 5mm thick, which were
then divided into two fragments, one with 1.0x1.0cm and another 0.5x0.5cm. The 1cm2
53
fragment was fixed in 10% formaldehyde solution and smaller fragments where further
divided in two fragments and frozen in liquid nitrogen with subsequent storage at -
80oC. Each microtube contained four pieces, of all different areas, in order to ascertain
representativeness. RNA extraction was performed and further detection of ZIKV by
RT-qPCR. The same procedure was performed for the other regions of the placenta,
including the amniotic membrane, chorionic villi and chorionic plate (Figure 1). For the
umbilical cord samples, we collected 3 fragments, containing full thickness of the
tissue. All material was stored in the Institutional Biobank of the Women’s Hospital.
In addition, 3 fragments of 1cm3 of the placenta was shipped in a dry ice tube to
the RL for detection of ZIKV, collected regularly by the clinical team, not the research
team, as part of the institutional protocol, following the national recommendations for
healthcare.
Detection of ZIKV in placentas of infected women during pregnancy
The fragments from each of the four placental regions were added in a single
tube for TRIzol Plus RNA extraction associated with the PureLink RNA Mini Kit
(Invitrogen) for further detection of ZIKV by RT-qPCR. Three umbilical cord samples
were collected, one of which was submitted to TRIzol RNA extraction protocol. The
results obtained were then compared with the official data of detection of ZIKV in the
placenta of these same pregnant women published by the public reference laboratory
for arbovirus detection in the State of São Paulo. Finally, to determine if the difference
in the detection rate of ZIKV was due to the placental sample collection or the RNA
extraction protocols, the fragment of each one of the regions was submitted to a new
RNA extraction using the RNeasy Mini Kit (Qiagen), following the protocol used at RL.
RNA extraction
For RNA extraction and ZIKV detection, a tube containing the four micro
fragments from each placental region, stored in the biobank, was sent to the Laboratory
of Emerging Virus Studies. The material was weighed and homogenized using zirconia
beads, 1ml of TRIzol Plus RNA extraction and Magna Lyser instrument (Roche Life
Science) for 40 seconds at 6000 rpm. The purification was performed by the PureLink
RNA Mini Kit (Invitrogen) following a protocol suggested by the manufacturer. The
collected tissues were also submitted to RNA extraction using the RNeasy Mini Kit
(Qiagen) and the Taqman GoTaqÒ Probe 1-Step RT-qPCR System Kit (Promega), the
54
same kits used by the Reference Laboratory.
In addition, RNA was obtained from 140μl of serum and urine obtained during
the acute phase of the disease and/or time of deliver, after extraction with the QIAamp
Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). All RNA samples were quantified by
analyzing the absorbance at 260/280nm in a Nanodrop One (Thermo)
spectrophotometer and stored until use at -80°C.
RT-qPCR for detection of ZIKV
The detection of ZIKV by RT-qPCR was performed following a previously
published protocol (Lanciotti et al., 2007). Briefly, the cycling conditions were: 45°C for
1 min (RT step); 95°C for 5 min and 45 cycles at 95°C for 15 s and 60°C for 1 min.
Primers and probes for ZIKV were used in the final concentrations of 400nM and
200nM, respectively. All reactions were performed with the TaqMan Fast virus 1-Step
Mastermix kit (Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific) or Taqman GoTaqÒ
Probe 1-Step RT-qPCR System (Promega) in a Quantistudio 3 (Thermo) in reactions
with 12μL final volume, using 7μL template RNA (approximately 1μg). Reactions of
RT-qPCR with cycle threshold values (Ct) greater than 40 cycles were considered
negative.
Urine sample
We also analyzed the viral load of ZIKV in the stored urine collected during the
acute phase of the infection, from patients who were ZIKV-positive in the placenta.
Anatomopathological analysis
A pathologist with no clinical information and previous results analyzed all
placentas in relation to villous maturaty, histological signs of inflammation, acute and
chronic hypoxic lesions, and vascular abnormalities (basal plate, membranes and villi).
Hematoxylin-eosin analysis was performed in blocks of the 39 regions positive for ZIKV
by RT-qPCR.
Ethical Considerations The research project followed all rules for the use of human samples, with
approval by the Research Ethics Committee of the State University of Campinas
(UNICAMP), CAAE: 64253416.9.0000.5404. All samples were stored in the
55
Institutional Biobank, as approved by the ethics committee of the same hospital, CAAE:
60863516.2.0000.5404. All women signed the informed consent form authorizing the
collection, storage and use of clinical samples.
RESULTS Characteristics of considered women during ZIKV outbreak in Campinas-SP
Seventy-seven pregnant women aged between 16 and 40 years (mean: 26.7 ±
6.5 years) presented symptoms of arbovirus infection during gestation and were
referred to the Women’s Hospital at the University of Campinas, during 2015/2016. Of
these, 49 had childbirth at the institution and 17 had placental samples collected.
Seven of these cases presented positive testing for ZIKV in serological and/or
molecular tests by RT-qPCR during gestation in urine samples, in tests carried out at
the reference laboratory and/or Laboratory of Emerging Virus Studies (Figure 2). All
the pregnant women were negative for HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, Syphilis,
Toxoplasma, Cytomegalovirus, Rubella and infectious Mononucleosis, according to
routine tests.
The clinical, demographic and childbirth characteristics of all pregnant women
with and without systematic placental sampling are included in Table 1. Conjunctivitis,
exanthema, fever, headache, joint pain, myalgia and pruritus, were the symptoms that
characterized the ZIKV-positive patients. The cases with the worst perinatal outcomes
were from later infections (27 and 28 weeks and evolved to neonatal death).
Of the 17 placentas analyzed, 14 (82%) were positive by the PureLink RNA Mini
Kit (Invitrogen) for ZIKV in some of the placental regions. Following the same
methodology used by the reference laboratory applied to the systematic collected
placental samples proposed alternative protocol, submitted to RNA extraction using
the RNeasy Mini Kit (Qiagen) we obtained 10 (59%) positive placentas, in comparison
with none reported by the reference laboratory. The region with the highest detection
rate of ZIKV was chorionic villi, followed by chorionic plate, amniotic membrane, basal
plate and umbilical cord (Table 2). Although ZIKV was more frequently detected in
chorionic villi, no correlation was observed with ZIKV infection in other regions, nor
between the detection of ZIKV in the placenta and the gestational age at which acute
infection occurred.
56
No correlation was observed between the dissemination of ZIKV in
the placenta and the presence of fetal findings. The only two newborns who presented
fetal growth restriction and fetal malformation were children of patients P.3 and P.14,
who had distinct patterns of placental infection. While the P.3 patient presented
positivity for ZIKV in all placental regions, patient P.14 had ZIKV only in chorionic villi
(Table 2).
Table 3 presents anatomopathological results and the most common findings
were hypoxia (nine), Inflammation (six), followed by maternal vascular malperfusion
(four) and hemorrhage (four). Hematoxylin-eosin analysis in blocks of the 40 regions
positive for ZIKV by RT-qPCR showed the most common findings were increased
cellularity (six regions), villitis (five regions) and calcification (three regions) (Figure 3).
The basement membrane, chorionic plate and chorionic villi showed the highest
values of viral load (Figure 4). However, there was no clear association between the
viral load in urine during the acute phase and the viral load in the different placental
regions after delivery (Figure 5). We identified two patients who presented positivity in
chorionic villi and had presented urine with >100 FFU equivalents per milliliter (eq/ml).
Another 9 patients presented positivity in different placental regions and had presented
urine with £100 FFU eq/ml. And one patient presented positivity in different placental
regions and had not presented positivity in the urine. Viral quantification in the acute
phase in the urine ranged from 101 to 103 FFU eq/ml and in the different placental
regions ranged from 103 to 108 FFU eq/g.
DISCUSSION
Detection analyzes in the various biological samples used in the study
demonstrate differences in positivity according to timing, between the samples
corresponding to the acute phase (symptoms) and the chronic phase (childbirth). While
ZIKV was detected in most patients during the symptomatic acute phase in urine
samples, ZIKV was not detected in serum samples during delivery, contrasting with
the high frequency of ZIKV detection in placenta. It suggests that the placenta may be
a site of replication and persistence of ZIKV, months after disappearance of the
symptoms. This fact emphasizes that those pregnant women who were underreported
for ZIKV could potentially present CZS, raising the degree of disturbance that this
pathogen may have generated during the ZIKV epidemic.
57
Another relevant finding of our study was the discrepancy between our RT-
qPCR results and the results presented by the reference laboratory. In addition to the
highest sensitivity test, we found 23% more cases using the Invitrogen RNA extraction
kit compared to the Qiagen kit. We also detected ZIKV in the acute phase through in
the urine and later in the placenta, where we found RNA in all placental regions
including the umbilical cord, with highlight to the chorionic villus that showed the
highest positivity. More severe fetal involvement was observed in the two mothers who
presented clinical symptoms during third trimester of gestation.
None of the placenta samples tested positive for ZIKV in the national reference
laboratory in comparison to 82% of positive samples in the systematic study samples.
We cannot rule out the effect of postponing placenta sampling and inadequately
storage to explain the disparity among ours and reference lab results. Our results
emphasize the importance of collecting the placenta shortly (within 12 hours) after
delivery and adequately storing the placenta.
A greater detection sensitivity of the Invitrogen Kit was identified, with 14
positive patients compared to the 10 positive samples diagnosed by the Qiagen Kit
performed at our lab, but none was positive at the reference lab. Placental samples
from the same patients sent to the reference lab were not collected by the research
team. They were obtained through collection at three random regions of the placenta
and kept in -20oC, according to the guideline determined by the Ministry of Health in
Brazil (Brazil, 2015). This result corroborates the importance of systematic collection
of the placenta, with adequate storage in the accurate diagnosis of ZIKV by RT-qPCR.
As a limitation, it is important to address that from the 49 women that delivered
at our institution, only 22 were sampled for placental diagnosis (as part of the
assistance protocol) and 17 submitted to systematic sampling. This reflects the
difficulty within implementing routine procedures involving unplanned deliveries with
different teams working at the obstetric room. The research team was much involved
and there seems to be a selection bias, with the 17 cases more prone to ZIKV positivity,
most likely due to close follow-up and of more severe cases.
It was also found that the detection of ZIKV in the acute phase by RT-qPCR
technique of RNA extracted from serum or urine presented less positivity in relation to
the detection of placental biopsies. As previously described, the detection window of
ZIKV in the acute phase by biological samples, in the case of serum and urine, covers
58
a short period of time, rarely exceeding two weeks after the appearance of the first
symptoms. Since this period may have been exceeded at the time of collection, and
serological techniques have higher rates of non-specificity, the diagnosis of this
infection may be impaired (Klase et al., 2016). Therefore, even in the absence of
viremia or virus in the urine, late detection in placentas, collected and stored in a
systematized and standardized way, is essential for a more accurate viral diagnosis.
Chorionic villi samples showed higher positivity and umbilical cord lower
positivity, corresponding to the regions with the highest and lowest cellularity,
respectively. In particular, chorionic villi, is known to be the region with the highest level
of HCs. This fact reveals a potential correlation with the transmission of ZIKV and
potential congenital disease. Jurado et al. (2016) suggested that HCs can contribute
to the spread of the virus in the placenta and promote vertical transmission. Thus, the
different degrees of positivity for ZIKV in the various placental regions may be directly
correlated with the distinct impairment in placental, fetal and neonatal development
and function during pregnancy, in addition to the gestational stage presented.
The most frequent morphological alterations such as hypoxia, inflammation,
maternal vascular malperfusion and maternal fetal hemorrhage are non-specific
findings, present in cases of intrauterine growth restriction (IUGR) for example (Neto
et al., 2011). Inflamatory findings are also frequent even in pregnancies with adequate
outcome (Romero et al., 2018).
Most reports and series of ZIKV cases in pregnancy show more severe cases
in early infection, especially in the first trimester. According to studies by Noronha et
al. (2016) and Singh et al. (2016), most infants with CZS were the children of mothers
who had symptomatic Zika fever in the first trimester. Miranda-Filho et al. (2016) found
that 70% of mothers of children with microcephaly had rash in the first trimester. In our
study, the cases with the worst perinatal outcomes were from later infections (27 and
28 weeks), and both malformed newborns evolved to neonatal death.
Two studies using mouse models also addressed the causal relationship
between maternal ZIKV infection in pregnancy and fetal outcomes. Cugola et al., 2016,
inoculated gestational barriers intravenously with a high dose of a Brazilian strain of
ZIKV and demonstrated fetal growth restriction and severe fetal brain damage in
cortical neurons in the cerebral cortex and ocular abnormalities also observed in
newborns humans. Wu et al., 2016, injected a contemporary ZIKV Asian strain
59
intraperitoneally into immunocompetent gestational barriers at embryonic day 13.5,
which provoked transient viremia and placental seeding leading to infection of cortical
neuronal progenitors from fetal mice. Together, these studies established that ZIKV
transplacental infection in pregnancy led directly to fetal brain injury. Another mouse
study has shown that the vaginal delivery route can lead to fetal infection as well as
direct intrauterine inoculation. Vaginal infection with an Asian strain in early-stage led
to embryo reabsorption, intrauterine growth restriction and infection in fetal brains,
suggesting that ZIKV infection in the lower female reproductive tract may lead to a
pathway transvaginal ascending to access the fetus during pregnancy and infect via
the placental route (Yockey et al., 2016).
The absence of commercial serological and molecular tests for the diagnosis of
ZIKV, since in-house tests currently available are limited to reference laboratories,
limits the prompt diagnosis of ZIKV infection, especially in the most vulnerable groups,
pregnant women and patients with autoimmune conditions and chronic diseases. In
fact, it is urgent to develop rapid immunochromatographic tests, serological tests and
molecular tests. There are recent reports of deaths in patients with chronic diseases,
lupus, hemolytic anemia, sickle cell anemia and others, which makes these groups
prior to the diagnosis of ZIKV infection (Charrel et al., 2016, De Oliveira and
Vasconcelos, 2016; Duarte and Garcia, 2016).
As a limitation we also had a very restricted number of malformations among
considered cases to permit further inferences based on viral load and different regions
of placenta showed to be infected. In fact, the expected endemic malformations in
consequence of ZIKV were not confirmed in the geographic region. Reasons for the
discrepancy among the high incidence of cases in Northeast of Brazil compared with
other regions in the same country or other countries (IPEA, 2018).
This study clearly demonstrated that the placenta is a site of viral persistence of
the ZIKV. In addition, systematic collection and storage of the same interferes directly
in the diagnosis of the ZIKV. Future studies should address for long term follow-up of
cases with positive placental testing for ZIKV and no diagnosed perinatal adverse
outcome.
60
CONCLUSIONS ZIKV can infect different regions of the placenta such as umbilical cord, amniotic
membrane, chorionic plate, chorionic villus and basal plate of infected pregnant
women, showing that the systematic collection and adequate storage of the placenta
is fundamental for the diagnosis of ZIKV. The detection of ZIKV in the placenta after
several months of initial symptoms, even in mothers without detection of ZIKV by RT-
qPCR in urine and/or serum during the acute phase, suggests that this tissue may be
a site for viral persistence during pregnancy.
FINANCIAL SUPPORT
This work was financed by FAPESP (São Paulo Research Foundation) - 2016 /
00194-8 and CNPq (National Council for Scientific and Technological Development) -
409605 / 2016-6. EMV is supported by CAPES (Higher Education Personnel
Improvement Coordination) - 88882.329828 / 2019, GMN is supported by CNPq
(Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) (119172 / 2018-6),
while APS is supported by the Student Aid System. PLP and DATT are supported by
FAPESP fellowships (2017/26908-0 and 2017/02402-0). MLC has CNPq support: #
409605/2016-6. EA is CNPq research fellows. The funders had no role in study design,
data collection and analysis, decision to publish, or preparation this manuscript.
61
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65
TABLES Table 1. Sociodemographic, clinical, obstetrical characteristics and maternal/fetal outcomes of women with follow up and childbirth at the hospital at University of Campinas, for suspected ZIKV, among the group with systematic placental sampling (17) and without (32). Clinical and demographic characteristics (n=17) (n=32) Age (years ± SD) 27.3 ± 6.2 25.9 ± 6.7 Gestational age of onset of symptoms (weeks ± SD)
22.7 ± 8.9 30.1 ± 8.5
Symptoms 1° trimester 3 (18%) 1 (3%) 2° trimester 6 (35%) 9 (28%) 3° trimester 8 (47%) 22 (68%) Conjunctivitis 2 (12%) 1 (3%) Exanthema 11 (65%) 17 (53%) Fever 9 (53%) 13 (40%) Headache 6 (35%) 15 (46%) Joint pain 5 (29%) 6 (18%) Myalgia 3 (18%) 9 (28%) Pruritus 8 (47%) 12 (37%) Mean interval between onset of symptoms and urine and/or blood sample collection (days ± SD)
12.9 ± 24.4 3.4 ± 3.7
Vaginal delivery 9 (53%) 19 (60%) Cesarean delivery 8 (47%) 13 (40%) Fetal malformation * 2 (12%)1 3 (9%)1
Neonatal death * 2 (12%)1 2 (6%)1
* same cases; 1 Microcephaly
66
Table 2. Results of RT-qPCR for ZIKV detection by placental region (n = 17).
GA: Gestational age at infection, UC: umbilical cord, AM: amniotic membrane, CP: chorionic plate, CV:
chorionic villus, BP: basal plate, Ct: cycle threshold values, und: undetermined, RL: reference
laboratory results, +: Positive result, -: negative, X: Missing sample in the Biobank (most likely not
collected).
Cases included
GA UC Ct AM Ct CP Ct CV Ct BP Ct Total RL
P1 8 + 33,7 + 36,0 + 34,6 + 34,4 + 31,0 5 - P2 16 - und + 34,9 + 26,2 + 42,5 - und 3 - P3 27 + 36,8 + 37,9 + 39,4 + 36,0 + 39,3 5 - P4 24 + 38,1 - und + 41,7 + 37,6 - und 3 - P5 36 - und - und - und - und - und 0 - P6 20 - und + 38,9 + 38,7 + 38,4 + 35,0 4 - P7 16 + 37,4 + 37,7 - und + 39,1 - und 3 - P8 27 - und - und - und + 40,3 + 41,0 2 - P9 37 - und + 33,7 - und + 37,5 - und 2 -
P10 7 - und - und - und + 37,6 - und 1 - P11 10 - und - und - und - und - und 0 - P12 29 - und - und - und - und - und 0 - P13 26 + ? - und + 42,3 - und - und 2 - P14 28 - und - und - und + 42,3 - und 1 - P15 30 - und - und - und + ? + ? 2 - P16 27 - und - und X X + 39,2 + 35,4 2 - P17 20 - und + ? + 35,1 + 35,5 + ? 4 -
Total + 5 7 7 13 7 39 0
67
Table 3. Results of anatomopathological findings and Hematoxylin-Eosin analysis of the systematic placental sampling
Patient Region Pathological analysis Diagnosis Region Systematic placental samples analysis
P1
Weight, volume, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
410g GA 37/38/3rd T (p25-50, adequate weight)
3 vessels, no particularities
Focus of lymphocytic chronic deciduitis
Chronic villitis (> 20 small focus) in BP, CV and
CP, absence of thrombosis
High grade villitis
UC Only stroma and amnion AM Mild inflammatory infiltrate
CP Usual villous (2 small focus) and mild chronic vasculitis
CV
Usual villositis (2 small focus)
BP
Wide villus (8 focus), calcifications and
thrombosis suspected
P2
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
380g GA 39/3rd T (p10, low weight)
3 vessels, no particularities
Reactive amniocytes (meconium?), decidual vasculopathy
Increased perivillous fibrin deposition and persistence of cytotrophoblast
Maternal vascular
malperfusion and decidual vasculopathy
AM No histopathological abnormalities
CP
A villus with slightly more cellular stroma
CV
No histopathological abnormalities
BP
Lymphocytic chronic deciduitis, mild increase in cellularity and fibrotic stroma
P3
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
215g GA 37/3rd T (<p3, extreme low weight)
3 vessels, no particularities
Focal lymphoplasmacytic deciduitis, acute focal chorioamnonitis and decidual vasculopathy
Focus of villous immaturity and edema, villous agglutination and intravillous hemorrhage,
chronic villitis in a focus
Low grade villitis, maternal
vascular malperfusion
UC No histopathological abnormalities
AM
Slight acute acute chorionitis foci
CV Discrete hypercellularity; villitis and
thrombosis suspected
BP Edema and increase of cytotrophoblast
P4 Hipóxia crônica, UC No histopathological abnormalities
68
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
340g GA 39/3rd T (p3-p5, very low weight)
3 vessels, no particularities
No particularities
Increased perivilous fibrin and persistence of cytotrophoblast, calcifications and intravillous
hemorrhage
Maternal vascular
malperfusion
CP
Calcifications
CV
Calcifications
P6
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
315g GA 34/3rd T (p10-p25, adequate)
3 vessels, no particularities
Reactive amniocytes (meconium?)
Increase of perivilous fibrin deposition, central remote infarcts and 10 focus of moderate
chronic villitis
High grade villitis, maternal
vascular malperfusion
(hypertension)
AM No histopathological abnormalities CP Cytotrophoblast hyperplasia CV Two foci of usual villitis
BP
Focal villitis on basal villi, stroma mild
increase in cellularity and fibrosis, villous agglutination, chronic deciduitis without
plasma cells
P7
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
375g GA 37/3rd T (p10-p25, adequate)
3 vessels, no particularities Fetal-maternal hemorrhage,
maternal vascular
malperfusion, decidual
vasculopathy
UC
No histopathological abnormalities
Decidual vasculopathy and meconium deposition AM Lymphocytic deciduitis, decidual
vasculopathy, meconium
Accentuated increase of perivillous fibrin deposition, intervillous and subchoronic
thrombosis CV
Increased stromal cellularity
P8
Weight, GA and villous maturation
Cord
420g GA 39/3rd T (p10-p25, adequate)
3 vessels, no particularities
Extensive decidual laminar necrosis
No abnormalities
CV
BP
No histopathological abnormalities
Lymphocytic deciduitis
69
Membranes Placenta
No particularities
P9
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
455g GA 40/3rd T (p25-50, adequate)
3 vessels, no particularities
No particularities Increased perivilous fibrin deposition,
persistence of cytotrophoblast, focus of mild chronic villitis, avascular villi in two distinct foci,
intervillous thrombosis and calcifications
Low grade villitis, maternal
vascular malperfusion, fetal-maternal hemorrhage,
low-grade fetal vascular
malperfusion
CV
BP
Persistence of cytotrophoblast
Calcifications, persistence of cytotrophoblast
P10
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
390g GA 38/3rd T (p25, adequate) 3 vessels, no particularities Low grade
villitis, maternal vascular
malperfusion, fetal-maternal hemorrhage
CV No histopathological abnormalities No particularities
Increased perivilous fibrin deposition, focal villi agglutination and proliferation of extravillous
trophoblast, focus of mild chronic villitis, intervillous thrombosis
P13
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
495g GA 39/3rd T (>p50, adequate)
3 vessels, no particularities Maternal vascular
malperfusion, fetal-maternal hemorrhage
UC
CP
Light acute phlebitis
Few avascular villi No particularities
Increased perivillous fibrin deposition and intervillous thrombosis
70
P14
Weight, GA and villous maturation
Cord Membranes
Placenta
305g GA 31/32/2nd T (p25-59, adequate)
3 vessels with post-mortem changes
Post-mortem changes Extensive deposition of perivillous fibrin and
post-mortem changes
Maternal vascular
malperfusion CV Post-mortem changes
P16
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
470g GA 39/3rd T (p25-50, adequate)
3 vessels, no particularities
No particularities
Increase of perivillous fibrin deposition and focus of mild chronic villitis
Low grade villitis, maternal
vascular malperfusion
CV
BP
No histopathological abnormalities
Avascular villi suspected
P17
Weight, GA and villous maturation
Cord
Membranes
Placenta
285g GA 40/3rd T (>p3, extreme low weight)
3 vessels, no particularities
No particularities
Villous agglutination and intervillous thrombosis
Maternal vascular
malperfusion, fetal-maternal hemorrhage
AM No histopathological abnormalities CP No histopathological changes CV Increased stromal cellularity
BP
No histopathological abnormalities
GA: gestational age at delivery, p: percentage, T: trimester, UC: umbilical cord, AM: amniotic membrane, CP: chorionic plate, CV: chorionic villi, BP: basal plate.
71
Figure 1. Scheme for systematic placental sampling. (A). Cross section of the placenta showing its
components - image adapted from OpenStax, Anatomy & Physiology. OpenStax CNX. Chapter 28.2,
Embryonic Development, Feb, 26, 2016. (B). Image of the fetal side of the human placenta. (C) Sample
collection points based on umbilical cord insertion. (D) Processing and storage of placental fragments
samples.
DE
B CA
DE
B C
B
DE
B C
C
DE
B C
D
72
Figure 2. Flowchart with included women in the considered cohort, diagnostic testing
and follow-up.
77 pregnant women with suspected ZIKVduring
pregnancy*
49 follow up and childbirth at the
institution**
28 childbirth elsewhere
17 placentas with systematic sample
collection #
32 placentas without systematic sample
collection
7 AP of placenta 1 villiti
9 AP of placenta 2 villitis
14+ RT-qPCR (IB) 0+ RT-qPCR (RL)
7 urine + RT-qPCR (IB) 6 urine+ RT-qPCR (RL)
5- RT-qPCR (RL)***
3 urine + RT-qPCR (IB) 1 urine + RT-qPCR (RL)
1 blood + (RL)
*ZIKV tested during acute phase (serum and/or urine) and referral to high risk antenatal care.** Women's hospital at University of Campinas.*** 3 fragment 1cm3 collected as part of the assistance protocol and sent to the reference laboratory.# Stored in the institutional BiobankAP: Anatomopathological analyzes; RT-qPCR: Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction; IB: Biology Institute; RL: reference laboratory;
73
Figure 3. Representative evaluation of placental, hematoxylin/eosin findings. A- Pacient 1, chorionic
third trimester villi small sample with a cracked basophilic dystrophic calcification at 10x objective
(asterisk). B- Pacient 2, chorionic plate small sample with cellularity augmented on a villus at 10x
objective (arrowheads limiting). C- Pacient 6, Basal plate small sample with chronic deciduitis
(arrowheads) at 10x objective. It denotes minor inflammatory changes. D- Pacient 6, inflammatory
trophoblastic destruction with villi agglutination and fibrin deposition (asterisk), at 10x objective. Can be
seen congestion around this villitis area (arrowheads).
74
Figure 4. ZIKV viral load in different clinical samples from analyzed patients. A. ZIKV viral load in serum
and urine of ZIKV infection during acute phase by RT-qPCR. Bars represent median. Each point
represents an individual patient (n=7). B. ZIKV viral load in different placenta regions. Bars represent
means and error bars represent standard error. Each point represents an individual patient (n=17).
A B
75
Figure 5. Correlation graphs between viral load in urine and different clinical samples: whole lines
represent linear regression, dashed lines represent 95% confidence interval, each point represents an
individual patient (n=7). Correlation between ZIKV viral load in urine and umbilical cord (A), amniotic
membrane (B), chorionic plate (C) chorionic villus (D) and basal plate (E).
A B
C D
E
76
5 DISCUSSÃO
As ameaças globais à saúde podem devastar as comunidades em termos
sociais e econômicos e impedir o avanço do desenvolvimento. Surtos de doenças,
como febre amarela, Ebola e gripe, têm o potencial de aumentar as desigualdades
sociais e de saúde. O ZIKV é uma dessas ameaças. Calculou-se que o Zika é
responsável por perdas tangíveis no Produto Interno Bruto, estimadas em US $ 7-18
bilhões no período de 2015-2017 e impôs um ônus imediato aos sistemas de
assistência médica e de assistência social. Entendeu-se que investimentos adicionais
em estratégias de prevenção, preparação e resposta nos níveis local, nacional e
regional seriam mais custo-efetivos (PNUD, 2017).
Um estudo inicial tipo caso-controle com recrutamento prospectivo de recém-
nascidos mostrou uma forte associação entre microcefalia e infecção congênita por
ZIKV. Neste estudo, foi recomendado que uma nova síndrome congênita do ZIKV
fosse incluída entre as TORCH (toxoplasmose, outras [sífilis, varicela-zoster,
parvovírus B19], rubéola, citomegalovírus e herpes), um conjunto de infecções
transmitidas de mãe para filho durante a gravidez, e renomeada para TORCHZ.
Antecipou, também, uma epidemia global de microcefalia e outras manifestações da
síndrome zika congênita (de Araujo et al., 2016). Este foi o primeiro estudo
epidemiológico, analítico, desenvolvido para testar uma hipótese de associação entre
microcefalia e infecção congênita pelo ZIKV foi desenvolvido em Pernambuco pelo
Grupo de Pesquisa Epidemiológica em Microcefalia, com o apoio do Ministério da
Saúde e da Organização Pan-Americana da Saúde.
Cuidar de uma criança com distúrbios de desenvolvimento ou microcefalia
muitas vezes obriga a família, especialmente mulheres e adolescentes a deixar o
mercado de trabalho ou desistir da educação formal, contribuindo para a perda de
produtividade e aumento da dificuldade econômica nas populações já marginalizadas.
São fatores que contribuem para um risco mais elevado de transmissão de doenças,
a pobreza, a desigualdade em termos de infraestrutura (como o acesso a serviços de
água e saneamento essenciais, bem como serviços de saúde), as disparidades no
acesso á informação e o apoio á prevenção (Castro, 2015).
Resultados de estudos recentes de microcefalia no Nordeste brasileiro
concluíram que a maioria dos casos relatados ocorreu em famílias de baixa renda.
Sugerindo que a epidemia poderia contribuir para ampliar as desigualdades
77
socioeconômicas. A maioria das mulheres no Brasil que tiveram bebês com
microcefalia ou outras doenças associadas á CZS tende a ser jovem, solteira,
afrodescendente, pobre e viver em pequenas cidades ou áreas periurbanas (Soares
de Araújo et al., 2016; Butler, 2016).
Recife, o “centro” da epidemia de Zika no Brasil, tem uma história de infecções
relacionadas com a água que afetam principalmente os bairros pobres. Sistemas de
abastecimento de água e saneamento deficientes (incluindo a eliminação de
resíduos), particularmente em bairros urbanos pobres altamente povoados, foram
apontados como uma das principais causas de as famílias serem rotineiramente
forçadas a armazenar água potável para uso doméstico, proporcionando as condições
ideais para a reprodução do mosquito e aumentando o risco de transmissão (Castro,
2015b). Para os arbovírus, as pobres condições de habitação, abastecimento de água
e infra-estrutura sanitária favorecem o estabelecimento e reprodução de mosquitos
Aedes aegypti (Snyder et al., 2017).
Entendeu-se que o Zika seria capaz de provocar uma crise na saúde, com
potencial para afetar mais drasticamente as comunidades mais pobres e vulneráveis.
No entanto, não é mais considerado uma emergência de saúde pública de importância
internacional. Essa situação é decorrência da maior clareza sobre os mecanismos
fisiopatológicos da infecção e reconhecimento de que o Zika estará presente durante
anos como um desafio de saúde pública permanente (OMS, 2016).
A identificação de outras malformações congênitas e neurológicas em recém-
nascidos requer técnicas sofisticadas e pessoal treinado, o que pode ser caro e não
estar facilmente disponível em regiões com poucos recursos. Outra dificuldade é a
falta de pessoal treinado em serviços primários e especializados de saúde para
acompanhamento dos casos. O Brasil, que concentrou o maior número de casos de
microcefalia em pouco tempo, expandiu sua cobertura de exames diagnósticos
complexos e centros de reabilitação, mas tem o desafio de garantir que os
profissionais de saúde tenham acesso a ferramentas de diagnóstico e terapêuticas,
além de treinamento adequado para atender os casos de síndrome congênita do Zika
(PNUD, 2017).
Estudos em animais têm sugerido que a presença de imunidade ao vírus da
dengue resulta no aumento da replicação do ZIKV em células trofoblásticas (Brown et
al., 2019). No Brasil, os arbovírus de maior circulação são DENV, CHIKV e ZIKV.
78
Porém, vale ressaltar a presença endêmica do vírus da febre amarela e de outros
arbovírus com potencial de disseminação no país (Lopes et al., 2014), como o vírus
Mayaro (MAYV), do gênero Alphavirus e família Togaviridae, e o vírus Oropouche
(OROV), do gênero Orthobunyavirus e família Bunyaviridae, frequentemente
identificados na região Amazônica em pacientes com quadros febris inespecíficos ou
com comprometimento neurológico. Outro arbovírus que tem sido isolado em
humanos no Brasil é o vírus da encefalite de Saint Louis e Nilo Ocidental do
gênero Flavivirus e família Flaviviridae, além do vírus da Encefalite Venezuelana,
todos potencialmente associados a quadros graves, com risco de futuras epidemias
(Donalisio et al., 2017).
Os surtos de doenças virais, além de terem consequências potencialmente
graves para a saúde, podem devastar social e economicamente as comunidades. Em
estudo de 121 gestantes com rash cutâneo no Rio de Janeiro no período de 2015 a
2018, o ZIKV foi detectado em 45 casos (37,2%), chikungunya em 33 (27,3%) e
dengue em um (0,8%). Semelhança dos sintomas clínicos foi observada em todos os
grupos; no entanto, 84,8% dos pacientes com chikungunya apresentaram artralgia.
Considerando gestantes infectadas por arbovírus e outras infecções, 41% residiam
em favelas urbanas, principalmente em Niterói. Suas conclusões foram a circulação
simultânea de arbovírus e outros agentes responsáveis por infecções congênitas
como citomegalovírus, listeria, sífilis e toxoplasmose; no entanto, não identificaram co-
infecções entre os arbovírus. Enfatizando a importância do pré-natal adequado para
fornecer orientação para um diagnóstico oportuno na presença de
sintomatologia/suspeita de arbovirose (Carvalho et al., 2019).
Esforços para combater os vírus transmitidos por mosquitos precisam ser
integrados. Dado o enorme custo combinado de combater essas doenças, a relação
custo-benefício será vantajosa para os governos que investem em estratégias de
longo prazo para controle de mosquitos. Trabalhos devem ser feitos para detectar,
prevenir e monitorar múltiplos vírus transmitidos por mosquitos, na tentativa de
prevenir futuras epidemias. A maioria das intervenções de prevenção se concentra
em ampliar as estratégias de controle de vetores já em uso para outros vírus
transmitidos por mosquitos. Estas incluem o envolvimento das comunidades para
eliminar criadouros de mosquitos nos bairros, fumigação em locais específicos e
mensagens de comunicação de risco (PNUD, 2017).
79
O simpósio Worldwide Network Resistent Insecticide (WIN) forneceu uma visão
geral dos métodos alternativos atualmente em desenvolvimento para o controle de
vetores de arbovírus (Corbel et al., 2016). Um método emergente mostrando
resultados impressionantes para impedir a propagação de arbovírus é o uso do gênero
bacteriano Wolbachia para eliminar o mosquito Aedes aegypti (supressão da
população de mosquitos) ou restringir a infecção por arbovírus (ou seja, a substituição
da população de mosquitos) (Mains et al., 2016). Foi demonstrado que a co-infecção
do mosquito com a bactéria endossimbiótica Wolbachia, naturalmente presente em
até 40% de todos os artrópodes (Zug et al., 2012), é capaz de bloquear a transmissão
de muitos patógenos humanos em mosquitos, como CHIKV, DENV, ZIKV e o
Plasmodium (Moreira et al., 2009; Shultz et al., 2018). Esses métodos mostram limites
de eficácia, além de questões éticas a serem resolvidas, de forma a integrar um
manejo de controle de vetores sustentável, efetivo, baseado na comunidade e
adaptado localmente para reduzir a carga de doenças transmitidas pelo Aedes (Roiz
et al., 2018).
Serviços integrados de saúde centrados no paciente, que forneçam diagnóstico
precoce, tratamento e acompanhamento das pessoas afetadas pelo Zika, devem ser
fornecidos pelos governos. Além disso, é necessário financiamento de serviços de
apoio e de reabilitação psicossocial para as famílias que tem filhos com síndrome
congênita do Zika. Estas ações devem ser complementadas por políticas que apoiem
a saúde e promovam os direitos sexuais e reprodutivos das mulheres, tendo como
alvo as comunidades afetadas, o que inclui orientação atualizada e clara sobre o Zika,
bem como acesso a serviços de planejamento familiar e diagnóstico pré-natal a todas
as mulheres, para que qualquer resposta ao Zika seja eficaz (PNUD, 2017).
Nesse contexto, a investigação epidemiológica e a suspeita de outros arbovírus
devem fazer parte das rotinas da vigilância epidemiológica e das preocupações da
saúde pública nacional para prever novas emergências epidemiológicas. Por outro
lado, são essenciais os esforços para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de
exames diagnósticos ágeis, sensíveis e com pequena reação cruzada com outras
arboviroses, imunobiológicos específicos e síntese de medicamentos antivirais,
principalmente diante da infecção de gestantes pelo ZIKV (Donalisio et al., 2017).
O Zika é um alerta de que todos os países continuam vulneráveis a doenças
infecciosas emergentes e de que uma doença capaz de afetar principalmente as
80
populações mais pobres tem amplas implicações sociais e econômicas para
comunidades inteiras. Pesquisas futuras devem ser realizadas para incluir uma melhor
investigação de casos e resultados com acompanhamento de longo prazo de mães e
bebês expostos, bem como a análise do papel da infecção assintomática e seu risco
de transmissão, especialmente na gravidez, e o desenvolvimento de medicamentos
antivirais e vacina para prevenir a infecção, transmissão vertical e outras epidemias.
Esse estudo mostrou que a placenta é um sítio de persistência viral do Zika
vírus, sugerindo que através de células imunes contidas nesse órgão é possível o
contágio do feto que, poderá ou não desenvolver a síndrome Zika Congênita. Também
mostrou que a coleta e armazenamento sistematizado e padronizado da mesma
interfere diretamente no diagnóstico do ZIKV. Sendo assim, sugere-se que a coleta
de pelo menos uma amostra que inclua a vilosidade coriônica, região que apresentou
maior positividade pela técnica de RT-qPCR, salientando-se o armazenamento
adequado, seja preconizado em parturientes que tenham suspeita de arboviroses
durante a gestação. Para isso, serão necessários treinamento de pessoal, material e
protocolos de armazenamento e transporte que reduzam a probabilidade de
comprometimento do material biológico para posterior análise.
81
6 CONCLUSÕES
1- Foram identificados 32 estudos com descrição de avaliação placentária em
humanos pós infecção por ZIKV na gestação. Os achados patológicos placentários
são, em sua maioria, leves e inespecíficos, possivelmente com um papel importante
de células de Hofbauer, dentro das vilosidades.
2- O ZIKV pode infectar diferentes regiões da placenta como cordão umbilical,
membrana amniótica, placa coriônica, vilosidade coriônica e placa basal, mostrando
que a coleta sistematizada e armazenamento adequado do tecido placentário é
fundamental para o diagnóstico de ZIKV e que este tecido pode ser um local para a
persistência viral durante a gravidez.
82
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89
ANEXOS
Anexo 1- Protocolo assistencial do Ministério da Saúde para diagnóstico por
RT-PCR
90
Anexo 2- Protocolo de Coleta de Placentas
Objetivo: Realizar coleta sistemática de placenta para incorporação ao BIOBANCO
institucional do CAISM.
Serão coletadas placentas previamente selecionadas, com TCLE BIOBANCO
assinado. A placenta deverá ser mantida em geladeira até a coleta (a equipe da
enfermagem será responsável pela identificação do material e armazenamento em
geladeira, no expurgo do Centro Obstétrico). Conforme necessidade e orientação da
equipe médica assistencial, a placenta poderá ser encaminhada para exame
anátomo-patológico após coleta do BIOBANCO (para tanto, deve ser colocada
novamente em geladeira, com recado para que a Enfermagem realize o
armazenamento em formaldeído).
A coleta para BIOBANCO é realizada em sala própria, equipada, dentro do centro
obstétrico do CAISM.
Material necessário
- Luvas de procedimento, cuba rim ou bandeja de placenta, soro fisiológico estéril ou
PBS 1x
- 6 cassetes (2 para MB, 1 para VC, 1 para MA, 1 para PC, 1 para Cordão umbilical)
- 10 criotubos (2 para MB, 2 para VC, 2 para MA, 2 para PC, 2 para o Cordão umbilical)
- 1 bisturi (ou tesoura pós esterilização- lembrando que é importante evitar a
contaminação entre as diferentes áreas de coleta)
- 1 pinça estéril
- Papel filtro ou campo estéril para colocação da placenta no momento da coleta (sobre
tábua acrílica)
- 1 frasco com formalina tamponada a 10%
- 1 galão de nitrogênio líquido (sempre verificar o volume de nitrogênio disponível
antes de iniciar o procedimento)
Cassete Criotubo Bisturi Pinça
91
Papel Filtro Formalina Galão de Nitrogênio
Preparação dos criotubos
- Utilizar criotubos brancos. Cada criotubo deve ser identificado conforme a seguinte
legenda, representando o material a ser coletado:
- MB – Membrana Basal
- MA – Membrana Amniótica
- PC – Placa Coriônica
- VC – Vilosidade Coriônica
- CU – Cordão Umbilical
- Além disso, cada criotubo deve ser identificado com o HC da paciente. Ambas as
anotações devem ser feitas com letra legível, com caneta permanente ou lápis 2,
abaixo do código de barras próprio do criotubo ou do código numeral impresso no
criotubo.
- Realizadas as devidas identificações nos criotubos, deve-se anotar no caderno de
registros os números que aparecem logo abaixo do código de barras seguido de qual
tecido esse criotubo irá conter dentro dele, por exemplo:
92
MB/MA/VC/PC/cordão: 624
Observação: Para realizar a identificação dos criotubos deve-se utilizar luva de
procedimentos, evitando qualquer contaminação.
Preparação dos cassetes
- Todos os cassetes devem ser identificados como placenta em sua face lateral
direita. Cada cassete deve ser identificado em sua face lateral esquerda conforme a
seguinte legenda:
- MB – Membrana Basal
- MA – Membrana Amniótica
- PC – Placa Coriônica
- VC – Vilosidade Coriônica
- CU – Cordão Umbilical
(lado direito) (lado esquerdo)
- Além disso, cada cassete deve ser marcado na sua face anterior com o HC da
paciente. Todas as marcações devem ser realizadas preferencialmente com lápis
preto.
93
- Após colocar o tecido coletado no interior de cada cassete, deve ser adicionado logo
acima deste material uma etiqueta de papel devidamente identificada, conforme
legenda acima, e o HC da paciente.
Preparação da Bancada
- A bancada deve ser inicialmente higienizada; após a higienização da mesma, deve-
se dispor a tábua acrílica e cobrir toda a sua extensão com papel-filtro. Devem ser
separados a pinça e o bisturi, e os cassetes e criotubos previamente preparados
devem ser dispostos à direita da tábua. Recomenda-se que os criotubos e cassetes
já estejam abertos neste momento, facilitando o passo seguinte da coleta.
Preparação da Placenta
- O tempo máximo entre a coleta das amostras para o biobanco e o parto não pode
ser superior a 12 horas. Neste intervalo, a placenta deverá ser armazenada em saco
plástico (não-estéril) em geladeira comum, sem qualquer outro material (formol, soro
fisiológico, etc).
- A placenta deve ser inicialmente lavada com soro fisiológico estéril ou PBS 1x na pia
da bancada, no interior de uma cuba rim ou bandeja de placenta, buscando-se limpar
resíduos sólidos ou coágulos visíveis.
- Em sequência, a placenta deve ser pesada na balança de precisão localizada no
laboratório de coleta. O peso em gramas da placenta deve ser anotado no caderno de
registros e na ficha de coleta de dados.
94
Registro fotográfico
- Antes de se iniciar a coleta, devem ser realizados registros fotográficos da face
materna e da face fetal da placenta. A face a ser fotografada deve ser totalmente
descoberta de membranas e ser fotografada ao lado de régua. O arquivo fotográfico
deve ser armazenado.
Coleta das amostras de tecido placentário
- A coleta das amostras de tecido placentário deve ser sistematizadas na seguinte
ordem: membrana basal, vilosidade coriônica, membrana amniótica, placa coriônica e
cordão umbilical. A escolha do local de coleta de cada um destes tecidos, para garantir
representatividade, tem por base a inserção do cordão. Nas placentas cujo cordão se
insere centralmente, deve-se imaginar três círculos concêntricos (um maior nas
bordas placentárias, um menor marginal ao cordão e um terceiro intermediário) e os
sítios de coleta serão localizados no círculo intermediário. Serão escolhidos quatro
pontos no círculo intermediário, equidistantes entre si, evitando áreas de alteração
macroscópica grosseira. Nas placentas cuja inserção do cordão seja periférica, deve-
se imaginar 3 semi-círculos concêntricos partindo do cordão, e no círculo intermediário
vão se realizar as coletas. As áreas onde vão se realizar as coletas não devem conter
anomalias macroscópicas, como áreas de descolamento ou de calcificação extensa.
95
INSERÇÃO CENTRAL
INSERÇÃO PERIFÉRICA
Membrana basal: corresponde à face materna da placenta. Nos pontos escolhidos
para a coleta, deve-se realizar incisão com o bisturi com 0,5cm de profundidade,
buscando-se evitar contaminação com vilosidades. A partir disso, obtém-se quatro
amostras de aproximadamente 1x1 cm, sendo duas dessas amostras depositadas em
um cassete e as outras duas num segundo cassete, tendo ambos cassetes sido
previamente identificados; deve-se atentar para o fato de posicionar a face mais
externa (visivelmente mais brilhante), para baixo (garantindo que, no bloco, a primeira
região a ser seccionada seja a MB). Na sequência, estes cassetes devem ser
adequadamente fechados e armazenados no frasco com formalina.
- Em seguida, deve-se coletar mais um fragmento de cada local onde houve a coleta
da amostra anterior, respeitando dimensões de aprox. 0,5x0,5cm. Após essa coleta,
cada fragmento deve ser subdividido em duas amostras, obtendo-se assim, oito
fragmentos, dois de cada local onde ocorreu a incisão. Essas amostras devem então
serem divididas entre os dois criotubos referentes à membrana basal, ou seja, quatro
fragmentos correspondentes a cada região para cada criotubo. Estes devem então
serem fechados com suas respectivas tampas e colocados no galão de nitrogênio
líquido.
96
- Vilosidade coriônica: corresponde ao tecido subjacente à membrana basal. Coletar
nas mesmas regiões da coleta anterior, porém na camada mais inferior. Deve-se
coletar um fragmento de 1x1 cm de cada região, desprezar o tecido mais superficial,
que pode conter traços da membrana basal, dispô-los no cassete previamente
identificado e em seguida armazená-lo no frasco com formalina. Sendo assim, os
quatro fragmentos correspondentes a vilosidade coriônica serão armazenados num
único cassete.
- Em seguida, deve-se coletar quatro fragmentos de aprox. 0,5x0,5cm nos locais onde
já se previamente incisou a placenta para a coleta da membrana basal, na camada
mais inferior, desprezando o tecido mais superficial. Tais fragmentos também devem
ser divididos em duas amostras e tais amostras devem ser divididas entre os dois
criotubos (de preferência separadamente, em paredes opostas do frasco) referentes
às vilosidades coriônicas. Os criotubos devem ser então fechados com suas
respectivas tampas e colocados no galão de nitrogênio líquido.
- Membrana amniótica: corresponde à membrana fina e transparente que reveste o
útero. É um tecido frágil e de fácil obtenção. Deve-se coletar quatro fragmentos de
0,5x0,5 cm, dispô-los no cassete previamente identificado e em seguida armazená-
los no frasco com formalina.
- Em seguida, devem-se coletar quatro fragmentos de aprox. 0,5x0,5 cm, em cada
local previamente determinado. Tais fragmentos também devem ser divididos em
duas amostras e tais amostras devem ser divididas entre os dois criotubos referentes
97
à membrana amniótica. Os criotubos devem ser então fechados com suas respectivas
tampas e colocados no galão de nitrogênio líquido.
- Placa coriônica: corresponde à face fetal da placenta. Para a aquisição deste tecido,
as amostras devem ser coletadas também conforme o esquema dos círculos
previamente apresentado. Devem-se evitar vasos sanguíneos calibrosos que estejam
visíveis, privilegiando áreas livres. Deve-se coletar um fragmento de 1x1 cm das
quatro regiões previamente selecionadas; para essa amostra em especial, é preciso
dissecar a membrana e coletar o tecido abaixo, com cerca de 0,5 cm de espessura,
dispô-lo no cassete previamente identificado e em seguida armazená-lo no frasco com
formalina. Neste caso, também num mesmo cassete deve ser colocado os quatro
fragmentos.
- Em seguida, devem-se coletar quatro fragmentos de aprox. 0,5x0,5 cm, em cada
extremidade do círculo intermediário. Tais fragmentos também devem ser divididos
em duas amostras e tais amostras devem ser divididas entre os dois criotubos
referentes às placas coriônicas. Os criotubos devem ser então fechados com suas
respectivas tampas e colocados no galão de nitrogênio líquido.
- Cordão umbilical: a finalização da coleta ocorre com o cordão umbilical. Deve-se
escolher um fragmento do mesmo, no sentido transversal de aprox. 0,5x0,5cm, o qual
será colocado no cassete e armazenado na formalina.
- Dois outros fragmentos de 0,5x0,5cm devem ser obtidos e seccionados em duas
amostras, para serem armazenados nos dois criotubos, que devem ser então
fechados com suas respectivas tampas e colocados no galão de nitrogênio líquido.
98
Armazenamento das amostras
- As amostras, após obtidas, devem ser rapidamente armazenadas no frasco com
formalina tamponada ou no galão de nitrogênio líquido. A formalina tamponada é
cáustica e devem ser usadas luvas para evitar contato acidental. O nitrogênio líquido
está em extrema-baixa temperatura (aprox. -80oC), e o contato acidental com o
mesmo pode causar queimaduras graves na pele. Ambos os recipientes devem
permanecer fechados, abrindo-os apenas quando se for realizar o depósito das
amostras.
Estimativa do volume placentário
A medida do volume da placenta é a última etapa do processo de coleta do material
biológico; para isso, preenche-se um recipiente com água até a iminência de
transbordar. Em seguida, coloca-se esse recipiente já com a água num outro
recipiente, que seja maior que aquele. Após essa sequência, adiciona-se a placenta
com cuidado ao recipiente com água, de modo que apenas o volume que a placenta
ocupe no local seja deslocado. Coleta-se então esse volume de líquido deslocado,
que corresponderá ao volume da placenta, medindo-se com um frasco. Abaixo há uma
foto ilustrativa do material utilizado para realizar esse procedimento.
99
Limpeza e descarte do material utilizado
Após terminado todo o processo, a placenta deverá ser colocada num saco plástico
com formol e enviada para análise histopatológica. O papel filtro e as luvas utilizadas
durante a sessão devem ser desprezadas como lixo infectante. Quanto ao bisturi e a
pinça estéril, estes deverão ser colocados no lixo de materiais infectantes, o mesmo
da foto ilustrativa logo abaixo.
100
Anexo 3- TCLE- Biobanco
101
102
Anexo 4- Parecer Consubstanciado do CEP projeto Arboviroses
103
104
105
106
107
108
109
Anexo 5- TCLE- Projeto Arboviroses
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – TCLE Gestante com Suspeita de Arbovirose
ARBOVIROSES EM GESTANTES E CRIANÇAS: AVALIAÇÃO CLÍNICO-LABORATORIAL
[PROJETO AGC-ACL] Pesquisador responsável: Prof.a Dra. Eliana Amaral Telefone para contato: 19-35219304 Número do CAAE: 64253416.9.0000.5404 Asenhoraestásendoconvidadaaparticipardeumapesquisa,comovoluntáriadogrupodepacientes,podendoserportadoradeumaarbovirose.Apósseresclarecidasobreas informaçõesaseguir,nocasodeaceitarfazerpartedoestudo,assineaofinaldestedocumento,queestáemduasvias.Umadelasésuaeaoutradopesquisadorresponsável.
Por favor, leiacomatençãoecalma,aproveitandoparaesclarecer suasdúvidas.Sehouverperguntas antes oumesmo depois de assiná-lo, você poderá esclarecê-las com o pesquisador. Sepreferir,podelevaresteTermoparacasaeconsultarseusfamiliaresououtraspessoasantesdedecidirparticipar.
Nãohaveránenhumtipodepenalizaçãoouprejuízosevocênãoaceitarparticiparouretirarsuaautorizaçãoemqualquermomento. Justificativa e objetivos: Nosúltimosanosmuitaspessoas tiveram infecçõescausadaspelovírusdaDengue (DENV).Maisrecentemente,doisoutrosvírusdemesmogrupodovírusdadengue(arbovírus),passaramacausardoençasnoBrasil.SãoelesosvírusChikungunya(CHIKV)eovírusZika(ZIKV).Esseúltimotemsidoassociadocomoaumentodonúmerodecasosdeumaparalisiaprogressivadosmúsculos(doençadeGuillainBarré)ecomadiminuiçãodocérebrodebebês(microcefalia)podendocausarproblemaspermanentesparaascrianças.
Esse estudo buscará verificar se você tem infecção por algum desses vírus e, se houver, quais os problemas que ele pode vir a causar. Para isso, caso você concorde em participar desse estudo, os pesquisadores farão perguntas a respeito dos seus problemas de saúde e de seus familiares. Procedimentos:
Para participar do estudo, é necessária sua permissão para colhermos amostras de sangue de uma veia do braço (10 ml), o equivalente a duas colheres de sopa, antes do parto e no parto. A coleta de sangue para a realização de exames laboratoriais faz parte da rotina de investigação de qualquer suspeita de infecção e de situações como essa, segundo orientação do Ministério da Saúde. Os exames do estudo serão utilizados para confirmação de infecção por arbovírus (Dengue, Chikungunya e Zika), descartar outras infecções similares e para medir a inflamação causada por eles.
No momento da suspeita de arbovirose, quando a você procurar o serviço pela “vermelhidão” no seu corpo, além dos exames de sangue, precisaremos coletar amostra do conteúdo da vagina. Ainda, pediremos que você forneça 2 amostras de urina de 10mL no momento de suspeita da doença, para estudos recomendados pelo Ministério da Saúde e para este projeto, além de uma amostra das suas fezes.
110
Após o parto, serão coletadas quatro amostras da placenta (1 cm3 cada), que é uma recomendação também do Ministério da Saúde para gestantes com suspeita de infecção por Zika vírus. Isso não interfere com outros exames que sejam necessários para estudar a placenta. Também colheremos 20 mL sangue do cordão umbilical.
Os dados de seu prontuário serão consultados e utilizados. As informações desta pesquisa serão confidencias e serão divulgadas apenas em eventos ou publicações científicas, não havendo identificação das mães e dos bebês, a não ser entre os responsáveis pelo estudo, sendo assegurado o sigilo sobre sua participação.
O material genético, extraído tanto do sangue como da placenta de cada paciente, será utilizado para este projeto, com armazenamento em banco de material biológico, para possível utilização em estudos futuros. Desconfortos e riscos:
Os exames são seguros e não costumam causar efeitos colaterais. As coletas de sangue e de urina podem gerar algum desconforto, mas os exames da pesquisa serão colhidos no mesmo momento de punção venosa necessária para as rotinas assistenciais. A coleta do conteúdo da vagina pode gerar o desconforto da colocação de dois cotonetes no interior da vagina, mas será apenas 2 cm além da sua entrada. Benefícios:
Esseestudobuscaráverificarsevocêteveinfecçãoporalgumdessesvíruse,sepositivo,quaisosproblemasquepodemviracausar.Osresultadosfuturosdesteestudopoderãocolaborarparaacompreensãodadoençaepossíveltransmissãoparaosbebês.
Serãogarantidas,àsparticipantes,respostasaquaisquerperguntas,emqualquermomentoda pesquisa, e esclarecimento de qualquer dúvida acerca dos assuntos relacionados com estapesquisa. Acompanhamento e assistência: Esseestudobuscaráverificarsevocêteminfecçãoporalgumdessesvíruse,setiver,quaisosproblemasqueelepodeviracausar.Para isso,casovocêconcordeemparticipardesseestudo,ospesquisadoresfarãoperguntasarespeitodosseusproblemasdesaúdeedeseusfamiliares.
Quando você procurar o serviço na suspeita de arbovirose, serão coletados os exames jácitados e você será encaminhada para acompanhamento em Ambulatório específico de pré-nataldesteserviço.Seráfeitotodoacompanhamentoobstétrico,incluindoexamesdeecografiafrequentes.Nomomentodoparto,serácoletadomaterialplacentárioedesanguedecordãoumbilical.Osdadosdeprontuárioserãoconsultadoseutilizados. Sigilo e privacidade: Asinformaçõesdestapesquisaserãoconfidenciaseserãodivulgadasapenasemeventosoupublicações científicas, não havendo identificação das mães e dos bebês, a não ser entre osresponsáveispeloestudo,sendoasseguradoosigilosobresuaparticipação. Ressarcimento e Indenização:
A participante do estudo não receberá qualquer benefício ou valor em dinheiro. Este estudo será feito durante a rotina de atendimento hospitalar da participante. Armazenamento de MATERIAL BIOLÓGICO:
Omaterialgenético,extraídotantodosanguecomodaplacentadecadapaciente,seráutilizado para este projeto, com armazenamento em banco de material biológico, parapossívelutilizaçãoemestudosfuturos.
111
Toda nova pesquisa a ser realizada com o material armazenado será submetida para aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) e, quando for o caso, da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP).
Para este armazenamento, haverá aplicação de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ou Termo de Assentimento, para menores de idade), específico do serviço (BIOBANCO CAISM). Liberdadedeabandonarapesquisasemprejuízo:
Euentendiqueaparticipaçãonesteprojetodepesquisaévoluntáriaequeeupossorecusarouretirarmeuconsentimento,aqualquermomento(incluindosobreaamostradesangue),semcomprometeroscuidadosmédicosquereceboourecebereinofuturo.Contato:
Emcasodedúvidassobreapesquisa,vocêpoderáentraremcontatocomapesquisadora:ElianaAmaral–DepartamentodeTocoginecologia/ÁreadeObstetrícia–UNICAMPFone:(19)35219304ouemail:[email protected]
Emcasodedenúnciasoureclamaçõessobresuaparticipaçãoesobrequestõeséticasdoestudo,vocêpoderáentraremcontatocomasecretariadoComitêdeÉticaemPesquisa(CEP)daUNICAMPdas08:30hsàs11:30hsedas13:00hsas17:00hsnaRua:TessáliaVieiradeCamargo,126;CEP13083-887Campinas–SP;telefone(19)3521-8936ou(19)3521-7187;e-mail:[email protected].
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO:
Após ter recebido esclarecimentos sobre a natureza da pesquisa, seus objetivos, métodos,benefícios previstos, potenciais riscos e o incômodo que esta possa acarretar, aceito participar edeclaro estar recebendo uma via original deste documento assinada pelo pesquisador e pormim,tendotodasasfolhaspornósrubricadas:
Nomedo(a)participante:________________________________________________________
Contatotelefônico:_____________________________________________________________
e-mail(opcional):______________________________________________________________
_______________________________________________________Data:____/_____/______.(AssinaturadoparticipanteounomeeassinaturadoseuRESPONSÁVELLEGAL) ResponsabilidadedoPesquisador:
Asseguro tercumpridoasexigênciasda resolução466/2012CNS/MSecomplementaresnaelaboraçãodoprotocoloenaobtençãodesteTermodeConsentimentoLivreeEsclarecido.Asseguro,também,terexplicadoefornecidoumaviadestedocumentoaoparticipante.InformoqueoestudofoiaprovadopeloCEPperanteoqualoprojetofoiapresentado.Comprometo-meautilizaromaterialeosdadosobtidosnestapesquisaexclusivamenteparaasfinalidadesprevistasnestedocumentoouconformeoconsentimentodadopeloparticipante.
______________________________________________________Data:____/_____/______.
(Assinaturadopesquisador)
112
Anexo 6- Parecer Consubstanciado do CEP Biobanco
113
114
115
116
Anexo 7- Protocolo assistencial do CAISM-UNICAMP, para casos suspeitos de
arboviroses
117
Anexo 8- Confirmação de submissão- Artigo 1
118
Anexo 9- Confirmação de submissão- Artigo 2
![Zika VirusPacific Ocean were infected with ZIKV in the outbreak in 2007.[4] [1] This outbreak of Zika virus, in Yap Island, was the first outbreak of the ZIKV disease outside Africa](https://static.fdocuments.us/doc/165x107/60b2ac7f6cc1d3743371f908/zika-virus-pacific-ocean-were-infected-with-zikv-in-the-outbreak-in-20074-1.jpg)