Caracterización inmunológica de péptidos sintéticos de ... · péptidos medió la producción...
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Caracterización inmunológica de péptidos sintéticos de proteínas de superficie de Mycobacterium tuberculosis H37Rv Immunologic caracterization of Mycobacterium tuberculosis H37Rv surface protein-derived peptides Resumen En este trabajo, se realizó la evaluación antigénica de péptidos de las proteínas Rv1980c y Rv0679c con capacidad de unión específica a receptores sobre macrófagos, e inhibición de la invasión de Mycobacterium tuberculosis. Con este propósito, se evaluó el efecto del pool de péptidos sobre la activación de células dendríticas, observando un aumento en la expresión de CD83, hecho que podría estar relacionado con procesos de maduración y por tanto de modulación de la respuesta inmune. Adicionalmente, se evaluó in vitro la activación de linfocitos, mediada por el pool de péptidos, en personas infectadas y no infectadas con M. tuberculosis. Los péptidos fueron capaces de activar células T CD4+ vírgenes y de memoria efectora, y células T CD8+ de memoria efectora. El pool de péptidos medió la producción de las citoquinas inflamatorias IL-2 e INFγ, las cuales han sido reportadas previamente como claves en el establecimiento de una respuesta protectiva contra la tuberculosis. Palabras clave: Tuberculosis, péptido de alta actividad de unión, antigenicidad, vacuna, respuesta inmune. Abstract In the present study, the antigenicity of peptides derived from the Mycobacterium tuberculosis Rv1980c and Rv0679c proteins was assessed. These peptides display high specific binding activity to macrophage receptors and inhibit mycobacterial entry to these cells. The effect of the peptide pool on dendritic cell activation was thus studied. An increase in CD83 expression was observed, which could be related to maturation processes and modulation of the immune response. Moreover, the effect of the peptide pool in lymphocyte activation in vitro was evaluated in M. tuberculosis infected and non- infected individuals. Peptides were able to activate naive and effector memory CD4+ T cells, as well as effector memory CD8+ T cells. The peptide pool induced inflammatory cytokine production of IL-2 and INF-γ, both of which have been previously reported as key factors in establishing a protective immune response against tuberculosis. Key words: Tuberculosis, high activity binding peptides, antigenicity, vaccine, immune response.
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Caracterización inmunológica de péptidos sintéticos de proteínas de superficie de
Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Immunologic caracterization of Mycobacterium tuberculosis H37Rv surface protein-derived
peptides Resumen En este trabajo, se realizó la evaluación antigénica de péptidos de las proteínas Rv1980c y Rv0679c con capacidad de unión específica a receptores sobre macrófagos, e inhibición de la invasión de Mycobacterium tuberculosis. Con este propósito, se evaluó el efecto del pool de péptidos sobre la activación de células dendríticas, observando un aumento en la expresión de CD83, hecho que podría estar relacionado con procesos de maduración y por tanto de modulación de la respuesta inmune. Adicionalmente, se evaluó in vitro la activación de linfocitos, mediada por el pool de péptidos, en personas infectadas y no infectadas con M. tuberculosis. Los péptidos fueron capaces de activar células T CD4+ vírgenes y de memoria efectora, y células T CD8+ de memoria efectora. El pool de péptidos medió la producción de las citoquinas inflamatorias IL-2 e INFγ, las cuales han sido reportadas previamente como claves en el establecimiento de una respuesta protectiva contra la tuberculosis. Palabras clave: Tuberculosis, péptido de alta actividad de unión, antigenicidad, vacuna, respuesta inmune. Abstract In the present study, the antigenicity of peptides derived from the Mycobacterium tuberculosis Rv1980c and Rv0679c proteins was assessed. These peptides display high specific binding activity to macrophage receptors and inhibit mycobacterial entry to these cells. The effect of the peptide pool on dendritic cell activation was thus studied. An increase in CD83 expression was observed, which could be related to maturation processes and modulation of the immune response. Moreover, the effect of the peptide pool in lymphocyte activation in vitro was evaluated in M. tuberculosis infected and non-infected individuals. Peptides were able to activate naive and effector memory CD4+ T cells, as well as effector memory CD8+ T cells. The peptide pool induced inflammatory cytokine production of IL-2 and INF-γ, both of which have been previously reported as key factors in establishing a protective immune response against tuberculosis. Key words: Tuberculosis, high activity binding peptides, antigenicity, vaccine, immune response.
Caracterización inmunológica de péptidos sintéticos de proteínas de superficie de
Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Diana Marcela Rodríguez Calderón
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias
Posgrado Interfacultades en Microbiología Bogotá D.C, Colombia
2012
Caracterización inmunológica de péptidos sintéticos de proteínas de superficie de
Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Diana Marcela Rodríguez Calderón
Trabajo de investigación presentado como requisito para optar al título de: Magíster en Microbiología
Director: Profesor Carlos Alberto Parra L., M.D., Dr.Sc.
Codirector: Profesor Manuel Alfonso Patarroyo G., M.D., Dr.Sc.
Línea de investigación: Evaluación inmunológica de antígenos de Mycobacterium tuberculosis
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias
Posgrado Interfacultades en Microbiología Bogotá D.C, Colombia
2012
NOTA DE ACEPTACIÓN
La presente tesis fue sustentada y aprobada para el grado de Maestría en Microbiología, el 9
de Abril de 2012.
En constancia firman:
orado: Gabriela Delgado PhD.
Departamento de Farmacia
Universidad Nacional de Colombia, Bogotá
Jurado: Arley Gómez PhD.
Facultad de Medicina
Universidad del Rosario. Bogotá
Director: Cárlos A. Parra M.D., Dr.Se.
Facultad de Medicina
Universidaf Nacional de Colombia, Bogotá
Codirector: Manuel A. Patarroyo M.D., Dr.Sc.
Jefe Deptos. Biología Molecular e Inmunología
Fundación Instituto de Inmunología de
Colombia - FIDIC
… así que suelta los cabos, navega lejos del puerto seguro y atrapa los vientos a tu favor… EXPLORA, SUEÑA, DESCUBRE…
Mark Twain
Agradecimientos
Agradezco inmensamente a la vida y a Dios, por permitirme levantar todas las mañanas y cumplir con mi labor. Por enseñarme a ser honesta y congruente con mi propósito de vida. A mis papás, Jorge y Marina, por ser mis consejeros número uno. Por enseñarme a pensar con cabeza fría y a tomar las decisiones con madurez y responsabilidad. Por permitirme sentir su confianza y su respaldo, y por alentarme a creer en mí. A mis hermanas, Caroll y Joanna, por ser un gran ejemplo de vida, inspirarme seguridad, y enseñarme que en lo que se hace día a día, hay que buscar la felicidad. A mis sobrinitos, por representar el futuro y la felicidad!. A Misha, por acompañarme, apoyarme y aportarle tantas cosas lindas a mi vida. A mis amigos: Carolina Vizcaíno porque hemos crecido y aprendido juntas, y a mis amigos que de lejos o de cerca, han sido una grata compañía y un gran respaldo en mi vida!! A la Universidad Nacional y todas las personas, maestros, estudiantes y administrativos, que me enseñaron a cuestionar, a dudar y a soñar. Al Posgrado en Microbiología, muy especialmente a la profesora Martha Fontanilla, por todo el apoyo en el desarrollo de mi maestría, y a Socorro Prieto por su continuo acompañamiento. Al profesor Carlos Parra, por su decidida e incondicional colaboración durante todo el desarrollo del proyecto, por sus enseñanzas, y por darme un grato acercamiento al mundo de la Inmunología. Al Dr. Manuel Alfonso Patarroyo, por todo su tiempo y su inmenso apoyo para que este proyecto pudiera llevarse a cabo, y por su exigencia, que me impulsa a demostrarme que si se quiere, se puede. A David Bernal, gracias infinitas por su tiempo y enorme colaboración en todo el desarrollo de mi tesis. A la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia, por formarme y hacerme una persona más disciplinada y comprometida. A Marisol Ocampo, por sus valiosos aportes y consejos. A Diana Tovar por su tiempo y colaboración y a la bacterióloga del proyecto, Caro López, gracias por toda su colaboración y por su valiosa amistad.
Resumen y Abstract V
Resumen
En este trabajo, se realizó la evaluación antigénica de péptidos de las proteínas Rv1980c y Rv0679c con capacidad de unión específica a receptores sobre macrófagos, e inhibición de la invasión de Mycobacterium tuberculosis. Con este propósito, se evaluó el efecto del pool de péptidos sobre la activación de células dendríticas, observando un aumento en la expresión de CD83, hecho que podría estar relacionado con procesos de maduración y por tanto de modulación de la respuesta inmune. Adicionalmente, se evaluó in vitro la activación de linfocitos, mediada por el pool de péptidos, en personas infectadas y no infectadas con M. tuberculosis. Los péptidos fueron capaces de activar células T CD4+ vírgenes y de memoria efectora, y células T CD8+ de memoria efectora. El pool de péptidos medió la producción de las citoquinas inflamatorias IL-2 e INFγ, las cuales han sido reportadas previamente como claves en el establecimiento de una respuesta protectiva contra la tuberculosis. Palabras clave: Tuberculosis, péptido de alta actividad de unión, antigenicidad, vacuna, respuesta inmune.
Caracterización inmunológica de péptidos sintéticos de proteínas de superficie de Mycobacterium tuberculosis H37Rv VI
Abstract
In the present study, the antigenicity of peptides derived from the Mycobacterium tuberculosis Rv1980c and Rv0679c proteins was assessed. These peptides display high specific binding activity to macrophage receptors and inhibit mycobacterial entry to these cells. The effect of the peptide pool on dendritic cell activation was thus studied. An increase in CD83 expression was observed, which could be related to maturation processes and modulation of the immune response. Moreover, the effect of the peptide pool in lymphocyte activation in vitro was evaluated in M. tuberculosis infected and non-infected individuals. Peptides were able to activate naive and effector memory CD4+ T cells, as well as effector memory CD8+ T cells. The peptide pool induced inflammatory cytokine production of IL-2 and INF-γ, both of which have been previously reported as key factors in establishing a protective immune response against tuberculosis. Key words: Tuberculosis, high activity binding peptides, antigenicity, vaccine, immune response.
Contenido VII
Contenido
Resumen ................................................................................................................................ V
Lista de figuras ..................................................................................................................... XI
Lista de tablas .................................................................................................................... XIII
Lista de abreviaturas .......................................................................................................... XIV
1. Introducción .................................................................................................................... 1
2. Formulación del problema .............................................................................................. 3
3. Estado del arte ................................................................................................................. 5
3.1 Generalidades de la tuberculosis ................................................................................... 5
3.1.1 Situación epidemiológica ....................................................................................... 5
3.1.1.1 Incidencia ......................................................................................................... 5
3.1.1.2 Prevalencia y Mortalidad ................................................................................. 6
3.1.1.3 Tuberculosis multi-resistente y extremadamente resistente a los fármacos. ... 6
3.1.1.4 Cifras en Colombia .......................................................................................... 6
3.1.2 Mycobacterium tuberculosis .................................................................................. 7
3.1.2.1 Características de la envoltura micobacteriana ............................................... 8
3.1.2.2 Proceso de infección ...................................................................................... 10
3.1.2.2.1 Micobacteria y macrófagos ........................................................................ 10
3.1.2.2.2 Formación del granuloma ........................................................................... 11
3.1.2.2.3 Internalización de Mtb mediada por receptores .......................................... 12
3.1.2.2.3.1 Rv1980 ..................................................................................................... 12
3.1.2.2.3.2 Rv0679c ................................................................................................... 13
3.2 Respuesta inmune .................................................................................................. 14
3.2.1 Respuesta inmune adaptativa .......................................................................... 14
Contenido VIII
3.2.1.1 Inmunidad celular .......................................................................................... 15
3.2.1.1.1 Moléculas CD4 y CD8. .............................................................................. 15
3.2.1.1.1.1 Activación de células T CD4+ ................................................................ 15
3.2.1.1.1.3 Activación de células T CD8+ ................................................................ 17
3.2.1.1.2 Memoria de células T ................................................................................. 17
3.2.1.1.2.1 Fenotipo de superficie de células T de memoria ..................................... 17
3.2.1.1.3 Células dendríticas ...................................................................................... 18
3.2.1.1.4 Producción de citoquinas y polarización de la respuesta inmune .............. 19
3.2.2 Respuesta inmune a la tuberculosis ...................................................................... 20
3.2.2.1 Respuesta inmune innata contra la tuberculosis ............................................ 21
3.2.2.2 Respuesta inmune adaptativa contra la tuberculosis ..................................... 21
3.2.2.2.1 Relevancia de las células T en la tuberculosis ............................................ 22
3.2.2.2.2 Respuesta reguladora de células T .............................................................. 23
3.2.2.2.3 Citoquinas relevantes para el control de la tuberculosis ............................. 23
3.2.3 Monocitos, macrófagos y células dendríticas ...................................................... 24
3.3 Métodos diagnósticos para la infección con Mtb ....................................................... 25
4. Objetivos ....................................................................................................................... 27
4.1 Objetivo General ......................................................................................................... 27
4.2 Objetivos Específicos .................................................................................................. 27
5. Hipótesis ........................................................................................................................ 29
6. Metodología .................................................................................................................. 31
6.1 Síntesis de péptidos ..................................................................................................... 31
6.2 Población de estudio ................................................................................................... 32
6.3 Obtención de células mononucleares de sangre periférica ......................................... 32
6.4 Diagnóstico de infección con Mtb .............................................................................. 33
6.5 Cultivo de Mtb ............................................................................................................ 34
6.6 Obtención de lisado de Mtb por sonicación ................................................................ 34
6.7 Activación de monocitos humanos ............................................................................. 35
6.7.1 Separación positiva de monocitos por columna magnética ................................. 35
6.7.2 Inhibición de la invasión a monocitos humanos .................................................. 35
6.7.3 Maduración de células dendríticas ....................................................................... 36
Contenido IX
6.7.3.1 Cuantificación de citoquinas de perfil inflamatorio ...................................... 37
6.7.4 Determinación de muerte celular en monocitos humanos ................................... 38
6.7.4.1 Establecimiento de muerte celular con estaurosporina .................................. 38
6.7.4.2 Determinación del efecto de los HABPs sobre la muerte celular de monocitos
................................................................................................................................... 39
6.8 Activación de linfocitos ......................................................................................... 40
6.8.1 Medición de citoquinas de perfil Th1 y Th2 ........................................................ 41
6.9 Análisis estadístico ...................................................................................................... 41
7. Resultados ..................................................................................................................... 43
7.1 Población de estudio y obtención de PBMCs ............................................................. 43
7.2 Activación de monocitos ............................................................................................. 44
7.2.1 Separación de monocitos por selección positiva .................................................. 44
7.2.2 Inhibición de la invasión a monocitos humanos .................................................. 44
7.2.3 Maduración de células dendríticas ....................................................................... 45
7.2.4 Determinación muerte celular en monocitos humanos ........................................ 49
7.2.4.1 Establecimiento de un control de muerte celular ........................................... 49
7.2.4.1 Efecto de los HABPs sobre la muerte celular ................................................ 51
7.3 Activación de linfocitos .............................................................................................. 53
7.3.1 Análisis de linfocitos T CD4+ .............................................................................. 54
7.3.2 Análisis de linfocitos T CD8+ .............................................................................. 57
7.3.3 Expresión de CD27 .............................................................................................. 58
7.3.4 Perfil de citoquinas Th1-Th2 ................................................................................ 59
8. Discusión ....................................................................................................................... 63
8.1 Población de estudio ................................................................................................... 63
8.2 Capacidad inhibitoria de los HABPs .......................................................................... 64
8.3 Maduración de células dendríticas .............................................................................. 64
8.4 Inducción de muerte celular ........................................................................................ 66
8.5 Activación de linfocitos .............................................................................................. 66
9. Conclusiones y recomendaciones .................................................................................. 77
9.1 Conclusiones ............................................................................................................... 77
9.2 Recomendaciones ....................................................................................................... 78
Contenido X
10. Consideraciones éticas ............................................................................................... 79
11. Anexos ....................................................................................................................... 81
11.1 Consentimiento informado ................................................................................. 81
11.2 Formato de información adicional ......................................................................... 85
11.3 Base de datos voluntarios estudio .......................................................................... 86
11.4 Información adicional ............................................................................................ 87
12. Bibliografía ................................................................................................................ 89
Contenido XI
Lista de figuras
Página Figura 1. Nuevos casos estimados de tuberculosis………………………..………………..6 Figura 2. Tasa de incidencia Colombia……………………………………………………..7 Figura3. Esquema general de la envoltura micobacteriana……………………...……….…9 Figura 4. Moléculas accesorias de los LT…………………………………………………16 Figura 5. Polarización de células T………………………………………………………...20 Figura 6. Esquema general de la metodología utilizada en este estudio…………………..31 Figura 7. Distribución de las muestras en las placas de QTF…………………………….34 Figura 8. Inhibición de la invasión………………………………………………………...44 Figura 9. Porcentajes de Inhibición de la invasión………………………………………..45 Figura 10. Maduración de células dendríticas…………………………………………….47 Figura 11. Expresión de CD83…………………………………………………………….48 Figura 12. Perfil de citoquinas inflamatorias célulasdendríticas…………………………49 Figura 13. Dinámica de apoptosis…………………………………………………………50 Figura 14. Dot plot para apoptosis en monocitos humanos…….…………………………51 Figura 15. Muerte celular de monocitos…………………………………………………..52 Figura 16. Poblaciones de estudio…………………………………………………………54 Figura 17. Porcentajes de INFγ intracelular, en linfocitos CD4+….……………………...56
Contenido XII
Figura 18. Porcentajes de INFγ intracelular, en linfocitos CD8+…………………………58 Figura 19. Porcentajes de expresión de CD27…………………………………………….59 Figura 20. Cuantificación de la producción de citoquinas de perfil Th1– Th2…………...61
Contenido XIII
Lista de tablas
Página Tabla 1. Péptidos sintetizados y usados en el estudio……………………………………..32 Tabla 2. Población de estudio……………………………………………………………..43
Contenido XIV
Lista de abreviaturas
Mtb: Mycobacterium tuberculosis BCG: Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin HABPs: High activity binding peptides INFγ: Interferón γ MDR-TB: Multiresistentes a los fármacos
XDR-TB: Extremadamente resistentes a los fármacos LT: Linfocitos T CR: Receptores del complemento LM: Lipomanán LAM: Lipoarabinomanán IL: Interleuquina PPD: Purified Protein Derivative CMH: Complejo Mayor de Histocompatibilidad CD: Célula dendrítica DC-SIGN: Dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin TNF: Factor de Necrosis Tumoral NK: Natural Killers
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1. Introducción
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por especies pertenecientes al complejo Mycobacterium tuberculosis, que en la actualidad representa una de las mayores causas de enfermedad y muerte en el mundo. Un tercio de la población mundial se encuentra actualmente infectada con M. tuberculosis (Mtb), de los cuales, 5 a 10% llegan a desarrollar la enfermedad activa o tuberculosis primaria. Actualmente, la tuberculosis es controlada con el uso de antibióticos, sin embargo, el panorama socioeconómico de las áreas endémicas, el extenso periodo de tiempo que representa su tratamiento junto a los efectos secundarios causados, y la aparición de casos de tuberculosis multirresistente, hacen de ésta una solución que no representa protección real para la población infectada. Por otra parte, la única vacuna contra la tuberculosis, el Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ofrece solo una protección parcial que oscila entre un 0% y 80%, haciendo urgente y necesaria la creación de una nueva vacuna que ayude a prevenir la aparición de nuevos casos de esta enfermedad. Basados en esto y en el principio de desarrollo de una vacuna sintética subunitaria, multiantigénica, fundada en la identificación de péptidos de alta unión específica (HABPs) a receptores de células blanco, se ha iniciado la evaluación de proteínas de superficie de Mtb H37Rv involucradas en su proceso de infección al macrófago, como principal célula blanco de infección. Con esta base, se ha llevado a cabo la identificación y selección de un gran número de péptidos relevantes, de los que aún se desconoce su papel en la activación del macrófago o en la modulación de la de respuesta inmune. Hasta hoy no ha sido descrito con exactitud el mecanismo inmunológico mediante el cual se genera protección contra la tuberculosis. Sin embargo, se ha observado que la resistencia ante las infecciones micobacterianas está asociada principalmente con la interacción de células T antígeno-específicas y células presentadoras, que mediada por citoquinas específicas, es capaz de generar una respuesta T ayudadora tipo 1 dominada principalmente por la producción de IFN-γ [1]. Conocer el potencial de péptidos de superficie de Mtb en la modulación y activación de macrófagos/monocitos, así como el tipo de respuesta celular que estos puedan inducir, es un paso fundamental en la exploración y desarrollo de diferentes estrategias inmunoprofilácticas y terapéuticas. En este sentido, se propone evaluar los efectos que puedan tener los péptidos sobre monocitos humanos, bien sea activándolos o induciendo apoptosis, así como la generación de una posible respuesta antígeno-específica en individuos sanos infectados y no infectados.
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2. Formulación del problema
La tuberculosis continúa siendo una de las mayores enfermedades infecciosas causantes de muerte en todo el mundo. Para el 2007, se registraron más número de casos de tuberculosis que en cualquier otro momento en la historia, hecho que se relaciona fundamentalmente con la aparición de nuevas cepas resistentes y multi-resistentes a antibióticos y la aparición de nuevos casos de co-infección con VIH [2]. Múltiples esfuerzos para frenar el creciente número de nuevos casos de tuberculosis se concentran especialmente en la búsqueda exhaustiva de métodos diagnósticos tempranos, procedimientos terapéuticos, y diseño de nuevas vacunas que logren superar la efectividad de la actual vacuna BCG. La Fundación Instituto de Inmunología de Colombia, basada en el principio de desarrollo de vacunas multi-epítope, químicamente sintetizadas, ha dirigido parte de sus esfuerzos en el diseño de una vacuna contra la tuberculosis, que mediante el uso de péptidos sintéticos de proteínas de superficie de Mtb, sea capaz de impedir la entrada de este agente patógeno a sus principales células blanco y de generar una respuesta inmune protectiva [3]. De esta forma, se han identificado hasta el momento más de 40 péptidos en cerca de 15 proteínas de superficie de Mtb, que presentan alta especificidad de unión a receptores de macrófagos humanos, y que son capaces de inhibir la invasión de la micobacteria a los mismos [4-6]. Sin embargo, el efecto que tienen estos péptidos sobre la activación y modulación de la respuesta de los macrófagos no ha sido estudiado, al igual que se desconoce por completo su posible naturaleza antigénica. Además del interés principal de nuestro instituto en la selección de péptidos candidatos a ser incluidos en una vacuna, estos péptidos capaces de reconocer sitios funcionales e inhibir la invasión de Mtb a blancos celulares, podrían actuar como agonistas o antagonistas biológicos, siendo útiles para el diseño de alternativas terapéuticas.
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3. Estado del arte
La tuberculosis es una de las enfermedades más antiguas de la humanidad y es hasta nuestro días, una de las enfermedades infecciosas que, pese a la existencia de la actual vacuna BCG y la disponibilidad de tratamientos antibióticos, más número de muertes produce alrededor de todo el mundo [7]. 3.1 Generalidades de la tuberculosis 3.1.1 Situación epidemiológica
3.1.1.1 Incidencia De acuerdo a datos reportados por la Organización Mundial de la Salud, para el año 2009 se estimaron 9,4 millones de casos incidentes de tuberculosis (equivalentes a 137 casos por 100.000 habitantes), de los cuales un aproximado de 3,3 millones de casos (equivalente al 35% del total), correspondieron a mujeres [2]. Los mayores porcentajes de casos incidentes fueron registrados en Asia (55%) y Africa (30%), y los menores porcentajes en las regiones mediterránea oriental (7%), europea (4%), y las Américas (3%). Los países con mayor número de casos reportados fueron en su orden India (1,6-2,4 millones), China (1,1-2,5 millones), Suráfrica (0,40-0,59 millones), Nigeria (0,37-0,55 millones) e Indonesia (0,35-0,52 millones) [2] (Figura 1). De los 9,4 millones de casos incidentes en el 2009, un estimado de 1,0-1,2 millones (11-13%) correspondieron a casos VIH positivos.
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Figura 1. Nuevos casos estimados de tuberculosis, por cada 100.000 pobladores [2].
3.1.1.2 Prevalencia y Mortalidad Con una prevalencia mundial de 14 millones de casos para el 2009 (200 casos por 100.000 habitantes), el número estimado de muertes por tuberculosis fue de 1,3 millones de personas, incluyendo 0,38 millones de mujeres entre los casos incidentes - VIH negativos, y 0,4 millones de muertes entre casos incidentes - VIH positivos. El número de muertes totales entre personas VIH positivas y negativas, está estimado en 26 muertes por cada 100.000 pobladores [2].
3.1.1.3 Tuberculosis multi-resistente y extremadamente resistente a los fármacos.
En relación a la aparición de casos de tuberculosis por cepas multiresistentes (MDR-TB) o extremadamente resistentes a los fármacos (XDR-TB), se registraron 440.000 casos de MRD-TB en 2008, con mayor prevalencia en China, India, Rusia y Suráfrica. Para Julio del 2010, 58 países y territorios, habían reportado al menos un caso de XDR-TB [2].
3.1.1.4 Cifras en Colombia Colombia reporta anualmente más de 11.000 casos nuevos de TB en todas sus formas (no exclusivamente tuberculosis pulmonar). Durante el año 2008, se notificaron 11.342 casos nuevos, para una incidencia de 25,6 casos por 100.000 habitantes (Figura 2), de los cuales 6.815 (60,08%) ocurrieron en hombres y 4.527 en mujeres (39,91%). En cuanto a TB infantil, el informe indica que 719 casos (6,3%) ocurrieron en población menor de 15 años, para una incidencia de 5,47 casos por 100.000 menores de 15 años [8].
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Figura 2. Tasa de incidencia notificada TB en todas las formas. Colombia, 1993 – 2008 [8]. En 2006, según datos oficiales del DANE, la tasa de mortalidad por TB en todas sus formas fue de 2,5 muertes por 100.000 habitantes. En Colombia, la tuberculosis es la cuarta causa de mortalidad por enfermedades transmisibles, lo que equivale al 10% de las muertes por estas patologías [8]. 3.1.2 Mycobacterium tuberculosis Mtb, el agente causal de la tuberculosis, es un bacilo ácido alcohol resistente perteneciente al complejo Mtb, que junto con otras cepas tales como M. africanum, M. canetti, M. bovis y M. microti, constituye un grupo de bacterias patógenas intracelulares. Aun cuando estas especies muestran una estrecha relación en algunos de sus loci, presentan también diferencias importantes en cuanto a su morfología, bioquímica, rango de hospederos y patrones de enfermedad [9]. El bacilo de la tuberculosis fue descrito por primera vez en 1882 por Robert Koch, de donde se deriva su sobrenombre “bacilo de Koch”. Mtb, es una bacteria perteneciente al género Mycobacterium, familia Mycobacteriaceae, orden Actinomicetales [10]. Son bacterias inmóviles y con forma bacilar, cuyo tamaño varía entre 2 µm a 4 µM de longitud, y 0,2 µm a 0,5 µm de grosor. Es una bacteria aerobia obligada, razón por la cual en los casos de tuberculosis, los complejos de Mtb se encuentran concentrados en los lóbulos superiores de los pulmones [11]. Mtb es un parasito facultativo intracelular, usualmente de macrófagos, y tiene un tiempo de generación lento (de 15 a 20 horas). Dos medios son utilizados para su cultivo in vitro: Middlebrook y Lowenstein-Jensen. Las colonias de Mtb son pequeñas y tardan entre 2 a 4 semanas en crecer y poder ser visualizadas. Estas bacterias tienden a agregarse formando grupos, asociados
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con el “factor cuerda”, que fue descrito por Robert Koch, como una factor relacionado con la virulencia en estas bacterias [11]. Su pared celular es muy característica, con un alto contenido lipídico, lo que las hace relativamente impermeables a tinciones básicas. Son clasificadas como bacterias ácido alcohol resistentes por su capacidad de resistir a la decoloración con solventes orgánicos acidificados. Su visualización en el microscopio, se lleva a cabo con la tinción de Ziehl-Neelsen, que utiliza fucsina fenicada, alcohol ácido, y azul de metileno como tinción de contraste [11].
3.1.2.1 Características de la envoltura micobacteriana La compleja envoltura de las micobacterias, consiste en una membrana plasmática, una pared celular y una cápsula, presente en micobacterias patógenas como Mtb y M. leprae [12]. La membrana plasmática de la micobacteria es asimétrica, y está asociada con carbohidratos y fosfolípidos, principalmente fosfatidil-glicerol, difosfatidil-glicerol, fosfatidil-etanolamina y fosfatidil-inositol, con sus respectivos manósidos (PIMs), que se encuentran preferencialmente ubicados en la cara externa de la membrana citoplasmática [13]. Los PIM son precursores biosintéticos del lipomanán (LM) y el lipoarabinomanán (LAM), los cuales son componentes exclusivos de los Actinomycetales [14]. Dentro de este ambiente lipídico de la membrana celular, se encuentra también un importante componente proteico constituido por un amplio grupo de enzimas esenciales, receptores y transportadores [12], además de lipoproteínas, proteínas eventualmente secretadas, enzimas relacionadas con la biogénesis de la pared celular, entre otras [15]. Por otra parte, la pared celular, uno de los componentes más característicos de la micobacteria, está constituida por una red de peptidoglicano unido covalentemente con moléculas de arabinogalactano (un polímero formado por cuatro motivos de arabino- y galactofuranosas), y a su vez, esterificado con ácidos micólicos. Este peptidoglicano está conformado por unidades entrecruzadas de N-acetilglucosamina y ácido N-glicolilmurámico, en lugar del ácido N-acetilmurámico, encontrado típicamente en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas [16]. Otra gran diferencia entre el péptidoglicano de las micobacterias y el de las otras eubacterias, es el tipo y elevado número de enlaces que entrecruzan estas cadenas peptídicas. [16]. Estos ácidos micólicos anclados al peptidoglicano, y los ácidos grasos de cadenas largas unidos al arabinogalactano, han sido propuestos como parte de la organización de una segunda bicapa lipídica externa. Estos ácidos micólicos harían parte de la cara interna de esta segunda bicapa lipídica (Figura 3) [17]. Estudios previos han mostrado por difracción de rayos X, que los ácidos micólicos se encuentran orientados en paralelo entre ellos y de forma perpendicular al plano de la envoltura celular [18].
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Figura 3. Esquema general de la envoltura micobacteriana. Tomado de: [19]. La presencia de esta segunda bicapa lipídica en micobacterias, ha sido corroborada mediante microscopía crio-electrónica [20]. Adicionalmente, el descubrimiento de la porina MspA de M. smegmatis fue la primera evidencia concluyente de la existencia de proteínas funcionales de membrana externa en micobacterias [21]. Pese a la importancia de estas proteínas para la toma de nutrientes, los procesos de secreción y las interacciones hospedero-patógeno en bacterias gram-negativas, aún se conocen muy poco acerca de las proteínas de membrana externa para micobacterias. Las únicas proteínas bien caracterizadas esta membrana, son hasta el momento, la porina MspA de M. smegmatis, y la proteína formadora de canal OmpA de Mtb. Por último, la cápsula corresponde a la capa más externa de la envoltura celular, y consiste en una combinación de diferentes componentes (polisacáridos, proteínas y lípidos) unidos no covalentemente a la pared celular y fácilmente removibles mediante tratamiento mecánico y con detergentes [22]. Siendo ésta la interface entre la bacteria y la célula hospedera, la cápsula y sus constituyentes parecen estar involucrados en la patogenicidad de la bacteria. Algunos estudios han identificado por ejemplo, algunos glicanos que podrían mediar la adhesión y penetración del bacilo a la célula hospedera, enzimas secretadas, y algunos transportadores, que presuntamente estarían relacionados con la multiplicación intracelular de la micobacteria. Por otra parte, la cápsula podría también representar una barrera pasiva para impedir la difusión de macromoléculas hacia los componentes más internos de la envoltura [23]. Este último aspecto, podría representar una limitación para el reconocimiento de proteínas de superficie por parte de anticuerpos específicos, en el cual se basan muchas de las aproximaciones al desarrollo de una vacuna contra la tuberculosis.
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Otros trabajos han demostrado que la cápsula de microorganismos tales como Staphylococcus aureus, es fácilmente penetrada por proteínas de alto peso molecular, como anticuerpos y proteínas del complemento [24, 25]. Diferentes estudios han reportado el reconocimiento de antígenos de superficie de Mtb por parte de anticuerpos específicos. Sin embargo, teniendo en cuenta que gran parte de estos trabajos han sido desarrollados a partir de cepas cultivadas in vitro, en donde la cápsula generalmente está ausente, el reconocimiento de antígenos de superficie durante una infección natural, puede ser altamente variable.
3.1.2.2 Proceso de infección La tuberculosis es transmitida por aerosoles a través de micro-gotas que contienen un pequeño número de bacilos de Mtb (1-5 bacilos) que pasarán desde una persona con la infección pulmonar a otra receptora no infectada. Esta carga de bacilos inhalados alcanzará el espacio alveolar en donde serán internalizados por macrófagos alveolares y empezarán su proceso de replicación. A continuación, se describirán brevemente los eventos que pueden desarrollarse una vez la bacteria ha iniciado esta primera etapa de infección a los macrófagos.
3.1.2.2.1 Micobacteria y macrófagos El rol central del macrófago en la tuberculosis ha sido ampliamente establecido sobre la base de estudios histológicos de la infección en modelos animales [26]. En este punto, los macrófagos actúan como la primera barrera de defensa y, de forma paradójica, como el centro de replicación de la misma, siendo las primeras células que responden a la infección con la micobacteria y quienes posteriormente ayudarán a su diseminación [27]. Ensayos in vitro con macrófagos han revelado que las micobacterias patogénicas pueden usar una gran variedad de receptores que permiten su entrada, lo cual sugiere que la bacteria ha desarrollado un sistema para alcanzar su destino dentro del hospedero. En este sentido, es posible que la micobacteria exprese diferentes factores de acuerdo a las fases de la infección, ya que su habilidad para usar múltiples receptores del hospedero para su internalización, representa una serie de adaptaciones para llevar a cabo su ciclo de infección, modulando así, su destino dentro del hospedero [27]. Ha sido demostrado que Mtb es capaz de inhibir la fusión del fagosoma y el lisosoma como un mecanismo de supervivencia [28]. Este fenómeno ha sido observado en todas las especies patogénicas del complejo Mtb, excepto para M. lepraemurinum, la cual reside predominantemente en el fago-lisosoma durante la infección [29]. Es importante resaltar el hecho de que en macrófagos activados con IFN-γ, la micobacteria se encuentra predominantemente en fagolisosomas en donde puede ser eliminada [30, 31]. Es tal la capacidad de la micobacteria para modular su destino dentro del hospedero, que se ha demostrado que cuando esta bacteria es internalizada por interacción con anticuerpos a través de receptores Fc, la bacteria es capaz de sobrevivir e incluso de replicarse dentro de los fagolisosomas
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[32]. Existe evidencia de que en los granulomas, estructuras de contención de la bacteria, la micobacteria también puede sobrevivir dentro del fagolisosoma [33]. Adicionalmente, las células del linaje de los monocitos y macrófagos, han demostrado someterse a muerte por apoptosis luego de una infección intracelular por ciertos patógenos capaces de sobrevivir dentro del ambiente hostil del fagosoma. Mtb, es un parásito intracelular de macrófagos, en donde la inducción de apoptosis ha sido ampliamente reportada [34]. Algunos estudios han mostrado evidencia de que la apoptosis es desencadenada por la interacción de Mtb con los monocitos y macrófagos. Keane y colaboradores inocularon macrófagos alveolares humanos con Mtb H37Rv (cepa virulenta en ratones) y H37Ra (atenuada). La apoptosis en macrófagos fue observada con ambas cepas, aunque H37Ra fue un inductor más potente que H37Rv. Esta apoptosis fue bloqueada por inhibición de TNFα endógeno, y acelerado por la adición de TNFα, mientras que la viabilidad de macrófagos no infectados no fue afectada por la adición de TNFα [35]. Estos datos indican que el reto con Mtb de alguna forma de alguna forma sensibiliza a los macrófagos alveolares, para que el TNFα autocrino o paracrino medie la apoptosis. Placido y colaboradores demostraron que la apoptosis de los macrófagos derivados de monocitos primarios humanos era inducida por la exposición in vitro con Mtb H37Rv, y que este reto debía hacerse con Mtb viva, ya que la micobacteria muerta no era capaz de inducir apoptosis [36]. La inducción de apoptosis en macrófagos es una respuesta adaptativa que lleva a la eliminación del nicho favorable para la replicación micobacteriana. La producción del TNF se asocia con la producción de óxido nítrico y la activación de la cascada de las caspasas, que actuarán como las moléculas efectoras de la muerte en las células infectadas. Como respuesta adaptativa, la apoptosis tiene ventajas adicionales, pues las células apoptóticas pueden ser específicamente removidas por otras células fagocíticas, evitando la inducción de una reacción inflamatoria. Por el contrario en la necrosis, las células susceptibles liberarían su contenido al medio extracelular, aumentando el daño tisular, la inflamación y permitiendo que las micobacterias infecten a otros macrófagos [37].
3.1.2.2.2 Formación del granuloma Una vez la bacteria ha sido internalizada por macrófagos o por otras células fagocíticas como las células dendríticas, se inicia en el hospedero la formación de un foco de infección a partir del cual se desarrollará un granuloma. Los granulomas son formados en respuesta a patógenos intracelulares persistentes, tales como Mycobacterium, Schistosoma y Brucella. Esta formación granulomatosa consiste en macrófagos, linfocitos T (LT), algunos linfocitos B, células dendríticas, neutrófilos, fibroblastos, y algunos componentes de la matriz extracelular. Aunque el papel de todas las células accesorias en el granuloma aún no ha sido esclarecido, todos estos en conjunto actuarán manteniendo la estructura del granuloma, restringiendo el crecimiento de la bacteria [38, 39]. La formación del granuloma empieza con la agregación de fagocitos que rodean macrófagos individuales infectados [33]. Estos macrófagos activados, sufrirán un aumento en tamaño, número de organelos sub-celulares, plegamientos de la membrana celular, y aumento de su actividad
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fagocítica y microbicida [40]. Un rasgo común entre los granulomas causados por Mycobacterium es la fuerte diferenciación de los macrófagos en células epitelioides que se conectan mediante estructuras membranales con células adyacentes. En muchos casos, muchos macrófagos pueden fusionarse para formar células gigantes [33]. En algunas oportunidades, los granulomas presentan áreas de necrosis caseosa, las cuales son regiones de restos celulares en el núcleo del granuloma [26] rodeadas por células epitelioides y linfocitos. La micobacteria estará entonces localizada dentro de los macrófagos de estos granulomas y en gran número dentro de la región caseosa central. Los granulomas humanos pueden también presentarse fibrosos o calcificados. El desarrollo de estos diferentes tipos de lesión dependerá del tipo de respuesta inmune generada y de la activación de los macrófagos.
3.1.2.2.3 Internalización de Mtb mediada por receptores
Estudios han demostrado que el proceso de invasión de la micobacteria a macrófagos y otras células epiteliales no fagocíticas, puede estar mediado por proteínas de superficie micobacteriana, como es el caso de las proteínas pertenecientes a la familia Mce [41]. En nuestra experiencia, algunas proteínas de superficie de Mtb participan en el proceso de invasión. Dentro de ellas, Rv1980c, Rv0679c, Rv2004, Rv2536, Rv2560, Rv1490, Rv1510, Rv2707 y Rv2969 [4, 6, 42, 43] han sido evaluadas y caracterizadas en términos de su capacidad de unión específica e importancia en la entrada de la micobacteria a células A549 y macrófagos derivados de monocitos U937. La interacción de la célula hospedera con Mtb es mediada por una variedad enorme de receptores, entre estos se encuentran los bien conocidos receptores de manosa, TLRs, receptores de proteína surfactante A y D, receptores scavenger y receptores del complemento (CR) 1, 3 y 4 [44, 45]. Los ligandos que Mtb despliega sobre su superficie, le permiten a la micobacteria unirse a diferentes tipos de receptores y de alguna forma modular su destino en el macrófago, asegurando su supervivencia. La utilización de un receptor sobre la célula hospedera por parte de Mtb, puede estar determinado por el estado de diferenciación o activación de un macrófago. Por ejemplo, durante la diferenciación de los monocitos, CR3 disminuye su expresión, mientras que los niveles de CR4, receptores de manosa y receptores scavenger, entre otros, incrementan. Por otra parte, puede ocurrir cooperación entre los receptores para optimizar la unión e internalización de la bacteria [46]. La cooperación entre CR1 y CR3 ha sido demostrada, así como puede ocurrir también la cooperación con moléculas CD14 [47].
3.1.2.2.3.1 Rv1980
La proteína Rv1980c (Mpt64), hace parte de una familia de proteínas inmunogénicas, altamente conservada en especies del complejo Mycobacterium tuberculosis, y ausente en algunas de las cepas de Mycobacterium bovis BCG [48]. Rv1980c, ha sido objeto de estudios enfocados principalmente en su uso como método diagnóstico temprano para personas asintomáticas con infección activa por Mycobacterium tuberculosis [49, 50]. Este Patch Test for Active Tuberculosis (PTAT), es hasta el momento la alternativa diagnóstica más aceptada, que al parecer genera un tipo
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de hipersensibilidad retardada similar a la observada para el actual test de la tuberculina [51-54]. A diferencia del test de PPD (del inglés Purified Protein Derivative), esta proteína altamente conservada en las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis, presenta muy baja reactividad cruzada con otras especies de micobacterias diferentes a las del complejo [55] y permite detectar solo pacientes con enfermedad activa, ya que se expresa y secreta únicamente en micobacterias en crecimiento [56-58]. En la búsqueda de una vacuna eficiente contra la tuberculosis, Rv1980c ha sido estudiada sola y en combinación con otras proteínas antigénicas secretadas como Ag85 y ESAT-6 [50, 59-62], resultando en la disminución de la infección y el aumento de protección, aunque no ha superado la efectividad de la actual vacuna BCG [63-65]. Para Rv1980c, no se ha esclarecido una función concreta en la micobacteria. Sin embargo, teniendo en cuenta que hace parte de los 11 genes de la región deletada 2 (RD2) de las cepas de Mycobacterium bovis BCG, y que contiene un motivo estructural β-grasp, se sugiere para esta proteína un rol importante en la compleja patogénesis de la micobacteria [54]. El dominio β-grasp ubicado hacia el extremo N-terminal de la proteína, con una hélice α entre los residuos 64 y 82 y una red de 7 hebras β que la envuelven , ha sido reconocido en proteínas altamente antigénicas, superantígenos, proteínas inhibitorias de la quimiotaxis, una proteína G de superficie de Streptococcus que funciona como dominio de unión a IgG, y en algunas adhesinas secretadas, como la proteína de adherencia extracelular (EAP) de Staphylococcus aureus. Este motivo β-grasp, representa un dominio bacteriano que en general está implicado en la unión proteína-proteína y que supone para Rv1980c, con motivo similar, un rol en la interacción de ésta con otras proteínas, haciéndola potencialmente importante para la virulencia micobacteriana [54, 66-70] Mediante ensayos de unión a macrófagos derivados de monocitos (U937), se reportaron tres HABPs, de los cuales 31107 y 31101 (36827) poseen capacidad para inhibir la invasión de la micobacteria [6].
3.1.2.2.3.2 Rv0679c El gen rv0679c en Mtb H37Rv codifica una proteína cuyo peso molecular se está predicho en 16.586 Da. Consiste en 165 aminoácidos los cuales contienen una secuencia señal hacia el N-terminal y un motivo consenso de lipoproteínas [71]. La proteína Rv0679c de Mtb es clasificada como una proteína hipotética de membrana. Su proteína homologa en BCG es una lipoproteína asociada a lipoarabinomanano (LAM), uno de los mayores componentes de la envoltura celular (Figura 3), implicado en respuestas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias [72]. Más recientemente, se reportó mediante un detallado análisis bioinformático, que la proteína se encuentra ubicada en la membrana externa de la micobacteria [17]. En el trabajo realizado por Cifuentes y colaboradores, se evaluó la localización subcelular de la proteína, mostrando que está
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ubicada en la envoltura. En este mismo trabajo fueron reportados dos HABPs (30979 y 30987) con capacidad de inhibición de la invasión de la micobacteria a células U937 [43]. 3.2 Respuesta inmune La función fisiológica del sistema inmunitario en general, consiste en la defensa contra los microorganismos infecciosos o agentes no propios o desconocidos. Esta defensa se genera a través de las primeras reacciones correspondientes a la inmunidad innata, y a las respuestas posteriores a cargo de la inmunidad adaptativa. La inmunidad innata aporta la primera línea de defensa por medio de mecanismos celulares y bioquímicos, capaces de responder con gran rapidez a la infección. Los principales componentes de la inmunidad innata son las barreras físicas y químicas, como los epitelios y las sustancias antimicrobianas producidas en su superficie; las células fagocíticas, como neutrófilos, células dendríticas y macrófagos; los linfocitos citolíticos naturales (Natural Killer cells); las proteínas sanguíneas como los factores del sistema de complemento y otros mediadores de inflamación; y las citoquinas, que regulan y coordinan muchas de las funciones de las células encargadas de la inmunidad innata. Los mecanismos de la inmunidad innata son específicos para estructuras comunes en los grupos microbianos [73]. A diferencia de la inmunidad innata, la inmunidad adaptativa, es estimulada por la exposición a los organismos infecciosos, y su magnitud y capacidad de respuesta crece con las exposiciones sucesivas al mismo antígeno. 3.2.1 Respuesta inmune adaptativa
Todas las respuestas inmunes humorales (mediada por anticuerpos producidos por células B), y celulares dirigidas contra antígenos extraños, poseen las siguientes propiedades fundamentales: Las respuestas inmunes son específicas frente a los distintos antígenos, determinantes o epítopes, cualquiera que sea su naturaleza. Esta especificidad supone que cada linfocito, debe generar receptores de membrana diferentes, capaces de discernir entre antígenos diferentes. Esta propiedad que caracteriza al repertorio de linfocitos se denomina diversidad, y surge como consecuencia que posee la estructura de los lugares de unión antigénica en los receptores linfocíticos [73]. La exposición del sistema inmunitario a un antígeno extraño, debe generar memoria. La exposición repetitiva a un antígeno favorece su capacidad para responder, y esta respuesta debe ser más rápida y amplia que la primera respuesta generada. Los linfocitos sufren expansión clonal tras su exposición a un antígeno. Esto significa que habrá un aumento en la cantidad de células que expresan un mismo receptor frente a un mismo antígeno (clones).
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El sistema inmune es especializado, es decir debe montar una respuesta inmune específica, de acuerdo a la naturaleza de los antígenos. El tipo de repuesta que se desencadene será específica para el antígeno. Todas las respuestas inmunes declinan con el paso del tiempo (homeostasis), con lo que el sistema inmune recupera su estado basal de reposo. El sistema inmune debe presentar tolerancia contra los antígenos propios, de manera que reconozca antígenos extraños, pero no reaccione contra los antígenos propios [73].
3.2.1.1 Inmunidad celular La activación de los LT se produce tras el reconocimiento por parte del receptor de células T (TCR) de la molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) y del péptido presentado por la misma [74]. Una vez activados, los LT producirán de modo preferencial citoquinas o factores citotóxicos, según se trate de LT CD4+ o CD8+. Los LT CD4+ colaborarán en la posterior activación de otras células, tales como NK, T CD8+, linfocitos B o macrófagos. A su vez, los LT CD8+ activados ejercerán su función citotóxica produciendo la muerte a células infectadas [74]. Sin embargo, la unión del antígeno presentado con el TCR no es por si misma suficiente para dar lugar a una respuesta inmune eficaz. Para que esta respuesta se lleve a cabo, se requiere la participación de una serie de moléculas accesorias, cuya función es la de facilitar la interacción entre las células presentadoras y los linfocitos [75]. De esta forma, se establece la sinapsis inmunológica entre LT y la célula presentadora de antígeno. Las principales moléculas que están implicadas en este fenómeno de reconocimiento son el CD4, CD8, CD2, CD3, CD45 y CD28, y sus respectivos ligandos. Todas estas moléculas de adhesión también juegan un importante papel en la transducción de señales y activación de la célula T [75] (Figura 4).
3.2.1.1.1 Moléculas CD4 y CD8. Las moléculas CD4 y CD8 son glicoproteínas cuyos ligandos naturales son las moléculas del CMH de clase II y de clase I respectivamente. Las moléculas CD4 se expresan en la mayoría de los LT cooperadores, mientras que las moléculas CD8 se presentan principalmente, en LT con función citotóxica [73].
3.2.1.1.1.1 Activación de células T CD4+ Durante una respuesta inmunológica, las células presentadoras de antígeno profesionales endocitan el material foráneo (bacterias o virus durante un proceso de infección), el cual procesan y presentan por medio de moléculas del CMH clase II. Las células
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viajan a los nódulos linfáticos, en donde llevan a cabo la presentación del material foráneo a los LT CD4+ que expresen TCRs específicos para ese complejo péptido-CMH [73]. Cuando un linfocito T CD4+ cooperador, encuentra y reconoce el antígeno sobre la célula presentadora, el complejo TCR/CD3 del linfocito se enlaza fuertemente al complejo péptido/CMH de la célula presentadora (Figura 4). El CD4, un co-receptor del complejo TCR, también se une a una porción diferente de la molécula del CMH. Estas interacciones acercan a estas proteínas, permitiendo a las quinasas en las porciones intracelulares de las proteínas TCR, CD3 y CD4, desencadenar cambios bioquímicos al interior del linfocito. Con la participación de una fosfatasa intracelular, unida a CD45, las principales vías bioquímicas de los linfocitos cooperadores son activadas en el citoplasma [74]. De esta forma ocurre la primera señal para la activación del linfocito T CD4+, y se inicia la formación de una sinapsis inmunológica. En esta interacción entre la célula presentadora y el CMH también participan integrinas como la LFA-1 en la superficie del LT, y la ICAM en la célula presentadora (Figura 4) [73].
Figura 4. Moléculas accesorias de los LT. A) Interacción de la célula T CD4+ con una célula presentadora de antígeno. B) Interacción de un LT citotóxico con una célula blanco. Tomado de: [73]. Una vez recibida la primera señal TCR/CD3, el LT virgen debe recibir una segunda señal para llevar a cabo su completa activación. Esta segunda señal actúa como un punto de verificación que evita que el LT responda hacia un antígeno propio. Si esta segunda señal no está presente durante la exposición inicial al antígeno, la célula T entrará en anergia, pues el antígeno será reconocido como propio [76].
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La segunda señal involucra la interacción entre el CD28 en la superficie de los LT CD4+ y las proteínas CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) en las células presentadoras de antígeno profesionales. Estas dos moléculas co-estimuladoras, activan el receptor CD28 [76]. Una vez ambas vías de señalización han sido activadas, los cambios bioquímicos inducidos por la señal 1 son modificados, permitiendo que los linfocitos sean activados. Durante eventos de reinfección o contacto con el mismo antígeno, la segunda señal se vuelve obsoleta y sólo se requerirá de la primera señal para una futura activación, lo que favorece que durante un re-estímulo, la respuesta inmune se produzca más rápidamente [77].
3.2.1.1.1.3 Activación de células T CD8+ Las células infectadas por microorganismos intracelulares (como los virus), presentan antígenos sobre su superficie en el contexto de una molécula de CMH clase I, siendo reconocidos por LT CD8+. El proceso de activación de estos linfocitos es básicamente igual al que ocurre en los CD4+, en donde se requieren dos señales para su activación [73]. La primera señal, se trata de la unión del TCR en la membrana del linfocito, con el CMH clase I sobe la célula presentadora de antígeno. Al igual que ocurre para linfocitos cooperadores, es necesaria la participación de CD3. Como segunda señal es importante la co-estimulación con CD40 presente en la membrana de la célula presentadora, y su lingando (CD40L) sobre el linfocito. Mientras más contactos de CD40 con su ligando ocurran, mayor cantidad de ligandos sobre el linfocito serán producidos, amplificando la señal de activación [74].
3.2.1.1.2 Memoria de células T La memoria inmunológica puede ser definida como la respuesta más rápida y robusta luego de una re-exposición a un mismo antígeno. Las células de memoria expresan un patrón diferente de marcadores sobre su superficie, y son funcionalmente diferentes a células vírgenes [78]. En contraste a las células vírgenes, las células de memoria secretan un amplio rango de citoquinas activadoras de células T. Los requerimientos para la activación de células de memoria para proliferación y producción de citoquinas, no están limitados como para las células vírgenes, siendo la co-estimulación menos importante que cuando éstas se activan [78].
3.2.1.1.2.1 Fenotipo de superficie de células T de memoria CD45 ha sido ampliamente usado para definir las poblaciones de memoria. Las isoformas con el más alto peso molecular definen la población de células vírgenes, mientras que las isoformas de más bajo peso molecular definen el pool de células en donde residen las células T de memoria. Múltiples isoformas de CD45 son expresadas sobre la superficie celular en varias combinaciones. La presencia de cualquiera de las tres isoformas A, B, o C es frecuentemente tomada como evidencia de una población de células vírgenes [79]. De esta forma, las células vírgenes están
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asociadas al fenotipo CD45RA+, CD45RO, mientras que las células CD45RA-, CD45RO+, corresponden a células de memoria. Los anticuerpos dirigidos contra CD45RO, identifican un epítope que está presente, cuando los isotipos A, B y C están ausentes [79]. Los perfiles CD45 pueden cambiar con la activación o el tratamiento con citoquinas, razón por la cual, en algunas oportunidades es recomendable utilizar la marcación simultánea con moléculas de adherencia, como CD62L expresado sobre células vírgenes [80]. CD62L, una L-selectina, es una molécula de adhesión celular (MAC) que se expresa en la superficie celular de linfocitos y monocitos, cuya función es la adhesión inicial de estas células al endotelio vascular. La expresión de CD62L sobre células CD4+ vírgenes es necesaria para su eficiente recirculación y compartimentalización entre la sangre y los nodos linfoides [81]. A partir la expresión de CD62L, los linfocitos se adhieren a las vénulas del epitelio alto. Una subsecuente cascada de señalización empieza con la expresión de CCR7, que genera la migración de los mismos al nodo linfoide [82]. Si en el nodo linfoide, estas células vírgenes no reconocen su antígeno afín sobre las células dendríticas, volverán a recircular por la sangre [83]. Otro marcador utilizado para la caracterización de las poblaciones de memoria es CD27, un receptor perteneciente a la familia de receptores del TNF. CD27 es expresado por todas las células T CD4+ vírgenes y por el 80% de las células CD4+ de memoria. La pérdida de CD27 ha sido reportada como una característica de inducción de células CD4+ y CD8+ hacia un fenotipo efector [84]. Basados en sus perfiles transcripcionales, Schiott y colaboradores observaron que CD27 provee una clara división de la población de memoria en células activadas versus células no activadas [85]. Sus resultados mostraron que la población de memoria CD27- es una población más diferenciada, con altos niveles de secreción de citoquinas efectoras, y una fuerte respuesta hacia antígenos previamente vistos, comparada con la población CD27+ [85].
3.2.1.1.3 Células dendríticas Las células dendríticas son esenciales en la respuesta inmune innata, censando la presencia de patógenos a través de varios receptores de reconocimiento de patrones - PRRs (del inglés pattern-recognition receptors), que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos - PAMPs (del inglés pathogen-associated molecular patterns). Estos PAMPs, no son más que componentes repetitivos (como algunos lípidos, polisacáridos o carbohidratos) que se encuentran en los patógenos y que están ausentes en el hospedero humano. Tras este reconocimiento del patógeno, las CDs liberan grandes cantidades de citoquinas pro-inflamatorias o antivirales, resultando en la activación de células inmunes innatas, y el control de la infección [86]. Por otra parte, el papel de las células dendríticas en la inmunidad adaptativa (en el cual nos enfocaremos en este trabajo), se basa en su capacidad de presentar antígenos a células T e inducir una respuesta inmune [86, 87]. Progenitores hematopoyéticos de médula ósea dan lugar a precursores de CDs que migran a la sangre y a tejidos linfoides y no linfoides, donde residen como CDs inmaduras. Las CDs inmaduras
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poseen una alta capacidad endocítica y fagocítica, permitiendo así la captura del antígeno, pero expresan bajos niveles de IL-12, CMH Clase II y de moléculas co-estimuladoras en su superficie. Luego de una infección microbiana y daño tisular, las CDs inmaduras migran a las regiones inflamatorias en respuesta a la producción de citoquinas inflamatorias a través de receptores específicos. Las CDs adquieren un fenotipo maduro, morfológicamente distinguidas por la pérdida de estructuras de adhesión, organización del citoesqueleto, presencia de dendritos que proveen una amplia área superficial para la interacción simultánea con varios LT. El proceso de maduración está asociado con la pérdida de receptores fagocíticos y endocíticos, y expresión de altos niveles de IL-12, CMH Clase II en la superficie celular y una producción incrementada de moléculas co-estimuladoras, incluyendo CD40, CD80 y CD86. Los marcadores CD80 y CD86, son glicoproteínas de membrana tipo I, pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La expresión de CD86 es constitutiva en monocitos y CDs, y es sobre-regulada por la activación. Por el contrario, CD80 es expresado en bajos niveles en APCs y sobre-regulado después de un estímulo [88-90]. CD80 puede ser más potente que CD86 en inducir respuesta antitumoral, mientras que el CD86 preferencialmente induce la producción de una respuesta Th2 [91]. Otros marcadores como la molécula CD83 y DC-SIGN (CD209), son ampliamente utilizados para diferenciar las células dendríticas en estado inmaduro de las células dendríticas maduras. CD83 es una proteína principalmente expresada en CDs maduras (CDs circulantes y en tejidos). El CD83 unido a membrana libera una importante señal de expansión de células T CD8+ activadas [92]. Por su parte, la molécula DC-SIGN es una lectina tipo-C involucrada en el reconocimiento de un amplio rango de estructuras, como carbohidratos, sobre diferentes patógenos. In vivo, DC-SIGN (Dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin) es expresada por CDs inmaduras en tejidos periféricos jugando papeles importantes en el reconocimiento por parte de CDs y macrófagos a patógenos, pero parece no ser requerida para activación de células T [93].
3.2.1.1.4 Producción de citoquinas y polarización de la respuesta inmune Diferentes subgrupos de células T promueven la generación, tanto de una respuesta inmune mediada por células (tipo 1), como de una respuesta humoral (tipo 2). Las células cooperadoras de tipo 1 (Th1) promueven las funciones citotóxicas de células natural killer, CD8+ y macrófagos. Estas también son capaces de promover la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, la cual ocurre en presencia de IgG2a en ratones e IgG1 en humanos. En contraste, los linfocitos Th2 promueven la inmunidad humoral, mediada por células B productoras de IgG4 e IgE en humanos (Figura 5) (Mosmann y col 1986). La secreción de citoquinas por parte de las células dendríticas que fagocitan los patógenos y presentan sobre su superficie los antígenos, es crucial para la inducción de una respuesta inmune específica. Algunas de estas citoquinas producidas por células dendríticas, son la IL-12p70, y el factor de necrosis tumoral (TNF), asociadas con una respuesta de perfil Th1; la IL-8, asociada con el reclutamiento de neutrófilos; la IL-10, asociada con la regulación de la respuesta de células T, y
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la IL-1β, asociada con el reclutamiento de leucocitos, activación de NFκB, e inducción corriente arriba de otras citoquinas y óxido nítrico, asociados con inflamación [94] (Figura 5).
Figura 5. Polarización de células T. Transición de una linfocito virgen a células activadas polarizadas . Tomado de: [95].
Por otra parte, una vez los linfocitos que han reconocido un antígeno, producen otras citoquinas que terminarán en la amplificación e inducción de la respuesta inmune específica. Entre éstas, algunas citoquinas de perfil Th1 como el INFγ, el TNF y la IL-2, son importantes en la promoción de la proliferación, maduración y activación de macrófagos y granulocitos. Por otra parte, algunas de las citoquinas de perfil Th2 producidas son la IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, responsables de la activación de células B y el desencadenamiento de una respuesta de tipo humoral [96]. 3.2.2 Respuesta inmune a la tuberculosis Luego de la infección con Mtb por medio de aerosoles, la bacteria es establecida en los pulmones del hospedero, en donde la respuesta inmune celular adquirida se induce y expresa de forma retardada. Esta demora en el inicio de una respuesta inmune, da paso al establecimiento de la infección y la generación de un ambiente inflamatorio modulado por la bacteria. Mtb tiene una variedad de moléculas de superficie que modulan la respuesta inmune, por medio de varios mecanismos para evitar el control de su continuo crecimiento [97]. A diferencia del amplio conocimiento que se tiene acerca la respuesta inmune contra la tuberculosis en modelos animales, el papel de las rutas celulares específicas en el control de Mtb en humanos, es menos conocido. Los mecanismos precisos que median el control de Mtb en personas sanas infectadas aún es desconocido [97], aunque es claro que en estas personas se desencadena un tipo
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de hipersensibilidad retardada [98]. Un aspecto de la respuesta inmune humana que ha recibido especial atención, es la identificación de antígenos reconocidos por individuos sanos infectados, lo que da indicios de cómo se comporta la respuesta inmune protectiva [99]. Hoy en día, aunque los mecanismos inmunológicos efectores que proveen protección contra la tuberculosis no son completamente entendidos, se sabe que la resistencia a la infección micobacteriana está principalmente mediada por la interacción de células T antígeno-específicas y macrófagos [99, 100]. Esta interacción es generalmente dependiente de la dinámica de citoquinas producidas por estas células, con especial relevancia del interferón gamma (IFNγ), considerado como uno de los principales mediadores de la inmunidad protectiva contra la tuberculosis [1]. Por otra parte, una respuesta de tipo Th2, caracterizada por la secreción de IL-4, IL-6 e IL-10, está asociada a la carencia de protección. En particular, IL-10 está asociada con una mayor susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad, al inactivar y regular negativamente la secreción de citoquinas de perfil Th1 [1].
3.2.2.1 Respuesta inmune innata contra la tuberculosis
Aunque la respuesta celular adquirida ha sido objeto de muchos estudios, la caracterización de la respuesta innata de los humanos a la infección, ha ganado importancia recientemente. Dos de los principales efectores de la respuesta innata, a quienes se les ha reconocido una importancia vital en la protección contra la tuberculosis, son los neutrófilos y las células Natural Killer (NK). Los neutrófilos han sido relacionados, por su propia naturaleza, en la inmunidad antibacteriana. Estos neutrófilos son capaces de reducir la viabilidad de la bacteria extracelular, además de reducir el crecimiento bacteriano en los macrófagos infectados, jugando un papel muy importante en los estadios más tempranos de la infección [101]. Las células NK, median también una importante actividad antimicobacteriana. La habilidad de estas células para lisar células infectadas ha sido observada en macrófagos alveolares humanos, sugiriendo que esta interacción hace parte de eventos de respuesta a la infección temprana [102]. En el modelo de ratón, se ha observado que aún en ausencia de una inmunidad adquirida, estas células pueden controlar el crecimiento de la bacteria, así como la acumulación de granulocitos en los focos de infección [103].
3.2.2.2 Respuesta inmune adaptativa contra la tuberculosis Durante la infección con Mtb, se ha observado un constante retraso en la inducción de linfocitos antígeno-específicos que hacen parte de la respuesta inmune celular adquirida [97]. Luego de que las células dendríticas son infectadas en el pulmón, estas deben migrar hacia el nódulo linfático de drenaje, en donde activarán células T vírgenes para que proliferen y se diferencien en células efectoras. Estas células allí activadas, migrarán hacia el pulmón, llegando al foco de infección luego de 18-20 días después de la llegada de la bacteria [104].
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Este retraso de las células efectoras que alcanzan el pulmón guiadas por señales inflamatorias, hace que al momento de iniciar una respuesta celular en el pulmón, la bacteria ya haya invadido macrófagos alveolares, células dendríticas y neutrófilos, permitiendo el exitoso establecimiento de la infección y la progresión de la enfermedad en individuos susceptibles [97]. En cuanto a las células presentadoras de antígenos, las células dendríticas tienen un papel importante en el establecimiento de una respuesta adaptativa efectiva. Existe evidencia de que la generación de diferentes tipos de respuesta inmune es controlada por estas células dendríticas, capaces de promover tanto una respuesta de tipo Th1, como una respuesta Th2 [105].
3.2.2.2.1 Relevancia de las células T en la tuberculosis
En la mayoría de modelos de vacunas, la capacidad de establecer una respuesta protectiva mediada por células T, empieza a darse luego de mínimo 14 días post-infección. En este tiempo, la micobacteria puede alcanzar un número suficientemente alto como para que las células puedan frenar su crecimiento. En este sentido, el énfasis de muchos estudios en el desarrollo de vacunas se centra la activación de células T en el mismo foco de infección, evitando el retraso de una respuesta efectora [99]. Pese a su presencia en lesiones tuberculosas, la importancia de los LT en el control de la tuberculosis no fue claro, hasta que logró evidenciarse en el modelo de ratón que estas células T eran necesarias para alcanzar una inmunidad antituberculosa luego de retos sistémicos y por aerosol [97]. El papel fundamental de las células T CD4+ como las principales mediadoras de la inmunidad fue bien conocido a partir del uso de ratones deficientes en el gen que codifica para esta molécula de superficie, en donde se observó un aumento importante en la carga bacteriana y un rápido avance de la enfermedad, respecto a los ratones no deficientes [106, 107]. En este mismo modelo, se demostró que la importancia de la activación de macrófagos mediada por citoquinas, juega un papel esencial en el control del crecimiento de la micobacteria [108, 109]. La relevancia de estas células CD4 en humanos se hizo evidente en estudios realizados en individuos infectados con VIH, que tras un descenso importante de esta población celular, mostraron un aumento en la susceptibilidad a la tuberculosis [110]. Aunque la inmunidad protectiva contra la tuberculosis es dependiente de una respuesta inmune celular intacta, especialmente mediada por células T CD4+ [38], los LT CD8+ también han demostrado contribuir de forma importante a la protección contra Mtb tanto en modelo de ratón como en humanos. Estudios con ratones deficientes en una respuesta efectiva T CD8+, exhiben un incremento en la susceptibilidad a la infección por Mtb [111]. Si bien se ha reconocido la importancia de las células T en la respuesta a la infección con Mtb, son igualmente importantes las señales co-estimulatorias requeridas para la óptima proliferación y producción de citoquinas de estas células [112]. Células dendríticas maduras expresan sobre su superficie altos niveles de moléculas presentadoras de antígenos y moléculas co-estimulatorias, como CD80 y CD83. La forma como Mtb afecta este proceso aún no es clara, e incluso se ha
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generado controversia sobre la expresión o no de estas moléculas tras la infección con Mtb. Henderson y colaboradores encontraron que Mtb era capaz de generar sobre-regulación de estas moléculas cuando células dendríticas era infectadas con la micobacteria [113]. Por otras parte, otros autores, han reportado que la presencia de trehalosa 6-6'-dimicolato en cepas de Mtb, genera supresión, o impide algún cambio en la expresión de marcadores de superficie tales como MHCII, CD1d, CD40, CD80 y CD86, mientras que Mtb delipidificado aumenta su exspresión [114].
3.2.2.2.2 Respuesta reguladora de células T Igualmente importante, es la expresión de una respuesta reguladora que limite la patogénesis producida por una respuesta celular exagerada. Como ocurre en la respuesta celular a cepas híper-virulentas, como Mtb del genotipo Beijing, una respuesta inmune aumentada de tipo Th1 puede lograr inhibir casi que por completo la expansión de poblaciones de células T regulatorias [115], causando patogénesis y progreso de la enfermedad. Una ruta de regulación de una respuesta celular aumentada puede ser la constituida por poblaciones de células B, para las que se ha demostrado que, si bien su deficiencia no resulta en susceptibilidad al crecimiento bacteriano, si son capaces de alterar el desarrollo de la lesión [116]. En la ausencia de células B, ratones expuestos a altas dosis de micobacteria por aerosoles, generan alteraciones inmuno-patológicas, con gran acumulación de neutrófilos que terminan en un incremento de la carga bacteriana. Esto sugiere que, tanto las células B como sus productos, pueden modular la respuesta inflamatoria y la respuesta de citoquinas [117]. Por otra parte, de acuerdo a reportes en humanos, se ha encontrado una asociación entre el riesgo de desarrollar tuberculosis y la presencia de IL-10, con una marcada tendencia hacia el desarrollo de tuberculosis primaria progresiva en individuos con elevados niveles de esta citoquina [118]. En soporte a esta hipótesis, estudios en ratones han demostrado una clara reducción en la carga bacteriana en aquellos ratones deficientes en IL-10, pero con un influjo aumentado de células productoras de IFN-‐γ [97].
3.2.2.2.3 Citoquinas relevantes para el control de la tuberculosis A medida que se amplía nuestro conocimiento acerca de la capacidad de ciertos microorganismos para modular la inmunidad, se hace más claro que Mtb se vale de una variedad de herramientas con las cuales orienta la respuesta inflamatoria hacia la infección. Este hecho no es sorprendente, ya que la bacteria depende de una respuesta inflamatoria que permita la diseminación de la enfermedad, entre otras cosas debido a la variedad de moléculas estimulatorias sobre su superficie [97]. Las células productoras de IFNγ, han sido altamente implicadas como reguladoras de la respuesta de células T en la enfermedad micobacteriana [119]. En ratón, se ha observado que el IFNγ actúa promoviendo la susceptibilidad de monocitos infectados a la apoptosis y de la misma forma, altera el nivel de señales apoptóticas durante la infección [99]. Orme en 1987, observó que en individuos
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que carecen de un receptor funcional de IFNγ, las células CD4 expresan bajos niveles de FasL, y por tanto, son pobres activadores de muerte inducida, reduciendo su capacidad de eliminar la micobacteria [106]. Se ha observado que esta activación de células productoras de IFN-γ se encuentra estrechamente relacionada con la producción de IL-23 e IL-12, y la reducción de los niveles de IL-10 [120]. En ratón, se observó que células dendríticas infectadas con Mtb generan IL-12 e IL-23, promoviendo la proliferación de poblaciones de células T CD4+ productoras de IFNγ e IL-17 [121]. Estos niveles relativos de células productoras de IFNγ e IL-17 durante la infección, tanto en humanos como en ratón, dependerá de las citoquinas específicas presentes durante y después de la activación de células T [97]. Estudios recientes demuestran una respuesta limitada de IL-17 hacia Mtb en poblaciones Europeas, mientras que en poblaciones suramericanas, la producción de estas células que expresan tanto IL17 como IL-22 es elevada [122]. Por otra parte, se sabe que los altos niveles de producción de ciertas citoquinas pueden conducir a una respuesta que pude resultar patogénica. Es así como IL-23 e IL-17 parecen aumentar la respuesta patológica en ratones infectados con Mtb [97]. Aunque estas células IL-17 pueden ser perjudiciales durante la infección crónica, se ha encontrado que son importantes durante la respuesta de memoria antígeno-específica inducida en células T CD4+ productoras de IFNγ. En un modelo de vacuna subunitaria basada en péptidos del antígeno secretado ESAT-6 probado en ratón, se observó una importante presencia de células productoras de IL-17 en el pulmón. Estas células productoras de IL-17 fueron capaces de responder mucho más rápido al reto por aerosoles y fueron necesarias para la expresión temprana de quimioquinas en el pulmón. En su ausencia, no se observó una respuesta rápida de IFNγ, y por tanto, en los ratones no vacunados no se produjo protección [123]. A pesar de su aparente importancia para mediar protección en el pulmón, estas células productoras de IL-17, al no ser suficientemente reguladas, pueden conducir a respuestas inmunopatológicas que medien la destrucción. IL-23 e IL-17 han sido encontradas en respuestas patológicas en múltiples experimentos realizados en ratón. Impulsar la respuesta protectiva a un grado importante, podrá ser posible si se logra identificar qué agentes median el daño o la patogénesis, y se logra separarlos de la respuesta protectiva [97]. 3.2.3 Monocitos, macrófagos y células dendríticas La habilidad de Mtb para establecerse y proliferar dentro de monocitos y macrófagos, pese a sus propiedades antimicrobicidas, ha hecho que los esfuerzos de muchos investigadores se orienten al entendimiento de los procesos y agentes mediadores que intervienen en su activación. Los monocitos y macrófagos alveolares que residen dentro del pulmón, han demostrado ser las principales células hospederas de Mtb in vivo [124]. La importancia del estudio de la activación del macrófago, reside en la evidencia de que una respuesta defectuosa de los mismos, puede limitar completamente el efecto protectivo de la vacunación. Tanto en humanos como en ratón, macrófagos y células dendríticas juegan papeles
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cruciales en la respuesta inmune contra la micobacteria, por un lado estimulando la eliminación de la misma, y por el otro sobre-regulando la expresión de moléculas capaces de estimular LT [124]. Gran parte de la importancia de la activación de las células dendríticas, reside en su habilidad de sobre-regular la expresión de moléculas del CMH clase II, que les permita hacer una buena presentación de los antígenos [97]. Al respecto, algunos estudios sugieren que Mtb puede modular la activación de células T, alterando la expresión del CMH clase II [125]. Por otra parte, estudios demuestran que en el momento en que los macrófagos ingresan al tejido pulmonar infectado, empiezan a sobre-regular la expresión de CMH clase II en una forma dependiente de IFNγ [97]. Por otra parte, el estudio de algunas proteínas expresadas sobre la superficie de los macrófagos, ha sido de gran ayuda para los investigadores a la hora de evaluar su activación. Es el caso de las lectinas tipo C, como DC-SIGN (CD209), implicadas en la modulación de la función de los fagocitos en respuesta a la micobacteria [126]. La micobacteria puede afectar la función de la maduración de la célula dendrítica, al ligarse al DC-SIGN presente sobre células inmaduras [97]. A nivel molecular, las interacciones entre el bacilo y el fagocito hospedero están mediadas por una variedad de receptores celulares, entre los cuales DC-SIGN o CD209 ha demandado especial atención. DC-SIGN permite a células dendríticas derivadas de monocitos reconocer una gran variedad de microorganismos, incluyendo virus, parásitos y bacterias [127]. DC-SIGN juega un papel clave en la interacción de la micobacteria con células dendríticas preferencialmente, y en general con células fagocíticas in vitro [128]. Además, DC-SIGN reconoce miembros del complejo M. tuberculosis a través del lipoarabinomamano (LAM), un abundante lipoglicano de la envoltura micobacteriana, y otras moléculas tales como arabinomanano, lipomanano y el antígeno de 19 kDa [129, 130]. Se ha observado que la interacción de DC-SIGN con LAM inhibe parcialmente la maduración de fagocitos y potencia la secreción de citoquinas reguladoras como IL-10 [129]. La interacción de DC-SIGN con la micobacteria o con productos micobacterianos, puede resultar en el beneficio del patógeno, modulando negativamente las funciones de las células dendríticas, o para el hospedero, limitando la inflamación del tejido y la inmunopatología [131, 132]. Comparación de ratones C3HeB/J susceptibles a Mtb, con ratones resistentes C57BL/6J, han permitido a los investigadores identificar un locus (sst1) asociado con la disminución de la sobrevivencia e incremento de lesiones necróticas [133]. Dentro de este locus, el gen Ipr1 es inducido en los fagocitos durante la infección con Mtb y ha sido asociado con la habilidad para controlar la bacteria y limitar la muerte necrótica de los macrófagos, incrementando en su lugar, la muerte por apoptosis [133]. 3.3 Métodos diagnósticos para la infección con Mtb Por el importante papel atribuido al Interferón gama (IFN-γ) en la respuesta inmune adaptativa para el control del Mtb, la cuantificación por ELISPOT del número de células productoras de IFN-γ (T-SPOT.TB®) y por ELISA (QuantiFERON-TB Gold In-tube®) de la cantidad de IFN-γ producido por células de sangre periférica, estimuladas con péptidos derivados de antígenos específicos de
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Mtb codificados en RD1 y RD11 [134], son dos pruebas conocidas como IGRAs (Interferon gamma release assays) que fueron recientemente aprobadas por la FDA como herramientas para el diagnóstico de tuberculosis latente, las cuales han tratado de reemplazar el uso del test de tuberculina (TST del inglés Tuberculin skin test), al demostrar en ciertas condiciones una mayor sensibilidad y especificidad en la detección de la infección por Mtb [135]. Dentro de las nuevas pruebas inmunológicas para el diagnóstico de tuberculosis latente, se ha venido utilizando en los últimos años la medición de IFN-γ y otras citoquinas producidas por leucocitos de sangre periférica en respuesta a antígenos específicos de Mtb (QTF-G y ELISPOT) pero sin la determinación del tipo de memoria de estos linfocitos. Esta técnica consta de un cultivo in vitro de sangre periférica (1ml) durante 16 horas en 2 tubos, un tubo contiene los antígenos ESAT-6, CFP-10 y TB7.7, y el otro es un tubo control. Posterior al cultivo, se separa el plasma y se realiza un ELISA para la medición de los niveles de IFN-γ (comparando el control vs el estimulado con antígenos). Existe una confusión en el propósito atribuido a los IGRAs, donde su diseño original involucra la detección de personas con una infección latente de Mtb, pero adicionalmente se le atribuye la detección también de tuberculosis activa [136, 137]. Sin embargo, hay un consenso relativo en que el único estándar de oro para la detección de tuberculosis activa sigue siendo el cultivo microbiológico [136, 138]. Un resultado positivo en un IGRA indica la exposición a la micobacteria, por lo tanto, puede explicar la causa de los síntomas de un paciente sugestivo de tuberculosis, pero no es una forma confiable para el diagnóstico de tuberculosis activa. Estudios comparativos entre las pruebas de detección de tuberculosis latente, QuantiFERON-TB Gold (QTF) y TST, muestran una concordancia en sus resultados que varían de 53 hasta un 94% en adultos inmunocompetentes [139]. Parte de la explicación de la poca concordancia, es el uso de péptidos específicos de Mtb en las pruebas de QTF, a comparación de la PPD; esta última contiene más de 200 antígenos compartidos con micobacterias no tuberculosas y con las cepas de la vacuna BCG de M. bovis [140].
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4. Objetivos
4.1 Objetivo General Evaluar el efecto de péptidos de dos proteínas de superficie de M. tuberculosis H37Rv sobre la activación de macrófagos, y su potencial antigénico en individuos con o sin infección previa con Mtb. 4.2 Objetivos Específicos
• Determinar en un grupo de voluntarios sanos, infección latente con M. tuberculosis, mediante el uso de una prueba diagnóstica.
• Evaluar in vitro la activación de macrófagos mediada por péptidos sintéticos de proteínas de superficie de M. tuberculosis.
• Evaluar in vitro el reconocimiento de péptidos sintéticos de proteínas de superficie de M. tuberculosis H37Rv, en células del sistema inmune de individuos sanos con y sin previa infección con la micobacteria.
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5. Hipótesis
Teniendo en cuenta que la protección contra Mtb tanto en modelo animal como en humano, se encuentra estrechamente relacionada con una respuesta celular de tipo Th1, mediada de forma importante por IFN-γ, y de una adecuada activación de los macrófagos, se espera que péptidos sintéticos de alta unión específica a macrófagos U937, sean capaces de estimular una respuesta celular de este tipo en aislados celulares de individuos sanos infectados y de generar la activación y maduración de macrófagos U937.
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6. Metodología
La metodología detallada a continuación se encuentra dividida en una fase de recolección de muestras y diagnóstico, una segunda fase de evaluación de la activación de monocitos, y una tercera fase de evaluación de evaluación de activación de linfocitos (Figura 6).
Figura 6. Esquema general de la metodología utilizada en este estudio.
6.1 Síntesis de péptidos Los péptidos fueron sintetizados químicamente por síntesis múltiple en fase sólida [141], usando la resina BHA (0.7 meq/mg) y aminoácidos protegidos por t-Boc. Una vez obtenidos, fueron liofilizados, purificados por cromatografía líquida de alto desempeño en fase reversa (RP-HPLC), y caracterizados por espectrofotometría de masas MALDI-TOF (Bruker, Ettlingen, Alemania). La secuencia de cada uno de los péptidos estudiados, se muestra en la Tabla 1.
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Tabla 1. Péptidos sintetizados y usados en el estudio. Secuencia de cada uno de los péptidos control (mitad superior de la tabla) de las proteínas ESAT-6, CFP10 y TB7, y analitos (mitad inferior de la tabla) de las proteínas Rv0679c y Rv1980. Los péptidos sombreados corresponden a no HABPs y los no sombreados corresponden a HABPs para U937.
6.2 Población de estudio Como poblaciones de estudio, fueron tomados individuos sanos con o sin infección previa con Mtb. La infección con Mtb fue confirmada mediante la prueba diagnóstica QTF, como será descrito más adelante en el apartado 6.4. Este estudio se realizó de acuerdo con las normas legales y fue previamente aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia-Sede Bogotá. Todos los individuos incluidos en el estudio, firmaron un consentimiento informado en donde recibieron toda la información acerca de la naturaleza del estudio (Anexo 1). Adicionalmente, a cada uno de los voluntarios se le pidió que diligenciara un formato en el que se solicitaba que especificaran género, edad, antecedentes de tuberculosis, afecciones pulmonares, u otras enfermedades, y si estaban recibiendo algún tratamiento con medicamentos en el momento de la toma de la muestra (Anexo 2). 6.3 Obtención de células mononucleares de sangre periférica Bajo condiciones asépticas, un total de 63 mL de sangre fue extraído por punción venosa a cada una de las 45 personas incluidas en el estudio. 60 mL de la sangre fueron utilizados para la separación y almacenamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, del inglés, Peripheral Blood Mononuclear Cells) utilizados en posteriores ensayos in vitro, y 3 mL más, fueron tomados para la realización de la prueba de infección con Mtb.
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La recolección de las muestras fue llevada a cabo en tubos Vacutainer heparinizados de 10 mL. La sangre fue diluida 1:2 en RPMI incompleto (sin suero fetal bovino (SFB)), y la separación de los PBMCs, se llevó a cabo utilizando un gradiente de Ficoll en una relación 2:1 (Ficoll:sangre). Las muestras fueron centrifugadas por 40 minutos a 1800 g, y el anillo de leucocitos fue recuperado. Se realizaron dos lavados mediante centrifugación a 1800 g por 7 minutos y resuspensión en medio RPMI completo (con 10% de SFB). Se realizó conteo en cámara de Neubauer y se utilizó azul de tripán como tinción de exclusión para estimar el porcentaje de viabilidad. Las células fueron congeladas en un volumen de 1,5mL de medio de congelación (50% RPMI, 40% SFB, 10% DMSO), y almacenadas en Nitrógeno líquido hasta su uso.
6.4 Diagnóstico de infección con Mtb El diagnóstico de infección con Mtb fue realizado usando el kit quantiFERON Gold (Cellestis Limited, Valencia, USA), basado en la medición de producción de INFγ a partir de células de sangre total expuestas a antígenos específicos de Mtb. Para esto, 3mL de sangre fueron tomados a cada uno de los voluntarios y colectados en tres tubos diferentes (1 mL por tubo). Uno de los tubos, el control negativo, carecía de algún agente estimulante de producción de IFNγ. Un segundo tubo correspondía al control positivo (fitohemaglutinina-P), que estimula las células inespecíficamente; y por último, un tercer tubo, contenía los antígenos específicos de Mtb (péptidos de las proteínas ESAT-6, CFP10 y TB7.7 de Mtb) (Tabla 1). Luego de la toma, las muestras fueron incubadas a 37°C y 5% CO2 durante 24horas. Los tubos fueron centrifugados a 2.000 g durante 8 minutos, para conseguir que el tapón de gelatina separara el plasma (arriba del tapón) de las células (abajo del tapón). Las muestras fueron almacenadas a -70°C hasta su uso. La prueba de QTF fue realizada de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, los estándares fueron preparados haciendo diluciones a partir de una muestra de IFNγ liofilizada. 50 µL de conjugado fueron adicionados a cada uno de los pozos de las cajas de 96 pozos cuyo fondo estaba recubierto con anti-INFγ (contenidas en el kit). Se adicionaron 50 µL de cada muestra (plasma) o de cada uno de los estándares preparados, y se incubó a temperatura ambiente por 120 minutos en la oscuridad. Se realizaron seis lavados con el buffer de lavado (provisto por el kit) y se añadieron 100 µL de solución enzimática de sustrato a cada uno de los pozos. En la figura 7, se muestra un ejemplo de la distribución de las muestras recomendada por el kit.
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Fig. 7. Distribución de las muestras en las placas de QTF. Tubos blanco (N), antígenos de Mtb (A), mitógenos (M) y estándares (S). Las cajas fueron agitadas e incubadas a temperatura ambiente (22°C ± 5°C) durante 30 minutos en oscuridad. Finalmente, se adicionaron 50 µL de solución enzimática de parada a cada pozo y se realizó la lectura de la densidad óptica (DO) en un lector ELISA. El análisis de los datos e interpretación de resultados fue realizado con ayuda de un software proporcionado por Cellestis para análisis de muestras de QTF. 6.5 Cultivo de Mtb Para el crecimiento de la cepa de Mtb H37Rv (ATCC 27294), se utilizó el medio líquido 7H9 con Tween 80 al 0,05% y glicerol al 0,2%, enriquecido con 10% de OADC (albúmina, dextrosa, catalasa y ácido oléico). El tiempo de crecimiento osciló entre 17 y 25 días a 37°C en agitación. Transcurrido este tiempo, la bacteria fue obtenida por centrifugación a 12,500 g durante 20 min a 4°C, resuspendida en 1 mL de PBS 1X y almacenada a -20°C. De igual forma, como control de crecimiento se utilizó una caja de petri con medio sólido 7H10 suplementado bajo las mismas condiciones mencionadas anteriormente y con la misma temperatura de crecimiento.
6.6 Obtención de lisado de Mtb por sonicación Un volumen de 10 mL de micobacteria crecida bajo las condiciones mencionadas previamente fue resuspendido en 20 mL de PBS 1X conteniendo ADNasa, ARNasa y un coctel de inhibidores de proteasas (1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF], 1 mM EDTA, 1 mg/mL Leupeptina y 1 mg/mL Pepstatina A). Se realizaron cuatro lavados con PBS 1X, disminuyendo gradualmente su volumen antes de la sonicación. Posteriormente, la bacteria fue sonicada dos veces durante 15 min c/u, con una amplitud de 3,0 y un ciclo de trabajo del 80% en baño de hielo, usando un Branson Sonifier® Ultrasonic Cell Disruptor 450. El sonicado fue luego centrifugado a 650 g por 20 min y el sobrenadante obtenido fue centrifugado a 36,000 g por 45 min a 4˚C. La concentración de las proteínas fue determinada por un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) usando como estándar albúmina sérica bovina (BSA) y analizado en un lector de ELISA (Multiskan® EX, Waltham, MA).
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6.7 Activación de monocitos humanos 6.7.1 Separación positiva de monocitos por columna magnética La obtención de monocitos fue realizada mediante selección positiva, a partir de PBMCs obtenidos por gradiente de Ficoll (como fue descrito anteriormente). El número y viabilidad celular fueron estimados por tinción con azul de tripán en cámara de Neubauer. Los PBMCs fueron centrifugados a 1800 g por 7 minutos y el sobrenadante fue retirado. Por cada 107 células, el pellet fue resuspendido en 80 µL de buffer de separación (RPMI+1%SFB+0,2mM EDTA) + 20 µL de microperlas magnéticas anti CD-14. Las células fueron incubadas durante 15 minutos a 4°C y lavadas adicionando 2 mL de RPMI+1% SFB. Se centrifugó por 7 minutos a 1800 g, el sobrenadante fue descartado, y el pellet resuspendido en 500 µL del buffer de separación. La columna para la separación positiva de monocitos fue puesta en el campo magnético del separador correspondiente, y debajo de ésta, se dispuso un tubo de citometría para la recolección de las células no marcadas (fracción CD14- que NO corresponde a los monocitos). 500 µL de RPMI+1% SFB fueron adicionados a la columna, seguidos por la suspensión celular marcada con las microperlas. Se realizaron tres lavados a la columna cada uno de 500 µL de RPMI+1% SFB para retirar el exceso de células no marcadas. Para cada lavado se tuvo en cuenta que el reservorio de la columna estuviera desocupado. Finalmente, se llevó a cabo la remoción de la columna del separador, fue agregado 1mL de RPMI+1% SFB dentro de la columna e inmediatamente fue retirada la fracción con las células marcadas magnéticamente (monocitos), colocando el émbolo dentro de la columna. Se realizó recuento y viabilidad celular de cada una de las fracciones obtenidas (células marcadas y no marcadas), con azul de tripán en Cámara de Neubauer. Para determinar la eficiencia de la purificación, se realizó tinción con anticuerpos monoclonales específicos anti-CD3-FITC y anti CD-14-PE, y se realizó la lectura en un citómetro de flujo FACScan. Los datos fueron analizados usando el software FlowJo 2.5. 6.7.2 Inhibición de la invasión a monocitos humanos Con el fin de establecer si los HABPs de las proteínas Rv1980c y Rv0679, con capacidad de inhibir la invasión de Mtb H37Rv a células U937, tienen la misma actividad sobre monocitos humanos, se llevaron a cabo ensayos de inhibición de invasión usando bacteria marcada con SYBR Safe. 2x105 monocitos separados por selección positiva, fueron sembrados por pozo en cajas de 96 pozos. Se realizó incubación por 72h a 37°C y 5% CO2, y el medio fue retirado y reemplazado por cada uno de péptidos de las proteínas Rv1980c (31101, 31107, 31100, 31102) y Rv0679c (30979, 30987, 30980, 30982), preparados en HBSS (del inglés Hank’s Basic Salt Solution). Cada uno de los péptidos fue ensayado a concentraciones de 20 y 200 µM. Las células fueron incubadas a 4°C por 2 horas.
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Para llevar a cabo la invasión, la micobacteria fue previamente marcada mediante incubación con SYBR safe 20X durante 20 minutos a 37°C en la oscuridad. Se realizó un lavado mediante centrifugación a 6.000 g durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante, y la bacteria fue resuspendida en medio RPMI completo sin antibiótico. La bacteria se sonicó por 20 segundos con el fin de disgregar los grupos de bacterias, y se incubó durante 10 minutos para permitir la precipitación de los mismos. El sobrenadante con la bacteria libre de grumos, fue cuantificado mediante espectofotometría y escala de McFarland, previamente ajustada en nuestro laboratorio. El medio de las cajas de células fue retirado y reemplazado con la suspensión de bacteria, a una multiplicidad de infección (MOI) de 1:50. Luego de 4 horas de incubación, la bacteria fue retirada, y se realizaron tres lavados con HBSS a la monocapa celular, para retirar el exceso de bacteria que no fue internalizada. Las células fueron desprendidas con una solución de tripsina 3%, EDTA 1%. Cuando las células empezaron a desprenderse, se adicionó medio RMPI completo y se centrifugó a 1800 g por 5 minutos. El sobrenadante fue descartado y las células resuspendidas y fijadas en 100 µL de paraformaldehído 4% durante 2 h a 4°C. Aproximadamente 5 minutos antes de la lectura en el citómetro, se agregaron 200 µL de azul de metileno al 6%, para evitar la emisión de autofluorescencia por parte de las células. Finalmente, se llevó a cabo la lectura en un citómetro de flujo FACScan, y los datos fueron analizados usando el software FlowJo 2.5. Como control positivo de invasión, las células fueron incubadas con HBSS sin péptido, y como control negativo con 10 µM de citocalasina D (inhibidor de la polimerización de actina). 6.7.3 Maduración de células dendríticas Con el fin de evaluar si los HABPs seleccionados tienen algún efecto sobre la maduración de células dendríticas derivadas de monocitos humanos, se llevó a cabo el siguiente procedimento: Células dendríticas (CDs) de 7 días fueron generadas a partir de monocitos purificados por selección positiva, a partir de 3 buffy coats donados por el hemocentro de la Secretaría de Salud de Bogotá. El número y viabilidad celular fueron cuantificados mediante conteo en cámara de neubauer usando tinción con azul de tripán. Para la diferenciación de monocitos a CDs, 1x106 monocitos purificados fueron sembrados por pozo, en un volumen de 500 µL de medio AIMV suplementado con IL4 (700 UI/mL) y GM-CSF (1.000 UI/mL), en cajas de 24 pozos. Las células fueron incubadas durante 72 horas a 37°C, 5% CO2. Al cabo de este tiempo, se retiró cerca del 75% del medio de cada pozo y se reemplazó con la misma cantidad de medio fresco, suplementado con las citoquinas mencionadas anteriormente, a las mismas concentraciones finales. Se incubó nuevamente a 37°C, 5% CO2, durante 48 horas. Al cabo de este tiempo, se retiró nuevamente el 75% del sobrenadante, y se reemplazó con la misma cantidad de medio AIMV con adición de IL4 (750 UI/mL), GM-CSF (1.000 UI/mL), IL-1β (10
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ng/mL), TNFα (10 ng/mL), IL6 (1.000 UI/mL) y PGE2 (1 µg/mL), a las concentraciones finales indicadas en paréntesis, en un volumen final de 500 µL por pozo. Se realizó incubación durante 48 horas a 37°C y 5% CO2. Alternativamente, en reemplazo de este último coctel de citoquinas, se realizó la incubación de las CDs con los siguientes tratamientos:
• Pool de HABPs de las proteínas Rv1980c (31101, 31107) y Rv0679 (30979, 30987). • Medio AIMV
La concentración final de cada uno de los péptidos fue de 10 µM en medio RPMI completo. Al día 7, las CDs maduras fueron desprendidas mediante incubación con PBS+EDTA 1%, a 37°C durante 15 minutos, y recogidas en tubos de citometría. Los sobrenadantes de todos los tratamientos fueron recogidos y almacenados a -20°C hasta su uso. Las células fueron lavadas dos veces con PBS+SFB 1%, centrifugando a 1800 g por 7 minutos, y a continuación se llevó a cabo la tinción con los marcadores de expresión, usando anti-CD83-PE-Cy5, anti-CD209-FITC, y anti-CD80-PE. Las células fueron resuspendidas en 50 µL de PBS + SFB 1% y 50 µL de la mezcla de los anticuerpos (previamente titulados). Adicionalmente, se realizó tinción de cada uno de los anticuerpos por separado, para realizar la compensación de colores en el citómetro de flujo. Las células fueron incubadas durante 20 minutos a 4°C y luego lavadas con 1500 µL de PBS. Los sobrenadantes fueron retirados y 400 µL de PBS fueron adicionados a cada tubo para realizar la lectura. La lectura de las muestras fue realizada en el citómetro FACSAria II. Fueron adquiridos 20.000 eventos por muestra, y los datos fueron analizados usando el software FlowJo 7.2. Este procedimiento fue repetido para 5 personas más, haciendo marcación únicamente con anti-CD83-PE-Cy5.
6.7.3.1 Cuantificación de citoquinas de perfil inflamatorio
A partir de los sobrenadates recogidos el día 7 de maduración de las células dendríticas, se llevó a cabo la medición de citoquinas inflamatorias secretadas al medio. La detección de múltiples citoquinas humanas se realizó usando el kit comercial CBA (Cytometric Bead Array Kit, BD Biosciences, Franklin Lakes, USA), para medición de citoquinas de perfil inflamatorio. Este kit utiliza perlas con diferentes intensidades de fluorescencia en APC, conjugadas con anticuerpo de captura específicos para cada una de las diferentes citoquinas (IL-6, IL-1β, IL-10, TNF e IL-8). Por otra parte, el kit cuenta de un reactivo de detección, una mezcla de anticuerpos conjugados con PE (del inglés phycoerythrin-PE), que generan señales fluorescentes en proporción a la cantidad de analito (citoquinas) unido. Cuando las perlas de captura y el agente detector son incubados con una muestra desconocida, complejos en sándwich (perla de captura+analito+reactivo de detección) son formados. De esta forma, las diferencias en las intensidades de fluorescencia en APC, nos permitirá diferenciar entre las diferentes citoquinas, mientras que las intensidades de fluorescencia en PE, corresponderán a las concentraciones de cada una de ellas.
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La reconstitución del estándar se realizó en 200 µL de diluyente. A partir de esto, se elaboró la curva de calibración, haciendo diluciones seriadas desde S10 (5.000 pg/mL), S9 (2500 pg/mL), S8 (1250 pg/mL), S7 (625 pg/mL), S6 (312 pg/mL), S5 (156 pg/mL), S4 (80 pg/mL), S3 (40 pg/mL), hasta S2 (20 pg/mL), y dejando S1 (0 pg/mL) solo con diluyente. Por otra parte, la mezcla de perlas de captura fue preparada para el número de muestras totales (incluyendo los estándares), agregando 2 µL de cada una de las perlas de captura y 10 µL de anticuerpo marcado con PE (reactivo de detección) por muestra. En tubos de citometría se sembraron 10 µL de cada una de las muestras y estándares (los sobrenadantes fueron previamente descongelados a temperatura ambiente), más 20 µL de la mezcla de perlas preparada anteriormente. Se realizó incubación por 2 horas a temperatura ambiente en completa ausencia de luz y se agregaron 300 µL de buffer para hacer un lavado por centrifugación a 1.000 g por 7 minutos. Los sobrenadantes fueron descartados y las muestras resuspendidas en 200 µL de buffer para su lectura. La lectura se llevó a cabo en un citómetro FACsAria II. Un total de 2.000 eventos fueron adquiridos y los resultados fueron expresados en pg/mL. 6.7.4 Determinación de muerte celular en monocitos humanos
6.7.4.1 Establecimiento de muerte celular con estaurosporina La muerte de las células por apoptosis o necrosis fue estimada utilizando el kit de Yoduro de propidio y Anexina V de Invitrogen (BioSource™). La apoptosis fue determinada mediante la detección de Anexina V, una proteína de alta afinidad por la fosfatidil serina, que al ser traslocada hacia la cara externa de la bicapa lipídica, refleja el inicio de eventos tempranos de apoptosis. Para su detección y lectura en el citómetro, la Anexina V, está acoplada a FITC. Adicionalmente, el kit incorpora una tinción de Yoduro de propidio (YP) que se incorporará dentro de las células durante eventos tardíos de la apoptosis, cuando las membranas celulares pierden su integridad. Este ensayo se realizó con el fin de ver la dinámica de la inducción de apoptosis por estaurosporina en monocitos humanos, y ver la separación de las poblaciones de acuerdo con las diferentes formas de muerte celular (apoptosis temprana, apoptosis tardía, necrosis), para realizar el análisis de las poblaciones en los ensayos posteriores. Para esto, 2x105 monocito separados por selección positiva fueron sembrados en tubos de citometría, en 200 µL de diferentes concentraciones de estaurosporina (0,1 µM, 0,2 µM, 2 µM y 5 µM) preparada en RPMI completo. Se realizó incubación durante 2, 4, 6, 12 y 24 horas. Como control negativo, fueron tomadas células que habían sido incubadas solamente con RPMI completo. Se realizó un lavado de las células con HBSS, centrifugando a 2.000 g por 5 min. Las células fueron resuspendidas en 100 µL de buffer de unión (10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2), 5 µL de AnexinaV-FITC y 10 µL de yoduro de propidio, e incubadas a temperatura ambiente por 15 minutos en la oscuridad. Adicionalmente, fueron preparadas células marcadas con cada una de las tinciones por separado y células sin marcar, con el fin de llevar a cabo la calibración
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del citómetro de flujo. Se adicionaron 400 µL de Buffer Anexina a cada tubo y se llevó a cabo la lectura en el citómetro de flujo. Un total de 10.000 eventos fueron adquiridos. La lectura fue realizada en el citómetro FACScan y los datos fueron analizados usando el software FlowJo 7.2. Para la interpretación de los datos, se tendrá en cuenta que aquellas células Anexina V-FITC+/YP-, corresponderán a células en estadios de apoptosis temprana; células Anexina V-FITC+/YP+, corresponderán a eventos de apoptosis tardía; células Anexina V-FITC–/YP+, a células necróticas; y células Anexina V-/YP- a células viables.
6.7.4.2 Determinación del efecto de los HABPs sobre la muerte celular de monocitos
El procedimiento para la determinación de muerte celular por apoptosis, se realizó a partir monocitos humanos separados por selección negativa utilizando el RosetteSep™ (Coctel de enriquecimiento para monocitos humanos), que mediante complejos de anticuerpos tetraméricos se une a CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, CD66b, CD123 y glicoforina A sobre los glóbulos rojos, agregando todas las células no deseadas, y dejando libres los monocitos de interés. La obtención de monocitos se realizó a partir de 30 mL de sangre de tres personas QTF positivas y tres personas QTF negativas, recogidas en tubos heparinizados de 10mL. Los tubos fueron centrifugados a 1800 g por 7 minutos y la fracción de células blancas fue separada en un tubo cónico de 15mL. 40 µL de coctel RosetteSep, fue agregado por cada mL de células, e incubado a temperatura ambiente por 20 minutos. A continuación se hizo una dilución del volumen total de las células 1:2 con medio RPMI y se realizó la separación de las células por gradiente de Ficoll. Al realizar la centrifugación por 45 minutos a 1800 g, las células capturadas en rosetas permanecieron en el fondo del tubo, mientras que los monocitos, se localizaron en la interfase entre el plasma y el gradiente de Ficoll. El anillo de monocitos fue recogido y lavado dos veces con medio RPMI. El conteo de células y cuantificación de viabilidad se realizó en cámara de Neubauer utilizando tinción de azul de tripán. Las células fueron congeladas en medio RPMI+SFB 40%+DMSO 10% a -70°C hasta su uso. Los monocitos fueron descongelados en baño de maría a 37°C, lavados dos veces con medio RPMI incompleto, y contados en cámara de Neubauer usando azúl de tripán. En tubos de citometría, 5x105
monocitos fueron sembrados en 200 µL de los siguientes tratamientos preparados en medio AIMV:
• Pool de HABPs de las proteínas Rv1980c (31101, 31107) y Rv0679 (30979, 30987). • Pool de No HABPs de las proteínas Rv1980c (31100, 31102) y Rv0679c (30980, 30982). • Pool péptidos QTF. • Lisado Mtb (concentración final 100 µg/mL). • Medio AIMV (Control)
La concentración final de cada uno de los péptidos fue de 10 µM.
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Se realizó incubación por 48h a 37°C y 5% CO2. Se centrifugó a 1800 g por 7 minutos para realizar un lavado, y se llevó a cabo la marcación con Yoduro de propidio y Anexina V, de la misma forma en que fue descrito arriba. Se obtuvieron 10.000 eventos por muestra en un citómetro FACs Aria II. El análisis de los datos se realizó usando el software FlowJo 7.2. 6.8 Activación de linfocitos La evaluación de la activación de PBMCs, se realizó siguiendo el protocolo reportado por Martinuzzi y colaboradores ([142]. A partir de PBMCs descongelados, se realizó el conteo y estimación de viabilidad celular, mediante tinción por exclusión con azul de tripán. 1x106 células fueron sembradas por pozo en 100 µL de medio AIMV suplementado con IL4 (700 UI/mL) y GM-CSF (1.000 UI/mL) en cajas de 96 pozos de fondo plano. La adición de estas citoquinas se realizó con el fin de inducir la diferenciación de los monocitos contenidos en los PBMCs en células dendríticas. Adicionalmente, cada uno de los pozos fue tratado con un antígeno o mezcla de antígenos diferentes como se describe a continuación:
• Pool de HABPs de las proteínas Rv1980c (31101, 31107) y Rv0679 (30979, 30987). • Pool péptidos QTF. • Lisado Mtb (concentración final 100 µg/mL). • Solo medio AIMV+IL4+GM-CSF (Control).
Las células fueron incubadas a 37°C y 5% CO2 durante 24 horas y posteriormente se les agregó IL-1β (10 ng/mL), TNFα (10 ng/mL), IL6 (1.000 UI/mL) y PGE2 (1 µg/mL), con el fin de inducir la maduración de las células dendríticas. Adicionalmente, cada uno de los tratamientos fue suplementado con los mismos antígenos (a las mismas concentraciones) que habían recibido 24 horas antes. Se realizó una nueva incubación a 37°C y 5% CO2 por espacio de 24 horas, y se adicionó Brefeldina A, a una concentración final de 5 µg/mL. Las células fueron incubadas por 4 horas a 37°C, centrifugadas a 1800 g por 7 minutos, y los sobrenadantes retirados y almacenados -20°C. Se realizó un lavado adicionando 200 µL de PBS a cada uno de los pozos y posteriormente se realizó incubación de las células con 50 µL de los anticuerpos monoclonales anti-CD45RO-FITC, CD62L-PE-Cy5, CD27-APC, CD8-PE Texas Red, y CD3-PE-Cy7 (20 minutos a 4°C). Se realizó un lavado con PBS, y con el fin de realizar la marcación de INFγ intracelular, las células fueron resuspendidas e incubadas por 20 min a 4°C con solución de fijación y permeabilización (kit Cytofix cytoperm de BD). Se realizó un lavado con solución perm wash (proporcionada por el kit), y las células fueron resuspendidas e incubadas por 30 minutos a 4°C con 100 µL de anticuerpo monoclonal anti-INFγ-PE en buffer perm wash.
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Finalmente, se realizó un último lavado con solución perm wash, y las células fueron resespendidas en 400 µL de la misma solución, para llevar a cabo su lectura en el citómetro de flujo. Todos los procedimientos se realizaron evitando al máximo la exposición de los anticuerpos monoclonales a la luz, para evitar la pérdida de fluorescencia de los mismos. Se obtuvieron 100.000 eventos por muestra en un citómetro FACs Aria II. El análisis de los datos se realizó usando el software FlowJo 7.2. 6.8.1 Medición de citoquinas de perfil Th1 y Th2 A partir de los sobrenadantes, se realizó la medición de citoquinas secretadas, usando el kit CBA Th1/Th2 (BD Biosciences), que permite la detección de las citoquinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INFγ y TNF. El procedimiento realizado, fue el mismo especificado arriba para la medición de citoquinas pro-inflamatorias (ver apartado 6.7.3.1).
6.9 Análisis estadístico El análisis de los datos se realizó con ayuda del software para análisis bio-estadísticos GraphPad Prism. Para el análisis de las diferencias significativas entre los diferentes tratamientos, se aplicó la prueba estadística no paramétrica Mann-Withney de dos colas. Se usó un intervalo de confianza del 95%. Valores p menores a 0,05, fueron considerados como significativos, y menores a 0,01, altamente significativos.
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7. Resultados
7.1 Población de estudio y obtención de PBMCs La prueba de QTF fue realizada a un total de 45 personas, de las cuales 18 resultaron QTF positivas, y 27 negativas. De cada una de las personas fueron congelados 5 viales, con un promedio de 12’000.000 de PBMCs cada uno. Se construyó una base de datos con el número de los pacientes, fecha de toma de las muestras, resultado de la prueba QTF Gold, y número de PBMCs congelados por vial (Anexo 3). Adicionalmente se reunió información adicional de cada una de las personas, donde se especificó género, edad, antecedentes con tuberculosis, e información acerca de posibles fármacos que estén siendo administrados en el momento de la toma de la muestra (Anexo 4). Las edades de los voluntarios oscilaron entre los 20 y los 59 años, con un promedio de edad de 36±11,5 años. Un 73% de la población correspondió a mujeres y un 26% a hombres. Del total de la población muestreada, 40% resultó ser positiva para la prueba de QTF, de los cuales, 66,6% corresponde a personal científico que manipula cepas patógenas de M. tuberculoisis, 22,2% a personal de la salud que ha estado en contacto directo con pacientes enfermos con tuberculosis, y 11,1%, corresponde a personas que no tienen antecedentes conocidos de contacto con Mtb (Tabla 2). Tabla 2. Población de estudio. Características generales de la población muestreada a quienes se aplicó la prueba diagnóstica para Mtb. Un total de 45 personas fueron incluidas.
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7.2 Activación de monocitos 7.2.1 Separación de monocitos por selección positiva La eficiencia de la purificación de monocitos por selección positiva, se cuantificó mediante citometría de flujo usando anti-CD14-PE y anti-CD3-FITC. A partir de esto, se obtuvo un rendimiento del 90% (porcentaje de células CD14+ en la población total), y una contaminación con linfocitos cercana a 8%. El número de monocitos obtenidos, fue en promedio del 1% de los PBMCs totales y la viabilidad de las células estuvo por encima del 95%. 7.2.2 Inhibición de la invasión a monocitos humanos Los HABPs 30979, 30987, 31107 y 36827 de las proteínas Rv1980c y Rv0679c de Mtb, fueron evaluados en su capacidad para inhibir la invasión de Mtb a monocitos humanos. Los resultados mostraron que, al igual que ocurre en células U937, los HABPs son capaces de inhibir la invasión de Mtb H37Rv a monocitos humanos. Todos los HABPs fueron probados a concentraciones de 20 y 200 µM. Los porcentajes de inhibición fueron calculados con respecto a un control de invasión, tomado como 100%, en el que la bacteria y las células son incubadas sin ningún agente inhibitorio. Como control positivo de inhibición de la invasión, se utilizó citocalasina D (30 µM), un inhibidor de la polimerización de los filamentos de actina, que evita los movimientos del citoesqueleto y así la fagocitosis. Las células tratadas con citocalasina D, presentaron una inhibición de la invasión de 50%, porcentaje cercano al que se observa para células células U937 (Figura 8).
Figura 8. Inhibición de la invasión. A) Población de monocitos separados por selección positiva. B) Control de invasión, tomado como 100%. C) Control de inhibición de la invasión usando citocalasina D 10 µM.
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Para la proteína Rv0679c, el HABP 30979 (20 µM) mostró un efecto inhibitorio de la entrada de Mtb a monocitos humanos, con un 58,48% de inhibición (Figura 9). Por otra parte, a la menor concentración (20 µM) de este HABP, no se observó ningún efecto inhibitorio. El HABP 30987, fue capaz de inhibir la invasión en un 7,77% a una concentración de 20 µM, aumentando hasta 54,71% cuando fue usado a 200 µM. Respecto a la proteína Rv1980c, el HABP 36827 logró inhibir la invasión en un 60% a una concentración de 200 µM, y un 23,7% a 20 µM. El HABP 31107, también de Rv1980c, mostró porcentajes más bajos, de 16% y 23% a las concentraciones de 20 µM y 200 µM, respectivamente. Como control, fueron evaluados los péptidos no HABPs 30982 de Rv0679c, y 31100 y 31102, de Rv1980c. Ninguno de los péptidos fue capaz de inhibir la invasión de la micobacteria, excepto por el péptido 31102 que mostró un porcentaje de inhibición de 13,4% a una concentración de 20 µM. Este porcentaje sin embargo, decae con el aumento de la concentración a 200 µM, por lo que no parece un efecto directo del péptido sobre la entrada de la micobacteria (Figura 9).
Figura 9. Porcentajes de Inhibición de la invasión. Los porcentajes de inhibición son calculados a partir de un control de invasión. Se muestran los porcentajes de inhibición para los HABPs de las proteínas Rv1980c y Rv0679c de Mtb, tres péptidos no HABPs, y citocalasina D como control de inhibición. Las barras representan el error estándar. A partir de este ensayo pudimos observar que el efecto de inhibición de la invasión de Mtb mediado por los HABPs se conserva en monocitos humanos y que, al igual que ocurre en células U937, es específico solo de algunos HABPs. A partir de estos resultados, se continuó con la caracterización inmunológica de este pool de HABPs. 7.2.3 Maduración de células dendríticas Teniendo en cuenta la capacidad de los péptidos 31107, 36827, 30979 y 30987 de unirse con alta afinidad a receptores sobre los macrófagos, el efecto de esta interacción sobre monocitos humanos, en términos de maduración e inducción de apoptosis, fue evaluado. Las células dendríticas a las cuales les fue inducida la maduración utilizando el coctel de citoquinas (IL4, GM-CSF, IL-1β, TNFα, IL6 y PGE2), que de acá en adelante serán referidas como dendríticas
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maduras, mostraron un aumento en la expresión de los marcadores CD80 y CD83 (marcadores de maduración), con respecto a las células dendríticas inmaduras, a las cuales no se les aplicó ningún tratamiento de maduración (Figura 4). Para CD80, los valores de Intensidad Media de Fluorescencia (IMF), pasaron de un promedio de 311,4 en células inmaduras, a 1406,4 en células maduras. En el caso de CD83, la IMF pasó de un promedio de 607,7 en células inmaduras, a 3235,7 en células maduras (Figura 10A). Por otra parte, la expresión de CD209 decreció en células dendríticas maduras, cuando estas fueron comparadas con el control de células inmaduras, mostrando una IMF promedio de 367,2 y 226,4 respectivamente (Figura 4B). El posible efecto de los HABPs sobre la maduración de las células dendríticas, no fue evidente al medir la expresión de los marcadores CD209 y CD80. Para CD209, la IMF promedio fue de 400,1, y de 258,2 para CD80, muy cercanos a los valores encontrados para las células dendríticas inmaduras (367,2 y 258,2, respectivamente) (Figuras 10B y 10C). Para el caso de CD83, se observó una tendencia al aumento cuando las células dendríticas fueron estimuladas con el pool de HABPs de las proteínas Rv1980c y Rv0679c. Los promedios de la IMF pasaron de 607,7 en células inmaduras a 942,1 en células estimuladas con los HABPs (Figura 10D). Para ninguno de los tratamientos se encontraron diferencias estadísticamente significativas. Dado el aumento de la expresión de CD83 por parte de las células dendríticas incubadas con el pool de HABPs, cinco nuevos individuos fueron ensayados, esta vez realizando marcación con anti-CD83 solamente. En este ensayo, fue incluido un pool de cuatro péptidos que no presentan capacidad de unión a receptores sobre macrófagos, con el fin de evaluar si el efecto de los HABPs sobre la maduración es específico, y si está relacionado con su capacidad de unión a un receptor. Como resultado, se observó nuevamente un aumento en la expresión de CD83, cuando las células fueron estimuladas con el pool de HABPs (Figura 11A). Por el contrario, las células tratadas con el control de no HABPs (de las mismas proteìnas), no mostraron un aumento en la expresión de CD83, siendo de 401 (IMF promedio) para las células inmaduras y de 476,2 para las células tratadas con el pool de no HABPs. Para estos cinco nuevos individuos, el promedio de la IMF de CD83, aumentó a 508,3 cuando las células fueron incubadas con los HABPs.
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Figura 10. Maduración de células dendríticas. A) Los histogramas representan las diferentes intensidades de fluorescencia en el eje x, representando los diferentes niveles de expresión de los marcadores CD209, CD80 y CD83. Pool HABPs, corresponde a los cuatro péptidos de las proteínas Rv1980c y Rv0679c; Maduras, células estimuladas con coctel de citoquinas; Inmaduras, células no estimuladas. B) Intensidad media de fluorescencia (IMF) de CD209 en células dendríticas inmaduras, en las estimuladas con HABPs y en las maduras. C) IMF de CD80 en los tres grupos celulares. D) IMF de CD83 en los tres grupos celulares. A partir de estos resultados, se realizó un análisis completo teniendo en cuenta los ocho individuos ensayados (Figura 11B). Como resultado, se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión de CD83 en las células inmaduras (IMF promedio= 478,5) y las células
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maduras (IMF promedio= 2144,9) (Figura 11B). El promedio de expresión de CD83, también presentó diferencias estadísticamente significativas entre las células inmaduras y aquellas tratadas con el pool de HABPs, aumentando la IMF promedio a 671 con este tratamiento. El control de no HABPs, no presento diferencias significativas con el control de células inmaduras, confirmando el efecto específico de los péptidos con capacidad de unión a un receptor (Figura 11B).
Figura 11. Expresión de CD83. A) Histogramas representativos de las intensidades de fluorescencia para CD83. B) Promedio de la IMF de CD83 para los ocho individuos evaluados. Las barras representan en error estándar. * p<0,05; **p<0,01, ns= diferencias no significaticas. Continuando con la evaluación de los HABPs sobre la maduración de células dendríticas, se realizó la cuantificación de citoquinas inflamatorias secretadas por estas células, a partir de los sobrenadantes recolectados y congelados al día 7 del ensayo. Como se observa en la figura 12, se encontraron diferencias significativas entre las células dendríticas inmaduras y células dendríticas maduras para todas las citoquinas evaluadas, excepto para IL-12P70 (Figura 12E). Para la IL-8, se observaron diferencias significativas entre las células inmaduras y las tratadas con el pool de HABPs (Figura 12C). Se observaron también diferencias significativas entre las concentraciones de IL-1β secretadas por células inmaduras y células incubadas con el pool de no HABPs (12A).
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Figura 12. Perfil de citoquinas inflamatorias para células dendríticas. Citoquinas secretadas por células dendríticas sometidas a diferentes tratamientos de maduración. Las concentraciones son expresadas en pg/mL. A) IL-1β, B) IL-6, C) IL-8, D) IL-10, E) IL-12P70, F) TNF. Las barras representan el error estándar. * p<0,05; ***p<0,001. 7.2.4 Determinación muerte celular en monocitos humanos
7.2.4.1 Establecimiento de un control de muerte celular Para la evaluación de muerte por apoptosis, se evaluó un control positivo de muerte celular en monocitos humanos. Para esto se utilizó estaurosporina, un alcaloide bacteriano, que actúa como potente inhibidor de la Proteína-quinasa C. Diferentes tiempos y concentraciones de estaurosporina fueron evaluados. Para los tratamientos de 2 horas y 6 horas, pudo observarse una dinámica dependiente de la concentración de estaurosporina para los procesos de apoptosis tardía, apoptosis temprana y necrosis. Sin embargo, la dinámica es más evidente a un periodo de 6 horas, cuando se observó claramente una disminución en los porcentajes de apoptosis temprana, y aumento en los porcentajes de apoptosis tardía y necrosis, con el aumento de la concentración de estaurosporina (Figuras 13 y 14).
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Fig. 13. Dinámica de apoptosis a diferentes tiempos (2, 4, 6, 12 y 24 horas) y concentraciones de estaurosporina (0,1 µM, 0,5 µM, 2 µM y 5 µM). Comparación de porcentajes de apoptosis tardía, temprana y necrosis entre los diferentes tratamientos. Luego de tiempos de incubación más prolongados (12 y 24 horas), no se observó un comportamiento dependiente de concentración, y la viabilidad de las células decayó.
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Fig 14. Dot plot para apoptosis en monocitos humanos. Porcentajes de muerte celular en células incubadas durante 6 horas A) sin tratamiento de estaurosporina, B) con estaurosporina 0,1 µM, C) estaurosporina 0,5 µM, D) estaurosporina 2 µM y E) estaurosporina 5 µM.
7.2.4.1 Efecto de los HABPs sobre la muerte celular El efecto de los HABPs, fue evaluado en términos de su capacidad para inducir muerte celular en monocitos. El análisis de las poblaciones de muerte se realizó teniendo en cuenta la distribución de las poblaciones obtenidas mediante el ensayo con estaurosporina 6h, 2 µM. Como control de la inducción de apoptosis por Mtb, las células fueron incubadas con lisado de Mtb y el pool de péptidos de QTF. Como un control adicional, las células fueron incubadas con el pool
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no HABPs, con el fin de establecer el efecto específico de los péptidos de alta unión, sobre la muerte celular. Aún cuando no se observaron diferencias significativas en la inducción de muerte por apoptosis tardía entre monocitos expuestos a diferentes estímulos, si se observó una clara tendencia al aumento, en células de personas QTF positivas tratadas con lisado de Mtb (Figura 15A). Los porcentajes de apoptosis en este caso, pasaron de un 1,85% en el tratamiento control, a un 3,1% en células tratadas con el lisado. En cuanto a la inducción de apoptosis temprana (Figura 15B), se observó nuevamente una marcada tendencia al aumento en monocitos de personas QTF positivas tratadas con lisado total de Mtb (4,9% para el control y 9,1% para las células tratadas con lisado). Para ninguno de los tratamientos restantes, tanto en personas QTF positivas, como QTF negativas, se observó aumento de los porcentajes de apoptosis con respecto al control (Figura 15B). Como se observa en la figura 15C, los porcentajes de necrosis en monocitos de personas QTF positivas fueron en general, más elevados que los observados para personas QTF negativas. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas en monocitos de personas QTF positivas, pasando de 3,1% en el tratamiento control, a 5% en monocitos tratados con los péptidos de QTF. A diferencia de lo observado para apoptosis temprana y apoptosis tardía, el aumento de los porcentajes de necrosis en monocitos incubados con lisado de Mtb no fue evidente. Por su parte, los monocitos tratados con el pool de no HABPs, mostraron un aumento notorio en los porcentajes de necrosis (9,5%), aunque no presentaron diferencias estadísticamente significativas con respecto al control. El pool de HABPs no mostró un efecto sobre la inducción de muerte celular por apoptosis temprana ni por apoptosis tardía, tanto en personas QTF positivas, como QTF negativas. Solo para monocitos de personas QTF positivas se observó un aumento en el porcentaje de necrosis, siendo de 3,1% para el control, y 4,2% para monocitos tratados con el pool de HABPs. No se encontraron diferencias significativas entre estos dos tratamientos (Figura 15C).
Figura 15. Muerte celular de monocitos inducida por pool de péptidos de QTF, pool de HABPs y pool de no HABPs, en personas QTF positivas y QTF negativas. A) Porcentaje de células muertas por apoptosis tardía. B) Porcentaje de células muertas por apoptosis temprana. C) Porcentaje de células muertas por necrosis. Las barras representan el error estándar. * p<0,05.
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7.3 Activación de linfocitos Con el fin de evaluar el potencial antigénico de los HABPs, se realizaron ensayos de activación a partir de PBMCs de cinco personas QTF positivas y cinco personas QTF negativas. La población de individuos QTF positivos, será representativa de una respuesta inmune protectiva. Con este fin, se realizó la generación y maduración de células dendríticas a partir de monocitos contenidos en la fracción completa de PBMCs, a la vez que se realizó estimulación con los antígenos. Como controles, las células fueron estimuladas con lisado de Mtb, y pool de péptidos de QTF. Como control negativo, las células fueron incubadas en ausencia de algún antígeno. Todas las muestras de células utilizadas en este estudio (PBMCs), presentaron un porcentaje de viabilidad mayor al 70%, luego de ser descongeladas. Luego de realizar la marcación con anti- CD45RO-FITC, -CD62L-PE-Cy5, -CD27-APC, -CD8-PE Texas Red, y -CD3-PE-Cy7, se realizó el análisis de cada una de las poblaciones de interés. Inicialmente, la población de monocitos fue seleccionada de la muestra total, teniendo en cuenta los parámetros de complejidad (SSC-A) y tamaño (FSC-A) (Figura 16A). A partir de esta población, se llevó a cabo la selección de la fracción CD3+, correspondiente a la población de LT, y aquella CD4+, para seleccionar la fracción correspondiente a LT cooperadores. La población de LT CD8+, fue seleccionada por exclusión de los linfocitos CD4+ (Figura 16B). A partir de cada una de las poblaciones CD3+/CD4+ y CD3+/CD4- (referidas de acá en adelante como CD8+), se llevó a cabo el análisis de cada una de las poblaciones de células vírgenes, efectoras terminales, de memoria efectora y memoria central (Figura 16C). La producción de INFγ intracelular, fue cuantificada para cada una de las poblaciones de memoria por separado, para las poblaciones CD4+ y CD8+, y para la población de linfocitos en general (Figura 16D). Adicionalmente, se realizó el análisis de la expresión de CD27, para evaluar la activación y diferenciación de los linfocitos hacia un fenotipo efector (Figura 16E).
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Figura 16. Poblaciones de estudio. Representación general del análisis realizado en las diferentes poblaciones de linfocitos. A) Población de linfocitos discriminada por complejidad (SSC-A) y tamaño (FSC-A). B) Poblaciones CD3+/CD4+ y CD3+/CD4- (tomada como población de linfocitos CD8+). C) Poblaciones de memoria. Linfocitos vírgenes (CD62L+/CD45RO-), efectoras terminales (CD62L-/CD45RO-), de memoria central (CD62L+/CD45RO+) y de memoria efectora (CD62L-/CD45RO+). D) producción de INFγ intracelular en población CD3+. E) Análisis de expresión de CD27 por histogramas. 7.3.1 Análisis de linfocitos T CD4+ Para la población de LT CD4+ de personas QTF positivas, se encontraron diferencias significativas entre los porcentajes de INFγ intracelular producidos por células estimuladas con el pool de péptidos de QTF (0,46%), y células que no fueron estimuladas (0,25%) (Figura 17A). Diferencias estadísticamente significativas, fueron encontradas también entre el tratamiento control y el tratamiento con lisado de Mtb (0,42% de INFγ) en personas QTF positivas. Cuando fueron comparadas las poblaciones de individuos QTF positivos e individuos QTF negativos, se observaron diferencias significativas en la producción de INFγ, ante el estimuló de las células con el pool de péptidos de QTF. Para los individuos QTF negativos, la producción de INFγ fue de 0,20% en promedio, mientras que para los individuos QTF positivos, estos porcentajes aumentaron a 0,46%. Cuando las células fueron estimuladas con los HABPs, se observó una clara tendencia al aumento de la producción de INFγ (0,33%) entre personas QTF positivas.
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Los individuos QTF negativos en general, presentaron porcentajes más bajos de producción de INFγ que los individuos QTF positivos, independientemente del estímulo que se utilizara. No se observaron diferencias ni tendencias entre los tratamientos del grupo de individuos QTF negativos (Figura 17A). Cuando se realizó el análisis de las diferentes poblaciones de memoria, se observó que para los linfocitos vírgenes, los porcentajes de producción de INFγ, fueron notoriamente más elevados en individuos QTF positivos, que los porcentajes encontrados en individuos QTF negativos (Figura 17B). Diferencias estadísticamente significativas, se encontraron entre las células no estimuladas de los individuos QTF positivos, con un 0,37% de INFγ, comparado con un 0,19% en individuos QTF negativos. De igual manera ocurrió con células estimuladas con el pool de HABPs, con porcentajes de 0,50% en QTF positivos y 0,21% en QTF negativos, y células tratadas con el pool de QTF, pasando de 0,18% en individuos QTF negativos, a 0,55% en QTF positivos (Figura 17B). Aunque no significativamente diferente, también se observó un claro aumento en los porcentajes de producción de INFγ en células de individuos QTF negativos estimuladas con lisado de Mtb, y células de individuos QTF positivos, tratadas bajo el mismo estímulo (0,25% y 0,45%, respectivamente). El aumento en los niveles de INFγ, no solo fue observado cuando se comparó la población de individuos QTF positivos, con la población de individuos QTF negativos. Aunque en ausencia de diferencias estadísticas, se observó una marcada tendencia de los linfocitos de individuos QTF positivos, a activarse y producir mayores niveles de INFγ, cuando estos fueron estimulados con los diferentes antígenos de Mtb (Figura 17B). Esta tendencia fue observada tanto para los linfocitos estimulados con el pool de HABPs, como con el pool de péptidos de QTF y el lisado de Mtb (Figura 17B). Por otra parte, los linfocitos de memoria efectora (Figura 17C), mostraron diferencias significativas entre los porcentajes de INFγ producidos por linfocitos de personas QTF negativas, estimulada con el pool de péptidos de QTF, y linfocitos de personas QTF positivas, sometidas al mismo estímulo (promedios de 0,04% y 0,13%, respectivamente). Dentro de la población de individuos QTF positivos se aprecia un aumento en la producción de INFγ por parte de linfocitos estimulados con el pool de HABPs (0,13%), el pool de péptidos de QTF (0,14%), y el lisado de Mtb (0,12%), comparados con el control de células no estimuladas (0,07%) (Figura 17C). Para la población de linfocitos CD4+ de memoria central, no se encontraron diferencias significativas para ninguno de los tratamientos. Sin embargo se observó un aumento de la media de producción de INFγ, en células estimuladas con el pool de péptidos de QTF (en personas QTF positivas), con un promedio de 1,30%, y células estimuladas con lisado de Mtb, promedio de 1,10%, con respecto al control de células no estimuladas (0,84%) (Figura 17D). Por último, entre los linfocitos de fenotipo efector (Figura 17E), no se demostraron diferencias estadísticamente significativas, así como tampoco se observó alguna tendencia clara en la producción de INFγ por parte de los linfocitos estimulados con los diferentes antígenos.
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Figura 17. Porcentajes de INFγ intracelular, en linfocitos CD4+, y las diferentes subpoblaciones de memoria en individuos QTF positivos y QTF negativos. A) Población total de LT CD4+. B) LT CD4+ Vírgenes. C) LT CD4+ de Memoria efectora. D) LT CD4+ de Memoria central. E) LT CD4+ efectores terminales. Las barras representan en error estándar. * p<0,05; **p<0,01.
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7.3.2 Análisis de linfocitos T CD8+ Siguiendo con la evaluación de la producción de INFγ por parte de los linfocitos, se observó que para la población total de células CD8+, no existen diferencias significativas entre ninguno de los tratamientos. Se observó una tendencia de los linfocitos de individuos QTF positivos, a producir mayores cantidades de INFγ, en respuesta al estímulo con el pool de péptidos de QTF (0,46%), en comparación con los linfocitos no estimulados (0,26%) (Figura 18A). Para la población de LT CD8+ vírgenes, de individuos QTF positivos, se observó un aumento de la producción de INFγ, pasando de un 0,91% en linfocitos no estimulados, a 1,48% en linfocitos estimulados con lisado de Mtb (Figura 18B). En las poblaciones de linfocitos de memoria efectora, y linfocitos efectores terminales, no se observaron diferencias en la producción de INFγ entre ninguno de los tratamientos evaluados (Figuras 18C y 18E). Para la población de memoria central, se observaron diferencias en la producción de INFγ entre las poblaciones de individuos QTF positivos y QTF negativos. Diferencias significativas fueron observadas en células no estimuladas, arrojando un porcentaje de producción de INFγ de 0,00% en personas QTF negativas, y 0,73% en personas QTF positivas (Figuras 18D).
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Figura 18. Porcentajes de INFγ intracelular, en linfocitos CD8+, y las diferentes subpoblaciones de memoria en individuos QTF positivos y QTF negativos. A) Población total de LT CD8+. B) LT CD8+ Vírgenes. C) LT CD8+ de Memoria efectora. D) LT CD8+ de Memoria central. E) LT CD8+ efectores terminales. Las barras representan el error estándar. * p<0,05.
7.3.3 Expresión de CD27 La expresión de CD27, fue cuantificada teniendo en cuenta que la disminución en la expresión de este marcador, es un indicador de la activación de los linfocitos de memoria, y de su diferenciación hacia un fenotipo efector.
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Para la población de LT CD4+ totales (Figura 19A), se observaron medias de CD27 ligeramente mayores para los individuos QTFs negativos que para los individuos QTF positivos. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Solo para la población de memoria efectora CD8+, se observó una disminución significativa del porcentaje de expresión de CD27, pasando de 6,6% en células de personas QTF positivas estimuladas con el pool de HABPs, a 9,4% en células que no recibieron estímulo (Figura 19H). De la misma manera, se observaron diferencias significativas en la pérdida de CD27, al comparar la respuesta al estímulo con el pool de HABPs de personas QTF positivas (6,6%) y QTF negativas (14,5%) (Figura 19H).
Figura 19. Porcentajes de expresión de CD27. (A) Poblaciones totales de LT CD4+ y (B) linfocitos CD8+. (C) Poblaciones de linfocitos vírgenes CD4+ y (G) CD8+. (D) Poblaciones de linfocitos de memoria efectora CD4+ y (H) CD8+. (E) Poblaciones de memoria central CD4+ y (I) CD8+. (F) Poblaciones de linfocitos efectores terminales CD4+ y (J) CD8+. Las barras representan el error estándar. * p<0,05. 7.3.4 Perfil de citoquinas Th1-Th2 A partir de los sobrenadantes de los PBMCs estimulados con los diferentes antígenos, se llevó a cabo la medición de citoquinas de perfiles Th1 y Th2 secretadas al medio. Como resultados se observaron diferencias entre los niveles de producción de IL-2, por parte de la población de individuos QTF negativos (concentraciones entre 7,9pg/mL hasta 19,5pg/mL), en
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comparación con los individuos QTF positivos (22,3pg/mL-49,5pg/mL). Diferencias estadísticamente significativas, se observaron en las concentración de esta citoquina entre células de personas QTF positivas estimuladas con el pool de HABPs (37,2pg/mL), y células de personas QTF negativas sometidas al mismo estímulo (5,1pg/mL) (Figura 20A). Hubo diferencias significativas también entre personas QTF positivas y QTF negativas cuando se realizó el estímulo con el pool de péptidos de QTF (49,5 y 7,8pg/mL, respectivamente). Para la producción de IL-4, no se observaron diferencias entre las células estimuladas con los diferentes antígenos, ni entre las poblaciones de personas QTF positivos y QTF negativos (Figura 20B). Los niveles de producción de IL-6 fueron en mayores para personas QTF positivas que para las QTF negativas. Entre individuos QTF positivos, los niveles de producción de IL-6 disminuyeron significativamente para las células estimuladas con el pool de HABPs, pasando de 7882,8pg/mL en el control, a 5447,6pg/mL con este tratamiento (Figura 20C). Para personas QTF positivas, se observó una disminución de la producción de IL-10 entre el tratamiento control (18,2pg/mL) y el tratamiento con el pool de péptidos de QTF (4,7pg/mL). Diferencias significativas fueron encontradas entre las células no estimuladas y las células estimuladas con lisado de Mtb, aumentando los niveles de producción hasta 476,8pg/mL. También se encontraron diferencias significativas entre la producción e IL-10 por parte de células de personas QTF positivas y QTF negativas, cuando estas fueron estimuladas con el pool de péptidos de QTF (4,7pg/mL y 0,4pg/mL, respectivamente), y con el lisado total de Mtb (476,8pg/mL y 44,72pg/mL, respectivamente). Para la producción de INFγ, no se observaron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos ni poblaciones, excepto para células de personas QTF negativas y QTF positivas estimuladas con el pool de péptidos de QTF (5,6pg/ml y 59,7pg/ml, respectivamente). Sin embargo, la producción de INFγ fue en general, mayor en individuos QTF positivos, que en individuos QTF negativos. Igualmente, se observó un aumento en la producción de INFγ en células de personas QTF positivas estimuladas con los diferentes antígenos de Mtb, pasando de 26pg/mL en el control, a 44,5pg/mL para el pool de HABPs, y 73,9pg/mL para el lisado de Mtb (Figura 20E).
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Figura 20. Cuantificación de la producción de citoquinas de perfil Th1 – Th2. Citoquinas secretadas por PBMCs sometidos a los diferentes tratamientos. Las concentraciones son expresadas en pg/mL. A) IL-2, B) IL-4, C) IL-6, D) IL-10, E) INFγ, F) TNF. Las barras representan el error estándar. * p<0,05. Finalmente, para el grupo de individuos QTF positivos, se observó una disminución significativa de la producción de TNF entre células no estimuladas, con una concentración de 3640,5pg/mL, y células estimuladas con el pool de HABPs, con una concentración de 1038pg/mL.
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8. Discusión
Basados en el principio de desarrollo de una vacuna sintética, sub-unitaria, multi-estado propuesto por la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia, se ha iniciado para Mtb la identificación de proteínas implicadas en procesos invasivos. A partir de esto, ha sido posible identificar péptidos de alta unión específica a receptores sobre células U937, capaces de inhibir la invasión de la micobacteria a esta misma línea celular. Las proteínas Rv1980c y Rv0679, fueron seleccionadas en este estudio por tratarse de dos proteínas en las que han sido identificados HABPs con capacidad de inhibir la invasión de Mtb a macrófagos, en porcentajes mayores al 40%. La proteína Rv0679c es una proteína reportada como hipotética de membrana externa de la micobacteria y cuya localización sobre la superficie ha sido comprobada mediante microscopía inmuno-electrónica. Esta proteína parece estar asociada con moléculas de arabinomanano, lo que puede contribuir al establecimiento de una respuesta inmune inflamatoria. Por otra parte, la proteína Rv1980c es una proteína inmunogénica ampliamente estudiada como potencial componente de una vacuna subunitaria, y como potencial subunidad en el desarrollo de una prueba diagnóstica de tuberculosis activa. A partir de esto, los estudios adelantados por la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia han permitido avanzar en el conocimiento de estas dos proteínas, con la identificación de péptidos capaces de unirse específicamente a un receptor sobre los macrófagos y de inhibir en cierto porcentaje la entrada de la micobacteria. En el presente estudio, se realizó la evaluación antigénica de un conjunto de HABPs de estas dos proteínas, mediante la aplicación de una metodología sensible que permitió determinar la respuesta T antígeno-específica. De esta manera, se pretende que esta aproximación metodológica sea útil para la evaluación de futuras proteínas o segmentos de ellas, que permitan continuar con la selección de probables candidatos a una vacuna sub-unitaria contra la tuberculosis. 8.1 Población de estudio Como población de estudio, se trabajó con personas sanas que presentan infección con Mtb, y que representan una respuesta inmune protectiva capaz de mantener la infección en un estado de latencia. Como punto de referencia, se trabajó con una población de individuos que no presentaron infección con Mtb. La aplicación de la prueba de QTF Gold, permitió detectar 18 personas sanas infectadas con Mtb.
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La prueba de QTF Gold es una alternativa a la prueba de la tuberculina o PPD, que presenta mayor especificidad para el diagnóstico de la tuberculosis. Esta prueba diagnóstica, se basa en la cuantificación de la producción de INFγ por parte de linfocitos estimulados con antígenos específicos de Mtb, como la proteína secretada ESAT-6 (del inglés: Early Secreted Antigenic Target 6), CFP-10 (del inglés: Culture Filtrate Protein 10) y TB7.7. En Colombia, donde las tasas de incidencia están entre 25-49 casos/100.000 pobladores, las probabilidades de estar en contacto con micobacterias ambientales y de haber sido vacunado con BCG son elevadas, siendo esta última, parte del régimen de vacunación para infantes recién nacidos. La prueba diagnóstica QTF, no presenta reactividad cruzada con la vacuna BCG, ni con otras micobacterias ambientales, por lo que el uso de esta herramienta fue útil para el diagnóstico de infección con Mtb. 8.2 Capacidad inhibitoria de los HABPs A partir de los resultados, pudimos observar que la capacidad inhibitoria de los péptidos es similar entre las células U937 y los monocitos humanos. Se observó para el HABP 30979 a una concentración de 200 µM, que la capacidad inhibitoria en monocitos fue de cerca del 60%, una actividad mayor a la observada por Cifuentes y colaboradores para células U937, en donde observaron porcentajes de inhibición de 40% a la misma concentración [43]. Para el HABP 30987, se obtuvo una inhibición de la invasión a monocitos cercana al 55%, comparable con la reportada en células U937, de cerca del 40%. Para el HABP 31107, se encontraron porcentajes de inhibición en monocitos de cerca de 28% a una concentración de 200µM, mientras que para células U937 fue de 62% [6]. Por último, el HABP 36827 (reportado en previas publicaciones como 31101), mostró un porcentaje de inhibición de 60%, muy cercano a los porcentajes reportados previamente, que fueron de 65% para células U937 [6]. Los péptidos restantes, 30982, 31100 y 31102, que no representan péptidos de alta capacidad de unión específica, no mostraron porcentajes de inhibición mayores a 15%, lo que demuestra que esta característica es solo de péptidos que presentan alta unión específica a un receptor sobre el macrófago. Los cambios observados en los porcentajes de inhibición de la invasión para células U937 y monocitos humanos, pueden estar relacionados con el diferente número de receptores que se expresen sobre la línea celular transformada y la línea celular primaria. Partiendo de esta actividad de inhibición de la invasión conservada entre células U937 y monocitos humanos no transformados, se decidió continuar con la evaluación de su potencial antigénico en personas con la infección latente y personas sanas no infectados. 8.3 Maduración de células dendríticas Teniendo en cuenta la capacidad de los HABPs para unirse específicamente a receptores sobre las células U937 y de inhibir la entrada de la micobacteria, tanto a esta línea celular como a monocitos humanos, se evaluó el efecto de esta interacción con su receptor, en términos de la inducción de la maduración en células dendríticas.
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El uso de GM-CSF e IL-4 para la generación de células dendríticas a partir de monocitos, y de estímulos pro-inflamatorios para su maduración, ha sido reportado por diferentes autores como un mecanismo efectivo para obtener células dendríticas con una capacidad estimulatoria completa [143, 144]. Para la evaluación de la maduración de las células dendríticas, se esperaba un fenotipo de superficie CD80Alto, CD83Alto, y CD209Bajo. Como resultado, se observó un aumento de la expresión de CD83 (Figura 11, página 62), cuando las células dendríticas inmaduras fueron estimuladas con el pool de HABPs. Los péptidos control (no HABPs de las proteínas Rv1980c y Rv0679c), no indujeron maduración de las células, lo que permite establecer que este efecto fue específico de los péptidos que se unen con alta afinidad a su receptor. Aunque la función exacta de CD83 no se conoce, muchos patógenos como el virus de herpes simple han mostrado interferir con la expresión de CD83 en células dendríticas infectadas, lo cual interfiere con la consecuente estimulación de las células T [145]. En experimentos en donde se impide la expresión de CD83, la capacidad estimulatoria de células dendríticas es inhibida [145]. En respuesta a Mtb, se ha observado que la proliferación de células T, es dependiente de la maduración de las células dendríticas [146]. Otros estudios han demostrado que la expresión de CD83, es importante para la activación de células T CD8+, exhibiendo un incremento en la citotoxicidad [147]. En cuanto a la expresión de CD83 en células dendríticas, se sabe que su transcripción es inducida por NF-κB, y que esta ruta de señalización es crucial durante la inducción de una respuesta inmune adaptativa [148]. Por otra parte, se ha reportado que el TNF es un importante inductor del promotor de la expresión de CD83 [149]. Señales tales como agonistas de TCRs o citoquinas pro-inflamatorias, han sido reportadas como activadores de NFκB en células dendríticas, desencadenando la expresión de esta molécula de superficie, además de otros factores como citoquinas proinflamatorias y quimioquinas [150]. En este trabajo, no fue posible relacionar el perfil de expresión de citoquinas con la inducción de la expresión de CD83. Sin embargo, este es un tema que reviste una gran importancia para la inducción de la maduración de células dendríticas, y por ende para la modulación de la respuesta inmune, que debe ser explorado a profundidad, en busca de la identificación de posible rutas de activación implicadas. Las células dendríticas, juegan un rol determinante en la génesis de la respuesta inmune. La interacción inicial entre las células T vírgenes y las células dendríticas, y el consiguiente ambiente de citoquinas generado, influencian críticamente la calidad de la respuesta [151]. A partir de la evaluación de la producción de citoquinas de perfil inflamatorio, se observó para todas las citoquinas, excepto para la IL-12P70, diferencias significativas entre los controles de células dendríticas inmaduras y células dendríticas maduras. Solo para la IL-8, se observaron diferencias significativas entre las células dendríticas inmaduras y las células estimuladas con el pool de HABPs (Figura 12, página 63). La IL-8 es una quimioquina que ha sido ampliamente relacionada con el reclutamiento de linfocitos hacia el granuloma, [124]. Estudios in vivo han mostrado que el pre-tratamiento con anti-IL8 puede inhibir la formación del granuloma [152]. Por otra parte, a nivel celular, se ha observado que la IL-8, es un importante estímulo de la fagocitosis
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de Mtb por monocitos humanos [153, 154]. IL-8 está involucrada en la quimio-atracción de neutrófilos y reclutamiento de monocitos y células T [155]. En este sentido, el aumento de la producción de esta citoquina mediada por los HABPs, podría relacionarse con el control de la infección en estado de latencia. No obstante, experimentos adicionales son necesarios para corroborar esta hipótesis. 8.4 Inducción de muerte celular La apoptosis ha sido reconocida como un componente de la respuesta protectiva del hospedero en respuesta a ciertas infecciones intracelulares. Cuando las células blanco son infectadas con el parásito intracelular, la apoptosis limita los recursos disponibles para su replicación y reduce las consecuencias de la necrosis celular [34]. Algunos microorganismos como Mtb, han desarrollado mecanismos para evitar su eliminación y son capaces de sobrevivir e incluso replicarse dentro de las células fagocíticas. Si bien el granuloma provee una barrera importante para evitar la diseminación de la enfermedad, el bacilo no es totalmente erradicado por medio de esta respuesta. La eliminación completa de la micobacteria involucra inmunidad celular, en la cual células T reactivas a Mtb, son capaces de activar los macrófagos con el fin de aumentar la muerte intracelular del bacilo. Ha sido demostrado que la inducción de apoptosis de células infectadas con Mtb, es dependiente de la producción de TNFα. Algunos datos indican que la micobacteria puede desencadenar la producción de IL-10, inhibiendo la función de TNFα y suprimiendo la respuesta apoptótica [36]. Solo para monocitos de individuos QTF positivos, tratados con el lisado de Mtb, se observó un aumento en la muerte por apoptosis temprana y apoptosis tardía, cuando estos son comparados con monocitos no estimulados. Para los demás tratamientos de estimulación de las células, no se observaron cambios importantes en el tipo de muerte celular en comparación con el control. Como será discutido más adelante, el pool de HABPs no indujo la producción de TNFα, por tanto la generación de muerte por apoptosis pudo ser inhibida de esta forma (Figura 20, página 78). El pool de HABPs, tampoco provocó la muerte de monocitos mediante necrosis celular (Figura 15, página 67). Algunos autores, señalan que la muerte por apoptosis parece estar restringida en su mayoría a macrófagos maduros [34]. Es posible que esta condición haya impedido detectar la inducción de apoptosis mediada por los diferentes estímulos, ya que el trabajo se realizó solo a partir de monocitos sin ningún estímulo previo de maduración. 8.5 Activación de linfocitos Con el fin de realizar un análisis completo de la capacidad de los HABPs de las proteínas Rv1980c y Rv0679c de inducir activación de los linfocitos, se siguió una metodología a partir de la cual
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fueron analizadas las poblaciones de LT CD4+ y CD8+, y cada una de las diferentes poblaciones de memoria, linfocitos vírgenes y linfocitos efectores. La baja frecuencia de células T específicas presentes en sangre para un antígeno particular, representa una de las mayores dificultades para la evaluación de una respuesta de células T antígeno-específica. Esta necesidad ha sido suplida en cierta medida con el desarrollo de técnicas de detección altamente sensibles, como el ensayo de puntos por inmunoabsorción unido a enzimas–ELISPOT (del inglés: Enzyme-Linked Inmunosorbent Spot) y la citometría de flujo [142]. Sin embargo, en muchos casos es necesaria la aplicación de técnicas adicionales que permitan la amplificación y detección de una respuesta antígeno-específica, como es el caso de la expansión preliminar de las células T. El inconveniente que muchas veces presentan estas técnicas, es el requerimiento de tiempo y manipulación adicional, que pueden generar resultados sesgados [156]. La metodología aplicada en este trabajo, está basada en la alta capacidad que tienen las células dendríticas de llevar a cabo la presentación de antígenos, en comparación con otras células presentadoras contenidas en la fracción completa de PBMCs. En este sentido, se esperaba que los péptidos se unieran a las moléculas del MHC clase II dispuestas sobre la superficie de las células dendríticas. Si bien no ha sido totalmente esclarecido en humanos, Santambrogio y colaboradores, proponen que las células dendríticas podrían expresar grandes cantidades de moléculas del MHC clase II libres sobre su superficie, permaneciendo estables aún en ausencia de un péptido unido [157]. Con este propósito, la fracción de PBMCs completa fue incubada por 24h con los diferentes antígenos, y a su vez con agentes inductores de diferenciación de monocitos (IL-4 y GM-CSF). GM-CSF parece ser requerido para la supervivencia y diferenciación de monocitos in vitro, mientras que la IL-4 induce diferenciación a partir de monocitos humanos, ejerciendo una función inhibitoria sobre la diferenciación a macrófagos [158]. En este punto, las células dendríticas inmaduras son células fagocíticas activas, con un fenotipo de presentación de antígenos deficiente. Como será comentado más adelante, estas células dendríticas inmaduras podrán llevar a cabo procesos de micropinocitosis, macropinocitosis activa, y fagocitosis mediada por receptores, en donde podrán tomar una gran variedad y cantidad de antígenos solubles [159]. Luego de estas primeras 24 horas de inducción de diferenciación de las células dendríticas inmaduras y estímulo con los diferentes antígenos, los agentes de maduración fueron adicionados. Dauer y colaboradores en 2003, observaron que cuando los mediadores pro-inflamatorios TNFα, IL1β, IL-6 y PGE2 son adicionados después de las 24 horas de cultivo con GM-CSF e IL-4, las células despliegan un fenotipo de células dendríticas completamente maduras (CD83+, CD40+, CCR7+, CD14-, CD80+, CD86 High MHC clase II High) [160]. Las células dendríticas maduras presentan una baja capacidad fagocítica y una elevada expresión de MHC clase II. En este punto, la presentación de los antígenos previamente internalizados es más eficiente. La activación de los linfocitos, fue establecida a partir de la medición de producción de INFγ, siendo esta citoquina crítica para el establecimiento de una respuesta protectiva contra la tuberculosis [108, 109]. El INFγ parece estar relacionado con la activación de las células fagocíticas
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para destruir la micobacteria intracelular, mediante la activación de un mecanismo bactericida [159]. A partir de los resultados obtenidos, se observó que los controles utilizados para la producción de interferón gamma fueron efectivos. El control de lisado de Mtb se llevó a cabo con el fin de exponer los linfocitos a una variedad de antígenos a los que el individuo pudo estar expuesto al momento de la infección. Por otra parte, el control del pool de péptidos de QTF, permitió trabajar bajo parámetros de estimulación muy similares a los de los antígenos que se proponen en este estudio, trabajando en los dos casos con antígenos de naturaleza peptídica, que para el caso de los péptidos de QTF se sabe, generan una respuesta de LT antígeno-específica. Con la aplicación de los controles positivos (pool de péptidos de QTF y lisado de Mtb) se esperaba la activación de linfocitos de individuos QTF positivos, y la no respuesta por parte de linfocitos de individuos QTF negativos. En la figura 17A (página 72), se observa que la respuesta a estos dos antígenos fue efectivamente más alta en células de individuos QTF positivos, que en individuos QTF negativos. Se observó que el pool de HABPs es capaz de producir un aumento en la producción de INFγ a partir de células T CD4+ de individuos QTF positivos, principalmente a partir de las poblaciones de células vírgenes y de memoria efectora. Sin embargo, un efecto de los HABPs sobre la producción de INFγ en células T CD4+ de memoria central, aunque menos evidente, también se encontró (Figura 17). Las células de memoria difieren de las células vírgenes tanto en los perfiles fenotípicos, presentando diferentes patrones de expresión de marcadores de superficie, como en los perfiles funcionales, respondiendo de forma diferente a antígenos previamente vistos. Las células T de memoria típicamente presentan una mayor capacidad proliferativa y actividad efectora que las células T virgen en respuesta a antígenos previamente vistos [78]. De acuerdo con esto, es interesante ver cómo a partir del estímulo con los diferentes antígenos de Mtb, las células de personas QTF positivas generaron una respuesta de memoria esperada. Este hecho indica que durante la infección con la micobacteria, los antígenos fueron probablemente reconocidos por LT vírgenes, que luego de su activación, generaron LT antígeno-específicos de memoria. Sin embargo, se observó también para esta misma población de estudio, una respuesta importante por parte de la población de células vírgenes. Lisby y colaboradores, observaron este mismo fenómeno cuando estudiaban la proliferación de células vírgenes y de memoria en respuesta al Níquel. Ellos argumentan que una posible reversión de CD45RO a CD45RA, puede estar mostrando este fenotipo de células vírgenes activadas [161]. Este concepto es soportado por las observaciones de la regulación cíclica de la expresión de las isoformas CD45 en cultivos in vitro de células T. Sin embargo, aún no es claro si este fenómeno también ocurre in vivo [162]. Se sabe que tras el reconocimiento del antígeno, las células vírgenes con un fenotipo de superficie CD45RA+, cambian la expresión a su isoforma CD45RO+, mostrando un fenotipo de linfocitos de memoria. Sin embargo, este cambio que en principio parecía ser uni-direccional e irreversible, parece ser cíclico y reversible. De esta forma, una vez la célula ha
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adquirido el fenotipo de memoria, pueden retornar a la expresión de la isoforma CD45RA+, que típicamente correspondería a una célula virgen [162]. En este sentido, es posible que durante la primera activación de los LT con Mtb, en el momento de la infección, estos hayan adquirido el fenotipo de memoria, que luego en algunas células pudo revertir, dando paso a la expresión de CD45RA. De esta forma, al realizar el análisis, se encontrarían células que presuntamente corresponden a células de memoria, con un fenotipo de superficie de células vírgenes productoras de INFγ. En concordancia con esto, se sabe que típicamente las células de memoria producen altos niveles de citoquinas como la IL-2, IL-4 e INFγ, mientras que las células vírgenes producen altos niveles de IL-2, pero solo pequeñas trazas de IL-4 e INFγ [78]. De acuerdo con esto y con los resultados obtenidos, es probable que parte de las células que fueron observadas como células vírgenes productoras de INFγ, realmente correspondan a células de memoria activadas por el reconocimiento de un antígeno previamente visto. Por otra parte, esta importante respuesta por parte de células T vírgenes, puede estar soportada por las observaciones hechas por Dauer y colaboradores, que demuestran que las células dendríticas de dos días, no solo son capaces de estimular una respuesta a antígenos previamente vistos, sino que también son capaces de iniciar una fuerte respuesta primaria efectiva, basados en la alta proliferación que observaron para células vírgenes [160]. Peachman y colaboradores también observaron que mientras los macrófagos son generalmente eficientes en la re-estimulación de células T y B, las células dendríticas son eficientes en la activación de células T CD4+ y CD8+ vírgenes [163], lo que podría contribuir a la importante respuesta observada en la población de células vírgenes. Es importante rescatar que la respuesta a los diferentes estímulos estuvo dada exclusivamente por parte de las personas QTF positivas (Figura 17B, 72). Para personas QTF negativas, la activación y producción de INFγ, presentó niveles basales en respuesta a cualquiera de los estímulos. Esto demuestra la alta especificidad de la respuesta, principalmente de memoria, generada hacia los antígenos exclusivos de Mtb. La capacidad del pool de péptidos de QTF, de inducir una fuerte producción de INFγ a partir de células T CD4+ vírgenes, de memoria efectora y de memoria central, resalta el potencial antigénico de las proteínas incluidas en esta prueba. Estas proteínas, además de ser utilizadas como método diagnóstico, han sido evaluadas por otros autores, solas o en combinación con otras proteínas antigénicas, como potenciales candidatos a una vacuna contra la tuberculosis [164-166]. En las poblaciones de memoria efectora y memoria central, se observó un aumento en la producción de INFγ por parte de células de personas QTF negativas, cuando éstas fueron estimuladas con el lisado de Mtb. Esta respuesta, puede estar relacionada con el hecho de que más del 90% de la población del país ha recibido la vacuna BCG, y por tanto puede haber reconocimiento cruzado de antígenos compartidos entre Mtb y M. bovis – BCG.
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En lo referente a la perdida de CD27, o diferenciación de las células hacia un fenotipo efector, se observó que para las poblaciones de linfocitos CD4+ totales, CD4+ vírgenes y CD4+ de memoria efectora, las medias son más bajas (aunque no significativamente) para la población de personas QTF positivas, en comparación con personas QTF negativas (Figuras 19A, 19C y 19D, página 76). Este perfil de pérdida de CD27, fue congruente con los porcentajes de células productoras de INFγ analizados arriba, que fueron mayores en personas QTF positivas. Además de diferenciarse en células CD45RO+ y CD45RO- [167], otros marcadores de superficie (como CD27) han sido identificados en los LT CD4+ de sangre periférica en humanos, los cuales se encuentran regulados diferencialmente durante la activación de las células T [78]. CD27 pertenece a la familia de receptores de TNF, y es expresado por todas las células T CD4+ vírgenes y por el 80% de las células CD4+ de memoria. La pérdida de CD27 ha sido reportada por ser una característica de inducción de células CD4+ y CD8+ hacia un fenotipo efector [84]. Schiott y colaboradores, basados en las propiedades funcionales, así como en los perfiles transcripcionales, observaron que CD27 provee una clara división de la población de memoria en células respondedoras versus células en reposo [85]. Sus resultados mostraron que la población de memoria CD27-, es una población más diferenciada, con altos niveles de secreción de citoquinas efectoras, y una fuerte respuesta hacia antígenos previamente vistos, comparada con la población CD27+ [85]. Las células CD27- se encuentran en un estado más activado que la población de células CD27+ [168]. Los genes sobre-regulados en poblaciones de células CD27-, están más relacionadas con la diferenciación celular. Estos genes son por ejemplo T-bet (un factor de transcripción Th1, de unión al promotor de INFγ) [169], y GATA-2 (conocido por inducir GATA-3, un factor de transcripción Th2 que eleva la producción e citoquinas como IL-4 y la IL-5) [170]. De acuerdo a los resultados de este estudio y en concordancia con los estudios citados, las poblaciones de células de personas QTF positivas que mostraron mayor pérdida de la expresión de CD27, corresponden a las poblaciones con mayor producción de INFγ. A pesar de que las células CD4+ han sido ampliamente estudiadas y catalogadas como clave en la respuesta inmune contra la tuberculosis, recientemente el papel de las células CD8+ ha ganado importancia. A partir de los análisis realizados sobre la población de linfocitos CD8+, se observó que en general, la activación de esta población celular fue menor que la observada para la población de células T CD4+. Diferencias en la activación de linfocitos CD8+ fueron observadas solo para la población de memoria efectora. De acuerdo con los perfiles de expresión de CD27, cuando las células de personas QTF positivas fueron estimuladas con el pool de HABPs, se observó una mayor diferenciación y activación de las células T CD8+ de memoria efectora (Figura 19, página 76). Estos resultados se correlacionan a su vez con los resultados obtenidos para la producción de INFγ, en donde se observa un aumento del porcentaje de células de memoria efectora productoras de INFγ en las personas QTF positivas, en comparación con las personas QTF negativas (Figura 18, página 74). Este aumento de las medias de
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INFγ intracelular, se observó principalmente para las células estimuladas con el pool de péptidos QTF y con el pool de HABPs (Figura 18 C, página 74). Existe evidencia creciente de que células CD8+ secretoras de INFγ y TNFα son capaces de activar los mecanismos micobactericidas de los macrófagos [171]. Adicionalmente, las células T CD8+ pueden llevar a cabo funciones citotóxicas, lisando células infectadas y liberando la bacteria para su muerte extracelular o para su posterior toma por macrófagos activados [172]. Estudios realizados en células CD8+ en humanos, han demostrado que estas células son capaces de montar una respuesta citolítica cuando son estimuladas con micobacteria. En el modelo murino, Cooper y colaboradores observaron que ratones knockout para la ruta Fas y la producción de perforinas y granzimas (característicos de células CD8+), son más susceptibles a la infección con Mtb que los ratones silvestres, al menos durante la infección aguda temprana [173]. En otros trabajos, se ha observado que la inmunidad pasiva con células T CD8, ha sido dependiente de su habilidad para secretar INFγ [174]. La caracterización de antígenos contra los cuales las células T CD8 responden aún no ha sido ampliamente caracterizada. Algunos de los antígenos conocidos son dos péptidos de la proteína ESAT-6 y un péptido de la proteína de 19kDa [175, 176], y otros estudios han sido enfocados en otras, como la proteína de 38kDa, Ag85 y la proteína de choque térmico-65 [171]. Si bien no se esperaba una respuesta por parte de las células CD8+ debido al tamaño de los péptidos sintéticos (20 aminoácidos), que no serían cargados sobre una molécula del MHC I, la población de células T CD8+ de memoria efectora en respuesta a los HABPs fue evidente. Otros autores, han reportado la activación de células T CD8+ a partir de péptidos de 20 aminoácidos. Smith y colaboradores, realizaron el mapeo del Antígeno 85A, identificando péptidos capaces de reaccionar con células T CD8+ [171]. Debido a que no se llevó a cabo la separación y estímulo de las poblaciones de linfocitos CD4+ y CD8+ independiente, no podemos argumentar que haya ocurrido presentación de los péptidos en el contexto del MHC clase I. Sin embargo, podemos inferir que una posible activación de las células CD8 haya sido mediada por células CD4+ activadas, que hayan llevado a cabo la producción de citoquinas como IL-2, y finalmente hayan generado la activación de esta población celular. Por otra parte, la posibilidad de que los péptidos tanto del pool de HABPs, como del pool de péptidos de QTF (que en los dos casos superan los 11 aminoácidos que acepta como máximo una molécula de MHC clase I), hayan sido presentados en el contexto del MHC clase I, puede estar relacionado con la ocurrencia de presentación cruzada de los antígenos. Se sabe que las células dendríticas inmaduras pueden capturar antígenos mediante tres mecanismos: la macropinocitosis, la fagocitosis y la endocitosis mediada por clatrina [177]. Ehrenreich and Cohn, demostraron la internalización de los péptidos a partir de un proceso de pinocitosis en macrófagos [178]. En este sentido, los péptidos internalizados pueden ser filtrados hacia el citosol, clivados por el proteasoma y transportados al retículo endoplasmático por una ruta que puede ser dependiente o independiente de TAP [179, 180]. Estos péptidos se unirán a moléculas del MHC I, entrarán al complejo de Golgi y serán transportados hacia la superficie celular, en donde interactuarán con el receptor de células T CD8+ [179]. Existe evidencia que muestra que la permeabilidad de la membrana del fagosoma de
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macrófagos infectados puede ser una ruta para la difusión de antígenos hacia el citosol y la presentación de antígenos a células CD8+ [171]. Sin embargo, las células dendríticas pueden contener también un sistema especializado de translocación para exportar antígenos internalizados al citosol [181]. Estudios han demostrado que células dendríticas derivadas de ratón y diferenciadas por GM-CSF, puede llevar a cabo presentación cruzada. Uno de estos casos es la presentación de péptidos de ovoalbumina a células CD8+, luego de haber sido localizados en el macropinosoma mediante seguimiento con peroxidasas [182, 183] Otra alternativa para que estos péptidos puedan producir activación de células T CD8+, es que los antígenos sean cargados externamente en moléculas MHC clase I sobre la superficie de la célula dendrítica. Santambrogio et al, mostraron que las células dendríticas, a diferencia de las células B, son capaces de proteo-lisar antígenos a través de la secreción de serin-proteasas [157]. De esta forma, péptidos de 20 aminoácidos pueden ser procesados desde el exterior de la célula y unirse al MHC clase I en el tamaño apropiado. A partir del estímulo de células de personas QTF positivas, la respuesta por parte de la población de memoria efectora, tanto en células T CD4+ como CD8+, fue relevante en respuesta a los diferentes estímulos con antígenos de Mtb. La importancia de las poblaciones de LT de memoria efectora en la protección contra procesos infecciosos, radica en su habilidad de desplegar funciones efectoras en los tejidos periféricos, a diferencia de los LT de memoria central, que permanecen preferencialmente en los órganos linfoides secundarios con una baja actividad efectora. LT CD8+ de memoria efectora llevan a cabo la producción de grandes cantidades de perforina, y tanto CD4+ como CD8+ producen INFγ, IL-4 e IL-5 luego de ser estimulados con un antígeno [184]. A partir de los resultados presentados en este trabajo, esta actividad mencionada de los LT de memoria efectora, fue observada dentro de las poblaciones de LT CD4+ y CD8+, con un aumento en la producción de INFγ. Por su parte, la activación de los LT efectores terminales, no mostró una activación importante en respuesta a los diferentes estímulos, lo que podría estar relacionado con el corto tiempo de cultivo, que pudo limitar la diferenciación de las células de memoria central a células con un fenotipo efector. Para tuberculosis, diferentes autores han descrito la importancia de la población de memoria efectora en respuesta a la infección con Mtb. Fenniri y colaboradores, observaron que la proporción de LT polifuncionales específicos para Mtb, estuvieron representados en su mayoría por LT de memoria efectora [185]. Otros estudios en ratón, han demostrados que tras la vacunación con BCG, esta población de memoria efectora es más elevada en comparación con la población de LT de memoria central [186]. Para tuberculosis, ha sido demostrado que el ambiente de citoquinas en el foco de infección de Mtb, determinará el desarrollo o la contención de la enfermedad en un estado de latencia [187]. Generalmente, es aceptado que una respuesta inmune celular de tipo Th1, es la responsable de la inmunidad protectiva contra la tuberculosis, mientras que una respuesta de tipo Th2, es relacionada con el desarrollo y progresión de la enfermedad [188, 189]. Citoquinas de perfil Th1 (INFγ, TNFα e IL-2) promueven la proliferación, maduración y activación de macrófagos y granulocitos, mientras que citoquinas de perfil Th2, como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 promueven la producción de
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anticuerpos, a la vez que suprimen una respuesta tipo Th1, importante para el control de la tuberculosis [96]. La utilización de la herramienta para la detección de múltiples citoquinas mediante citometría de flujo, CBA, permitió realizar el análisis conjunto de seis citoquinas, evitando el sesgo que trae una mayor manipulación de las muestras y su análisis por separado [190]. Como respuesta al estímulo con el pool de HABPs y el pool de péptidos de QTF en personas QTF positivas, se observó un aumento en la producción de IL-2, lo que sugiere la inducción de la proliferación y diferenciación de células T antígeno-específicas de memoria. Estudios previos han mostrado resultados similares en respuesta a los péptidos de QTF [191]. Por otra parte, se observó que en personas QTF positivas los niveles de IL-6 fueron, en general, más elevados que para personas QTF negativas. Este aspecto puede estar relacionado con la observación de algunos autores, acerca de la importancia de la IL-6 en el mantenimiento de la infección en un estado de latencia [96]. Esta citoquina parece derivar la diferenciación de células T hacia un perfil Th17, caracterizado por la producción de IL-17, IL-21, IL-22 e IL-17. La producción de estas citoquinas induce la producción de defensinas, así como el reclutamiento de neutrófilos y monocitos al sitio de la inflamación, importante en el control de la infección en estadios tempranos [192]. Para personas QTF positivas, se observó sin embargo, una disminución de la producción de IL-6 en respuesta al pool de HABPs. Nagabhushanam y colaboradores, demostraron que la alta producción de IL-6 puede generar la inhibición de la activación de los macrófagos en respuesta al INFγ, evitando la destrucción de la micobacteria [193]. En este sentido, la disminución de la IL-6 mediada por lo HABPs estaría contribuyendo a una respuesta protectiva, permitiendo la activación de los macrófagos. Con respecto al estudio de Saunders y colaboradores, mencionado previamente, la importancia de la IL-6 en la respuesta contra la tuberculosis, parece estar limitada a estadios tempranos de la infección, por tanto la disminución de esta interleuquina durante estadios posteriores, no tendría implicaciones negativas sobre el mantenimiento de la enfermedad latente. Respecto a la IL-10, esta citoquina ha sido ampliamente relacionada con la persistencia de Mtb, y la reactivación de la enfermedad [194]. Sin embargo, estas conclusiones han sido establecidas a partir de trabajos comparativos entre personas que presentan la enfermedad activa y personas sanas. Si bien se observó que las personas que presentan infección con Mtb, produjeron mayores cantidades de IL-10 respecto a las personas no infectadas, en este estudio no se estableció comparación con personas con la infección activa, para las que se suponen valores muy superiores. Al-Attiyah y colaboradores, encontraron que personas sanas expresan niveles de IL-10 entre 200 y 400pg/mL cuando son estimuladas con diferentes antígenos secretados de Mtb, y muestran un aumento en la producción hasta cerca de 800pg/mL, cuando son estimuladas con lisado completo de Mtb [195]. Es este estudio, también pudo evidenciarse un aumento de IL-10 cuando las células de personas sanas QTF positivas y negativas fueron estimuladas con el lisado de Mtb. Este aumento en la producción de IL-10 mediado por el estímulo con el lisado completo de Mtb, podría generarse en respuesta a la gran variedad de antígenos incluidos, que podrían inducir respuestas tanto de perfil Th1 como de perfil Th2.
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Si bien un amplio espectro de citoquinas pueden contribuir a la protección contra Mtb, una respuesta de tipo Th1, dominada por INFγ, es considerada como la principal mediadora de una respuesta protectiva contra la tuberculosis [196]. Los niveles de INFγ observados a partir de los sobrenadantes, mostraron un patrón muy similar al descrito para el INFγ intracelular en células CD4+. Los HABPs fueron capaces de estimular de la producción de INFγ y el perfil de producción de esta citoquina, en términos generales, fue más elevado para personas QTF positivas que para personas QTF negativas. Por último, se observó una notable disminución de los niveles de TNFα a partir de los cultivos de personas QTF positivas y QTF negativas que fueron estimulados con el pool de HABPs. Estudios previos han demostrado que el TNF juega un rol importante en la respuesta del hospedero hacia la infección con Mtb. En ratón, se ha demostrado que el TNF es indispensable para la formación del granuloma, esencial en la contención de la micobacteria, y que en sinergia con el INFγ puede activar y reclutar macrófagos y linfocitos para la llevar a cabo la formación del granuloma [197, 198]. Sin embargo, el TNF ha sido relacionado también con diferentes rasgos inmunopatológicos durante procesos infecciosos, en donde se ha observado que un incremento en los niveles de TNF, pueden desencadenar efectos letales [199]. El TNF ha sido relacionado con síntomas de reacción adversa en pacientes con lepra y tuberculosis [200, 201]. El TNF ha sido asociado a desarrollo de daño tisular y puede inducir la multiplicación de la bacteria en el pulmón [202]. El efecto del TNF in vivo parece tener un efecto dosis-dependiente. Bajos niveles de esta citoquina parecen mediar la protección de Mtb, mientras que altas concentraciones pueden provocar daño tisular. En este sentido, la disminución de los niveles de TNF mediada por el pool de HABPs, podría contribuir a una respuesta protectiva contra la tuberculosis y no necesariamente a la supresión de la activación de los macrófagos. Sin embargo, se hace necesaria la realización de estudios adicionales que permitan confirmar esta hipótesis. Es importante resaltar, que a pesar de que esta disminución en los niveles de TNF fue evidente, la producción de esta citoquina no es nula, y que en relación con la respuesta de células de personas QTF negativas, las células de personas QTF positivas mostraron niveles de TNF más altos, pasando de 550pg/mL a 1038pg/mL, respectivamente. Bajo los estímulos ensayados, se observó en general una respuesta protectiva asociada a la producción e IL-2 e INFγ. Previamente, algunos autores han soportado la idea de que uno de los mayores retos para el desarrollo de una vacuna contra la tuberculosis, es la identificación de antígenos inmunodominantes capaces de inducir una fuerte respuesta de INFγ e IL2 por parte de células T CD4+ y T CD8+ en individuos infectados [203]. La importancia de las poblaciones de células T antígeno-específicas, en particular de aquellas secretoras de INFγ e IL-2, ha sido considerado como importante para el diseño y la evaluación de candidatos a vacuna [204]. En ratón, ESAT-6 ha generado una fuerte respuesta de INFγ e IL-2 mediadora de protección [205] y en humanos, células T poli-funcionales secretoras de estas dos citoquinas, han sido asociadas con personas capaces de resolver la enfermedad sin necesidad de un tratamiento anti-tuberculosis [206] o con aquellas capaces de mantener la infección en estado latente [207], lo cual implica un control inmune a largo plazo. Estas características han sido observadas en trabajos previos para proteínas
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como ESAT-6 y CFP10, coincidiendo con los resultados que obtuvimos en respuesta al pool de péptidos de QTF [208]. Si bien hubo un claro efecto del estímulo con el pool de HABPs sobre la inducción de producción de citoquinas de perfil Th1, el estudio de estos péptidos por separado se hace necesario, con el fin de conocer el efecto individual de cada uno de los péptidos sobre la respuesta global observada para el pool. Estudiar el efecto individual de cada uno de los péptidos, permitirá conocer cuál o cuáles de ellos son los principales inductores de una respuesta Th1, y cuál o cuáles los responsables de algunos de los resultados inesperados como la disminución de la expresión de TNF. La aproximación metodológica propuesta en este trabajo permitió establecer diferencias claras en la respuesta de personas QTF positivas y QTF negativas a los diferentes estímulos con antígenos de Mtb. Se evidenció una respuesta específica por parte de las personas que presentan infección con Mtb, lo que permitió establecer que se trata de una respuesta de memoria dirigida hacia estos antígenos previamente vistos.
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9. Conclusiones y recomendaciones
9.1 Conclusiones
• A partir de la aplicación de la prueba QuantiFERON Gold, se llevó a cabo el diagnóstico de 45 personas y la colección de muestras para estudios posteriores.
• La capacidad de los HABPs de las proteínas Rv1980c y Rv0679c para inhibir la invasión de Mtb H37Rv a monocitos humanos, es similar a la previamente reportada para la línea celular U937.
• El pool de HABPs de las proteínas Rv1980c y Rv0679c, es capaz de inducir la expresión del
marcador de superficie CD83. A partir esto, se concluye que los péptidos podrían influir en la maduración de las células dendríticas y probablemente en la modulación de una respuesta de células T.
• El pool de HABPs fue capaz de inducir un aumento en la producción de IL-8; esta citoquina se ha relacionado con el reclutamiento de linfocitos y neutrófilos, importantes en la formación del granuloma y la contención de la infección en un estado de latencia.
• La producción diferencial de INFγ por parte de células de personas QTF positivas con respecto a personas QTF negativas, en respuesta a los antígenos de Mtb, permite establecer que la prueba diagnóstica de QTF Gold, es altamente eficiente en la diferenciación de estas dos poblaciones.
• La activación de células de personas QTF positivas es notablemente mayor que la observada
para personas QTF negativas, lo que sugiere que se trata de una respuesta antígeno-específica.
• Péptidos de las proteínas Rv1980c y Rv0679c son capaces de activar, tanto LT CD4+ como LT CD8+, lo que permite sugerir que estos péptidos podrían ser presentados en el contexto del MHC clase I y clase II.
• En respuesta al pool de HABPs, la producción de INFγ por parte de los linfocitos de personas QTF positivas, estuvo mediada principalmente por la activación de células T CD4+ vírgenes y de memoria efectora, y células T CD8+ de memoria efectora.
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• Los HABPs son capaces de generar la activación de linfocitos CD4+ y CD8+ de memoria efectora, importantes para una rápida respuesta hacia un antígeno previamente visto, lo que reviste una gran importancia como posibles candidatos a ser en una vacuna contra la tuberculosis.
• HABPs de las proteínas Rv1980c y Rv0679c, son capaces de generar un perfil inflamatorio de perfil Th1, mediado principalmente por la producción de IL2 e INFγ, lo cual ha sido reportado por otros autores como una respuesta importante en la resolución y control de la infección en un estado de latencia.
• Mediante la aproximación metodológica, fue posible identificar células T antígeno-específicas, y puede ser aplicado en la evaluación de otros antígenos peptídicos como parte de la selección de candidato a una vacuna contra la tuberculosis.
9.2 Recomendaciones
• Estudiar antígenos de latencia de Mtb, que puedan ser reconocidos por individuos con infección latente y que puedan estar relacionados con la capacidad e contención de la infección en un estado de latencia. Evaluación de células polifuncionales. IL-2, INFγ.
• Iniciar la evaluación de otros candidatos peptídicos.
• Trabajar con una población representativa y realizar la tipificación de los haplotipos de HLA en la misma.
• Evaluar el potencial antigénico de los HABPs de forma individual.
• Estudiar las posibles rutas de inducción de expresión de CD83, generada a partir del estímulo con los HABPs evaluados en este estudio.
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10. Consideraciones éticas
El proyecto se encuentra amparado bajo la Resolución número 2378 de junio 27 de 2008, por cuanto la investigación fue realizada bajo la responsabilidad de entidades de salud idóneas en el ejercicio de la atención de primer nivel en pacientes, y aunque este estudio no buscaba la práctica clínica con medicamentos en seres humanos, todos los participantes firmaron previamente un consentimiento informado, explicando el objeto de la investigación, incluidos los riesgos y beneficios, todo esto buscando siempre salvaguardar la integridad del individuo. El proyecto fue evaluado y aprobado por el comité de ética involucrado en el estudio. En cuanto a la bioseguridad por el manejo de muestras con microorganismos patógenos o material que pueda contenerlos, se contó con instalaciones, equipo y personal entrenado en el manejo de material biológico, así como en los aspectos relacionados en los procedimiento operativos estándar (POEs) para el adecuado desecho y disposición de los mismos. Durante el desarrollo del presente trabajo, no se generaron impactos ambientales negativos. Los procedimientos experimentales se realizaron en cabinas de bioseguridad.
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11. Anexos
11.1 Consentimiento informado FECHA __________ NÚMERO DEL PARTICIPANTE _______ INFORMACION AL PACIENTE Justificación y objetivos de la investigación La tuberculosis es una enfermedad causada por una bacteria llamada Mycobacterium tuberculosis. Esta enfermedad afecta cada año a un número creciente de personas, dejando en el 2007 (último año para el que existe registro de casos), el mayor número de casos reportado alguna vez en la historia. Actualmente, solo existe una vacuna contra la tuberculosis capaz de proteger a una limitada parte de la población, por cuanto se hace indispensable el desarrollo de nuevas estrategias que ayuden a frenar la aparición de nuevos casos de esta enfermedad. En los países del trópico como Colombia, es muy probable que las personas hayan estado alguna vez en contacto con esta bacteria, sin embargo gracias al sistema de defensa del cuerpo la gran mayoría nunca desarrolla la enfermedad. Este sistema de defensa está compuesto entre otros, por células llamadas linfocitos, importantes para la eliminación de la bacteria y para prevenir que esta pueda generar enfermedad. El objetivo de este estudio, es utilizar estos linfocitos extraídos a partir de la muestra de sangre, para evaluar los efectos que puedan tener sobre estos, moléculas producidas químicamente en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC). Este procedimiento se realiza mediante el uso de una técnica llamada citometría de flujo, que nos permitirá evaluar los cambios que se produzcan en estas células extraídas de personas infectadas o no con la bacteria. Para establecer si existe infección (lo que NO implica que la persona presente enfermedad), se realizará también una prueba llamada QuantiFERON, que se llevará a cabo a partir de la muestra de sangre extraída. Mediante el estudio de estas moléculas sintetizadas químicamente, se pretende contribuir en el desarrollo de una vacuna contra la tuberculosis. Por esta razón solicitamos su permiso para:
1. Obtener una muestra de sangre de 60 mL a partir de la cual se evaluarán los linfocitos. 2. Obtener una muestra de sangre de 3 mL, con el fin de realizar la prueba de QuantiFERON.
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A partir de este estudio, se pretende determinar la importancia de ciertas moléculas de la bacteria involucradas en el proceso de invasión a células del humano, en la estimulación de linfocitos, como parte de la selección de moléculas candidatas a una vacuna contra la tuberculosis. Procedimientos a seguir Si usted es mayor de 18 años y está de acuerdo en participar en este estudio, se le solicitará la donación de 63 mL de sangre de la vena de su brazo (una décima parte del volumen que usualmente se toma para la donación de sangre). La sangre será tomada por personal de la salud especializado, a partir de una única toma. Una vez obtenida la muestra de sangre en 6 tubos heparinizados de 10mL y tres tubos especiales para la prueba del quantiFERON (1 mL por tubo), está será procesada por personal del laboratorio de investigaciones con el fin de alcanzar los propósitos antes descritos. Molestias o riesgos Los riesgos que existen al aceptar participar en este estudio son mínimos, pues solo son causados por la toma de la muestra de sangre. Producto de la toma de la muestra de sangre algunas personas pueden sufrir algo de mareo del cual la persona se recuperará rápidamente con algo de reposo. La toma de la muestra de sangre se hará bajo condiciones de estricta limpieza para evitar el riesgo de infección. Beneficios Su participación en este estudio no será objeto de remuneración alguna ni tiene ningún costo para usted. Su participación en este estudio es una contribución al desarrollo del conocimiento de posible utilidad en la selección de moléculas candidatas a una vacuna contra la tuberculosis. Sin embargo al ser un proyecto de investigación los resultados podrían no ser concluyentes. Se le dará por escrito el resultado de la prueba del quantiFERON. Recuerde una prueba positiva no significa que necesariamente tenga tuberculosis, sin embargo es una información valiosa para su médico tratante. Confidencialidad Los resultados de este estudio ingresarán a la base de datos y serán confidenciales. Si la información derivada del estudio se publica o presenta en reuniones científicas, no se usará su nombre ni ningún otro tipo de información personal, en su lugar se utilizará códigos. Su información personal y los resultados serán mantenidas con total confidencialidad. La información acerca de usted no será compartida ni entregada a nadie, excepto a entidades de control y vigilancia que podrían tener acceso a esta información con fines de garantizar el adecuado manejo de la información y desarrollo del estudio. PARTE A LLENAR POR EL PACIENTE Recibí una copia de cada una de las 3 páginas de este formulario. Las he leído o alguien más las ha leído por mí. Entiendo la información y me han respondido claramente las preguntas e inquietudes que tenía acerca de los procedimientos, riesgos, beneficios y otros asuntos relacionados con la investigación. Además me fue explicado que tengo el derecho de retirar mi consentimiento y dejar de participar en el estudio en cualquier momento. También me es claro que estoy en mi total derecho de conocer toda la información actualizada acerca del estudio, y que esto puede hacer que pueda renunciar a mi participación dentro del estudio.
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Por lo anterior estando en pleno uso de mis facultades acepto que:
1. Se me tome las muestras de sangre, de 63 mL SI__ NO__ A continuación expreso mi decisión de participar voluntariamente en este estudio firmando este documento: ______________________________ ________________________________ Apellidos y Nombres Firma del voluntario C.C. Teléfono: Testigos: HE LEÍDO CON EXACTITUD, O HE SIDO TESTIGO DE LA LECTURA EXACTA DEL DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA EL PARTICIPANTE Y EL INDIVIDUO HA TENIDO LA OPORTUNIDAD DE HACER PREGUNTAS. CONFIRMO QUE EL INDIVIDUO HA DADO CONSENTIMIENTO LIBREMENTE. ______________________________ ________________________________ Apellidos y Nombres Firma del Testigo 1 C.C. Teléfono: ______________________________ ________________________________ Apellidos y Nombres Firma del Testigo 2 C.C. Teléfono: Si tiene cualquier pregunta acerca de este estudio puede comunicarse con la Investigadora Diana Marcela Rodríguez Calderón en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia teléfono 3158923 extensión 137 o con el Dr. Carlos Parra López en la Universidad Nacional de Colombia, facultad de Medicina en el teléfono 3165000 extensión 15016 / 15039. BENEFICIOS ADICIONALES Una vez procesadas las muestras tomadas y realizadas las pruebas propuestas en el protocolo de investigación de este proyecto, es posible que parte de la muestra restante pueda ser sujeta a nuevos análisis en un futuro con el fin de generar nueva información en el área de la microbiología y/o de la inmunología, útil para comprender mejor el comportamiento de la tuberculosis en nuestro medio. Es probable que usted y/o su familia no se beneficien directamente del nuevo conocimiento generado con estos nuevos resultados pero que estos si puedan ser útiles para futuras generaciones quienes podrían beneficiarse. En este caso su aprobación para que la muestra sobrante sea preservada para posibles nuevos estudios constituye un generoso aporte de su parte para el avance del conocimiento sobre la tuberculosis. Por lo anterior, sírvase marcar su decisión con respecto al manejo de la muestra sobrante y su posible utilización en estudios de investigación en un futuro:
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Deseo que la muestra restante sea DESECHADA una vez completado el presente estudio: �Si �No
Autorizo conservar muestras restantes de la muestra que me fue extraída con la posibilidad de emplearla junto con resultados del presente estudio, en las situaciones señaladas a continuación:
En estudios inmunológicos complementarios siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificación �Si �No
En estudios moleculares de investigación siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificación. �Si �No
En estudios de investigación colaborativos con otras instituciones nacionales y/o internacionales, siempre y cuando exista: (i) acuerdo interinstitucional entre las entidades participantes; (ii) aprobación por un comité de ética para la realización del estudio y (iii) se conserve en anonimato mis datos de identificación.
�Si �No
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11.2 Formato de información adicional
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11.3 Base de datos voluntarios estudio
# Voluntario
PBMCs Resultado quantiFERON Gold
Toma # células/vial # viales Nil TB antigen Mitogen TB Ag-
Nil Mitogen-Nil Resultado
1 25-feb-11 13'000.000 5 0,23 0,42 >10 0,19 >10 NEGATIVO 2 04-mar-11 19'360.000 5 0,17 0,16 >10 -0,01 >10 NEGATIVO 3 04-mar-11 10'250.000 5 0,07 0,06 >10 -0,01 >10 NEGATIVO 4 04-mar-11 12'160.000 5 0,13 0,09 >10 -0,04 >10 NEGATIVO 5 17-mar-11 16'050.000 5 0,07 0,1 >10 0,03 >10 NEGATIVO 6 11-mar-11 14'560.000 5 0,07 0,06 6,32 -0,01 6,25 NEGATIVO 7 08-jun-11 18'000.000 5 0,06 0,07 >10 0,01 >10 NEGATIVO 8 08-abr-11 15'000.000 5 0,07 7,02 >10 6,95 >10 POSITIVO 9 24-mar-11 16'200.000 5 0,06 1,49 >10 1,43 >10 POSITIVO 10 24-mar-11 9'825.000 5 0,05 0,06 >10 0,01 >10 NEGATIVO 11 24-mar-11 11'475.000 5 0,06 2,07 >10 2,01 >10 POSITIVO 12 24-mar-11 17'100.000 5 0,08 0,1 >10 0,02 >10 NEGATIVO 13 11-mar-11 10'400.000 5 0,06 0,08 >10 0,02 >10 NEGATIVO 14 25-feb-11 13'000.000 5 0,06 0,07 >10 0,01 >10 NEGATIVO 15 11-mar-11 9'280.000 5 0,07 0,08 >10 0,01 >10 NEGATIVO 16 17-mar-11 14'400.000 5 0,09 0,11 >10 0,02 >10 NEGATIVO 17 17-mar-11 13'200.000 5 0,05 0,06 >10 0,01 >10 NEGATIVO 18 17-mar-11 19'200.000 5 0,11 >10 >10 >10 >10 POSITIVO 19 11-mar-11 15'450.000 5 0,07 0,09 >10 0,02 >10 NEGATIVO 20 17-mar-11 17'700.000 5 0,07 0,1 >10 0,03 >10 NEGATIVO 21 24-mar-11 11'400.000 5 0,07 0,46 >10 0,39 >10 POSITIVO 22 11-mar-11 19'350.000 5 0,19 0,18 >10 -0,01 >10 NEGATIVO 23 18-mar-11 12'600.000 5 0,1 0,54 >10 0,44 >10 POSITIVO 24 18-mar-11 14'700.000 5 0,05 2,99 >10 2,94 >10 POSITIVO 25 18-mar-11 15'150.000 5 0,1 1,12 >10 1,02 >10 POSITIVO 26 18-mar-11 9'650.000 5 0,11 0,21 >10 0,1 >10 NEGATIVO 27 18-mar-11 12'450.000 5 0,04 0,1 >10 0,06 >10 NEGATIVO 28 24-mar-11 9'300.000 5 0,04 0,67 >10 0,63 >10 POSITIVO 29 25-mar-11 15'150.000 5 0,04 5,27 >10 5,23 >10 POSITIVO 30 25-mar-11 20'700.000 5 0,11 4 >10 3,89 >10 POSITIVO 31 25-mar-11 20'100.000 5 0,06 6,32 >10 6,26 >10 POSITIVO 32 25-mar-11 17'100.000 5 0,09 6,12 >10 6,03 >10 POSITIVO 33 25-mar-11 16'200.000 5 0,07 3,35 >10 3,28 >10 POSITIVO 34 31-mar-11 9'900.000 5 0,06 0,1 >10 0,04 >10 NEGATIVO 35 31-mar-11 19'500.000 5 0,12 1,55 >10 1,43 >10 POSITIVO 36 31-mar-11 15'600.000 5 0,07 0,08 >10 0,01 >10 NEGATIVO 37 31-mar-11 4'950.000 5 0,07 0,8 >10 0,73 >10 POSITIVO 38 31-mar-11 10'350.000 5 0,07 0,43 >10 0,36 >10 POSITIVO 39 01-abr-11 12'600.000 5 0,1 0,28 >10 0,18 >10 NEGATIVO 40 01-abr-11 10´000.000 5 0,07 0,07 >10 0 4,94 NEGATIVO 41 08-abr-11 16'500.000 5 0,08 0,1 >10 0,02 >10 NEGATIVO 42 08-abr-11 17'400.000 5 0,08 0,1 >10 0,02 >10 NEGATIVO 43 08-abr-11 13'800.000 5 0,06 0,05 >10 -0,01 >10 NEGATIVO 44 08-abr-11 16'500.000 5 0,06 0,05 >10 -0,01 >10 NEGATIVO 45 08-abr-11 20'400.000 5 0,04 >10 >10 >10 >10 POSITIVO
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11.4 Información adicional
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12. Bibliografía
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2010/262
Article in press - uncorrected proof
Peptides from the Mycobacterium tuberculosis Rv1980c
protein involved in human cell infection: insights into new
synthetic subunit vaccine candidates
Diana Rodrıguez1,2, Carolina Vizcaıno1,2, MarisolOcampo1,2,*, Hernando Curtidor1,2, Marta Pinto1,2,Manuel Elkin Patarroyo1,3 and Manuel AlfonsoPatarroyo1,2
1 Fundacion Instituto de Inmunologıa de Colombia (FIDIC),Cra. 50 No. 26-20, Bogota, Colombia2 School of Medicine and Health Sciences, Universidad delRosario, Bogota, Colombia3 School of Medicine, Universidad Nacional de Colombia,Bogota, Colombia
* Corresponding authore-mail: [email protected]
Abstract
Mycobacterium tuberculosis infection continues to be amajor cause of morbidity and mortality throughout the world.The vast complexity of the intracellular pathogen M. tuber-culosis and the diverse mechanisms by which it can invadehost cells highlight the importance of developing a fully pro-tective vaccine. Our vaccine development strategy consistsof including fragments from multiple mycobacterial proteinsinvolved in cell invasion. The aim of this study was to iden-tify high activity binding peptides (HABPs) in the immu-nogenic protein Rv1980c from M. tuberculosis H37Rv withthe ability to inhibit mycobacterial invasion into U937 mono-cyte-derived macrophages and A549 cells. The presence andtranscription of the Rv1980c gene was assessed in membersbelonging to the M. tuberculosis complex and other nontu-berculous mycobacteria by PCR and RT-PCR, respectively.Cell surface localization was confirmed by immuno-electron microscopy. Three peptides binding with high activ-ity to U937 cells and one to A549 cells were identified.HABPs 31100, 31101, and 31107 inhibited invasion of M.tuberculosis into A549 and U937 cells and therefore couldbe promising candidates for the design of a subunit-basedantituberculous vaccine.
Keywords: binding interactions; immunodetection;internalization; invasion inhibition; peptide; tuberculosis.
Introduction
Tuberculosis is an infectious disease caused by species of thegenus Mycobacterium belonging to the Mycobacteriumtuberculosis complex (MTC). According to the 2007 statis-
tics from the World Health Organization, tuberculosis is oneof the primary causes of disease and death worldwide: itresulted in approximately 9.27 million new cases, of which1.37 million occurred among HIV-positive individuals(WHO, 2009).
Tuberculosis can be effectively treated using antibiotictherapy; however, the effectiveness of such therapy to controlthe spread of tuberculosis has been limited owing to the dif-ficult socioeconomic conditions of people living in endemicareas and the secondary effects of drugs, which in somecases can lead to the detriment of patients’ health and theemergence of new multidrug-resistant mycobacterial strains.Currently, the Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) is the only existing vaccine against tubercu-losis, but because protection conferred by this vaccine is onlypartial, a new and improved vaccine is urgently needed(Dietrich et al., 2006; WHO, 2009).
Research into the biology of mycobacterial bacilli hasclearly shown that its success as a pathogen depends on itsability to enter, reside, and proliferate inside alveolar mac-rophages and other non-phagocytic cell lines, such as type IIpneumocytes, endothelial cells, and fibroblasts, all of whichmight act as potential mycobacterial reservoirs (Cosmaet al., 2003; Garcia-Perez et al., 2003b).
As a logical and rational approach to develop an anti-tuberculous vaccine, we followed the guidelines previouslydescribed for the development of multi-antigenic, subunit-based, chemically synthesized vaccines (Patarroyo and Patar-royo, 2008). Accordingly, putative M. tuberculosis H37Rvmembrane proteins with crucial roles in pathogenesis havebeen screened for the presence of conserved high-activitybinding peptides (HABPs), which could be used to designimmunogenic peptides by modifying their critical host cellbinding residues (Garcia-Perez et al., 2003a; Forero et al.,2005; Plaza et al., 2007; Chapeton-Montes et al., 2008b;Patarroyo et al., 2008a,b).
To date, several M. tuberculosis secreted proteins havebeen identified and a large number are presumed to act asimmune targets during early stages of infection (Malen et al.,2007). Among these secreted proteins, Rv1980c (Mpt64)belongs to a family of highly conserved immunogenic pro-teins present in species of the MTC but absent in someM. bovis BCG strains (Oettinger and Andersen, 1994). Stud-ies on Rv1980c have focused mainly on the use of this pro-tein as a tool for the early diagnosis of tuberculosis, such asin the Patch Test for Active Tuberculosis (PTAT) (Nakamuraet al., 2001). Unlike the Purified Protein Derivative test,PTAT shows very little crossreactivity with mycobacteria
208 D. Rodrıguez et al.
Article in press - uncorrected proof
Figure 1 Molecular assays.(A) 354-bp products obtained by PCR amplification of genomic DNA isolated from different Mycobacterium strains. (1) 123-bp fragmentlength marker (Gibco); (2) M. tuberculosis H37Rv; (3) M. tuberculosis H37Ra; (4) M. bovis; (5) M. bovis BCG Pasteur substrain;(6) M. africanum; (7) M. microti; (8) M. flavescens; (9) M. fortuitum; (10) M. szulgai; (11) M. peregrinum; (12) M. phlei; (13) M.scrofulaceum; (14) M. avium; (15) 123-bp fragment length marker; (16) M. smegmatis; (17) M. noncromogenicum; (18) M. simiae; (19) M.intracellulare; (20) M. gastri; (21) M. kansasii; (22) M. diernhoferi; (23) M. gordonae; (24) M. marinum; (25) M. terrae; (26) M. chelonaesubsp. chelonae; (27) PCR negative control (distilled water). (B) RT-PCR; (1–7) the same as in (A). (8) negative control; (9) positive PCRcontrol; (10) negative PCR control. (C) Constitutive rpoB gene. (1–10) same as in (B).
other than M. tuberculosis (MOTT) (Harboe et al., 1986) andallows detecting asymptomatic people with an active stageof tuberculosis owing to the exclusive expression and secre-tion of protein by actively growing mycobacterial bacilli(Andersen et al., 1991b).
As a vaccine candidate, Rv1980c has been studied aloneor in combination with other secreted antigenic proteins suchas Ag85 and ESAT-6 (Tian et al., 2004; Bai et al., 2008b;Fu et al., 2009), both of which have been shown to diminishinfection but have not conferred a protection comparablewith the one afforded by conventional BCG vaccination(Horwitz et al., 1995; Kamath et al., 1999; Bai et al., 2008a,2009).
Rv1980c is encoded by one of the 11 genes comprisingthe deletion region 2 of M. bovis BCG strains (Wang et al.,2007) and contains a b-grasp-like domain at its N-terminalportion consisting of an a-helix spanning from residue 65 to80 and surrounded by a network of 7 b-sheets (Wang et al.,2007). The b-grasp motif is commonly found in highly anti-genic proteins, superantigens (Papageorgiou and Acharya,1997), chemotaxis inhibitory proteins, the IgG-binding strep-tococcal protein G (Kraulis, 1991), and in some secretedadhesins (Geisbrecht et al., 2005), which outlines it as a pro-totype motif of bacterial proteins implicated in binding inter-actions and hence supposes a similar role for Rv1980c inthis type of interaction (Wang et al., 2007). To date, the con-crete role of Rv1980c has not been completely elucidated;however, the aforementioned studies allow the suggestion ofa possible pathogenic function for this protein, most probablyrelated to host cell invasion.
In this study, the presence and transcription of Rv1980cwas examined in 24 mycobacterial species by PCR and RT-PCR assays. Rv1980c expression and cell surface localiza-tion was analyzed by Western blot and immunoelectronmicroscopy (IEM), respectively. HABPs were identified in
Rv1980c and their invasion inhibition abilities were assessedin vitro using the A549 line of type II human alveolar epi-thelial cells (type II pneumocytes) and macrophages derivedfrom U937 monocytes. The results support the suggestion ofRv1980c HABPs as interesting candidates to be assessed infuture immunogenic studies in an appropriate animal model.
Results
Molecular assays
The presence of the Rv1980c gene in the MTC was con-firmed by PCR amplification of a 354-bp gene fragment inM. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis H37Ra, M. bovis,M. africanum, and M. microti but not in the M. bovis BCGPasteur substrain and MOTT (Figure 1A). Similarly, tran-scription of the Rv1980c gene was assessed in these samestrains by RT-PCR (Figure 1B). Transcription of the rpoBhousekeeping gene was observed in all strains and no ampli-fication was detected in the sample containing DNAse-Qtreated M. tuberculosis H37Rv, thereby confirming the valid-ity of the results (Figure 1C).
We do not really know why there is a difference in theintensity of the bands between the PCR and RT-PCR inM. microti (Figure 1A and C). However, the housekeepingrpoB gene used as positive transcription control amplified a360-bp fragment in M. microti using the same amount ofcDNA, therefore allowing us to discard problems with cDNAintegrity or concentration.
Immunodetection of Rv1980c protein
in mycobacterial surface
Protein expression was assessed by Western blot using a totallysate of M. tuberculosis H37Rv and sera obtained by inoc-
Rv1980c peptides involved in human cell infection 209
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Figure 2 Immunodetection assays.(A) Western blot. Lanes 1 and 2: preimmune sera of goats B87 and B95, respectively. Lanes 3 and 4: recognition of 24.3 kDa correspondingto Rv1980c by post-third immunization sera of goats B87 and B95, respectively. (B) IEM, 6000= original magnification. To the left,negative control using goat preimmune sera. To the right, detection of the Rv1980c protein on the cell surface of Mycobacterium tuberculosis.Anti-goat IgG antibody conjugated with 10 nm colloidal gold particles is indicated by black arrows.
ulating goats with polymerized B cell epitopes fromRv1980c, showing the recognition of a 24.3-kDa proteinwith post-third immunization sera but not with preimmunesera. Such molecular weight is consistent with the theoreticalweight of Rv1980c (24.8 kDa), which indicates that the goatanti-Rv1980c sera recognized the entire protein of M. tuber-culosis (Figure 2A).
Moreover, IEM assays using the same goat anti-Rv1980csera confirmed the presence of Rv1980c in the surface ofintact M. tuberculosis H37Rv bacilli, which indicates thatRv1980c is accessible to interaction with host cell surfacereceptors. On the contrary, immunolabeling with goat pre-immune sera showed no recognition of any specific structureon bacilli surface (Figure 2B).
Although crossreactivity of such antibodies with otherMycobacterium strains was not evaluated in this study, it isexpected for these antibodies to recognize other mycobac-terium species such as H37Ra and M. bovis because the twopeptides inoculated in goats show 100% identity betweenthese species.
Interaction of Rv1980c peptides with target cells
Receptor-ligand binding assays were performed to determinewhich of the 12 synthetic non-overlapping peptides spanningthe entire sequence of Rv1980c interacted specifically with
A549 cells and U937 monocyte-derived macrophages. Basedon previously established criteria, a peptide was consideredto be a HABP whenever the slope resulting from plotting thespecific binding (i.e., ratio between specifically bound w125Jx-peptide and added w125Jx-peptide) was greater than or equalto 1% (specific cell binding activity) (Garcia et al., 2005;Vera-Bravo et al., 2005; Plaza et al., 2007; Chapeton-Monteset al., 2008b). The results indicated that peptides 31101,31107, and 31110 bind specifically to U937 cells, whereasonly peptide 31100 binds with high activity to A549cells. No HABPs were shared between the two cell lines(Figure 3).
Saturation assays were carried out with peptides 31101,31107, and 31110, which were HABPs specific for the U937cell line, to characterize the interaction between HABPs andhost cell surface receptor(s). Binding of HABP 31101 toU937 cells was saturable and highly specific, as indicated byits dissociation constant (Kd) within the nanomolar range(Kds700 nM). Binding of HABPs 31107, 31101 and 31110to receptors in U937 cells was also saturable and highlyspecific (Kds650 nM and 1400 nM, respectively). Around700 000 binding sites per cell were found for HABP 31101,400 000 for HABP 31107 and 15 000 000 for HABP 31110.Receptor-ligand complexes formed by these three HABPsexhibited positive cooperativity, as shown by their Hill coef-ficients larger than 1 (nH)1) (Figure 4).
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Figure 3 Interaction of Rv1980c peptides with target cells and invasion assays.Binding profile of Rv1980c synthetic peptides with A549 cells and U937 monocyte-derived macrophages. The Figure shows the sequenceof each peptide, the name assigned according to our institute’s serial numbering system and its position inside the protein. Peptides comprisingthe b-grasp motif are shown in gray. The vertical bar to the left shows the structural conformation of each peptide, according to the structuredisplayed within the native protein (Wang et al., 2007). Black bars: b-sheets; white bars: a-helices.
Figure 4 Saturation assays.Saturation curves obtained by plotting free w125Ix-peptide versus w125Ix-peptide concentration specifically bound to the U937-HABPs 31101,31107, and 31110. The larger graph is the saturation curve and the smaller graph is the Hill plot. In the Hill plot, the abscissa is Log Fand the ordinate is Log wB/(Bmax-B)x, where B is the bound peptide concentration, Bmax is the maximum concentration of bound peptide andF is the free peptide concentration.
Rv1980c HABPs inhibit M. tuberculosis H37Rv
invasion
Taking into account that M. tuberculosis uses epithelial cellsas a reservoir and body dissemination intermediate, inhibi-tion assays were preformed with A549 cells and U937 mono-cyte-derived macrophages (Cosma et al., 2003).
The percentage by which each HABP inhibited mycobac-terial invasion was determined. Cytochalasin D was used asinhibition control, which inhibits polymerization and elon-gation of actin filaments. The results indicated that Rv1980cHABPs inhibited invasion of M. tuberculosis H37Rv to thecell line to which they bound with high specificity. Myco-bacterial invasion to A549 cells was significantly reduced byHABP 31100, as indicated by the 82.86"14.46% reductionat 50 mM and 81.96"3.57% at 100 mM. Although the largestpeptide concentration (200 mM) resulted in a 44.25"6.15%invasion reduction, it was not statistically significant com-pared with the invasion control (Figure 5A).
Regarding the ability of HABP 31107 to inhibit invasionto U937 cells, the results showed 42.02"9.11% and 65.27"25.78% inhibition percentages at 100 mM and 200 mM,respectively. HABP 31101 significantly inhibited mycobac-
terial invasion compared with the invasion control, resultingin inhibition percentages of 49.59"2.67%, 62.12"29.24%, and 71.09"11.83% at peptide concentrations of50 mM, 100 mM, and 200 mM, respectively. HABP 31110had no significant effect on mycobacterial invasion to thiscell line (Figure 5B).
The specificity of a particular HABP for its correspondingcell line was evaluated by carrying out an invasion controlassay with the other cell line, i.e., the cell line to which suchHABPs showed no high-binding activity. The results of suchassays showed that invasion of M. tuberculosis to A549 cellswas not significantly inhibited by peptide 31107 (which wasa HABP for U937 cells but not for A549 cells) comparedwith the invasion control (Figure 5A). Similarly, invasion toU937 cells was not significantly inhibited by the peptide31100 (Figure 5B), which was a HABP for A549 but not forU937 cells.
Latex bead internalization by A549 type II
pneumocytes
The ability of HABPs to mediate internalization of latexbeads in A549 cells was assessed to examine whether
Rv1980c peptides involved in human cell infection 211
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Figure 5 Invasion inhibition percentages.(A) Inhibition percentages of M. tuberculosis H37Rv invasion intoA549 cells. (B) Inhibition percentages of M. tuberculosis H37Rvinvasion into U937 cells. Standard errors are indicated by blackbars. *pF0.05, **pF0.01.
Figure 6 Structure of Rv1980c peptides.(A) Circular dichroism of Rv1980c HABPs and some peptides localized within the b-grasp motif. The results were expressed in terms ofmean residue ellipticity wQx, the units being degrees=cm2=dmol according to the function wQxsQl/(100lcn). (B) Three-dimensional structureof Rv1980c. Left, b-grasp motif (cyan). Right, position of HABPs in Rv1980c: 31100 (yellow), 31101 (red), 31107 (green), and 31110(orange). PDB accession number is 2HHI; adapted from Wang et al. (2007).
HABPs were involved in mycobacterial entry to host cellsand identify a possible correlation with the results obtainedin invasion inhibition assays. The results showed a statisti-cally significant increase in the internalization percentagewhen latex beads were coated with HABP 31100 (6.69"0.98%; pF0.05) when compared with the control of beads
without peptide (2.02"0.49%). On the contrary, internali-zation of latex beads was not facilitated when cells were firstincubated with peptide suspensions and then exposed touncoated latex beads (1.67"0.43%), which suggests thatlatex beads internalization is facilitated by the coating of thebeads with HABP 31100 and not by possible cell damagecaused by this peptide.
Structural features of Rv1980c peptides
Given the importance of the tridimensional structure-proteinfunction relationship and taking into account that the b-graspstructural motif of Rv1980c is involved in protein-proteininteractions, the structural conformation of some of theRv1980c peptides was determined by circular dichroism(CD) spectroscopy. Figure 6A shows the spectra of allRv1980c HABPs and some of the peptides located inside theb-grasp motif. Peptides 31102, 31106, 31107, and 31110displayed a clear tendency to form a-helical conformations,with a maximum ellipticity at ;192 nm and two minima at202 nm and 222 nm, respectively. Peptide 31104 had a pre-dominant b-sheet conformation, showing a maximum ellip-ticity at 195 nm and a minimum at 218 nm (Figure 6A). Noclear structural features could be established for peptides31100 and 31101.
The tridimensional model of the Rv1980c protein (acces-sion number 2HHI) reported by Wang et al. (2007) was stud-ied to analyze whether HABPs were located inside relevantstructural domains and if such short peptides display thesame tridimensional features that they exhibit in the nativeprotein. Interestingly, HABPs 31100 and 31101 were locatedinside the b-grasp structural motif, whereas the a-helicalHABPs 31107 and 31110 were located outside this motif(Figure 6B).
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HABPs 31107 and 31110, both located outside theb-grasp motif, conserved the same a-helical secondary con-formation shown by such sequences in the tridimensionalstructure of the protein (Figure 6A and B). Other peptidessuch as 31102 and 31106, which were located inside theb-grasp structural motif but that were not identified asHABPs, also conserved the same secondary structure whencompared with the tridimensional model of the protein.
Discussion
The vast complexity of pathogenic M. tuberculosis and thediverse mechanisms by which the bacilli can invade hostcells stress the necessity of implementing a logical andrational vaccine development strategy that includes proteinfragments from the different mycobacterial proteins involvedin host cell invasion. Based on this concept, the M. tuber-culosis H37Rv genome has been screened with the aim ofidentifying proteins involved in invasion to alveolar macro-phages and type II pneumocytes and selecting their mini-mum-binding fragments (Garcia-Perez et al., 2003a; Foreroet al., 2005; Plaza et al., 2007; Chapeton-Montes et al.,2008b; Patarroyo et al., 2008a,b; Patarroyo and Patarroyo,2008).
We used PCR and RT-PCR techniques to examine the dis-tribution of the Rv1980c gene in the MTC, as well as inMOTT (which included saprophytic and environmental spe-cies), with the aim of establishing a preliminary relationshipbetween the presence of the protein encoding gene in a par-ticular mycobacterial species and its virulence.
Although the region selected here for PCR amplificationonly displayed positive results in mycobacteria belonging tothe MTC, a BLASTp analysis showed more than 74% iden-tity between the Rv1980c protein from M. tuberculosisH37Rv and M. kansasii, 66% with M. ulcerans, 65% withM. marinum, 54% with M. avium, and 51% with M. intra-celullare. Despite the fact that these mycobacteria aregrouped outside the MTC, all species displaying BLASTpidentities above 50% are able to cause disease. This highdegree of identity with pathogenic and/or opportunisticMOTT could indicate a role for this protein in virulenceprocesses.
In this sense, to develop a subunit antituberculous vaccine,it is necessary to select peptides (more specifically HABPs)from M. tuberculosis proteins involved in host cell invasionthat are exclusively present in MTC or in mycobacteriumspecies related to invasive processes or causing disease, suchas Rv1980c.
Additionally, IEM studies indicate that Rv1980c is pre-dominantly located on the surface of M. tuberculosis H37Rv(Figure 2B), where it is accessible to interaction with hostcell surface receptors. Despite its surface localization, nocharacteristic anchor motifs (i.e., GPI anchor, transmembranedomains, lipobox, etc.) were detected when the primary pro-tein sequence was analyzed with bioinformatics tools. Itseems plausible to think that most of the protein is beingsecreted through the general export pathway (Gomez et al.,
2000). Studies have shown that secreted proteins can berelated to receptor-mediated cell invasion (Garcia-Perez etal., 2003b).
The interaction of M. tuberculosis with its host cell hasbeen shown to be mediated by several surface receptors, suchas mannose receptors, Toll-like receptors, surfactant proteinsA and D receptors, scavenger receptors and complementreceptors 1, 3 and 4 (Ernst, 1998; Rooyakkers and Stokes,2005), and other receptor proteins not yet identified. Bearingin mind this concept, our institute has developed a highlyspecific methodology to analyze mycobacterial surface pro-teins and identify peptides capable of binding to surfacereceptors of A549 cells and U937 monocyte-derived mac-rophages as well as of inhibiting invasion of these two celllines (Forero et al., 2005; Garcia et al., 2005; Vera-Bravo etal., 2005; Plaza et al., 2007; Chapeton-Montes et al., 2008b).
Through the use of such methodology, three HABPs bind-ing with high activity to U937 cells and one to A549 cellswere identified in Rv1980c but no peptides with high spe-cific binding capacity to both cell lines were identified inthis study, which suggests the existence of different mecha-nisms for mediating entry into non-phagocytic cells thatmight involve pathways or receptors different to the onesused by macrophages (Passmore et al., 2001).
Invasion inhibition showed that HABP 31100 was able tosignificantly reduce invasion of A549 (Figure 5A). Theseresults are consistent with the increase in latex beads inter-nalization by non-phagocytic A549 cells when beads werecoated with this HABP. It is worth noting that the inhibitorypotential of the peptide decreased at largest concentration,indicating that this peptide concentration could be producingstress, cell membrane damage or structural modifications thatwould affect the interaction of the peptide with host cellreceptors, as reported previously (Plaza et al., 2007).
By contrast, HABPs 31101 and 31107 inhibited mycobac-terial invasion to U937 monocyte-derived macrophages,whereas HABP 31110 showed no significant inhibitoryeffect on this cell line (Figure 5B). Additionally, the speci-ficity of HABPs to specifically inhibit invasion of the cellline to which they bind with high activity but not of the othercell line demonstrates the importance of the high-activitybinding interactions established between host cell surfacereceptors and mycobacterial proteins for M. tuberculosisentry into its target cell (Figure 5).
Regarding the presence of HABPs inside the structuralmotif of Rv1980c, CD spectroscopy results showed that thesynthetic Rv1980c peptides used in biological assays con-served the secondary structure displayed in the native protein(Figure 6A). Similar results have been reported by otherstudies showing that 18–25 amino acid long, non-overlapp-ing peptides derived from proteins of other important path-ogens (e.g., Plasmodium falciparum, Epstein-Barr virus, andHuman Papillomavirus) maintain the same secondary struc-ture exhibited in the parental protein where they were iden-tified (Patarroyo and Patarroyo, 2008).
Additionally, HABPs 31100 and 31101 showing the larg-est binding percentage are located inside the b-grasp motif
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(Figure 6B), which is particularly interesting given that thismotif is known to be implicated in protein-protein interac-tions (Kraulis, 1991; Papageorgiou and Acharya, 1997; Geis-brecht et al., 2005; Wang et al., 2007). The a-helicalconformations displayed by the HABPs 31107 and 31110located outside the b-grasp structural motif are in agreementwith the observations made by other authors, who havefound that the majority of protein binding regions are con-stituted by a-helical structures (Stites, 1997; Jian-Tao andMao-Zu, 2008). Moreover, all HABPs identified in Rv1980care located on surface-exposed regions of this protein, whichexplains their high-specific capacity to bind receptors on thecell surface and supports a possible role for these HABPs inmycobacterial invasion.
It has been recently reported that immunogenic secretedproteins considered attractive candidates for subunit-basedvaccines (Orme, 1988; Andersen et al., 1991a,c; Horwitzet al., 1995) could be key regulatory elements of macropi-nocytosis-mediated entry of M. tuberculosis into host cells(Garcia-Perez et al., 2003a). This phenomenon is frequentlyobserved without the establishment of a direct interactionbetween the bacilli and the host cell, therefore showing thatmembrane remodeling leading to macropinocytosis can beinduced by mycobacterial secreted proteins (Garcia-Perezet al., 2003a). The complexity of processes used by intra-cellular microorganisms to invade their target cells highlightsthe importance of developing a vaccine capable of blockingall different microbial invasion stages.
In our experience, peptides that bind specifically to targetcells and are capable of inhibiting to some extent mycobac-terial entry could be used as a template for designing immu-nomodulating peptides. Immune responses targeted againsthigh-specific binding sequences of mycobacterial proteinscan prevent target cell invasion, either during a first encoun-ter with the pathogen or during reactivation of a latentinfection.
Vaccine design has been traditionally oriented by theparadigm that the immune response against extracellularpathogens is mainly controlled by humoral mechanismsinvolving production of specific antibodies, whereas protec-tion against intracellular pathogens requires cellular immu-nity effector mechanisms. Nevertheless, this paradigmaticdistinction between type 1 and type 2 T-helper (Th) cell hostimmune responses faces a great challenge given that severalantigens or vaccine immunogens induce mixed responsesthat involve humoral as well as cellular immune effectors.Moreover, the functional independency of antibody- and cell-mediated immune responses under in vivo physiological con-ditions is uncertain (Igietseme et al., 2004; Maglione andChan, 2009).
Based on the fact that Th cells are very important for thedevelopment and specialization of B cells, and that the attackof intracellular infections is determined by the joint work ofcellular and humoral responses (Maglione and Chan, 2009),we expect for peptides of Rv1980c to induce an immuneresponse where humoral and cellular immunity are not mutu-ally excluded. In this sense, we can expect for peptide pres-
entation to T lymphocytes to trigger an effective cellularresponse capable of clearing out intracellular pathogens,being such a response mainly mediated by IL-2, TNF-a andIFN-g. We also expect for an active role of B cells and long-lasting antibodies, principally IgA, capable of regulating anacute inflammatory response and inducing opsonization and/or neutralization of mycobacteria, therefore blocking inva-sion to new target cells, even more considering that thisinhibitory potential was reported in this work for someHABPs identified in Rv1980c (Reljic et al., 2006; Lopez etal., 2009). Based on the aforementioned, we conclude thatthe implementation of a subunit-based vaccine containingconserved fragments of Rv1980c would probably interferewith the diagnostic utility of this protein.
In the case of tuberculosis, even though several HABPscapable of inhibiting entry to target cells have been identi-fied, the characterization of their immunological propertieshas been delayed owing to the lack of appropriate biosafetyconditions to carry out studies in animal models (Forero etal., 2005; Garcia et al., 2005; Vera-Bravo et al., 2005; Plazaet al., 2007; Chapeton-Montes et al., 2008b).
The results obtained in this study showed that HABPs31100, 31101, and 31107 were able to inhibit invasion ofM. tuberculosis to A549 cells and U937 monocyte-derivedmacrophages. Moreover, this study indicates that Rv1980chas an important role in mycobacterial pathogenesis, proba-bly related to host cell invasion, and therefore provides sup-port for the inclusion of these three HABPs as promisingcomponents of a multiepitope, chemically synthesized sub-unit antituberculous vaccine.
Materials and methods
Mycobacterial species
The following Mycobacterium species and strains were used:M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294), M. tuberculosis H37Ra(ATCC 25177), M. bovis (ATCC 19210), M. bovis BCG (ATCC35734, Pasteur substrain), M. africanum (ATCC 25420), M. microti(Pasteur strain, kindly donated by Dr. F. Portaels, Institute of Trop-ical Medicine, Belgium), M. flavescens (ATCC 14474), M. fortuitum(ATCC 6841), M. szulgai (ATCC 35799), M. peregrinum (ATCC14467), M. phlei (ATCC 11758), M. scrofulaceum (ATCC 19981),M. avium (ATCC 25291), M. smegmatis (ATCC 14468), M. non-chromogenicum (ATCC 19530), M. simiae (TMC 25275), M. intra-cellulare (ATCC 13950), M. gastri (ATCC 15754), M. kansasii(ATCC 12478), M. diernhoferi (ATCC 19340), M. gordonae (ATCC14470), M. marinum (ATCC 927), M. terrae (ATCC 15755), andM. chelonae chelonae (ATCC 35752). Strains were grown in Midd-lebrook 7H9 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) mediumaccording to the recommendations for each strain and manipulatedin a biosafety level 3 facility.
Molecular assays
The presence and transcription of Rv1980c was assessed in the 24Mycobacterium strains listed in the above section. ChromosomalDNA was isolated by phenol-chloroform extraction as describedelsewhere (Del Portillo et al., 1991; Parra et al., 1991; Mahairas et
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al., 1996). PCR assays were carried out on a Perkin-Elmer thermalcycler GeneAmp PCR system 9600, using 0.4 mM of forward (59-GCT GTC GTT TTG CTC TGT TG-39) and reverse primers (59-CGT GGT CGT TGG GTG CG-39) to amplify a 354-bp fragmentof Rv1980c. Amplification products were electrophoretically sepa-rated on agarose gel stained with SYBR safe (Invitrogen, Eugene,OR, USA). For reverse transcription (RT) PCR assays, RNA wasisolated according to Katoch’s methodology (Katoch and Cox,1986), kept at 378C for 1 h and treated the same as in PCR assays.The rpoB gene was used as positive transcription control (Lee etal., 2000) and DNAse-Q treated M. tuberculosis H37Rv DNA as anegative cDNA synthesis control.
Production of anti-Rv1980c sera in goats
Two goats previously determined to be nonreactive to M. tubercu-losis H37Rv sonicate by Western blot were inoculated with 5 mgof polymerized peptide 28484 (CG21ATAAPKTYCEELKGTD-TGQA40GC) or 28486 (CG141PITYDTLWQADTDPLPVV-FP160GC). These peptides were located at the N-terminal andC-terminal regions of the protein, respectively, and corresponded toB cell epitopes predicted using the BepiPred 1.0b server epitopeprediction software (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/) (Lar-sen et al., 2006). Polymers were administered on days 0, 20, and40 emulsified with Freund’s Incomplete Adjuvant (Sigma, St. Louis,MO, USA). Bleeding was carried out 20 days after the thirdinoculation.
Immunodetection by Western blotting and IEM
Rv1980c expression was assessed by Western blot analysis usinggoat anti-Rv1980c sera, as described elsewhere (Plaza et al., 2007).Protein subcellular localization was assessed by IEM. Briefly, myco-bacteria (M. tuberculosis H37Rv) were first fixed using 4% para-formaldehyde/0.5% glutaraldehyde in phosphate buffered saline andthen dehydrated through immersion in a series of graded alcohols(70%, 90%, and 100% twice). Bacilli were gradually embedded andpolymerized in LR-White resin (SPI supplies, West Chester, PA,USA), using accelerator for cold polymerization as specified by themanufacturer. Ultrathin sections were mounted on 300-mesh nickelgrids coated with collodion support. Grids were blocked in 5%bovine serum albumin/0.1% Tween 20 solution for 1 h and subse-quently incubated 16 h at 48C with 1:20 primary antibody for immu-nolabeling. Grids were then incubated with anti-goat antibodycoupled to 10-nm colloidal gold particles for 1 h at room temper-ature (Wagner et al., 1995). Finally, 6% uranyl acetate was addedto enhance image contrast and samples were analyzed in a HitachiHu-12A electron transmission microscopy. The M. tuberculosis usedfor IEM studies was harvested in logarithmic phase of growth toensure active mycobacterial growth and therefore Rv1980cexpression.
Cell cultures
The alveolar epithelial A549 cell line (ATCC CLL-185) and mac-rophages derived from U937 monocytes (ATCC CRL-1593.2) weremaintained in RPMI 1640 (Gibco, Eugene, OR, USA) medium sup-plemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco), at 378Cunder a 5% CO2 atmosphere. The two adherent cell lines were dis-lodged by suspension in Cell Dissociation Solution Non-enzymatic(1=) (Sigma) for 3 min at 378C and collected by centrifugation at500 g for 5 min. The pellet was resuspended in non-supplementedRPMI 1640 medium until further use.
Peptides
A total of 20 amino acid long, non-overlapping sequential peptidesspanning the entire length of the Rv1980c protein sequence weresynthesized by multiple solid phase methodology (Houghten, 1985).One Tyr residue was added at the C-terminus to those peptides notcontaining such residue in their sequence to allow w125Ix-radiolabel-ing. Peptides were purified by RP-HPLC and characterized bymatrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.
w125Ix-Radiolabeling
Peptides were radiolabeled according to a previously described tech-nique (Yamamura et al., 1978; Urquiza et al., 1996). In brief, Chlor-amine T (2.25 mg/ml) and 3.2 ml w125Ix-Na (100 mCi/ml) were leftto react with 5 ml peptide solution (1 mg/ml) for 5 min at 188C.The reaction was stopped by adding 15 ml sodium bisulfite (2.75mg/ml). Radiolabeled peptides were separated from reaction bypro-ducts on a Sephadex G-10 column (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
Binding assays
A549 or U937 cells (1.5=106) were incubated with increasing con-centrations of w125Ix-radiolabeled peptide (0–950 nM), in the pres-ence or absence of unlabeled peptide (40 mM), for 90 min at 48C(Forero et al., 2005; Vera-Bravo et al., 2005; Plaza et al., 2007).The reaction mixture was passed through a 60:40 dioctylphthalate-dibutylphthalate cushion (1.015 g/ml) and centrifuged at 4500 g for3 min. Cell-associated radioactivity was quantified in a gammacounter. Peptides showing a specific binding activity larger than 1%were considered to be HABPs, according to previously establishedcriteria (Forero et al., 2005; Vera-Bravo et al., 2005).
Saturation assay
Macrophages derived from U937 monocytes (1.2=106) were incu-bated with increasing concentrations of radiolabeled HABPs 31101,31107, and 31110 (0–3000 nM), in the presence or absence of thesame unlabeled HABP (30 mM). Unbound peptide was removedfrom cells by passing the reaction mixture through a dibutylphtha-late-dioctylphthalate cushion (1.015 g/ml). Cell-associated radioac-tivity data were plotted and the obtained curve was analyzed bysaturation and Hill analysis (Weiland and Molinoff, 1981; Hulme,1993).
Mycobacterial invasion assay
Invasion inhibition assays were performed according to the methodreported by Bermudez and Goodman (1996) and later modified byChapeton-Montes et al. (2008a). Harvested bacteria were labeledusing 20= SYBR safe (Invitrogen) and stored at -208C until use.A549 cells and U937 monocyte-derived macrophages (1=106), sus-pended in RPMI 1640 medium and supplemented with 10% FBS,were independently seeded in a 6-well multiwell plate and incubatedfor 16 h at 378C under a 5% CO2 atmosphere. Different peptideconcentrations (50, 100, and 200 mM) were added to the cell mono-layer and plates were kept at 378C for an additional hour. Mono-layers were incubated with RPMI 1640 medium instead of peptideas invasion control and with 3 mM cytochalasin D (Sigma) as neg-ative control. Mycobacteria (1=107 bacilli) suspended in 300 ml ofRPMI medium with no antibiotics were added to each well at a 1:10multiplicity of infection and incubated for 16 h at 378C. Amikacin
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Article in press - uncorrected proof
(ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) (20 mg/ml) was addedto each well and left under incubation for 2 h at 378C. Extracellularbacilli were removed by washing wells thrice with Hank’s BalancedSalt Solution (HBSS) (Gibco), and the cellular monolayer was dis-lodged using a 0.6% tripsin–0.2% EDTA solution (both from Sig-ma). Infected cells were suspended in 50 ml RPMI 1640 mediumand incubated with methylene blue (Merck, Darmstadt, Germany)for 5 min for flow cytometry analysis.
Samples were analyzed in a FACScan (Becton Dickinson, Moun-tain View, CA, USA), equipped with a 488-nm argon laser. Dataacquisition was carried out using Cellquest software (Becton Dick-inson) and analyzed with the FCS Express V3 program (De NovoSoftware, Los Angeles, CA, USA). A total of 30 000 events werecollected per sample (Chapeton-Montes et al., 2008a). Data werestatistically analyzed using the Student t-test.
In this study, we used A549 type II pneumocytes and macro-phages derived from U937 monocytes as an in vitro model of inva-sion owing to the ability of M. tuberculosis H37Rv to invade thesetwo types of cells. U937 cells are used to simulate the mycobacterialcolonization of the alveolar space by means of internalization andreplication inside macrophages. A549 cells allow studying a moreadvanced stage of infection in vitro, which involves not only alve-olar monocytes and macrophages but also epithelial and endothelialcells, a crucial step for mycobacterial dispersion to the bloodstreamand other organs (Mehta et al., 1996).
In a similar manner, the M. tuberculosis H37Rv reference strainused in mycobacterial invasion assays was also used in all experi-mental procedures (i.e., immunodetection and invasion assays),given that this strain produces full virulence in animal models oftuberculosis (Kubica et al., 1972), and its use allows the assuranceof obtaining results that are comparable and consistent with futuretrials in animal models.
Latex bead internalization
According to the methodology reported by El-Shazly et al. (2007),1=106 A549 cells were seeded onto a 6-well multiwell plate andleft 16 h until forming a cell monolayer. Independently, 100 mM ofeach peptide was coupled to 1=107 fluorescent latex beads of 1 mmdiameter (Sigma) by incubation at 378C for 2 h in incomplete RPMI1640.
Peptide-coated beads were incubated with A549 cells at 378C for3 h. Non-internalized beads were removed by washing cells thricewith HBSS. Cells were dislodged using a 0.6% trypsin–0.2% EDTAsolution and resuspended in 1 ml of incomplete RPMI medium tobe analyzed by flow cytometry, similarly described above in myco-bacterial invasion assays. Uncoated beads were used as negativecontrol. An additional control consisting of incubating cells withpeptides suspended in HBSS for 2 h followed by incubation withpeptide-free beads for 3 h was assessed to determine whether inter-nalization was produced by the peptides coating beads or whetherinternalization of latex beads was the result of any type of damageor modification caused by the peptide alone to A549 cells.
CD spectroscopy
CD studies were carried out with Rv1980c peptides to determinewhether there was any structural conformation-protein function cor-relation. In brief, the spectra of 0.1 mM peptide solutions in 30%(v/v) tetrafluoroethylene (TFE) aqueous solutions were obtained byaveraging three scans taken in a Jasco J-810 spectropolarimeter (Jas-co, Easton, MD, USA) at 208C, using a 1-cm cuvette, and correctedfor baseline deviation (wavelength range: 260–190 nm, scan rate:
20 nm/min, bandwidth: 1 nm) (Provencher and Glockner, 1981).The results were expressed in terms of mean residue ellipticity wQx,the units being degrees=cm2=dmol according to the functionwQxsQl/(100lcn), where Ql is the measured ellipticity, l is the opti-cal pathlength, c is the peptide concentration and n is the numberof amino acid residues in the peptide sequence (Sreerama et al.,1999).
Acknowledgments
The wholehearted assistance of Nora Martinez and Paula Martinezin the translation of this manuscript is greatly appreciated.
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Received August 12, 2009; accepted November 24, 2009
For Review O
nly
Two Mycobacterium tuberculosis surface protein-derived
peptides enhance CD83 expression in dendritic cells and a
Th1 cellular immune response in infected individuals
Journal: FEBS Journal
Manuscript ID: Draft
Manuscript Type: Regular Paper
Subdiscipline: Immunology
Date Submitted by the Author: n/a
Complete List of Authors: Rodriguez, Diana; Fundacion Instituto de Inmunologia de Colombia, Molecular Biology Parra-Lopez, Carlos; Universidad Nacional de Colombia, Microbiology Bernal, David; Universidad Nacional de Colombia, Microbiology Ocampo, Marisol; Fundacion Instituto de Inmunologia de Colombia, Molecular Biology Patarroyo, Manuel; Fundacion Instituto de Inmunologia de Colombia, Molecular Biology Patarroyo, Manuel; Fundación Instituto de Inmunologia de Colombia, Molecular Biology
Key Words: tuberculosis, high activity binding peptide, antigenicity, vaccine candidate, immune response
FEBS Journal
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1
Two Mycobacterium tuberculosis surface protein-derived peptides enhance CD83
expression in dendritic cells and a Th1 cellular immune response in infected
individuals
Diana Marcela Rodríguez 1, 2, 3 (£), Carlos Alberto Parra-López 3 (£), David Andrés
Bernal3, Marisol Ocampo 1, 2, Manuel Elkin Patarroyo 1, 3
and Manuel Alfonso Patarroyo* 1, 2
1 Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC), Carrera 50 # 26-20, Bogotá
D.C, Colombia
2 Universidad del Rosario, Carrera 24 # 63C-69, Bogotá D.C., Colombia
3 Universidad Nacional de Colombia, Carrera 45 # 26-85, Bogotá, D.C., Colombia
(£) Both authors contributed equally to this work
* Corresponding author: Fundación Instituto de Inmunología de Colombia, FIDIC
Cra. 50 No. 26-20 Bogotá, Colombia
Phone number +57-1-4815219
Fax number +57-1-4815269
E-mail address: [email protected]
Running title: Immunomodulation by Mtb surface protein peptides
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Abbreviations: High activity binding peptides (HABPs), Mycobacterium tuberculosis
(Mtb), T-lymphocyte (TL), dendritic cell (DC), cytometric bead array (CBA), mean
fluorescence intensity (MFI).
Key words: Tuberculosis; high activity binding peptide; antigenicity; vaccine candidate;
immune response.
Subdivision: Immunology
Summary
Our group has focused on identifying peptide regions within mycobacterial surface
proteins implicated in target cell entry for designing a sub-unit-based, synthetic, anti-
tuberculosis vaccine. The antigenicity of Mycobacterium tuberculosis Rv1980c and
Rv0679c protein high activity binding peptides (HABPs) to macrophages was evaluated
in the present study. Previous studies had shown that these HABPs were able to inhibit
M. tuberculosis H37Rv invasion of macrophages. These HABPs’ ability to activate
human dendritic cells and monocytes was therefore studied since both cells are targets
for mycobacterial invasion. The HABP pool was able to induce increased CD83
expression on dendritic cells. HABP recognition by healthy M. tuberculosis-infected and
non-infected individuals was also studied. CD4+ T lymphocyte (TL) activation (as
assessed by IFNγ production) was mainly observed in naïve and effector memory
subpopulations in individuals who had been previously exposed to M. tuberculosis.
Likewise, the CD8+ effector memory TL subpopulation was activated. Cell incubation
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with the HABPs induced the production of pro-inflammatory cytokines (IL-2 and IFNγ)
which are considered critical in establishing a protective immune response against
tuberculosis. Considering that these HABPs not only inhibit mycobacterial invasion of
target cells but also activate both CD4+ and CD8+ TLs, further studies aimed at
assessing their potential as anti-tuberculosis vaccine candidates should be undertaken.
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![Artritis Eber Oliva-Gutiérrez Martín Zapata-Zúñiga, Mayra ... · son estos residuos peptídicos citrulinados de la filagrina [36], por ello se denominaron anticuerpos anti-péptidos](https://static.fdocuments.us/doc/165x107/5e9a9f4cccacfd15fe055a67/artritis-eber-oliva-gutirrez-martn-zapata-ziga-mayra-son-estos-residuos.jpg)
