UNIVERSIDAD NACIONAL DE GENERAL SAN MARTÍN

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas “Rodolfo A. Ugalde”

Caracterización antigénica y funcional de la

proteína TSSA (Trypomastigote Small Surface

Antigen) de Trypanosoma cruzi

Tesis para optar por el Título de Licenciada en Biotecnología de la

Universidad Nacional de General San Martín.

Autor: Virginia Balouz

Director: Carlos A. Buscaglia

Octubre 2014

Abreviaturas

2

Agradecimientos

“… debemos compartir nuestro conocimiento con otros; todos tenemos muchas más capacidades de las que

utilizamos. Algunos lo descubrimos antes que otros…”

Brian Weiss: “Muchas vidas, muchos maestros”.

Agradezco a mis papás, por darme la oportunidad de estar aquí, ahora. Por el amor y apoyo

incondicional.

A Carlos, por su paciencia y por permitirme trabajar a su lado. Gracias por transmitirme tu

conocimiento y pasión por la investigación.

A Nati y Male, por ser hermanas, amigas y ejemplo. Las amo.

A Gaspar, por enseñarme y tenerme paciencia cuando más lo necesité.

Gracias a mis profesores, por transmitirme su pasión por el conocimiento.

Al Dr. Santiago Carmona y al Dr. Fernán Agüero, por compartir sus resultados conmigo, a la Dra.

Valeria Tekiel, por las infecciones de los ratones y a la Dra. Karina Pasquevich, que me ayudó a

entender y aplicar mejor la estadística.

A Mili por los ensayos de infección con parásitos y a Diego Rey, por compartir sus HeLa conmigo y

ensañarme a cuidarlas.

Agos, Su, Vicky, Jose, Sole, Chechu, Nicolino, Fran, Euge, les agradezco por ser una compañía

irremplazable, por hacerme reír siempre. A mis compañeros de en frente Maru, Cyn y Eze, por la

sonrisa y el ejemplo de pasión por el trabajo.

A Mili, Toti, Nachon, por compartir su conocimiento conmigo y ayudarme siempre.

Lu, gracias por tu paciencia y altruismo, por transmitirme tu amor por el trabajo bien hecho.

A Peter, quien me recomendó el libro citado al principio de esta página, gracias por ayudarme a

vencer mis miedos y transitar esta vida con más paz.

A mis amigas, Kei, Orne, Caro y Mai, por ir conmigo a la par.

A Pablín: Lamentablemente, en tantos años de estudio y a pesar de los esfuerzos, no hemos podido

demostrar la ausencia de ALIENS en nuestro planeta. Considerando nuestros avistamientos diarios,

creo que sería prudente abortar la misión. P.D.: Deberías considerar comprarte una agenda, genio.

A mis compañeros, Ani, Tite, Brian, Agus, Fran, Lu, por transitar conmigo este camino y enseñarme

que los prejuicios son sólo eso, prejuicios.

A Nelly, Heber, Nancy, Zulma, Kari y Fede por la sonrisa de todos los días.

A Magia y Timba, por su amor incondicional en cualquier situación, por recibirme siempre con un

rabo oscilante y demostrarme lo poco que les importa cuánto yo sepa, al quedarse dormidas en mi

falda en cada informe redactado frente a la PC.

A Juani, por tu paciencia, tu compañía, por hacerme feliz, por ayudarme a ser mejor persona y

amarme como soy (yo sé que es difícil). Te amo. Gracias.

I

Parte de los resultados obtenidos en este trabajo han sido presentados

(o están próximos a ser presentados) en los siguientes trabajos:

Cytokine Production but Lack of Proliferation in Peripheral Blood Mononuclear Cells from Chronic Chagas'

Disease Cardiomyopathy Patients in Response to T. cruzi Ribosomal P Proteins. Silvia A. Longhi, Augusto

Atienza, Graciela Perez Prados, Alcinette Buying, Virginia Balouz, Carlos A. Buscaglia, Radleigh Santos,

Laura M. Tasso, Ricardo Bonato, Pablo Chiale, Clemencia Pinilla, Valeria A. Judkowski, Karina A. Gómez.

PLoS Negl Trop Dis. 2014 doi: 10.1371/journal.pntd.0002906.

Use of high-density peptide microarrays to study natural immune responses directly from human clinical

samples. Santiago J Carmona, Morten Nielsen, Claus Schäfer-Nielsen, Juan S Mucci, Virginia Balouz,

Valeria Tekiel, Alberto C Frasch, Oscar Campetella, Jaime Altcheh, Carlos A Buscaglia, and Fernán Agüero.

Manuscrito enviado

Mapping antigenic and adhesive motifs in the Trypomastigote Small Surface Antigen (TSSA) from

Trypanosoma cruzi. Virginia Balouz, María de los Milagros Cámara, Gaspar E. Cánepa, Santiago J.

Carmona, Romina Volcovich, Jaime Altcheh, Fernán Agüero and Carlos A. Buscaglia. Manuscrito

en preparación

Abreviaturas

II

Abreviaturas

aa: Aa

abs: Absorbancia.

ABTS: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

ADN: Ácido desoxirribonucleico.

amp: Ampicilina.

ARNm: Ácido ribonucleico mensajero.

BSA: Albúmina sérica bovina.

cm: Cloranfenicol.

DAPI: 4',6-diamino-2-fenilindol.

DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium.

DMSO: Dimetilsulfóxido.

dpi: Días post-infección.

DTT: Ditiotreitol.

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay): Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas.

FN: Falso negativo.

fw: Forward.

GPI: Glicosilfosfatidilinositol.

GST: Glutatión-S-Transferasa.

HAI: Hemoaglutinación indirecta.

HRP (horseradish peroxidase): Peroxidasa de rábano.

IFI: Inmunofluorescencia indirecta.

IgG: Inmunoglobulina G.

IgM: Inmunoglobulina M.

IPTG: Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido.

kDa: KiloDalton.

km: Kanamicina.

LB: Medio de cultivo Luria-Bertani.

MASPs (Mucin-associated surface proteins): Proteínas de superficie asociadas a mucinas.

MEM (minimum essential medium): Medio mínimo esencial.

min.: Minutos

nm: Nanómetros.

NTD (Neglected Tropical Disease): Enfermedad tropical desatendida.

Abreviaturas

III

OVA: Ovoalbúmina.

PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis): Electroforesis en gel de poliacrilamida.

PBS: Buffer fosfato salino.

PCR (Polimerase Chain Reaction): Reacción en cadena de la polimerasa.

rv: Reverse.

SAPA (Shed Acute Phase Antigen): Antígeno secretado de fase aguda

SD: Desvío estándar.

SFB: Suero fetal bovino.

TBS: Tris buffer salino.

TIA (Trans-sialidase Inhibition Assay): Ensayo de inhibición de la trans-sialidasa.

TMB: 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina.

TPBS: Tween 20 al 0,05% en buffer fosfato salino.

TTBS: Tween 20 al 0,05% en buffer Tris salino.

TSs: Trans-sialidasas

TSSA (Trypomastigote Small Surface Antigen): Antígeno pequeño de la superficie del tripomastigote.

U.A.: Unidades Arbitrarias.

VP: Verdadero positivo.

5-FAM: 5- CarboxyFluorescein-Aminohexyl Amidite.

Glosario

IV

Glosario

carrier: Proteína transportadora usada para la conjugación de péptidos.

cut-off: Línea de corte.

if-then: Si- entonces

performance: Desempeño, rendimiento.

pooles: Mezclas.

screening: Búsqueda, en general a gran escala, de fenómenos de interés.

Índice

V

Índice

Introducción 1

Trypanosoma cruzi y Enfermedad de Chagas 1

Transmisión de la Enfermedad de Chagas 2

Epidemiología e Iniciativas para el control de la Enfermedad de Chagas 3

Diagnóstico de la Enfermedad de Chagas 4

Mecanismos de invasión de Trypanosoma cruzi 5

Trypomastigote Small Surface Antigen (TSSA) 6

Objetivos 9

Objetivos Generales 9

Objetivos Específicos 9

Resultados 10

I. Caracterización de la respuesta inmune humoral contra TSSA en pacientes

Chagásicos 10

I.I Estudio de la región antigénica de TSSA VI 10

I.I.I Microarreglo de péptidos 10

I.I.II Clonado, expresión y purificación de proteínas recombinantes 11

I.I.III Estudios de ELISA usando proteínas recombinantes 12

I.II Ensayo de inmunodetección basado en el péptido E2E3 16

I.II.I Estandarización 16

I.II.II Evaluación 19

I.III Exploración de la variabilidad de la respuesta inmune humoral contra TSSA 21

I.III.I Evaluación de TSSA como marcador de infecciones congénitas 21

I.III.II Estudio de la respuesta inmune contra TSSA en un modelo de infección

murino 24

II. Mapeo del dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas 27

II. I Ensayos de interacción con monocapas de células no macrofágicas 27

II. II Ensayos de infección in vitro 28

Discusión 32

I. Caracterización de la respuesta inmune humoral contra TSSA en pacientes

Chagásicos 32

Índice

VI

II. Mapeo del dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas de

mamíferos 36

Conclusiones 38

Materiales y Métodos 39

Microarreglo de péptidos 39

Cepas bacterianas y plásmidos 40

Oligonucleótidos 41

Preparación de células competentes 41

Construcción de las variantes delecionales de TSSA VI 41

Secuenciación 42

Expresión y purificación de proteínas recombinantes 42

Condiciones de Cultivo bacteriano 43

Técnicas de biología molecular 43

Péptidos 43

Acoplamiento de los péptidos 43

Homogenato de tripomastigotes 44

ELISA 44

ELISA de desplazamiento 45

Ensayos de pegado de proteínas recombinantes a células en cultivo 45

Detección colorimétrica 46

Criterios de positividad y negatividad en los ensayos de ELISA 46

Paneles de sueros usados 47

Infecciones de ratones 47

Infecciones de células en cultivo con T. cruzi 47

Viabilidad de los parásitos 48

Viabilidad celular 48

Análisis estadístico 49

Información suplementaria 50

Referencias Bibliográficas 52

Notas 58

Introducción

1

Introducción

Trypanosoma cruzi y Enfermedad de Chagas

La Tripanosomiasis Americana, comúnmente llamada Enfermedad de Chagas, es causada por el

parásito protozoario Trypanosoma cruzi1. Considerada una de las 17 enfermedades tropicales desatendidas

(Neglected Tropical Diseases, NTD) actuales2, la Enfermedad de Chagas es endémica en 21 países de

América. En los últimos años, y debido a fenómenos migratorios humanos, también se ha registrado un

aumento en el número de casos en países no endémicos3.

T. cruzi es un parásito unicelular flagelado cuyo ciclo de vida digeneico se desarrolla alternando entre

insectos triatominos (Subfamilia: Triatominae, Familia: Reduviidae, Orden: Hemiptera) y un amplio rango de

hospedadores vertebrados domésticos y salvajes, incluyendo al hombre1,4

. En cada hospedador, el parásito

atraviesa distintos estadios morfológicos mayoritarios; dentro del insecto vector se desarrollan los estadios de

epimastigote y tripomastigote metacíclico y en el hospedador vertebrado, los estadios de amastigote y

tripomastigote sanguíneo4. El ciclo infectivo comienza cuando el insecto hematófago ingiere tripomastigotes

(forma infectiva no replicativa) presentes en la sangre del humano infectado. Dentro del tracto digestivo del

insecto, los tripomastigotes se diferencian extracelularmente a epimastigotes (forma replicativa no infectiva).

Al alcanzar la última porción del tracto digestivo, los parásitos se diferencian al estadio de tripomastigote

metacíclico (forma infectiva no replicativa), los cuales son liberados junto a las heces del insecto cuando éste

se alimenta. El parásito ingresa al organismo humano por lesiones en la piel o las mucosas, e infecta las

células cercanas al sitio de inoculación. Una vez dentro de las células, el parásito se diferencia a amastigote,

que es la forma replicativa intracelular. Luego de varias rondas de división celular en el citoplasma de la

célula infectada, los amastigotes se transforman nuevamente en tripomastigotes (distintos bioquímica y

morfológicamente a los tripomastigotes metacíclicos), los cuales escapan de la célula y, vía fluídos

extracelulares, invaden distintos tipos celulares del corazón, ganglios y otros tejidos1.

Luego de un período de incubación de 5-40 días, el 10-30% de los individuos infectados comienzan a

manifestar los síntomas de la etapa aguda de la Enfermedad de Chagas. En esta etapa resulta frecuente la

aparición de un edema en el sitio de infección denominado ‘Chagoma’ o bien, cuando la entrada del parásito

es por conjuntiva ocular, de un edema palpebral unilateral característico denominado Signo de Romagna5,6

.

Estas manifestaciones facilitan el diagnóstico de la enfermedad; sin embargo, es común que la misma se

presente de manera subclínica o asociada con síntomas inespecíficos como dolor de cabeza, fiebre, dolor

estomacal, anorexia, entre otros. La tasa de mortalidad del Chagas agudo es del 5-10%, siendo las víctimas

más frecuentes los niños que desarrollan miocarditis o meningoencefalitis5,6

. La fase aguda, caracterizada por

altos niveles de parasitemia, concluye cuando se alcanza un equilibrio patógeno-hospedador en el cual el

número de tripomastigotes circulantes se reduce drásticamente y se produce la “seropositivización”: un

aumento significativo de la reactividad serológica contra distintos antígenos de T. cruzi.

Introducción

2

En ausencia de tratamiento con las drogas disponibles, que presentan eficacia subóptima y efectos

adversos7, las personas infectadas entran en la fase crónica de la enfermedad. La mayoría de los pacientes

Chagásicos permanecen asintomáticos durante sus vidas, aunque representan una potencial fuente de

transmisión y pueden sufrir una reactivación de la infección si son inmunosuprimidos8. Alrededor del 30% de

las personas infectadas desarrollan, al cabo de años o décadas, las manifestaciones clínicas características de

la Enfermedad de Chagas crónica9. Las patologías más comunes incluyen las cardiomiopatías y desórdenes

gastrointestinales como megaesófago y megacolon1,6,10,11

.

Las variaciones geográficas en la prevalencia y gravedad de las formas clínicas han sido asociadas

con aspectos inmunológicos y/o genéticos de las diferentes poblaciones humanas y/o a la complejidad

genotípica de la población del parásito12

. Hasta el momento, distintas tipificaciones bioquímicas y

moleculares realizadas sobre múltiples aislamientos o cepas del parásito han permitido delinear al menos 6

linajes evolutivos dentro de la especie T. cruzi, llamados TcI a TcVI13

. Estos linajes muestran fenotipos muy

diferentes a nivel de infectividad en el insecto vector, invasión y multiplicación intracelular in vitro,

susceptibilidad a drogas, tropismo tisular y/o virulencia en modelos animales definidos14–17

. Si bien la

situación eco-epidemiológica no ha sido bien definida, el escenario emergente de distintos estudios indica que

los linajes TcIII y TcIV son encontrados principalmente en animales selváticos mientras que los linajes

restantes parecerían estar relacionados con los ciclos de infección peridomésticos y/o domésticos, y de hecho

también han sido encontrados en pacientes infectados17,18

. Más recientemente, sin embargo, el linaje TcIV

(junto al TcI) ha sido identificado en brotes infecciosos humanos en zonas selváticas, posiblemente

relacionados con la vía de transmisión oral del parásito (ver debajo)19,20

.

Transmisión de la Enfermedad de Chagas

En zonas endémicas la vía de transmisión más prevalente es la vectorial, aunque el contagio también

puede ocurrir por transmisión oral al consumir comidas o bebidas contaminadas con insectos infectados o su

excreta19,20

. Otros modos de transmisión conocidos son la transferencia vertical de madre a hijo durante el

embarazo o en el parto, la transmisión por trasplantes con órganos infectados y/o transfusiones sanguíneas,

así como también por accidentes en laboratorios1. Las medidas sanitarias tomadas por los países endémicos

(ver más adelante) han logrado disminuir significativamente los casos de infección vectorial1. Sin embargo,

esta disminución ha puesto de manifiesto la importancia de la transmisión vertical, incluso en países donde la

enfermedad no es endémica. La prevalencia de la Enfermedad de Chagas en mujeres embarazadas en

América Latina es de 12,5% a 40% dependiendo de la zona geográfica, y la tasa de transmisión vertical oscila

entre un 1% a un 18,2%21

, indicando que la infección congénita por T. cruzi será un tema central de la Salud

Pública regional por al menos los próximos 20 años. Los factores que han sido relacionados con el riesgo de

trasmisión vertical incluyen la fase de la enfermedad en la que se encuentra la madre, el estatus

inmunológico, el linaje evolutivo de la cepa infectante y el aumento de la carga parasitaria por fenómenos de

Introducción

3

“reactivación”22

. A modo de prevención, se recomienda hacer análisis serológicos a las mujeres embarazadas

que vivan o hayan vivido en zonas endémicas, que vivan en zonas no endémicas pero hayan recibido

transfusiones sanguíneas en un país endémico, o que sean hijas de madres nativas de zonas endémicas. Los

recién nacidos infectados con T. cruzi suelen nacer prematuramente razón por la cual presentan bajo peso y

dificultad respiratoria, también pueden presentar un menor índice de APGAR, hepatomegalia,

esplenomegalia e ictericia23

. Muchos casos de infección congénita con T. cruzi, sin embargo, pueden

presentar síntomas no específicos, tal como se observa en otras infecciones congénitas (por ejemplo,

Toxoplasma gondii, el virus Rubéola, virus Herpex Simplex y Citomegalovirus21,24

).

Epidemiología e Iniciativas para el control de la Enfermedad de Chagas

Se estima que existen alrededor de 10 millones de personas infectadas con T. cruzi en Latinoamérica

y El Caribe y 0,4 millones de personas infectadas en países no endémicos. Cada año se registran 40000

nuevas infecciones, alrededor de 14000 recién nacidos con infección congénita y 20000 muertes relacionadas

con la Enfermedad de Chagas25

. Debido a las condiciones socio-economicas desfavorables de la mayoría de

las zonas endémicas, se estima que existen entre 25-90 millones de personas en riesgo de infección26

. Sin

embargo, todas estas son aproximaciones imprecisas ya que se basan en estudios estadísticos y supuestos

porcentuales1,27

. Entre las causas que podrían llevar a una subestimación en los índices de prevalencia se

encuentran la falta de una infraestructura adecuada (personal, insumos) para el diagnóstico y tratamiento en

zonas endémicas y las características clínicas particulares de la enfermedad. Por estas razones, se recomienda

tener en cuenta otros factores como presencia y tasa de infección de vectores, prevalencia en animales

domésticos que puedan actuar como reservorio del parásito, seroprevalencia poblacional y porcentajes de

infección en bancos de sangre, para realizar estudios epidemiológicos válidos. A su vez, se recomienda

analizar regiones delimitadas, ya que la prevalencia varía significativamente entre zonas rurales y urbanas1.

Debido a la ausencia de vacunas contra la Enfermedad de Chagas, los métodos más efectivos de

prevención son el control de las poblaciones de vectores mediante el uso de insecticidas (piretroides), el

testeo serológico de bancos de sangre y poblaciones de riesgo28

y la concientización de la población en zonas

endémicas. En países endémicos se han creado programas abocados a controlar la diseminación de la

enfermedad de Chagas usando una combinación de los métodos anteriormente descriptos. Los programas

incluyen el INCOSUR (Iniciativa del Cono Sur, 1991) en Argentina, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay,

IPCA (Iniciativa de los países de Centroamérica, 1997), IPA (Iniciativa de los países Andinos, 1998),

AMCHA (Iniciativa de los países del Amazonas, 2003) y la Iniciativa Mexicana (Iniciativa para la Vigilancia

y el Control de la Enfermedad de Chagas en la República Mexicana, 2004). En Argentina, la prevención y

control de la transmisión de la enfermedad de Chagas fue declarada de interés nacional en la Ley de Chagas

(Ley 26.281 del año 2007) que establece la obligatoriedad de realizar pruebas diagnósticas en mujeres

embarazadas, recién nacidos, hijos de madres infectadas y niños de 6 a 12 años de edad. También, son

Introducción

4

obligatorios los controles serológicos en donantes y receptores de órganos, tejidos y sangre. Los bancos de

sangre y tejidos humanos, los servicios de hemoterapia y los establecimientos públicos o privados de

cualquier denominación legalmente autorizados a extraer o transfundir sangre humana o sus componentes y a

realizar injertos de tejidos y trasplantes de órganos deben practicar los exámenes que establece la autoridad

sanitaria nacional y tomar los recaudos necesarios para evitar toda posibilidad de transmisión de la

enfermedad.

Diagnóstico de la Enfermedad de Chagas

Durante la etapa aguda, y debido a los altos niveles de parasitemia característicos, los métodos

diagnósticos más apropiados son los de detección parasitológica directa. Los métodos más utilizados son el

Strout, Microhematocrito, la Gota fresca, la Gota gruesa y Microtubo. Los 4 últimos son apropiados para

emplear en niños y neonatos debido al bajo volumen de sangre que emplean (0,3 ml). Todos estos métodos se

basan en la detección de parásitos en sangre por microscopía y precisan de personal calificado e

infraestructura adecuada29

. Existen también métodos parasitológicos indirectos como el hemocultivo y el

xenodiagnóstico, aunque éstos son más costosos y laboriosos29

. Por otro lado, se han desarrollado métodos

moleculares para la detección de “productos” del parásito, entre los que destacan los basados en técnicas de

PCR. El blanco más usado es el ADN extranuclear del kinetoplasto30

, el cual se presenta en múltiples copias

(~5.104) dentro de la mitocondria del parásito

31 y, por lo tanto, aumenta la sensibilidad del método respecto a

usar blancos en el ADN nuclear32

. Sin embargo, estos ensayos no son de rutina en el diagnóstico clínico por

su alto costo, requerimientos de equipamiento y personal especializado, y performance subóptima29

.

El diagnóstico de infecciones congénitas puede realizarse sobre sangre del neonato o del cordón

umbilical. Se recomienda la técnica de microhematocrito frente a la gota fresca por ser más sensible,

económica y rápida. En el caso de que el resultado sea negativo se debe realizar un test de detección de

anticuerpos contra T. cruzi luego de 9-12 meses, cuando el neonato ya no presente anticuerpos maternos en

sangre24,29

. En lo que respecta al diagnóstico serológico de infecciones agudas y congénitas, los métodos

basados en la detección de IgMs de distintas especificidades contra antígenos del parásito son

desaconsejados33

y los resultados más promisorios hasta el momento se han obtenido mediante la búsqueda

de IgGs contra el antígeno SAPA (Shed Acute Phase Antigen)34–37

.

Debido a la baja o nula parasitemia, los métodos de detección parasitológica directa y/o indirecta

(microscopía, hemocultivo, xenodiagnóstico y PCR) muchas veces arrojan resultados negativos falsos

durante la fase crónica, por lo que los test serológicos emergen como las herramientas más apropiadas para el

diagnóstico. Algunos de los test usados son: Inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemoaglutinación indirecta

(HAI), ELISA, la fijación de complemento, radioinmunoprecipitación y Western blot33,38,39

. De estos ensayos,

los tres primeros se implementan en la actualidad en forma rutinaria en la clínica debido a su simplicidad,

bajos costos y buena performance40

. Debe mencionarse que existen tests de diagnóstico serológico más

Introducción

5

sensibles y específicos, basados en la identificación de anticuerpos particulares, los cuales lamentablemente

son laboriosos y difíciles de implementar a gran escala. Entre ellos, se destaca el TIA (Trans-sialidase

Inhibition Assay) y la detección de anticuerpos contra epitopes glicosídicos de alfa-Galactosa (alfa-Gal)

presentes en las mucinas de tripomastigotes (fracción 2/3 o tGPI-mucins), con propiedades líticas41–44

.

Dado que no existe un ensayo gold standard (que muestre 100% de sensibilidad y especificidad) para

el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, la Organización Mundial de la Salud recomienda el uso de al

menos dos test en paralelo, basados en criterios diferentes (en general ELISA y HAI o IFI)45,46

. En caso de

tener resultados ambiguos o discordantes, se recomienda la realización de un tercer test33

. Algunos de los test

de ELISA comerciales se basan en la detección de anticuerpos contra lisados parasitarios (obtenidos de

formas epimastigote) descripto originalmente por Voller y col. en 197547

. Este test, al igual que todos los que

usan mezclas indefinidas de antígenos de T. cruzi, presenta baja especificidad debido a la reacción cruzada de

anticuerpos contra Leishmania spp y ciertas enfermedades autoinmunes48,49

. Distintos antígenos definidos han

sido propuestos y en algunos casos implementados para el diagnóstico de Chagas por ELISA con el objeto de

mejorar la especificidad y sensibilidad. Estos incluyen proteínas purificadas por lectinas50,51

, péptidos

sintéticos52,53

, proteínas recombinantes54–58

y antígenos secretados/excretados de tripomastigotes (TESA)59,60

.

En este contexto, la búsqueda activa de nuevas herramientas (reactivos y/o plataformas de acoplamiento de

los mismos) para el mejoramiento del serodiagnóstico constituye una prioridad en la investigación en

Enfermedad de Chagas33

.

Mecanismos de invasión de Trypanosoma cruzi

El proceso de interacción T. cruzi-célula hospedadora incluye la adhesión y reconocimiento,

señalización, invasión y remodelado. El primer evento involucra el reconocimiento entre moléculas presentes

tanto en el parásito como en la célula huésped; aunque también es posible que moléculas excretadas por el

parásito participen en este proceso61,62

. Un gran número de moléculas del glicocálix de T. cruzi (con aparente

redundancia funcional) han sido involucradas en la interacción inicial de las distintas formas tripomastigote

con la membrana plasmática de la célula huésped63,64

. Estas moléculas, por lo general ancladas por

glicosilfosfatidil inositol (GPI) a la superficie del parásito, se agrupan en distintas familias de glicoproteínas

incluyendo mucinas, trans-sialidasas (TSs)65–67

, moléculas tipo TS (TS-like) y MASPs (Mucin-

associated surface proteins)68,69

entre otras63,64,70

. Las propiedades adhesivas de todas estas moléculas del

parásito se dedujeron inicialmente a partir de ensayos de interacción con células completas y experimentos en

los que la adición exógena de moléculas solubles (proteínas nativas, recombinantes, anticuerpos específicos,

fragmentos Fab o glicosil hidrolasas) modulaba la adhesión e internalización del parásito, interfiriendo con la

interacción receptor-ligando.

Dentro de la familia de las TSs, se ha demostrado que Tc-85 y gp (glicoproteína) 83, restringidas a

los tripomastigotes derivados de células, se unen a integrinas, al receptor del factor de crecimiento nervioso

Introducción

6

TrkA (receptor de tropomiosin kinasa A) y a componentes de la matriz extracelular como fibronectina y

laminina71–74

. Las TSs activas, además, cumplen un rol ‘indirecto’ en la interacción, transfiriendo residuos de

ácido siálico desde los glicoconjugados del huésped a las mucinas del parásito y generando epitopes

glicosídicos involucrados en la adhesión, sobrevida e infectividad del tripomastigote75,76

. La proteína gp82

(un miembro de la familia de TSs restringido a tripomastigotes metacíclicos) interactúa con mucinas

epiteliales77

, mientras que otras moléculas relacionadas como gp90 y gp30 participan en la adhesión de estos

estadios via receptores celulares aún desconocidos65

.

Las mucinas son el grupo de glicoproteínas más numeroso en la superficie de T. cruzi y están

codificadas por dos grandes familias génicas llamadas TcMUC y TcSMUG78

. Las mucinas de T. cruzi

presentan una región central de entre 50-200 aminoácidos (aa) ricas en residuos Ser y Thr, aptas para la O-

glicosilación que les confiere el carácter hidrofílico característico75

. La expresión coordinada de un gran

repertorio de mucinas que contienen regiones variables en la cubierta del tripomastigote sugiere su

participación en la interacción con distintos tipos celulares y/o en el escape de la respuesta inmune del

hospedador78

. Como se mencionó arriba, se ha demostrado que proteínas de superficie tipo mucinas (y/o

epitopes sacarídicos que decoran estas moléculas) están implicadas en el reconocimiento y señalización de la

célula hospedadora65,76,78,79

. Si bien la variabilidad de las mucinas de T. cruzi tanto a nivel de secuencia

peptídica como de modificaciones post-traduccionales es enorme78

, los ligandos celulares para algunas de

estas moléculas han sido propuestos80

.

Trypomastigote Small Surface Antigen (TSSA)

En el año 2002, Di Noia y colaboradores81

describieron una proteína de T. cruzi expresada en la

superficie de tripomastigotes a la cual llamaron antígeno pequeño de la superficie del tripomastigote (TSSA,

Trypomastigote Small Surface Antigen), que generaba una fuerte respuesta humoral en humanos y animales

infectados. Análisis por Southern blot indicaron que el gen que codifica para TSSA se encuentra como copia

única81

, lo cual fue luego ratificado al secuenciarse el genoma de la cepa CL Brener82

. TSSA es una mucina

perteneciente al grupo III de la familia TcMUC78

, el cual comparte la presencia de sitios hipervariables

cercanos al extremo amino terminal, pero no presenta secuencias repetitivas ni corridas de residuos Thr como

los grupos I y II83

. Algoritmos de predicción y comparaciones de la secuencia de TSSA con mucinas

pertenecientes a los grupos TcMUC I y II, permitieron identificar una secuencia señal en el amino terminal de

26 aa con un 76% de similitud83,84

, y una secuencia de anclaje por GPI de 27 aa en el extremo carboxilo

terminal, la cual presenta un 85% de identidad con la señal de anclaje por GPI descripta para los grupos I y

II83

(figura I.1). En consecuencia, luego del procesamiento intracelular de estas señales, la proteína madura (o

core en la figura I.1) contendría aproximadamente 40 aa. Estudios acerca de la expresión a nivel

transcripcional evidenciaron la presencia del ARNm de TSSA en los estadios de epimastigote, tripomastigote

derivados de células, amastigote y tripomastigote metacíclico, siendo este último el de mayor nivel de

Introducción

7

transcripción. Sin embargo, el patrón observado a nivel de transcripción no parece correlacionarse con los

niveles de expresión proteica, ya que estudios por Western blot e inmunofluorescencia indirecta mostraron

que la expresión de TSSA se restringe al estadio de tripomastigotes derivados de células81

. Este fenómeno es

consistente con el predominio de la regulación génica posttranscripcional descripto en T. cruzi, en el cual la

abundancia de ARNm no correlaciona con los niveles de proteína expresada85

.

Análisis bioquímicos sobre la proteína TSSA nativa (aislada de tripomastigotes derivados de células),

así como también sobre la proteína recombinante expresada por epimastigotes transfectados, indicaron que

TSSA es procesada y expuesta en la superficie del parásito como una proteína tipo mucina43,86

. Sin embargo,

en contraste con la mayoría de las proteínas tipo mucina descriptas en T. cruzi78,87

, TSSA es muy pequeña (14

kDa) y no parece sufrir una abundante O-glicosilación in vivo81,86

. Péptidos sintéticos y/o proteínas

recombinantes basados en la región central de TSSA fueron fuertemente reconocidos por sueros de pacientes

Chagásicos y animales infectados con T. cruzi43,81,88

. A su vez, anticuerpos contra la proteína TSSA expresada

en bacterias (sin glicosilar), fueron capaces de reconocer a TSSA en la superficie de tripomastigotes

derivados de células86

. Todos estos resultados, en conjunto, sugieren la exposición de secuencias peptídicas

“desnudas” (es decir, hipoglicosiladas o no glicosiladas) en la superficie de los tripomastigotes derivados de

célula. Por lo tanto, el uso proteínas recombinantes expresadas en E.coli y/o de péptidos sintéticos

constituyen herramientas adecuadas para el estudio de las propiedades antigénicas y funcionales de TSSA86

.

Estudios sobre el locus de tssa, demostraron la presencia de secuencias polimórficas en la zona

central de la molécula, la cual contiene los secuencias antigénicas81

(ver abajo). En la actualidad se han

descripto al menos 6 isoformas mayoritarias de TSSA (figura I.1), las cuales se encuentran en los diferentes

linajes de T. cruzi (TcI a VI), sugiriendo el uso potencial de esta molécula en la tipificación indirecta, usando

técnicas serológicas 43,88–90

.

Proteínas recombinantes conteniendo toda la región central de TSSA VI (presente en los linajes TcII,

TcV y TcVI, figura I.1) o TSSA I (presente en el linaje TcI) fusionadas a Glutatión-S-Transferasa (GST) y un

extenso panel de sueros Chagásicos crónicos y de pacientes afectados por otras parasitosis o enfermedades

autoinmunes permitió el estudio del potencial serodiagnóstico de TSSA. La ausencia de reacción cruzada con

antígenos de Leishmania, la especificidad del 97,4% comparada con el 80-90% que se alcanza con los test

diagnósticos basados en mezclas indefinidas de antígenos y la sensibilidad del 87% usando muestras de

sueros de pacientes Chagásicos seropositivos y más de un 98% al usar muestras de pacientes con parasitemia

positiva, demostraron el potencial de TSSA VI como herramienta para el diagnóstico de infecciones

crónicas43

. Interesantemente, TSSA I mostró un reconocimiento nulo (similar al del control de GST) sobre

esa misma población de pacientes, sugiriendo un fuerte sesgo en los linajes circulantes en infecciones

humanas, al menos en la población estudiada (Argentina, Brasil). Estos datos mostraron cierta correlación

con los obtenidos por tipificación directa de parásitos aislados de pacientes de estas mismas regiones

geográficas89,91

.

Introducción

8

Un mapeo preliminar de epitopes B lineales (los cuales suelen estar conformados por 8-11 aa92

) en la

proteína TSSA VI, basado en un arreglo de péptidos de 8-11 aa con un solapamiento de 5 aa, permitió

identificar la presencia de una secuencia serorreactiva principal 41

KPATGEAPSQ50

y dos secuencias de

menor reactividad 30

TSSTPPSGTEN40

y 36

SGTENKPATG45

(esta última conformada por secuencias de las

dos primeras). Sin embargo, estudios posteriores en el laboratorio mostraron que los datos surgidos de este

mapeo preliminar deben ser revisados, ya que un péptido sintético de secuencia 41

KPATGEAPSQ50

presentó

una prevalencia subóptima al ser ensayado contra un panel de sueros Chagásicos crónicos (~60%; datos no

publicados).

Más recientemente, estudios acerca de la función de TSSA demostraron su participación activa en el

reconocimiento y entrada del parásito en la célula huésped. Este fenómeno quedó evidenciado por la

interacción de moléculas recombinantes de TSSA VI con células de mamíferos, por la drástica reducción de

los niveles de infección de monocapas celulares in vitro en presencia de anticuerpos específicos y/o

moléculas recombinantes de TSSA VI adicionadas exógenamente, y por la complementación del fenotipo

“adhesivo” a estadios no invasivos de T. cruzi (epimastigotes) por expresión ectópica de TSSA VI93

.

Interesantemente, la adición exógena de péptidos sintéticos de TSSA VI provocó la movilización de Ca+2

intracelular y cascadas de señalización de quinasas en la célula huésped. En contraste con estos resultados,

TSSA I presentó bajo niveles de adhesión a monocapas de células no macrofágicas. Más aún, la adición

exógena de péptidos solubles de TSSA I no afectó la infectividad in vitro de tripomastigotes del linaje TcVI

y/o TcI. En conjunto con los datos mencionados anteriormente, estos resultados sugieren que las variaciones

entre las secuencias de las isoformas de TSSA tienen no sólo un impacto en su antigenicidad43,81

, sino que

poseen también un correlato funcional en términos de adhesión y transducción de señales86

.

Objetivos

9

Objetivos

Objetivos Generales

Caracterizar la respuesta inmune humoral contra TSSA VI en pacientes Chagásicos.

Mapear el dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas.

Objetivos Específicos

Mapear las secuencias inmunorreactivas de TSSA VI en la etapa crónica de la enfermedad.

Evaluar la reactividad de TSSA VI en sueros de pacientes agudos vectoriales, congénitos y

crónicos, con el propósito de identificar posibles características diferenciales entre los mismos.

Mapear el dominio de interacción entre TSSA y células no macrofágicas de mamíferos.

Resultados

10

Resultados

I. Caracterización de la respuesta inmune humoral contra TSSA VI en pacientes

Chagásicos

I.I Estudio de la región antigénica de TSSA VI

I.I.I Microarreglo de péptidos

Con el objetivo de mapear las secuencias

antigénicas de TSSA VI, se realizó un análisis basado

en un microarreglo de péptidos de alta densidad94

. El

arreglo contenía la secuencia completa de la proteína

TSSA VI, representada por 78 péptidos de 15 aa,

solapados en 14 aa de forma tal de tener una máxima

capacidad de resolución. Este microarreglo fue

evaluado con 2 mezclas de IgGs, cada una de ellas

purificada a partir de un pool de 5 sueros Chagásicos

crónicos, las cuales se ensayaron por duplicado.

La secuencia de cada uno de los péptidos del

microarreglo y sus reactividades individuales para cada

de las muestras se detalla en la tabla S. 1. El perfil de

reactividad global obtenido para cada una de las

muestras se muestra en la figura R.1. En la parte

superior de la imagen se indicaron los péptidos que

coinciden con las proteínas recombinantes usadas en

los análisis posteriores (ver a continuación). Ambas mezclas mostraron un pico único y amplio de

fluorescencia donde no fue posible identificar epitopes B discretos, con reactividad positiva (definida como >

3 Unidades Arbitrarias, U.A., de fluorescencia) para cada uno de los péptidos del 24 al 44 (figura R.1 y tabla

S. 1). Los péptidos reactivos, en conjunto, abarcan la secuencia

24TANGGSTSSTPPSGTENKPATGEAPSQPGASSGEA

58, la cual fue definida como la región antigénica de

TSSA VI. Cada mezcla de IgGs usada generó un perfil de reconocimiento peptídico diferente (figura R.1),

con una reactividad máxima para el péptido 31 (31

SSTPPSGTENKPATG45

, tabla S.1) en la mezcla 1 y para el

péptido 36 (36

SGTENKPATGEAPSQ50

, tabla S.1) en la mezcla 2, poniendo en evidencia la variabilidad de la

respuesta inmune humoral contra TSSA VI en pacientes Chagásicos crónicos. Estos resultados, además,

sugieren que la respuesta inmune humoral contra TSSA VI en muestras de pacientes Chagásicos crónicos es

Resultados

11

compleja, y está conformada por anticuerpos de especificidad levemente diferencial y, por lo tanto,

orientados a distintas secuencias de esta molécula (figura R.1).

I.I.II Clonado, expresión y purificación de proteínas recombinantes

A continuación, con el objetivo de profundizar los estudios sobre la respuesta inmune humoral contra

TSSA VI y refinar la búsqueda de secuencias inmunodominantes dentro de esta molécula, utilizamos un

nuevo acercamiento basado en proteínas recombinantes. Para ello, se generaron 2 conjuntos de variantes

delecionales de la proteína TSSA VI, uno compuesto por 5 proteínas de 15 aa cada una y otro conformado

por 4 proteínas de 9 aa cada uno. Las variantes delecionales se clonaron en el vector de expresión pGEX-2T

con el fin de obtener proteínas de fusión a GST. Los plásmidos obtenidos se introdujeron en la cepa de

Escherichia coli BL21-CodonPlus y se indujo la expresión de las proteínas recombinantes con IPTG. Estas

proteínas fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad a partir de la fracción soluble obtenida luego

de la lisis bacteriana. En paralelo, se expresaron y purificaron siguiendo la misma metodología las proteínas

recombinantes GST, GST-TSSA VI (residuos 24 a 62) y GST-TSSA I (residuos 24 a 61) para ser usadas

como controles. Las últimas 2 proteínas, que ya habían sido descriptas86

, carecen de las secuencias de

direccionamiento a retículo endoplásmico y anclaje por GPI, abarcando exclusivamente la porción de la

proteína potencialmente expuesta en la superficie del tripomastigote de uno u otro linaje evolutivo (ver figura

I.1), que en el caso de TSSA VI coincide casi perfectamente con la región antigénica identificada en el

microarreglo (figura R.1).

Resultados

12

En la figura R.2 se muestran geles SDS-PAGE 12,5% teñidos con Azul brillante de Coomassie en los

que se sembraron 0,5 µg de cada una de las proteínas purificadas. En el panel a se muestran las proteínas

purificadas correspondientes a las variantes de 15 aa (con un peso molecular aparente de ~30 kDa) y las

proteínas GST-TSSA VI y GST-TSSA I, con un peso molecular aparente de ~37kDa y ~35kDa,

respectivamente. En todos los casos, los pesos moleculares aparentes fueron compatibles con los esperados

(ver figura R.3). La figura R.2 (panel b) muestra las proteínas purificadas correspondientes al panel de

variantes de 9 aa, que en todos los casos mostraron un peso molecular estimado de ~29kDa, también

compatibles con los esperados (ver figura R.3). Las diferencias de peso molecular aparente entre GST-TSSA

VI y GST-TSSA I, que no pueden ser explicadas a partir de las diferencias en su composición aminoacídica

(ver figura R.3), ya habían sido reportadas86

. En todos los casos obtuvimos una pureza considerable, reflejada

en la ausencia de bandas adicionales, aunque las proteínas GST-TSSA VI-e2 y GST-TSSAVI-eD,

presentaron bandas secundarias de menor peso molecular aparente, probablemente atribuibles a productos de

degradación parcial. Como resultado final se obtuvieron las proteínas de fusión a GST, representadas

esquemáticamente en la figura R.3. Las variantes delecionales de la serie GST-TSSA VI-e1 a -e5, tienen 15

aa de longitud y presentan un solapamiento parcial de 9 aa entre ellas, mientras que la serie GST-TSSA VI-

eA a -eD se compone de 4 proteínas de 9 aa de longitud y presentan un solapamiento parcial de 3 aa entre

ellas. Como se mencionó, las secuencias aminoacídicas contenidas en las variantes delecionales de 15 aa se

corresponden exactamente con algunos de los péptidos de los microarreglos (figura R.1 y tabla S.1) y, en

conjunto, conforman toda la secuencia inmunorreactiva de TSSA VI deducida a partir del análisis de los

mismos (residuos 24 a 62).

I.I.III Estudios de ELISA usando proteínas recombinantes

Se realizaron ensayos de ELISA usando individualmente las variantes delecionales de 15 aa

explicadas en el punto anterior. Como control positivo se usó la proteína GST-TSSA VI y como controles

negativos las proteínas GST y GST-TSSA I (que no es reconocida por sueros Chagásicos crónicos del sur de

Sudamérica81

). Se analizó un panel de 51 muestras de sueros Chagásicos crónicos (individuos adultos, de

distintos sexos y características etnográficas, y con > de 5 años de infección) proporcionados por el Instituto

Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén” y del Laboratorio de Parasitología-Enfermedad de

Chagas del Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutierrez”. Para la determinación del cut-off se usaron en cada

ensayo de 2 a 4 sueros del mismo grupo etario, negativos para los test de Chagas convencionales, obtenidos

de hemocentro (datos no mostrados).

Resultados

13

La proteína TSSA VI (control positivo), presentó una prevalencia de ~90% (46 sueros positivos sobre

51 sueros totales ensayados), concordante con los datos previos43,86

; mientras que la proteína TSSA I no

mostró reactividad con ninguno de los sueros analizados (figura R.4 y datos no mostrados). Interesantemente,

la proteína TSSA VI-e2 presentó la misma prevalencia, y en un 81% de los casos reactividad similar que la

proteína TSSA VI, sugiriendo que es capaz de recapitular en gran medida la performance diagnóstica de

TSSA VI (figura R.4). Las proteínas TSSA VI-e3 y TSSA VI-e4 mostraron prevalencias del ~57% y ~41%,

respectivamente, mientras que las proteínas TSSA VI-e1 y TSSA VI-e5, no mostraron reactividad en los

ensayos (figura R.4). El péptido 48, que posee la misma secuencia que TSSA VI-e5, tampoco había mostrado

reactividad en el ensayo del microarreglo peptídico (figura R.1 y tabla S.1). Sin embargo, el péptido 24, que

posee la misma secuencia que la proteína TSSA VI-e1, sí mostró reactividad para ambas mezclas de IgGs en

el microarreglo (figura R.1 y tabla S.1). Más allá de esta discrepancia, que podría atribuirse a diferencias

metodológicas entre los ensayos de microarreglos peptídicos y ELISA basado en proteínas recombinantes

utilizados, ambos ensayos mostraron resultados altamente coincidentes.

A continuación, expresamos un nuevo panel de 4 variantes delecionales de 9 aa cada una, solapadas

en 3 residuos. Estas variantes delecionales, en conjunto, abarcan las secuencias contenidas en TSSA VI-e2,

TSSA VI-e3 y TSSA VI-e4, reactivas en el ensayo de ELISA anterior (figura R.4). La reactividad de estas

nuevas variantes delecionales se analizó por ELISA, siguiendo el mismo protocolo descripto para las

variantes de 15 aa. La prevalencia de las variantes delecionales TSSA VI-eA y eD fue de 0%, mientras que

TSSA VI-eB y eC presentaron un ~33% y ~37% de prevalencia, respectivamente (figura R.4). Estos

resultados indican que la reactividad de la proteína de TSSA VI-e2 depende de residuos presentes tanto en su

Resultados

14

extremo N-terminal como C-terminal, ya que su fragmentación en dos variantes delecionales de 9 aa (TSSA

VI-eA y eB) conlleva una significativa reducción en la performance serodiagnóstica de las mismas (figuras

R.3 y R.4). Una situación similar ocurre con TSSA VI-e3, ya que su reactividad fue sustancialmente mayor

que la obtenida para las variantes delecionales TSSA VI-eB y eC derivadas de ella (figuras R.3 y R.4). En

contraste con estos resultados, la variante delecional TSSA VI-e4 presentó reactividad individual similar para

los sueros ensayados y valores de prevalencia comparables con TSSA VI-eC (~41% vs. ~37%,

respectivamente), indicando que los residuos 51 a 56 no contribuirían significativamente al potencial

serodiagnóstico de TSSA VI-e4 (figuras R.3 y R.4).

Resultados

15

El distinto patrón de reconocimiento antigénico para cada uno de los sueros analizados (figura R.4),

pone en evidencia la variabilidad en la especificidad de anticuerpos anti-TSSA VI dentro de la población

analizada, lo cual es coincidente con los datos del microarreglo peptídico. Más importante, el conjunto de los

resultados presentados hasta aquí sugieren que la respuesta inmune humoral contra TSSA VI está dirigida

principalmente hacia la secuencia 30

TSSTPPSGTENKPAT44

(TSSA VI-e2) y, en menor medida, hacia la

secuencia 36

SGTENKPATGEAPSQ50

(TSSA VI-e3).

Con el objetivo de evaluar esta hipótesis, llevamos a cabo un ensayo de desplazamiento usando

péptidos sintéticos (tabla M.3). Los sueros fueron preincubados 30 min con el péptido sintético indicado o

con PBS (control negativo), en un volumen final 10 μl (figura R.5). Luego de la incubación, se llevaron las

mezclas a un volumen final de 250 μl con solución de bloqueo y se sembraron, por triplicado, en placas de

ELISA previamente sensibilizadas con 0,5 μg de la proteína GST-TSSA VI. Finalmente, las muestras se

procesaron por ELISA según lo descripto y se revelaron con anticuerpos anti-IgG humana acoplados a

peroxidasa. En un primer ensayo, se usaron los péptidos sintéticos derivados de la secuencia de TSSA VI-e2

(E2), TSSA VI-e3 (E3), para estandarizar la cantidad de péptido adecuada para el desplazamiento. Para ello

se usaron dos sueros previamente caracterizados, uno de reactividad predominante para TSSA VI-e2 y otro

con reactividad predominante para TSSA VI-e3 (sueros 27935 y 30385, respectivamente, figura R.4). Se

preincubó cada suero con cantidades crecientes de péptido (0,02 μg; 0,2 μg y 2 μg) o con PBS como control

negativo. De esta manera, se determinó que la cantidad adecuada para obtener un desplazamiento cercano al

50% es 2 μg de péptido por pocillo (figura R.5). A continuación, se usaron 8 sueros de pacientes Chagásicos

crónicos reactivos para TSSA VI11

pero cuya especificidad de anticuerpos contra TSSA VI no había sido

mapeada. Además de los péptidos E2 y E3, en este análisis se incluyó un péptido llamado E2E3

(CTSSTPPSGTENKPATGEAPSQ) que combina la secuencia de TSSA VI-e2 y TSSA VI-e3 y, como

control negativo adicional, un péptido de igual composición aminoacídica que este último pero de secuencia

alterada (E2E3sc: CGPSNESTEKSPQSATATGPPT) (tabla M.3).

En concordancia con la hipótesis planteada anteriormente, en 7 sueros el desplazamiento con el

péptido E2 redujo la reactividad en más del 50%, mientras que el suero restante presentó una disminución de

la reactividad del 28%. La preincubación con el péptido E3, en cambio, produjo una disminución

significativa de la reactividad en sólo 3 de los 8 sueros analizados (figura R.5). Más importante, el péptido

E2E3 que combina ambas secuencias antigénicas provocó un aumento del efecto de desplazamiento que

alcanzó en los 8 sueros un 70 a 90%. En conclusión, estos resultados en conjunto con los obtenidos

previamente validan la “jerarquía” antigénica propuesta para distintas secuencias de TSSA VI e indican que

la secuencia 30

TSSTPPSGTENKPATGEAPSQ50

sería una herramienta adecuada para el desarrollo de un

nuevo reactivo de serodiagnóstico basado en TSSA VI.

Resultados

16

I.II Ensayo de inmunodetección basado en el péptido E2E3

I.II.I Estandarización

Basándonos en los resultados obtenidos en la sección anterior estandarizamos las condiciones para la

evaluación del péptido sintético E2E3 como reactivo de serodiagnóstico para la Enfermedad de Chagas

crónica. En un primer paso, los péptidos E2E3 y E2E3sc se acoplaron a la proteína carrier maleimida-

ovoalbúmina (OVA), a través de un residuo Cys artificial (ausente en la secuencia de TSSA VI) presente en

sus extremos N-terminales (tabla M.3). Distintas cantidades de los péptidos, acoplados a la proteína OVA o

sin acoplar, se usaron para sensibilizar las placas de ELISA, las cuales fueron luego ensayadas con 4 sueros

de pacientes Chagásicos crónicos; 2 con reactividad baja para TSSA VI-e3 y alta para TSSA VI-e2 (28222 y

28221); uno con reactividad alta para ambas variantes delecionales (13t) y uno con reactividad baja para

ambas variantes delecionales (20i) (figura R.4).

Resultados

17

En la figura R.6 se muestran los resultados obtenidos en el ensayo de estandarización de la cantidad

de péptido E2E3 y OVA-E2E3 por pocillo. El péptido E2E3 de mostró reactividad similar al usar 10 µg y 1

µg para los sueros 28222 y 20i, mientras que la cantidad siguiente (0,01 µg) mostró un decaimiento leve en la

reactividad para ambos sueros. En los sueros restantes, se observó un decaimiento leve en función de la

cantidad de E2E3, en todo el rango de cantidades ensayadas. Por otro lado, en las cantidades de 1 µg y 0,1

µg/pocillo de péptido acoplado a OVA se observaron absorbancias similares, y mientras que al usar 0,01

µg/pocillo se observó un decaimiento en la reactividad en todos los sueros. El péptido E2E3sc, tanto en

solución como acoplado a OVA, no mostró diferencias de reactividad en función de la cantidad usada. En

todos los casos, E2E3sc mostró absorbancias menores a 0,1, lo que indica que es un control adecuado para los

ensayos y que la reactividad del péptido E2E3 es específica de secuencia. En conclusión, se determinó que la

cantidad adecuada de péptido/pocillo para sensibilizar las placas de ELISA es de 1 µg para el péptido en

solución, sin acoplar a OVA y de 0,1 µg para el péptido acoplado a la proteína OVA.

Resultados

18

Tabla R.1: Evaluación del acoplamiento del péptido E2E3.

Suero

GS

T-

TS

SA

VI-

e2

GS

T-

TS

SA

VI-

e3

GS

T-

TS

SA

VI

E2

E3

OV

A-E

2E

3

30385 + +++ ++

30682 ++ ++

31070 ++ ++

19i +++ ++ +++

P08

P21 ++

P22

P25 +

RM1

RM2

RM08

RM10

RM12

RM13

A continuación, se realizó un ensayo en el cual se evaluó el desempeño del péptido E2E3 en

condiciones más astringentes (performance frente a sueros con reactividad baja o nula para TSSA VI) y

también la necesidad de acoplarlo a OVA. Con este objetivo, seleccionamos un total de 14 sueros de

pacientes Chagásicos crónicos, 4 de ellos previamente analizados (figura R.4) y 10 sueros con baja o negativa

reactividad para TSSA VI, no mostrados anteriormente11

. Se usaron los péptidos E2E3 y E2E3sc (ambos

acoplados o no a OVA) para el ensayo de ELISA y, para la determinación del cut-off, se ensayaron en

paralelo 3 pooles de 10 sueros negativos cada uno (datos no mostrados). Todos los sueros positivos para la

proteína GST-TSSA VI, resultaron positivos para E2E3 y OVA-E2E3; a su vez, todos los sueros negativos

para TSSA VI, resultaron también negativos para el péptido E2E3 (acoplado o en solución), indicando que la

sensibilidad del método de ELISA no pudo ser mejorada al usar el péptido sintético en cualquiera de las

presentaciones ensayadas (tabla R.1). El péptido E2E3sc no mostró reactividad en ningún caso (datos no

+++ Suero positivo con Abs450nm mayor a 0,8.

++ Suero positivo con Abs450nm entre 0,5 y 0,8.

+ Suero positivo con Abs450nm entre 0,5 y 0,4.

Suero negativo

Resultados

19

mostrados). En conclusión, dado que no se observaron diferencias significativas entre E2E3 acoplado o en

solución, se optó por usar el péptido libre (en solución) para la sensibilización en todos los ensayos

posteriores.

I.II.II Evaluación

Dados los resultados del punto anterior, realizamos un análisis exhaustivo del potencial

serodiagnóstico (en términos de especificidad y sensibilidad) del péptido E2E3. A fines comparativos, se

evaluó en paralelo a la proteína GST-TSSA VI. Para ello se usó un total de 108 muestras de sueros, 70

correspondientes a pacientes con infección Chagásica crónica y 38 muestras de individuos del mismo grupo

etario, negativos para los test de diagnóstico de Chagas comerciales. De las 70 muestras positivas, 51 habían

sido usadas en el análisis de mapeo de la región antigénica de la proteína TSSA VI (figura R.4). Se analizó la

reactividad de ambos antígenos y sus respectivos controles (E2E3sc y GST) en ensayos ELISA. Todos los

sueros fueron ensayados por triplicado, y su reactividad fue normalizada a la de un suero patrón de

reactividad conocida, que se evaluó en paralelo en cada ensayo. Como puede verse en la figura R.7, ambos

antígenos mostraron una capacidad para discriminar las poblaciones positivas y negativas de sueros altamente

significativa. Con los datos obtenidos, se graficaron las curvas ROC (receiver-operating characteristic) para

cada antígeno y se obtuvieron los parámetros de sensibilidad y especificidad y área bajo la curva de cada uno.

En la figura R.7, se muestra un modo alternativo de graficar los valores de sensibilidad y especificidad para

cada posible valor de corte. En este caso, se graficó sensibilidad o especificidad en función del cut-off

(expresado como porcentaje de reactividad) en un mismo eje cartesiano; las curvas de sensibilidad y

especificidad se cortan para un cierto valor de reactividad que corresponde al valor de cut-off para el cual se

obtiene la mejor combinación posible de sensibilidad y especificidad.

El análisis por curvas ROC deriva en un análisis gráfico que permite evaluar la performance de un

determinado ensayo en términos de sensibilidad y especificidad para cada posible valor de cut-off del ensayo.

Para realizar este análisis, se deben considerar punto a punto las dos afirmaciones correctas, verdadero

positivo (VP) y falso negativo (FN), que dependen del cut-off seleccionado. Las variaciones en el número de

estos parámetros dan lugar a diferentes valores de sensibilidad y especificidad.

Teniendo en cuenta que cuanto más cercano a 1 es el valor del área bajo la curva (AUC), más

informativo es el test diagnóstico aplicado95

, se dedujo que TSSA VI (AUC=0,9647) y E2E3 (AUC=0,9741)

son antígenos con alta performance diagnóstica (figura R.7). En el análisis realizado, el valor de sensibilidad

que maximizó la especificidad fue de 91,43% para GST- TSSA VI y de 88,57% para E2E3 (tabla R.2). Esto

indica que al exigir una especificidad del 100% (no tener falsos positivos), se obtendrá un 8,57% de FN en el

primer caso y 11,43% en el caso de usar E2E3.

Resultados

20

Por otro lado, el valor de especificidad que maximizó la sensibilidad fue 18,42% para GST- TSSA VI

y 31,58% para E2E3 (tabla R.2). Estos valores fueron bajos debido a que se incluyeron en el panel analizado

muestras de pacientes Chagásicos crónicos que no presentaban reactividad contra TSSA VI (figura R.4); por

lo tanto, exigir una sensibilidad del 100% requiere un valor de corte tan bajo que aumenta el número de

muestras positivas falsas (disminuyendo la especificidad). Por esta razón, consideramos más acertado

analizar la mejor combinación de valores de especificidad y sensibilidad (tabla R.2). Se obtuvieron valores

comparables en ambos antígenos, a su vez el porcentaje de especificidad mejoró con respecto al anterior

(94,74%) en ambos casos. Finalmente, realizamos el análisis estadístico propuesto por DeLong y

colaboradores96

para comparar las curvas ROC obtenidas para TSSA VI y E2E3 usando el software MedCalc.

No se obtuvieron diferencias significativas entre las curvas (P=0,4792), lo cual indica que la performance de

los antígenos evaluados para el diagnóstico de Chagas crónico es similar en estas condiciones experimentales.

En conclusión, obtuvimos un reactivo alternativo de serodiagnóstico basado en TSSA VI, con una

performance similar que la proteína recombinante GST-TSSA VI usada hasta este momento.

Tabla R.2: Valores de sensibilidad y especificidad calculados a partir de la figura R.10.

Antígeno % cut-off (PR)* % Sensibilidad % Especificidad

E2E3 8,025 100,00 31,58

19,04 88,57 100,00

GST-TSSA VI 5,72 100,00 18,42

16,24 91,43 100,00

E2E3 12,98 92,86 94,74

GST-TSSA VI 13,77 94,29 94,74 *PR: Porcentaje de reactividad

Resultados

21

I.III Exploración de la variabilidad de la respuesta inmune humoral contra TSSA

I.III.I Evaluación de TSSA como marcador de infecciones congénitas

Debido a la transferencia pasiva de anticuerpos maternos de isotipo IgG en los sueros de los

neonatos92

, se evaluó la presencia de anticuerpos IgM anti-TSSA VI, por el método ELISA, en un panel de 24

muestras Chagásicas; 12 correspondientes a pacientes menores de un año con infección congénita y 12 de

niños sanos del mismo grupo etario, hijos de madres infectadas. Para la determinación del cut-off se

ensayaron tres sueros de individuos del mismo grupo etario, hijos de madres no Chagásicas. Como controles

se usaron las proteínas GST, GST-SAPA (antígeno considerado gold-standard para la detección serológica

de infecciones agudas/congénitas35

) y homogenato de tripomastigotes. Cuatro sueros resultaron positivos para

el análisis de IgM contra la proteína GST-SAPA, de los cuales sólo uno resultó positivo también para la

proteína GST-TSSA VI y otro para el homogenato de tripomastigotes. Como se esperaba, el control con GST

no mostró reactividad en ningún caso, y las muestras provenientes de niños nacidos de madres no Chagásicas

tampoco mostraron reactividad para ninguno de los antígenos (tabla R.3). Estos resultados indican que la

presencia de IgM en general, y de IgM anti-TSSA VI en particular, no es un buen biomarcador para la

detección de infecciones congénitas.

Tabla R.3: Análisis de inmunoglobulinas en muestras de niños menores a un año nacidos de madres infectadas

Isotipo Muestras de sueros n GST GST- TSSA

VI

GST-

SAPA

Homogenato de

Tripomastigotes

IgM Infectados (MH+) 12 0 1* 4 1*

Sanos 12 0 0 0 0

IgG Infectados (MH+) 12 0 9 8 10

Sanos 12 0 5 2 6

IgG IgG bebé > IgG materna

Muestras pareadas 5 N.A. 0 4 N.A.

* Sueros con reactividad IgM contra GST-SAPA. MH+: Microhematocrito positivo. N.A.: No aplica.

Interesantemente, al analizar 9 muestras pareadas de madres infectadas con hijos sanos, encontramos

una madre infectada con presencia de anticuerpos IgM contra TSSA VI (datos no mostrados). En contraste,

ninguna de las madres de niños infectados mostró anticuerpos IgM contra TSSA VI ni SAPA (datos no

mostrados). Estos resultados indican que la presencia de IgM no se limita a la etapa aguda de la enfermedad

de Chagas, una de las razones por las que su uso es desaconsejado para el diagnóstico de infecciones

congénitas33

.

Resultados

22

En paralelo, se estudió también la presencia de anticuerpos de isotipo IgG dirigidos contra TSSA VI

en muestras pareadas de los bebés y madres infectadas (tabla R.3), usando los mismos controles que en el

ensayo anterior. Si bien todos los bebés infectados (y muchos de los no infectados) mostraron anticuerpos de

isotipo IgG contra TSSA VI, en ningún caso el título de los mismos superó el título de anticuerpos de isotipo

IgG contra el mismo antígeno en las madres (tabla R.3). Estos resultados sugieren que las IgG contra TSSA

VI presentes en los bebés podrían deberse a la transferencia pasiva de anticuerpos maternos. De todas

maneras, dado que se habían obtenido títulos muy altos para algunas de las muestras pareadas (figura R.8,

familia 1), cercanos al límite del rango dinámico de la técnica, decidimos re-evaluar la reactividad serológica

contra TSSA VI usando diluciones seriadas de los sueros (figura R.8). Se analizó la reactividad contra TSSA-

VI en 2 diluciones de suero materno y del bebé, en 2 de las muestras pareadas; una de ellas con valores de

reactividad contra TSSA VI altos y similares entre la madre y el niño (familia 1) y la familia 2 con

reactividad diferencial contra TSSA VI entre la madre y el hijo. En ninguna de las muestras pareadas se

observó una dilución con mayor reactividad contra TSSA VI en el niño que en su respectiva madre.

En contraste con estos resultados, el título de anticuerpos de isotipo IgG contra el antígeno SAPA

mostró ser, en el 80% de los casos, mayor en los bebés que en sus madres (tabla R.3), sugiriendo fuertemente

la síntesis endógena de anticuerpos de isotipo IgG contra SAPA como resultado de la infección activa, tal

cual lo sugerido36

. Estos resultados, en conjunto, indican que TSSA VI no es un buen biomarcador de

infecciones congénitas.

Por otro lado, buscamos explorar la utilidad de la variabilidad inter-individual (figura R.4) de la

respuesta inmune humoral contra TSSA VI con fines diagnósticos más específicos, particularmente como un

posible indicador de la progresión de la infección. El reconocimiento diferencial de anticuerpos contra

Resultados

23

distintos epitopes de un mismo antígeno a distintos tiempos de una respuesta inmune ha sido reportado97–99

.

Con el objetivo de analizar esta hipótesis, se evaluaron dos poblaciones de pacientes Chagásicos: la primera

correspondiente a 20 pacientes Chagásicos con infección congénita, de entre 1 y 3 años (población de

“crónicos tempranos”) y la segunda, compuesta por 6 pacientes con infección aguda vectorial, cuyo tiempo

de infección es menor a un año. Se evaluó la reactividad de todos los sueros contra GST-TSSA VI y todas sus

variantes delecionales en ensayos de ELISA, usando como control la proteína GST. En todos los casos, para

la determinación del cut-off se evaluaron 3 muestras de sueros de individuos sanos del mismo grupo etario.

De las 20 muestras de pacientes “crónicos tempranos”, 18 resultaron positivos para TSSA VI mientras que de

las 6 muestras de pacientes agudos, 3 resultaron positivos para esta proteína. Interesantemente, el isotipo

mayoritario en estas 3 muestras era IgM en vez de IgG; y en los 3 casos también presentaron IgM circulantes

contra SAPA (datos no mostrados). Posteriormente, se analizó la especificidad de anticuerpos en los sueros

positivos para TSSA VI. Ninguno de los sueros analizados mostró reactividad contra las variantes

delecionales TSSA VI-e1, TSSA VI-e5, TSSA VI-eA ni TSSA VI-eD (datos no mostrados).

Con el objetivo de identificar patrones de especificidad de anticuerpos diferenciales entre las

poblaciones, realizamos un análisis comparativo incluyendo a la población de pacientes Chagásicos crónicos

cuya especificidad de anticuerpos había sido mapeada anteriormente (figura R.4). El estudio incluyó sólo las

proteínas para las cuales al menos un suero mostró reactividad en cualquiera de las poblaciones (TSSA VI-

e2, e3, e4, eB, eC). La figura R.9 detalla, para cada población, el porcentaje de sueros que comparten un

perfil determinado de reactividad (indicado a la derecha).

Para evaluar las diferencias entre los perfiles de reconocimiento entre las poblaciones se aplicaron

árboles de decisión, que representan funciones lógicas (if- then). Brevemente, a partir de un conjunto de datos

de entrenamiento (en este caso el patrón obtenido para cada suero perteneciente a las diversas poblaciones) el

algoritmo infiere (aprende) de dicho conjunto de datos y genera un modelo (conjunto de reglas). Este modelo

deduce (o predice) las clases contenidas en el conjunto de datos de entrenamiento (en este caso, a qué

población corresponde) y como resultado crea un conjunto de datos de testeo100

. Mediante la comparación de

las clases reales contenidas en el conjunto de datos de entrenamiento con las clases predichas en el conjunto

de datos de testeo se determina el porcentaje de aciertos logrados. Con este porcentaje se estima en qué

medida el modelo creado es adecuado para clasificar los datos. En este caso, utilizamos el algoritmo “J48”

que utiliza un método heurístico para inferir el árbol, donde se realiza la selección del atributo en cada nivel

del árbol en función de la calidad de división que produce101

. El árbol de decisión que genera este algoritmo

se basa en la teoría del Grano de Información donde la bifurcación en cada nodo busca la mayor ganancia de

información, y se generan reglas de decisión que son fáciles de interpretar101

.

El árbol de decisión obtenido, logró clasificar correctamente 50 de 65 sueros totales (diagonal en la

tabla R.4), es decir que obtuvimos un 23% de sueros mal diagnosticados. Esto indica que, al menos con el

diseño experimental propuesto, no es posible identificar un patrón de reconocimiento distintivo de una dada

Resultados

24

población. Aparentemente la población “crónica” y “crónica temprana” poseen especificidades similares, que

a su vez difieren de la población de pacientes con infección aguda; sin embargo, los resultados de esta última

población se encuentran sesgados por la escasa cantidad de sueros incluidos.

Tabla R.4: Clasificación de los sueros usando el árbol de decisión generado

Población Clasificados como

Crónicos Crónicos tempranos Agudos

Crónicos 44 0 0

Crónicos tempranos 14 4 0

Agudos 1 0 2

I.III.II Estudio de la respuesta inmune contra TSSA en un modelo de infección murino

El antecedente de la presencia de IgM contra TSSA VI en sólo 1 de las 12 muestras de sueros de

pacientes con infección congénita comparado con la presencia de reactividad (IgM) en 3 de las 6 muestras de

pacientes con infección aguda, sugirieron la presencia de respuesta inmune humoral diferencial contra TSSA

VI (y posiblemente contra otros antígenos del parásito) debida a los distintos modos de infección. Sin

Resultados

25

embargo, la carencia de sueros de pacientes con infección aguda vectorial, acotó las posibilidades de hacer un

estudio exhaustivo al respecto. Como aproximación alternativa, nos propusimos evaluar la respuesta inmune

humoral en un modelo de infección en ratones, el cual es ampliamente usado en estudios de inmunidad en

infecciones por T. cruzi102,103

. Para el estudio se realizaron 3 infecciones independientes con la cepa RA

perteneciente al linaje Tc VI104

, en ratones hembra adultas (5-6 semanas) de las cepas C3H/HeJ y CF1. Se

infectaron un total de 16 ratones, aunque uno de ellos no sobrevivió más allá de los 15 dpi y por lo tanto fue

excluido del análisis. Los 15 ratones restantes negativizaron la parasitemia a los 25-35 dpi; sin embargo sólo

en 9 de ellos se logró detectar inmunidad humoral contra distintos antígenos de T. cruzi, según la reactividad

obtenida por ELISA contra un homogenato de tripomastigotes. En estos animales, se obtuvieron los valores

de parasitemia y los títulos de anticuerpos de isotipos IgM e IgG contra los antígenos GST-TSSA VI, GST-

SAPA y homogenato de tripomastigotes usando como control la proteína GST, a distintos dpi. A

continuación, se muestran los resultados de uno de los seguimientos (en representación de los tres realizados)

en el cual se infectaron 4 ratones hembras (CF1) con la cepa RA.

La figura R.10 muestra la curva de parasitemia y los títulos de anticuerpos IgM e IgG contra el

homogenato de tripomastigotes. Alrededor del día 15 post-infección comienza a aumentar la concentración

de parásitos en sangre, que muestra un pico al día

20 post-infección y comienza a decaer hasta

niveles indetectables a los 40 dpi. Este periodo, en

el cual se detecta presencia de parásitos en sangre,

correspondería a la etapa aguda en humanos

infectados. En infecciones en humanos, la

desaparición de la parasitemia marca el fin de la

etapa aguda y comienzo de la fase crónica de la

enfermedad, la cual se caracteriza también por la

presencia de anticuerpos contra los antígenos de T.

cruzi (seropositividad). Basándonos en estas

características, definimos estas etapas en el modelo

de infección estudiado.

Se observó un aumento de los en los títulos

de anticuerpos IgM contra TSSA VI, SAPA y

homogenato de tripomastigotes alrededor del día

24 post-infección (figuras R.10 y 11). Estos títulos

se mantuvieron hasta el día 42 post-infección y

luego disminuyeron hasta la finalización del

ensayo. Al analizar la parasitemia en conjunto con

Resultados

26

estos resultados, se observó que el título de inmunoglobulinas de isotipo M aumenta mientras todavía existen

parásitos en sangre (fase “aguda”) y se mantienen luego de su desaparición (fase "crónica”). A su vez, se

analizaron los títulos de anticuerpos para cada antígeno y se encontró que el antígeno con mayor título de

anticuerpos IgM entre los evaluados fue TSSA VI, seguido del homogenato de tripomastigotes y SAPA.

Para el análisis del perfil de anticuerpos de isotipo IgG generados durante la infección, se usaron los

mismos controles que en el estudio anterior (figura R.10 y 11). Se observó un aumento en los títulos de

anticuerpos IgG contra TSSA VI, SAPA y homogenato de tripomastigotes alrededor del día 24 post-

infección, estos títulos continuaron aumentando hasta el día 40, a partir del cual se mantuvieron constantes.

Al analizar la parasitemia en conjunto con estos resultados, se observó que el título de inmunoglobulinas de

isotipo G aumenta mientras todavía existen parásitos en sangre (fase “aguda”) y se mantienen luego de su

desaparición (fase “crónica”). A su vez, se encontraron diferencias significativas al comparar la reactividad

general (IgG) contra TSSA VI contra GST- SAPA (P<0,001) y el homogenato de tripomastigotes (P<0,05),

según el test estadístico de Bonferroni (ANOVA de dos vías).

Finalmente, al analizar el perfil de anticuerpos IgM e IgG en conjunto, pudimos observar que los

títulos de ambos isotipos aumentan de manera coordinada hacia el día 24 para los antígenos analizados; estos

resultados difieren con los observados en las respuestas inmunes clásicas donde al principio de la infección se

sintetizan inmunoglobulinas de isotipo IgM y, al madurar la respuesta se realiza el cambio de isotipo de

inmunoglobulinas a IgG92

. En conjunto, estos resultados muestran que, en el modelo de infección aguda

murina, existe una respuesta inmune primaria contra la proteína TSSA VI con presencia de anticuerpos de

isotipo IgM (7 de 9 ratones que montaron una respuesta inmune contra T. cruzi). La cinética de aparición de

Resultados

27

anticuerpos de isotipo IgM fue similar a la observada para SAPA. Estos resultados son más similares a lo

observado en pacientes con infección aguda vectorial que en pacientes con infección congénita.

II. Mapeo del dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas

II. I Ensayos de interacción con monocapas de células no macrofágicas

Estudios previos en nuestro laboratorio habían puesto en evidencia la interacción entre la proteína

TSSA VI con monocapas de células no macrofágicas de mamíferos86

. Teniendo en cuenta las variantes

delecionales de TSSA VI generadas anteriormente en este trabajo (figura R.3), decidimos utilizarlas como

herramientas moleculares para hacer un mapeo del motivo de esta proteína involucrado en el fenómeno de

interacción.

Los ensayos de interacción realizados constaron de la incubación de las diferentes proteínas

recombinantes con monocapas de células HeLa. Como controles positivos se usaron la proteína GST-TSSA

Resultados

28

VI86

y una proteína recombinante GST-MASP (conteniendo parte de la proteína codificada por el gen

TcCLB.511173.64) generada en el laboratorio, para la cual se habían verificado propiedades similares

(Ignacio Durante, resultados sin publicar)68

. Brevemente, el ensayo se basa en que las proteínas con motivos

adhesivos interaccionan con receptor/es no identificado/s en la superficie de las células, mientras que las que

carecen de motivos adhesivos son retiradas con los lavados posteriores. Dado que todas las proteínas usadas

se expresan como proteínas de fusión a GST, la reactividad de anticuerpos contra GST en un ensayo tipo

ELISA es indicador de la interacción (figura M.2)64

. En nuestro caso, usamos 3 tipos de anticuerpos anti-GST

(1 monoclonal comercial y 2 anticuerpos policlonales generados en ratón y conejo) para revelar estos

ensayos.

En todos los casos, la proteína TSSA VI-e4 mostró valores de adhesión significativamente mayores

que GST (P<0,001), e inclusive mayores que los de la proteína TSSA VI (figura R.12). En 2 casos, la

proteína TSSA VI-e2 mostró valores significativos de adhesión, aunque menores a TSSA VI-e4 (figura

R.12). A su vez, la proteína TSSA VI-eD mostró valores de interacción significativos en 2 de los 3 casos. Los

resultados obtenidos con TSSA VI-eD apoyan la especificidad de la interacción observada en para la proteína

TSSA VI-e4 (de la cual deriva TSSA VI-eD, figura R.3). Sin embargo, esta adhesividad es susceptible al

agregado de los 6 aa subsiguientes de la molécula de TSSA VI en el extremo carboxilo terminal, ya que

TSSA VI-e5 mostró una nula capacidad de interacción (figura R.12). Más importante, y en concordancia con

los resultados anteriores, ensayos preliminares usando concentraciones crecientes de las proteínas TSSA VI-

e2 y TSSA VI-e4 mostraron patrones de adhesión dosis dependiente y saturables, sugiriendo una interacción

del tipo receptor-ligando (datos no mostrados), de manera similar a los obtenidos en ensayos previos usando

la proteína TSSA VI86

. Próximamente, intentaremos validar estos resultados usando una alternativa basada

en el uso de péptidos fluoresceinados, cuya interacción con células adherentes puede determinarse de manera

directa (figura M.2). Si bien estos péptidos ya han sido sintetizados (tabla M.3), la implementación de estos

ensayos requiere de herramientas adicionales (microplacas, etc) que a la fecha no están a nuestra disposición.

II. II Ensayos de infección in vitro

Estudios anteriores en nuestro laboratorio mostraron que la adición del péptido tssa VI (cuya

secuencia es equivalente al péptido de fusión expresado en la proteína GST-TSSA VI, ver tabla M.3) o de la

proteína recombinante GST-TSSA VI a monocapas de células previo al desafío con tripomastigotes, producía

una disminución en los porcentajes de infección mientras que la adición del péptido tssa I (cuya secuencia es

equivalente al péptido de fusión expresado en la proteína GST-TSSA I, ver tabla M.3) o de la proteína

recombinante GST-TSSA I no producía este efecto86

(figura R.13). Más allá de correlacionar con la distinta

“adhesividad” de estas secuencias a monocapas celulares (figura R.12 y referencia86

), el efecto inhibitorio del

péptido tssa VI demostró ser cepa-dependiente, sustentando la especificidad de estos resultados. Brevemente,

el péptido tssa VI produjo una significativa reducción en los niveles de infección de tripomastigotes de la

Resultados

29

cepa CL Brener (que pertenecen al linaje TcVI y que expresan TSSA VI en su superficie) y no en

tripomastigotes de la cepa Sylvio X-10 (que pertenecen al linaje TcI y que expresan TSSA I en su superficie)

(figura R.13).

Teniendo en cuenta estos antecedentes, intentamos validar y verificar los resultados obtenidos para

nuestras variantes delecionales de TSSA en los ensayos de interacción proteína/célula (figura R.12). Para

ello, se estudió el porcentaje de adhesión e infección in vitro de tripomastigotes de T. cruzi luego de la

adición exógena de péptidos sintéticos (figura 14). En un primer experimento, se evaluó el efecto de la

adición de péptidos sintéticos en la infectividad de tripomastigotes de la cepa CL Brener sobre células HeLa.

Los péptidos sintéticos usados fueron: E2E3 (equivalente a las secuencias combinadas de TSSA VI-e2 y e3),

E2VI (equivalente a TSSA VI-e2) y E4VI (equivalente a TSSA VI-e4); como controles negativos se usaron

los péptidos tssa I (el cual no presenta efecto inhibitorio de los niveles de infección en la cepa CL Brener,

figura R. 13), E1VI (equivalente a TSSA VI-e1, secuencia que no mostró propiedades adhesivas en los

ensayos de adhesión), E4I (equivalente del péptido E4VI aunque en la proteína TSSA I) y como control

positivo se usó el péptido tssa VI (figura R.13).

Resultados

30

Los péptidos E2E3, E2VI y E4VI provocaron una notable disminución en los porcentajes de

infección, dosis-dependientes, comparables a los obtenidos con el péptido tssa VI (figura 14 y datos no

mostrados). En el caso de E2E3, sin embargo, estos resultados no fueron estadísticamente significativos.

Consistentemente, la adhesión de tripomastigotes a células en cultivo mostró una disminución significativa en

presencia del péptido E4VI pero no del

péptido E1VI (figura R.14). En conjunto,

estos resultados muestran una alta

correlación entre los niveles de adhesión

a células en cultivo e inhibición de la

interacción parásito-célula para los

péptidos TSSA VI-e4 y TSSA VI-e2.

Por otro lado, ensayos de

infección y adhesión realizados con

amastigotes (que no expresan TSSA en

su superficie,81

) de la cepa CL Brener en

presencia de los péptidos E1VI, E2VI,

Resultados

31

E4VI no mostraron diferencias significativas

respecto del control con PBS (figura R.15).

Resultados preliminares indican que

tampoco resultan inhibitorios en ensayos en

infección usando tripomastigotes de la cepa

Sylvio X-10 (datos nos mostrados).

Finalmente, con el objetivo de

descartar posibles efectos tóxicos de los

péptidos en los parásitos y/o en las células en

cultivo, se realizaron controles de viabilidad

(figura R.16). Para el control de toxicidad

celular, se incubaron células HeLa en

presencia de los péptidos E1VI, E2VI, E4VI,

E4VIsc o PBS durante 3 horas para luego

lavar e incubar en medio DMEM 4%. Al día

siguiente se tripsinizaron las células, se las

trató con el colorante vital Azul de Trypan y

se obtuvo el porcentaje de células no viables,

por conteo bajo el microscopio (figura R.16).

En ningún caso se observaron diferencias significativas con respecto al control tratado con PBS. Para el

control de viabilidad de parásitos, tripomastigotes de la cepa CL Brener fueron incubados con los péptidos

E1VI, E2VI, E4VI o con PBS durante 3 horas y luego tratados con el colorante vital ioduro de propidio y

analizados por citometría de flujo (figura R.16). Como controles se analizaron parásitos sin tratar con ioduro

de propidio (curva sombreada) y parásitos tratados con formol 4% (curva negra). Ninguno de los péptidos

evaluados mostró un efecto tóxico en los parásitos, a diferencia del control con formol 4%, en el cual se

observa que gran parte de la población de parásitos (97,8%) han incorporado la marca fluorescente. En

conjunto, estos resultados descartan un posible sesgo por toxicidad hacia las células y/o los parásitos en el

efecto de los péptidos sintéticos en los ensayos de invasión y adhesión.

Discusión

32

Discusión

I. Caracterización de la respuesta inmune humoral contra TSSA en pacientes

Chagásicos

En el marco de un proyecto más amplio, tendiente a identificar y mapear epitopes B lineales en

antígenos de T. cruzi a escala proteómica usando microarreglos de péptidos de alta densidad y máxima

resolución105

, re-evaluamos la reactividad de la proteína TSSA VI completa, incluyendo sus señales

secretorias, frente a IgGs purificadas a partir de sueros de Chagásicos crónicos. Este estudio nos permitió

delimitar una única zona antigénica dentro de esta molécula, comprendida por los residuos Thr24

a Ala58

. El

perfil de reactividad observado en el microarreglo (un único “pico ancho”) no permitió la identificación de

epitopes B discretos en TSSA VI. Este perfil de reactividad, en cambio, se corresponde mejor con la

presencia de distintos epitopes parcialmente solapados dentro de la región antigénica de esta proteína, los

cuales serían reconocidos por poblaciones de anticuerpos mostrando especificidades levemente diferenciales.

Según nuestra hipótesis, el solapamiento inter-epitópico dificultaría la resolución de “picos” individuales del

tamaño de un epitope B discreto92

en los microarreglos. La reactividad de variantes delecionales presentando

un solapamiento mínimo (como por ejemplo TSSA VI e2 y TSSA VI e4) y los mayores niveles de titulación

de anticuerpos obtenidos con el péptido E2E3 en comparación a los péptidos E2 y/o E3 determinados en el

ELISA de desplazamiento también son indicativos de la presencia de distintos epitopes dentro de TSSA VI,

los cuales serían reconocidos por poblaciones de anticuerpos con especificidades diferentes. Es importante

remarcar que, si bien no es la situación más común, perfiles de antigenicidad similares se han identificado en

otras moléculas de T. cruzi incluidas en los ensayos de microarreglos de péptidos105

.

Con el propósito de mapear las secuencias inmunorreactivas más relevantes dentro de la región

antigénica de TSSA VI, aplicamos un acercamiento basado en proteínas recombinantes. En este caso,

analizamos la respuesta individual de cada suero contra TSSA VI (conteniendo toda la región antigénica

identificada en el microarreglo) y distintas variantes delecionales de 15 y 9 aa. El resultado más evidente de

estos ensayos es que la población de sueros Chagásicos crónicos analizada muestra patrones de anticuerpos

anti-TSSA VI variables entre individuos. Estos datos son concordantes con los obtenidos en el microarreglo

de péptidos, en el cual las distintas mezclas de IgGs analizadas mostraron patrones de reactividad diferentes.

La compleja estructura antigénica de esta molécula y, sobre todo, diferencias en el estado inmunológico, el

background genético de los pacientes y eventualmente de la(s) cepa(s) infectante(s) en cada caso, podrían

contribuir a la variabilidad de la respuesta inmune contra TSSA VI106–108

.

Más importante, los estudios usando moléculas recombinantes nos permitieron identificar una

proteína (TSSA VI-e2) que reproduce casi completamente la performance diagnóstica de la proteína TSSA

VI y que, por lo tanto, contendría la mayoría de los determinantes antigénicos relevantes. Además, se

Discusión

33

identificaron otras dos proteínas, TSSA VI-e3 y TSSA VI-e4, que corresponden a secuencias

inmunorreactivas secundarias. El mapeo realizado con variantes delecionales de 9 aa, nos sugirió que las

secuencias inmunorreactivas principales de TSSA VI-e4 están en su extremo amino-terminal (proteína TSSA

VI-eC, de secuencia compartida con TSSA VI-e3), mientras que los residuos presentes en su extremo

carboxi-terminal (proteína TSSA VI-eD) serían dispensables a fines serodiagnósticos. Las proteínas TSSA

VI-e2 y -e3, en cambio, dependen para su inmunorreactividad de residuos distribuídos a lo largo de toda su

secuencia. En conjunto, los resultados obtenidos en los microarreglos, los ELISA usando variantes

delecionales y los ELISA de desplazamiento indican que la respuesta inmune humoral contra TSSA VI está

dirigida hacia la región central y variable entre las isoformas de TSSA; principalmente hacia la secuencia

30TSSTPPSGTENKPAT

44 y, en menor medida, hacia la secuencia

36SGTENKPATGEAPSQ

50.

Estos resultados difieren de los obtenidos en un mapeo preliminar de epitopes B lineales en TSSA

VI81

, en el cual se había definido una zona antigénica más acotada, conformada por una secuencia con

reactividad predominante 41

KPATGEAPSQ50

(la cual había sido definida como epitope principal) y otras dos

secuencias de mucha menor reactividad 30

TSSTPPSGTEN40

y 36

SGTENKPATG45

. Las diferencias se pueden

atribuir al distinto diseño experimental y, sobre todo, al mayor poder resolutivo de las estrategias utilizadas

aquí. Revisando aquellos datos a la luz resultados obtenidos en este trabajo, se pueden sacar algunas

conclusiones importantes. En primer término, que el sesgo en los resultados en ese mapeo preliminar se debió

fundamentalmente a la utilización de un menor número de péptidos de menor tamaño (8-11 residuos) y de

menor solapamiento entre ellos (5 residuos en vez de 14)81

. Esto determinó que algunas de las secuencias

identificadas aquí como críticas para el reconocimiento de los anticuerpos específicos no estuviesen

representadas. Entre ellas, la secuencia correspondiente a TSSA VI-e2 (30

TSSTPPSGTENKPAT44

), la cual

resultó fraccionada entre los péptidos 30

TSSTPPSGTEN40

(similar a TSSA VI-eA, sin reactividad por

ELISA) y 36

SGTENKPATG45

(similar a TSSA VI-eB, de baja prevalencia). La subrepresentación de

secuencias llevó, además, a proponer la secuencia 41

KPATGEAPSQ50

, que está incluida dentro de la proteína

TSSA VI-e3, como el epitope lineal B inmunodominante de TSSA VI81

. Interesantemente, un péptido

sintético conteniendo esta secuencia mostró una prevalencia de apenas ~60% al ser ensayado contra un panel

de sueros crónicos (Carlos Buscaglia, datos sin publicar), lo cual correlaciona perfectamente con el ~57%

determinado en este trabajo para TSSA VI-e3.

Basados en el mapeo antigénico refinado de TSSA VI, propusimos que el péptido sintético E2E3,

conteniendo las secuencias de TSSA VI-e2 y TSSA VI-e3 sería el candidato más adecuado para el desarrollo

de un reactivo alternativo de serodiagnóstico. La reactividad del péptido sintético E2E3 fue comparada en

ensayos de ELISA con la proteína GST-TSSA VI, el estándar para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

crónico basado en TSSA43

. La comparación de las curvas ROC obtenidas indicó que el péptido E2E3

presenta una performance serodiagnóstica muy similar, en términos de sensibilidad y especificidad, que la

Discusión

34

proteína recombinante, lo cual alienta una futura evaluación a mayor escala y frente a una población más

heterogénea de pacientes (por ejemplo, obtenidos de distintas regiones geográficas).

Los péptidos sintéticos ofrecen múltiples ventajas comparativas con respecto de las proteínas

recombinantes en términos de aplicación diagnóstica. Por un lado, su producción no implica el uso de

microorganismos; lo que se traduce en menores requerimientos de infraestructura y equipamiento para su

producción y purificación, controles de calidad más simples, disminución de la variabilidad entre los

diferentes lotes de producción, una mayor facilidad de estandarización y escalado, menores costos de

producción, etc. A su vez, los péptidos sintéticos no presentan secuencias adicionales (necesarias para su

correcta expresión y/o purificación) y/o antígenos contaminantes provenientes del sistema de expresión, lo

que redunda en un reactivo de mayor especificidad que la obtenida al usar proteínas recombinantes43,58

. En el

caso del péptido E2E3, además, nuestros resultados indican que no es necesario su acoplamiento a proteínas

carrier o recurrir a otras estrategias alternativas de síntesis o funcionalización109,110

para obtener una óptima

sensibilidad, por lo cual su implementación diagnóstica se vería simplificada. En este contexto, sin embargo,

y dado que E2E3 presenta una prevalencia menor al 100%, es preciso remarcar que en caso de ser utilizado

con fines diagnósticos, E2E3 debería ser incluído en el marco de un kit incluyendo otros antígenos de T.

cruzi111

.

A continuación, se evaluó la posibilidad de explotar la variabilidad inter-individual de la respuesta

inmune humoral anti-TSSA VI para el desarrollo de herramientas diagnósticas más específicas, de gran

necesidad en la investigación en Enfermedad de Chagas actual33

. En primer término, para el diagnóstico

serológico de infecciones congénitas. Para ello, se analizó la presencia de anticuerpos IgM e IgG en muestras

de sueros de bebés (infectados congénitamente o no) por técnicas de ELISA. La ausencia de anticuerpos IgM

contra TSSA VI en la mayoría de las muestras de sueros de bebés infectados es concordante con resultados

previos para otros antígenos de T. cruzi112,113

, y sugiere que la detección de IgM contra TSSA VI (y de IgM

en general) no es una herramienta adecuada para el diagnóstico de Chagas congénito. La presencia de estos

anticuerpos en un porcentaje de las madres Chagásicas también ha sido descripto114

, y puede atribuirse al

estado de inmunosupresión característico del embarazo el cual, en algunos casos, puede promover la

“reactivación” de la infección21,22

.

Es interesante notar que, en contraste con los pacientes con infección congénita, un 50% de los

pacientes con infección aguda vectorial mostraron reactividad de tipo IgM contra TSSA VI. Lo mismo fue

verificado en un modelo de infección murino, donde la cinética de aparición de estos anticuerpos fue similar

a la de los generados contra un antígeno de fase aguda (SAPA), e inclusive alcanzaron títulos mucho

mayores. Esta discrepancia puede atribuirse a diferencias intrínsecas de las poblaciones humanas agudas

estudiadas (grupo etario, maduración inmunológica, background genético, etc)106–108

, que exceden la vía de

infección. Sin embargo, teniendo en cuenta la fuerte reactividad de isotipo IgG contra TSSA VI en la mayoría

Discusión

35

de los pacientes Chagásicos crónicos43

y la transferencia pasiva de este isotipo de anticuerpos de madres a

niños durante el embarazo, es posible que los altos títulos de anticuerpos IgG de origen materno haya

interferido con la detección de anticuerpos de isotipo IgM en los ensayos de ELISA realizados a los bebés

con infección congénita. Esta hipótesis, basada en la titulación de antígenos provocada por las IgG maternas,

ha sido demostrada, por ejemplo, en el serodiagnóstico de la Toxoplasmosis congénita. En este caso, para

mejorar la sensibilidad del método, se emplean técnicas de purificación o inmunocaptura de IgM previas a la

incubación con antígenos de Toxoplasma gondii115

. El fenómeno de titulación de TSSA VI por la presencia

de IgG con especificidades similares, de existir, no se aplicaría en el caso de pacientes con infección aguda

vectorial. La comparación de los títulos IgG contra TSSA VI en muestras pareadas de madres Chagásicas y

niños infectados o sanos tampoco arrojó resultados alentadores. En contraste a lo reportado y a nuestros

propios resultados en paralelo con el antígeno de fase aguda SAPA34–37

, los títulos de IgG contra TSSA VI en

las madres infectadas resultaron consistentemente mayores que en los bebés, sugiriendo que no existe síntesis

endógena de anticuerpos IgG contra este antígeno en los niños menores a 1 año. En definitiva, el conjunto de

estos resultados indica que TSSA VI no sería un buen biomarcador para la detección de infecciones

congénitas, aunque en un futuro implementaremos técnicas de purificación de IgM a partir de muestras de

neonatos previas al test diagnóstico para evaluar mejor este punto.

En segundo término, exploramos la posibilidad de que la presencia de múltiples secuencias

inmunoreactivas dentro de TSSA correlacionara con una maduración de la especificidad de los anticuerpos

contra esta proteína a lo largo de la infección97

. Para ello, realizamos un estudio comparativo del perfil de

reconocimiento de anticuerpos obtenidos a partir de tres poblaciones de pacientes Chagásicos definidas

arbitrariamente de acuerdo a su tiempo estimado de infección: crónicos (> de 5 años de infección); “crónicos

tempranos” (entre 1 y 3 años de infección) y agudos (< de 1 año de infección). Nuestros resultados indican

que existe tanta variabilidad entre los grupos estudiados como dentro de los mismos; y que, por lo tanto, no es

posible diferenciar las poblaciones, sobre todo los pacientes crónicos y “crónicos tempranos”, basándose en

el perfil de reactividad contra TSSA VI. El árbol de decisión aplicado, sin embargo, clasificó correctamente

dos de los tres sueros de pacientes con infección aguda, por lo que podrían existir diferencias en el patrón de

reconocimiento de esta población. Alternativamente, la escasa cantidad de sueros usados podría haber

producido un efecto de sesgo en los resultados de esta población.

De manera análoga a lo mostrado en este capítulo, la complejidad epitópica y la variabilidad de la

respuesta inmune humoral contra TSSA VI podría ser explorada en otras áreas de activo interés en

Enfermedad de Chagas actual como la determinación de la efectividad de la quimioterapia33

, estudios de

epidemiología molecular89,90,116

para la identificación de perfiles de reactividad con valor prognóstico sobre la

patología de la enfermedad107,108

.

Discusión

36

II. Mapeo del dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas

Estudios previos en nuestro laboratorio pusieron en evidencia la interacción entre la proteína TSSA

VI con monocapas de células no macrofágicas de mamíferos y su participación activa en el reconocimiento y

entrada del parásito en la célula huésped86

. La adición exógena de péptidos sintéticos de TSSA VI provocó la

movilización de Ca++

intracelular y la activación de cascadas de señalización de quinasas en la célula

huésped. En contraste con estos resultados, TSSA I presentó bajo niveles de adhesión a monocapas de células

no macrofágicas de mamíferos y la adición exógena de péptidos solubles de TSSA I no afectó la infectividad

in vitro de tripomastigotes del linaje TcVI y/o TcI86

. Teniendo en cuenta las variantes delecionales de TSSA

VI generadas anteriormente en este trabajo, decidimos utilizarlas como herramientas moleculares para hacer

un mapeo del motivo involucrado en el fenómeno de interacción (pegado). Los estudios de pegado de

proteínas recombinantes a células y de infecciones in vitro mostraron una gran correlación e indicaron que

TSSA VI presenta dos motivos de interacción con células no macrofágicas, TSSA VI-e4 y TSSA VI-e2.

Ambos motivos mostraron los mismos niveles de inhibición de la infección que un péptido conteniendo la

secuencia de toda la región central de TSSA VI (péptido tssa VI) usado de control.

El modelo propuesto86

propone que TSSA funcionaría como un determinante positivo de la

interacción entre tripomastigotes y la célula blanco. La interacción de TSSA VI, anclada a la superficie del

tripomastigote a través de un motivo GPI, con receptor/es (aún no descripto/s) en la superficie de la célula no

macrofágica favorecería la internalización del parásito. La adición de TSSA VI “soluble” disminuiría la

cantidad de moléculas disponibles para interacción parásito-célula, provocando una disminución de los

niveles de infección de los tripomastigotes. Los porcentajes de inhibición máxima observados, cercanos al

50%, son compatibles con la presencia de mecanismos de invasión redundantes en T. cruzi78

. La especificidad

de los resultados quedó evidenciada por la ausencia de cambios en los niveles de infección al adicionar las

secuencias adhesivas de TSSA VI en tripomastigotes de la cepa Sylvio (TcI) y en amastigotes de CL Brener

(que no expresan la proteína TSSA en su superficie81

), los cuales presentarían mecanismos alternativos para

la invasión de células no macrofágicas. Estudios estructurales y genéticos, actualmente en curso, permitirán

comprender mejor la participación de TSSA en los eventos de interacción entre el parásito y la célula, así

como también validar los fenómenos observados en este trabajo. A su vez, la identificación de motivos de

interacción con mayor “afinidad” que la proteína TSSA VI completa surgen como herramientas apropiadas

para la identificación de ligandos en la superficie de las células blanco.

En resumen, en este trabajo de Tesis hemos analizado la respuesta inmune humoral contra TSSA en

pacientes Chagásicos e identificado las secuencias inmunorreactivas principales dentro de esta proteína

usando distintas aproximaciones. Los conocimientos y las herramientas generadas para esta caracterización

antigénica, las hemos luego utilizado para el desarrollo de un reactivo de serodiagnóstico alternativo, para la

exploración de la variabilidad en la respuesta inmune contra esta proteína con fines específicos y para la

Discusión

37

identificación de secuencias dentro de esta proteína relevantes para la interacción del parásito con la élula

hospedadora.

Conclusiones

38

Conclusiones

Identificamos una zona inmunorreactiva dentro de la proteína TSSA VI conformada por los residuos

Thr30

a Gln50

.

La respuesta inmune humoral contra TSSA VI presenta variaciones entre individuos.

Desarrollamos un reactivo de serodiagnóstico peptídico basado en la secuencia inmunorreactiva

identificada, el cual mostró una performance diagnóstica similar a la proteína TSSA VI.

La presencia de anticuerpos de diferentes isotipos/especificidad contra TSSA VI no parece ser un

buen biomarcador para el diagnóstico de infecciones congénitas o para determinar el tiempo de

infección.

Se encontraron dos motivos de interacción con células no macrofágicas dentro de la molécula de

TSSA VI.

Materiales y métodos

39

Materiales y métodos

Microarreglo de péptidos

En el contexto de un proyecto tendiente a la identificación y mapeo de epitopes B en las proteínas de T. cruzi

a gran escala105

, se analizó la secuencia de la proteína TSSA VI en microarreglos peptídicos, los cuales

presentaban la totalidad de la secuencia de esta proteína, incluyendo las señales secretorias, representada por

78 péptidos de 15 aa, con un solapamiento parcial de 14 aa. Brevemente, se incubaron microarreglos

peptídicos de última generación94

durante la noche con 1 ml de IgG purificada diluida a 20 mg/ml en

Tris/acetato pH 8, 0,1 Tween 20. La purificación se realizó con el kit Melon Gel IgG (Thermo Scientific),

acorde a las instrucciones del fabricante. La pureza fue evaluada por tinción con Coomassie brilliant blue en

geles SDS-PAGE y la concentración fue estimada por comparación con una curva estándar de γ-globulina

purificada (BioRad Laboratories). Luego de lavar con buffer de incubación, los slides se incubaron con una

solución 1 µg/ml del anticuerpo secundario (IgG Cy3 de cabra anti-humana, Abcam) durante 2 h. Luego de

un segundo lavado con buffer de incubación, seguido de una etapa de lavado posterior con n-metil-

pirrolidona y diclorometano y secado al aire, se determinaron las señales en los arreglos con un scanner láser

(InnoScan 900, INNOSYS, Carbonne, France) con 1 µm de resolución, con una longitud de onda de

excitación de 532nm. Cada muestra correspondió a 5 individuos distintos (3 µl cada uno), que fueron

mezclados antes de la purificación de IgG. Los arreglos de péptidos se ensayaron secuencialmente, primero

con una muestra negativa (IgG purificada a partir de 5 individuos sanos) y luego con la muestra positiva (IgG

purificada a partir de 5 individuos infectados con T. cruzi). Con este diseño experimental, se obtuvieron 2

conjuntos de datos para cada experimento: uno correspondiente a la lectura de individuos sanos (control

negativo) y uno correspondiente a la señal acumulada de las muestras de la señal negativa + las muestras de

los pacientes infectados, a la cual por sustracción se le calcula la reactividad. Se graficaron los valores medios

de fluorescencia obtenidos luego de la sustracción de cada uno de los 78 péptidos derivados de TSSA VI.

Integrando todas las señales del microarreglo (que incluía controles positivos y negativos), se estableció un

valor de corte de 3 U.A. (unidades arbitrarias) de fluorescencia para el cual la sensibilidad y especificidad son

óptimas. Cabe señalar que, a pesar de CL Brener es un clon híbrido117

, la proteína TSSA deducida en ambos

alelos (TcCLB.507511.81 y TcCLB.507511.91) es idéntica. Por lo tanto, no se evaluaron polimorfismos de

TSSA en los arreglos.

Materiales y métodos

40

Cepas bacterianas y plásmidos

Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este trabajo se describen en la tabla M.1.

Tabla M.1: Cepas bacterianas y plásmidos utilizados

Cepas o plásmidos Características Referencia

Escherichia coli

DH5αF'IQ™

F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-,

mk+) phoAsupE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1/F´ proAB+ lacIqZΔM15

zzf::Tn5 [Kmr].

Invitrogen

Escherichia coli BL21-

CodonPlus(DE3)-RP

E. coli B F- ompT hsdS(rB mB ) dcm Tet gal l(DE3) endA Hte [argU

proL Camr] Stratagene

pGEX2T Vector de expresión, Ampr GE Healthcare

pGEX1λT Vector de expresión, Ampr GE Healthcare

pGEX1λT- SAPA Contiene la región repetitiva y antigénica del gen que codifica para la

proteína SAPA clonado en el vector pGEX1λT Ref.

118

pGEX2T-TSSA VI

Contiene la región comprendida entre los residuos 24 y 62 del gen

que codifica para la proteína TSSA VI(obtenida a partir de la cepa CL

Brener) clonado en el vector pGEX2T

Ref.81

pGEX2T-TSSA I

Contiene la región comprendida entre los residuos 24 y 61 del gen

que codifica para la proteína TSSA I (obtenida a partir de la cepa

Sylvio X-10) clonado en el vector pGEX2T

Ref.81

pGEX2T-TSSA VI-e1 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e1

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

pGEX2T-TSSA VI-e2 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e2

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

pGEX2T-TSSA VI-e3 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e3

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

pGEX2T-TSSA VI-e4 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e4

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

pGEX2T-TSSA VI-e5 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e5

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

pGEX2T-TSSA VI-eA Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-eA

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

pGEX2T-TSSA VI-eB Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-eB

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

pGEX2T-TSSA VI-eC Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-eC

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

pGEX2T-TSSA VI-eD Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-eD

clonada en el vector pGEX2T Este trabajo

Abreviaturas: Ampr, resistencia a ampicilina; Cam

r, resistencia a cloranfenicol; Km

r, resistencia a kanamicina.

Materiales y métodos

41

Oligonucleótidos

Los oligonucleótidos utilizados se detallan en la tabla M.2.

Tabla M. 2: Oligonucleótidos usados

Variante delecional

de 15 aa que

conforma

Nombre Secuencia nucleotídica (de 5’ a 3’)

Epitope 1 TSSA Ep 1 Forward CAGGATCCACAGCGAATGGTGGGTCTACTAGTTCT

TSSA Ep 1 Reverse CAGAATTCACGTACCAGAAGGTGGGGTAGAACTAGT

Epitope 2 TSSA Ep 2 Forward CAGGATCCACTAGTTCTACCCCACCTTCTGGTACG

TSSA Ep 2 Reverse CAGAATTCATGTAGCTGGTTTATTTTCCGTACCAGA

Epitope 3 TSSA Ep 3 Forward CAGGATCCTCTGGTACGGAAAATAAACCAGCTACA

TSSA Ep 3 Reverse CAGAATTCATTGAGATGGAGCTTCCCCTGTAGCTGG

Epitope 4 TSSA Ep 4 Forward CAGGATCCCCAGCTACAGGGGAAGCTCCATCTCAA

TSSA Ep 4 Reverse CAGAATTCAACCTGAAGAAGCCCCCGGTTGAGATGG

Epitope 5 TSSA Ep 5 Forward CAGGATCCCCATCTCAACCGGGGGCTTCTTCAGGT

TSSA Ep 5 Reverse CAGAATTCATGAGGAGGCTTCTGCTTCACCTGAAGA

N.A. pGEX Forward GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT

N.A. pGEX Reverse CCGGGAGCTGCATGTGTCAGA

N.A.: No aplica. Los sitios de restricción se indicaron con letra negrita y subrayada.

Preparación de células competentes

Las células competentes de las cepas Escherichia coli DH5αF'IQ™ y Escherichia coli BL21-

CodonPlus(DE3)-RP fueron preparadas por el método SEM (simple and efficient method)119

.

Construcción de las variantes delecionales de TSSA VI

Las construcciones de las variantes delecionales de TSSA VI se realizaron por rellenado mediado por

Taq polimerasa de oligonucleótidos parcialmente complementarios. Para la obtención de las variantes

delecionales TSSA VI-e1 a e5 se alinearon los oligonucleótidos TSSA VI Ep n Fw y TSSA VI Ep n Rv (tabla

M.2). En figura M.1 (panel a), se esquematizó el alineamiento correspondiente a la variante delecional TSSA

VI-e1, a modo de ejemplo. Para la obtención de las variantes delecionales TSSA VI-eA a eB, se alinearon los

oligonucleótidos TSSA VI Ep n+1 Fw con los TSSA VI Ep n Rv (tabla M.2). En la figura M.1 (panel b) se

esquematizó el alineamiento correspondiente a la variante delecional TSSA VI-eA, a modo de ejemplo. El

alineamiento y rellenado de los oligonucleótidos parcialmente complementarios se basó en una variante de la

reacción de PCR la cual consiste en un ciclo de desnaturalización, seguido de la disminución paulatina de la

temperatura para favorecer el alineamiento y una polimerización (rellenado) final con polimerasa Taq

Materiales y métodos

42

(Fermentas). A continuación, se realizó la restricción de los productos obtenidos usando las enzimas EcoRI y

BamHI (ambas de Fermentas). Los fragmentos obtenidos se ligaron en el plásmido pGEX2T previamente

digerido con las mismas enzimas de restricción. Este plásmido permite expresar proteínas como fusión al

extremo carboxilo terminal de la proteína Glutatión-S-Transferasa de Schistosoma japonicum (GST). Se

transformaron bacterias competentes DH5α con los distintos plásmidos y se realizó el screening de colonias

por PCR, usando los oligonucleótidos pGEX Fw y pGEX Rv (tabla M.2). Los plásmidos se purificaron a

partir de cultivos de colonias positivas crecidos toda la noche siguiendo protocolos descriptos y se analizaron

por secuenciación.

Secuenciación

La secuenciación de ADN fue realizada utilizando el secuenciador automático modelo ABI PRISM

377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems Division) según las indicaciones del fabricante.

Expresión y purificación de proteínas recombinantes

Se transformaron bacterias competentes Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RP con los

plásmidos pGEX2T, pGEX2T-TSSA VI-e1 a e5, pGEX2T-TSSA VI-eA a eD y pGEX2T-TSSA I y VI. La

cepa usada posee genes extra que codifican para los ARN de transferencia menos representados en el genoma

bacteriano, permitiendo mayores niveles de expresión de proteínas codificadas por genes heterólogos. Las

cepas resultantes de la transformación, se cultivaron en medio LB a 37ºC (250 rpm) hasta llegar a una

OD600nm de 0,6 y se indujo la expresión de las proteínas con IPTG 250 M y se incubó 16 horas a 28ºC en

agitación. La purificación se realizó a partir de la fracción soluble por cromatografía de afinidad hacia el

dominio GST de fusión, utilizando columnas de Glutatión-Sefarosa, siguiendo las indicaciones del fabricante

(Glutathione Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare). Las proteínas se dializaron contra PBS 0,5 X en

columna NAP10 y se concentraron en SpeedVac (Savant ISS110) alcanzando aproximadamente la mitad del

volumen de elución. Se verificó la pureza e integridad de las proteínas obtenidas en geles de poliacrilamida

12,5% teñidos con Coomassie Blue. La cuantificación se realizó por los métodos de Picodrop y Bradford

Materiales y métodos

43

según las indicaciones de los fabricantes (BioRad) usando como estándar soluciones de concentraciones

conocidas de BSA.

Condiciones de cultivo bacteriano

Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas a 37ºC en agitador rotatorio (200 - 250 rpm) o en

placas de Petri con agar 1,5% en medio Luria-Bertani (LB)120

. Según la cepa, el medio se suplementó con

los siguientes antibióticos: Ampicilina 100 μg/ml o cloranfenicol 34 μg/ml.

Técnicas de biología molecular

Las técnicas de restricción, ligación y purificación de ADN plasmídico, PCR, generación y

transformación de bacterias competentes son de uso corriente en el laboratorio. Se realizaron según se indica

en120

y según las indicaciones de los fabricantes de los diferentes kits y/o insumos utilizados para cada caso.

Péptidos

Los péptidos fueron sintetizados por GenScript. La pureza (>90%) e identidad de los péptidos fue

determinada por el fabricante usando cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y confirmada por

espectrometría de masa, respectivamente. Los péptidos usados se detallan en la tabla M.3.

Tabla M. 3: Detalle de péptidos usados

Nombre Secuencia Origen Particularidades

E4VI 42

PATGEAPSQPGASSG56

TSSA VI 5 FAM en NH2

E4I 41

TAAGGTPSPSGASSG55

TSSA I 5 FAM en NH2

E4VIsc GSPAPTGEPASQAGS(*) TSSA VI 5 FAM en NH2

E2VI 30

TSSTPPSGTENKPAT44

TSSA VI 5 FAM en NH2

E1VI 24

TANGGSTSSTPPSGT38

TSSA VI 5 FAM en NH2

tssa VI C24

TANGGSTSSTPPSGTENKPATGEAPSQPGASSGEAEASS62

TSSA VI Cys en NH2

tssa I 27

GGSTSSTPPGTDKKTAAGGTPSPSGASSG55

C TSSA I Cys en COOH

E2 C 28

GSTSSTPPSGTENKPAT44

TSSA VI Cys en NH2

E3 39

ENKPATGEAPSQ50

C TSSA VI Cys en COOH

E2E3 C 30

TSSTPPSGTENKPATGEAPSQ50

TSSA VI Cys en NH2

E2E3sc C GPSNESTEKSPQSATATGPPT (**) TSSA VI Cys en NH2

5-FAM: 5-CarboxyFluorescein-Aminohexyl Amidite.

*Contiene la misma composición aminoacídica que el péptido E4VI, aunque en distinta secuencia.

**Contiene la misma composición aminoacídica que el péptido E2E3, aunque en distinta secuencia.

Materiales y métodos

44

Acoplamiento de los péptidos

Para el acoplamiento de los péptidos se utilizó la proteína OVA activada por maleimida (Thermo

Scientific). Se diluyeron 2 mg de la proteína comercial con 200 µl de agua, los cuales se fraccionaron

inmediatamente en 5 tubos (40 µl cada uno), a los cuales se agregó 1 mg de péptido sintético liofilizado. La

concentración final se calculó en función de la proteína carrier.

Homogenato de tripomastigotes

Los tripomastigotes puros (conteniendo menos del 5% de contaminación con otros estadíos) se

lavaron con PBS y se lisaron mediante incubación en buffer RIPA (50 mM Tris pH = 8, NaCl 150 mM, 1 mM

Cl2Mg, 0,1% de SDS, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) al cual se le agregó un cóctel de inhibidores de

proteasas (Sigma) y DNAsaI (10 µg/ml) durante 30 min en hielo. El lisado se clarificó mediante

centrifugación y la concentración de proteínas en el sobrenadante se cuantificó por el método de Bradford y

se ajustó a 1 µg/µl con PBS. Finalmente, alícuotas de estas preparaciones se almacenaron a -80°C hasta su

uso104

.

ELISA

Se realizó la adsorción del antígeno a placas de 96 pocillos (Nunc MaxiSorp) en buffer bicarbonato

0,05M pH 9,6 a 4°C durante 16 horas. A continuación se bloqueó por una hora a 37°C, se lavó y se incubó

con el anticuerpo primario una hora a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación, se lavó y se incubó una hora

con el anticuerpo secundario correspondiente en cada caso. Finalmente se lavó el anticuerpo secundario y se

procedió con el revelado y finalización de la reacción para luego hacer la lectura de absorbancia a 450nm. En

todos los casos los sueros se analizaron por duplicado (excepto indicación contraria indicada en resultados).

Para el análisis de reactividad de las proteínas de fusión a GST o de los péptidos sin acoplar en muestras de

pacientes con infección crónica, congénita y/o aguda, se usó 1 μg de antígeno por pocillo. Se bloqueó con

leche descremada 4% en TBS y se incubaron los sueros diluidos 1:500 en solución de bloqueo. Se reveló con

anticuerpos anti-IgG humanos acoplados a HRP (Sigma) 1:5000, en solución de bloqueo. Para el análisis de

reactividad de los péptidos sintéticos acoplados a OVA, se usó 0,1 μg de proteína acoplada por pocillo. Se

bloqueó con 4% leche descremada en TBST 0,05% y se incubaron los sueros diluidos 1:500 en esta solución.

El procedimiento de revelado fue el mismo que en el caso anterior. Para el análisis de presencia de IgM en

muestras de sueros de humanos infectados (muestras de niños con infección congénita y muestras pareadas

madre/hijo), se usó 1 μg de proteína de fusión por pocillo. Se bloqueó con leche descremada 4% en TBS y se

incubaron los sueros diluidos 1:100 en esta solución en agitación (160 rpm). Se reveló con anticuerpos anti-

IgM humana acoplados a HRP (Sigma) 1:5000, en solución de bloqueo. Para el análisis de muestras de

sueros de pacientes con infección aguda se usó 1 μg de proteína de fusión por pocillo, bloqueó con leche

Materiales y métodos

45

descremada 4% en TBS y se incubaron los sueros diluidos 1:500 en solución de bloqueo. Se reveló con

anticuerpos anti-IgA, IgM, IgG humanas acoplados a HRP (Sigma) diluidos 1:5000 en solución de bloqueo.

Para el seguimiento serológico de ratones infectados con T. cruzi, se usaron 0,3 μg de proteína de fusión por

pocillo, se bloqueó con leche descremada 5% en TPBS 0,05% y se incubaron los sueros diluidos 1:400 en 1%

leche descremada en TPBS 0,05%. Se reveló con anticuerpos anti-IgG o anti-IgM de ratón acoplados a HRP,

diluidos 1:5000 o 1:1000, respectivamente. Las soluciones de revelado (1 mg de TMB (Sigma-Aldrich), 333

μl de DMSO y 120 μl de H2O2 (30 vol) en 10 ml de buffer citrato 0,1 M pH 4,2) y finalización (Ácido

sulfúrico 2M) fueron idénticas para todos los ensayos de ELISA.

ELISA de desplazamiento

El protocolo fue adaptado de 121

. Se sensibilizaron las placas con 0,5 μg de proteína GST-TSSA VI y

se procedió de igual modo que para el análisis de IgG (ver punto anterior). Sin embargo, los sueros fueron

preincubados durante 30 min. con el péptido sintético (2 μg; 0,2 μg; 0,02 μg por pocillo, para la

estandarización y 2 μg en el ensayo final) en un volumen final de 10 μl (en PBS). Antes de su incubación en

la placa de ELISA, se llevó a volumen la mezcla de suero-péptido con TBS-Leche 4% y se procedió tal cual

lo descripto en el punto anterior. La absorbancia de muestras de suero preincubadas con 10 μl de PBS en

ausencia de péptido y procesadas en paralelo de igual manera fue tomada como 100% de reactividad (0%

inhibición).

Ensayos de pegado de proteínas recombinantes a células en cultivo

Se crecieron células HeLa CCL2 (ATCC) en medio DMEM (Gibco) suplementado con SFB 10%

(Natocor), 100 µg/ml de estreptomicina y 100 unidades/ml de penicilina (Gibco). Se tripsinizaron con una

solución de tripsina-EDTA 0,05% (Gibco), y se calculó la concentración celular con cámara de Neubauer. Se

sembraron 4.104 células por pocillo en medio DMEM completo, en una placa de 96 pocillos (Orange

Scientific), las cuales fueron incubadas durante 16 horas a 37°C y 5% CO2. Pasado este tiempo, se extrajo el

medio de cultivo y se lavaron las células con 500 μl de PBS (3 lavados de 5 min cada uno) para luego fijarlas

con 100 μl de paraformaldehido 4% durante 20 minutos. Una vez fijadas las células se lavaron con PBS-

Tween (TPBS) 0,05% y se procedió a bloquear con SFB 5% (en TPBS) por una hora para luego lavar con

TPBS. A continuación se incubó con 100 μl de una solución de 200 μg/ml de la proteína de fusión a analizar

en SFB 2% (en TPBS). Como controles negativos se utilizaron las proteínas TSSA I, GST y como control

positivo se utilizó la proteína GST-MASP (que contiene un segmento adhesivo de una proteína MASP

clonada en el laboratorio) (Ignacio Durante, resultados sin publicar). Pasado el tiempo de incubación se lavó

con TPBS y se incubó por una hora con anticuerpos diluidos en SFB 2% (en TPBS). Se utilizaron anticuerpos

anti-GST monoclonales (clon M2, Sigma, 1:5000) o policlonales generados por inmunización en ratones o

conejos (1:250) (figura M.2). Luego se lavó con TPBS y se incubó por una hora con una dilución 1:1000 del

Materiales y métodos

46

anticuerpo secundario dirigido contra ratón o conejo conjugado a HRP, en SFB 2% (en TPBS). Finalmente se

lavó con TPBS y reveló con 100 μl de solución de revelado de ABTS: 10 ml de buffer fosfato-citrato 0,1 M

pH 5, 1 tableta de ABTS (Sigma) y 30 μl de H2O2. Se detuvo la reacción con SDS 1% y se determinaron los

valores de absorbancia a 405 nm.

Detección colorimétrica

La detección colorimétrica en los ensayos ELISA y de pegado de proteínas recombinantes a células

en cultivo descriptos arriba se realizaron con el sistema FilterMax F5 Multimode Microplate Reader

(Molecular Devices).

Criterios de positividad y negatividad en los ensayos de ELISA

En los ensayos en los que se usaron muestras de sueros de pacientes infectados crónicos, “crónicos

tempranos” y agudos se incluyeron de 2 a 4 sueros negativos del mismo grupo etario que el de muestreo. Los

sueros analizados se consideraron:

Positivos para cierto antígeno si la media de la absorbancia de la muestra menos 3 SD era mayor a la

media del valor obtenido para el mismo antígeno con los sueros negativos más 3 SD.

Negativos si la media de la absorbancia de la muestra menos 3 SD era menor a la media del valor

obtenido para el mismo antígeno con los sueros negativos más 3 SD.

Para los ensayos ELISA en los que se comparó el título de IgG anti-TSSA VI y anti- SAPA entre las madres

y los bebés, se consideró:

Materiales y métodos

47

Positivo si la media de la absorbancia obtenida en el suero del bebé para cierto antígeno menos 3 SD

superaba la media de la absorbancia de ese antígeno obtenida para el suero de la madre.

Negativo en el caso contrario.

Paneles de sueros usados

El panel de sueros de pacientes Chagásicos crónicos fue provisto por el Instituto Nacional de

Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén” (con resultados positivos para las técnicas IFI, HAI y ELISA

comerciales) y el Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutierrez” (con resultados positivos para las técnicas

ELISA y HAI comerciales). En todos los casos, los sueros pertenecían a pacientes mayores a 10 años,

nacidos en zonas endémicas y con más de 5 años de residencia en zonas no endémicas. Los sueros negativos

se obtuvieron de la Fundación Hemocentro Buenos Aires y fueron provistos por Jorgelina Blejer. El panel de

sueros de pacientes Chagásicos “crónicos tempranos” fue provisto por el Hospital de Niños “Dr. Ricardo

Gutierrez” (con resultados positivos para las técnicas ELISA y HAI comerciales). En todos los casos, los

sueros pertenecían a pacientes de entre 1 y 3 años, de residencia en zonas no endémicas y probable infección

congénita. Las muestras de sueros de pacientes con infección aguda (método de diagnóstico no especificado),

las muestras de suero de pacientes con infección congénita (con resultados positivos para las técnicas de

ELISA y HAI ), las muestras de sueros pareadas de madres infectadas con niños con infección congénita

(parasitemia positiva) y las muestras de pacientes sanos del grupo etario correspondiente, fueron

proporcionados por el Dr. Jaime Altcheh del Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutiérrez”, con quien se

estableció una colaboración de trabajo. Finalmente, los 8 sueros usados en el ensayo de desplazamiento con

péptidos sintéticos fueron proporcionados por la Dra. Karina Gomez del Instituto de Investigaciones en

Ingeniería Genética y Biología Molecular, “Dr. Héctor N. Torres”. Estos pacientes dieron resultados positivos

por las técnicas IFI, ELISA, HAI o fijación de complemento y habían sido testeados por ELISA contra TSSA

VI11

.

Infecciones de ratones con T. cruzi

Las infecciones, el sangrado de los animales y las determinaciones de parasitemia fueron realizadas

por la Dra. Valeria Tekiel del Laboratorio de Genética Molecular de Tripanosomátidos del Instituto de

Investigaciones Biotecnológicas “Dr. Rodolfo A. Ugalde”. Se realizaron 3 ensayos de infección

independientes utilizando hembras de las cepas de ratón C3H/HeJ y CF1. Se infectó cada ratón con 50

parásitos y se les extrajo sangre a distintos días post infección (dpi). Se midió la parasitemia por cámara de

Neubauer y, en alícuotas de esas mismas muestras, se determinó la presencia de anticuerpos por el método de

ELISA descripto arriba.

Materiales y métodos

48

Infecciones de células en cultivo con T. cruzi

Se crecieron células HeLa CCL2 en medio DMEM (Gibco) suplementado con SFB 4% (Natocor),

100 µg/ml de estreptomicina y 100 unidades/ml de penicilina (Gibco) en estufa a 37°C y 5% CO2. Se

tripsinizaron con una solución de tripsina-EDTA 0,05% (Gibco), y se calculó la concentración celular con

cámara de Neubauer. Se sembraron 1.104 células por pocillo en medio DMEM completo, en una placa de 24

pocillos con cubreobjetos circulares para microscopía, incubando 16 horas a 37°C y 5% CO2. Al día siguiente

se agregaron 5.105 tripomastigotes o amastigotes (ambos obtenidos a partir de sobrenadantes de células Vero

infectadas) por well en presencia 100 µg/ml de proteína recombinante o 200 µg/ml de péptido sintético por

pocillo. Luego de 3 horas de incubación a 37°C y 5% CO2 los cultivos se lavaron con PBS (4 lavados de 500

µl cada uno) para remover los parásitos no adheridos y se fijaron con paraformaldehido 4% inmediatamente

(ensayos de adhesión) o luego de una incubación de 36 horas en medio MEM 4% SFB (ensayos de

infección). A continuación, se lavaron las células con PBS, se incubaron 10 minutos con NH4Cl 25 mM, se

bloquearon 1 hora con PBS 2% BSA y 2% suero normal de cabra y se procesaron para IIF. Los parásitos

extracelulares se marcaron con suero de ratón infectado con T. cruzi (1:500 en solución de bloqueo) seguido

de la incubación con una solución 1:1000 en solución de bloqueo del anticuerpo secundario anti-Ig ratón

conjugado a Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes). Los parásitos intracelulares (marcación realizada sólo

para el ensayo de invasión) se marcaron a continuación con suero de conejo infectado con T. cruzi (1:500 en

solución de bloqueo con 0,5% saponina) y luego se incubó con una solución de anticuerpo secundario anti-Ig

conejo 1:1000 en solución de bloqueo marcado con AlexaFluor® 564 (Molecular Probes). Los cubreobjetos

se montaron en portaobjetos en presencia de 10 µl del agente Fluor Save (Calbiochem) con 1 µg/ml de DAPI

(Invitrogen). Se analizaron las imágenes en el microscopio Nikon Eclipse E600 acoplado a la cámara SPOT

RT™ (Diagnostic Instruments). Se contaron 300 células infectadas/no infectadas de manera manual.

Viabilidad de los parásitos

Se incubaron 1.106 parásitos en medio MEM con SFB 4% por 3 horas con PBS (control negativo),

con 200 μg/ml del péptido indicado (E1, E2 y E4) o con formol 4% (control positivo). Luego, se lavó 2 veces

con PBS y se incubó por 2 min con 1 μg/ml de ioduro de propidio. Se realizó un control sin teñir. A

continuación, se fijaron los parásitos por 20 min con paraformaldehido 4% en PBS, se lavó 3 veces con PBS

y se resuspendieron en 1 ml de PBS. Se analizaron las muestras en el canal F3 en el citómetro Partec

CyFlow® space.

Viabilidad celular

Se incubaron 1.103

células HeLa por pocillo en placa para cultivo celular de 96 pocillos (Orange

Scientific). Al día siguiente, se lavaron con PBS y se incubaron durante 3 horas con 200 μg/ml de péptido

Materiales y métodos

49

(E1VI, E2VI, E4VI, E4VIsc) o PBS (control negativo), por triplicado A continuación se lavó 2 veces con

PBS y se incubaron hasta el día siguiente en medio DMEM SFB 10%. Al día siguiente se tripsinizaron las

células con una solución de tripsina-EDTA 0,05% (Gibco) y se agregó un volumen de Azul de Trypan 0,4%.

Se contó el total de células vivas y muertas bajo el microscopio.

Análisis estadístico

Los distintos test estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 5. Los resultados de ELISA e

interacción proteína-célula se analizaron con test estadístico ANOVA de una o dos vías según se aclare en el

texto; se utilizó la variante Bonferroni para comparar con un tratamiento control. La comparación entre las

curvas ROC se realizó con el software estadístico MedCalc.

Información suplementaria

50

Información suplementaria

Tabla S. 1: Secuencia y reactividad de los péptidos de TSSA VI presentes en el microarreglo.

Péptido Proteína

recombinantea

Secuencia Mezcla #1 Mezcla #2

Media S.D. Media S.D.

p1-15 MTTCRLLCALLALAL -0,042 0,197 -0,047 0,028 p2-16 TTCRLLCALLALALC -0,045 0,212 -0,073 0,022 p3-17 TCRLLCALLALALCC -0,051 0,233 -0,095 0,008

p4-18 CRLLCALLALALCCC -0,064 0,223 -0,116 0,008 p5-19 RLLCALLALALCCCL -0,068 0,216 -0,151 0,008

p6-20 LLCALLALALCCCLT -0,074 0,226 -0,151 0,022 p7-21 LCALLALALCCCLTA -0,083 0,239 -0,151 0,028

p8-22 CALLALALCCCLTAC -0,063 0,227 -0,159 0,037

p9-23 ALLALALCCCLTACT -0,043 0,217 -0,16 0,037 p10-24 LLALALCCCLTACTT -0,025 0,21 -0,162 0,049

p11-25 LALALCCCLTACTTA 0,008 0,233 -0,164 0,085 p12-26 ALALCCCLTACTTAN 0,024 0,22 -0,172 0,05

p13-27 LALCCCLTACTTANG 0,045 0,166 -0,178 0,044

p14-28 ALCCCLTACTTANGG 0,053 0,148 -0,178 0,044 p15-29 LCCCLTACTTANGGS 0,055 0,142 -0,172 0,034

p16-30 CCCLTACTTANGGST 0,041 0,119 -0,164 0,034 p17-31 CCLTACTTANGGSTS 0,031 0,114 -0,162 0,027

p18-32 CLTACTTANGGSTSS -0,01 0,146 -0,16 0,003 p19-33 LTACTTANGGSTSST -0,054 0,101 -0,159 0,003

p20-34 TACTTANGGSTSSTP -0,067 0,128 -0,151 0,003

p21-35 ACTTANGGSTSSTPP -0,101 0,148 -0,124 0,01 p22-36 CTTANGGSTSSTPPS -0,118 0,162 -0,016 0,051

p23-37 TTANGGSTSSTPPSG 0,03 0,191 0,5 0,034 p24-38 TSSA VI-e1 TANGGSTSSTPPSGT 21,62 2,16 4,513 0,712

p25-39 ANGGSTSSTPPSGTE 29,71 0,55 10,68 3,289

p26-40 NGGSTSSTPPSGTEN 36,96 2,86 16,4 3,359 p27-41 GGSTSSTPPSGTENK 44,62 0,91 22,93 4,129

p28-42 GSTSSTPPSGTENKP 57,09 1,42 28,72 5,154 p29-43 STSSTPPSGTENKPA 78,24 2,1 33,71 6,734

p30-44 TSSA VI-e2 TSSTPPSGTENKPAT 95,02 2,24 42,82 8,505

p31-45 SSTPPSGTENKPATG 97,54 2,23 47,52 7,689 p32-46 STPPSGTENKPATGE 92,5 0 50,9 7,038

p33-47 TPPSGTENKPATGEA 86,37 5,29 53,48 5,08 p34-48 PPSGTENKPATGEAP 78,61 0,36 57,9 6,353

p35-49 PSGTENKPATGEAPS 70,15 3,7 62,76 8,612 p36-50 TSSA VI-e3 SGTENKPATGEAPSQ 55,19 2,6 66,97 9,299

p37-51 GTENKPATGEAPSQP 44,79 0,78 64,88 2,275

p38-52 TENKPATGEAPSQPG 40,27 0,11 54,13 2,346 p39-53 ENKPATGEAPSQPGA 32,65 0,05 47,65 2,656

p40-54 NKPATGEAPSQPGAS 27,83 1,47 41,6 3,387 p41-55 KPATGEAPSQPGASS 24,08 2,98 28,45 5,224

p40-56 TSSA VI-e4 PATGEAPSQPGASSG 18,55 4,12 18,6 18,738

p43-57 ATGEAPSQPGASSGE 10,01 3,82 10,75 14,897 p44-58 TGEAPSQPGASSGEA 2,31 0,141 5,291 3,828

p45-59 GEAPSQPGASSGEAE 0,09 0,164 2,74 0,443 p46-60 EAPSQPGASSGEAEA -0,042 0,181 2,126 0,2

p47-61 APSQPGASSGEAEAS -0,086 0,168 1,694 0,13 p48-62 TSSA VI-e5 PSQPGASSGEAEASS -0,125 0,251 1,508 0,099

p49-63 SQPGASSGEAEASSN -0,156 0,316 1,272 0,071

p50-64 QPGASSGEAEASSNK -0,165 0,336 0,986 0,016

Información suplementaria

51

p51-65 PGASSGEAEASSNKN -0,145 0,294 0,42 0,009 p52-66 GASSGEAEASSNKND -0,107 0,212 0,075 0,008

p53-67 ASSGEAEASSNKNDG -0,083 0,162 0,03 0,017 p54-68 SSGEAEASSNKNDGS -0,067 0,128 -0,008 0,058

p55-69 SGEAEASSNKNDGSL -0,055 0,102 -0,064 0,019 p56-70 GEAEASSNKNDGSLS -0,046 0,084 -0,111 0,01

p57-71 EAEASSNKNDGSLSS -0,047 0,033 -0,112 0,01

p58-72 AEASSNKNDGSLSSS -0,05 0,033 -0,098 0,01 p59-73 EASSNKNDGSLSSSA -0,057 0,033 -0,097 0,01

p60-74 ASSNKNDGSLSSSAW -0,059 0,031 -0,105 0,01 p61-75 SSNKNDGSLSSSAWV -0,101 0,039 -0,102 0,01

p62-76 SNKNDGSLSSSAWVS -0,115 0,053 -0,103 0,01

p63-77 NKNDGSLSSSAWVSA -0,127 0,059 -0,072 0,003 p64-78 KNDGSLSSSAWVSAP -0,128 0,062 -0,036 0,003

p65-79 NDGSLSSSAWVSAPL -0,132 0,075 0 0,008 p66-80 DGSLSSSAWVSAPLA -0,125 0,074 0,004 0,022

p67-81 GSLSSSAWVSAPLAL -0,121 0,076 0,001 0,034 p68-82 SLSSSAWVSAPLALA -0,107 0,041 -0,017 0,05

p69-83 LSSSAWVSAPLALAA -0,028 0,076 -0,038 0,09

p70-84 SSSAWVSAPLALAAS -0,021 0,08 -0,076 0,079 p71-85 SSAWVSAPLALAASA -0,008 0,065 -0,105 0,09

p72-86 SAWVSAPLALAASAL -0,003 0,031 -0,146 0,09 p73-87 AWVSAPLALAASALA -0,018 0 -0,177 0,09

p74-88 WVSAPLALAASALAY -0,022 0,014 -0,161 0,081

p75-89 VSAPLALAASALAYT -0,064 0,112 -0,128 0,05 p76-80 SAPLALAASALAYTA -0,061 0,098 -0,103 0,049

p77-91 APLALAASALAYTAL -0,06 0,08 -0,074 0,063 p78-92 PLALAASALAYTALG -0,068 0,052 -0,047 0,063

Cada arreglo fue ensayado por duplicado. Se indicó para cada mezcla de IgG la media de la reactividad y el desvío

estándar (S.D) obtenidos en cada péptido (la reactividad se expresó como unidades arbitrarias de fluorescencia). Se

consideraron reactivos los péptidos que arrojaron valores de media mayores a 3 unidades arbitrarias de

fluorescencia; los péptidos reactivos para cada mezcla se encuentran resaltados y el péptido de mayor reactividad

se encuentra subrayado. a Se indica la proteína recombinante conteniendo la secuencia correspondiente a este

mismo péptido (ver figura R.3)

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